CN1222195A - 编码反刍微生物肌醇六磷酸酶的dna序列 - Google Patents

Abstract

提供了源于反刍微生物的肌醇六磷酸酶。此肌醇六磷酸酶能够催化剂醇六磷酸释放无机磷。优选的肌醇六磷酸酶源包括月形单胞菌属(Selenomonas),普雷沃氏菌属(Prevotella),密螺旋体属(Treponema)和巨球形菌属(Megasphaera)。本发明提供了一个纯化的、分离的DNA,它编码源于反刍月形单胞菌JY35(Selenomonas ruminantiumJY35)(ATCC55785)的肌醇六磷酸酶。也提供了包含编码该肌醇六磷酸酶DNA的重组表达载体及转化了编码该肌醇六磷酸酶DNA的宿主细胞。此肌醇六磷酸酶可用于广泛的涉及肌醇六磷酸盐脱磷酸作用的应用,其它的情形包括用于动物饲料添加剂。

Description

编码反刍微生物肌醇六磷酸酶的DNA序列

                      发明领域

本发明涉及源于反刍微生物的肌醇六磷酸酶。

                      发明背景

尽管家畜饲料中的植物成分富含磷，为了使单胃动物生长良好，饲料中必需添加无机磷。植酸(肌醇六磷酸)通常与钙、镁和钾盐和/或蛋白质形成复合物存在，并且是谷物、油质种子、豆科植物中磷的主要形式，占种子干重的1-3％及种子总磷的60-90％(Graf,1986)。然而，单胃动物(如猪、家禽及鱼)利用肌醇六磷酸盐的能力很差或根本不利用肌醇六磷酸盐，因为它们缺乏能够水解肌醇六磷酸盐的胃肠道酶。肌醇六磷酸经过上消化道时基本上没有变化，在此它可通过螯合矿物质(如钙和锌)，结合氨基酸和蛋白质(Graf,1986)及抑制酶活性降低营养成分的生物有效性。粪便中的肌醇六磷酸磷造成严重的污染问题，有助于世界上家畜生产密集地区表面水的加富过程。

生产低效性及由肌醇六磷酸引发的磷污染问题可通过在单胃动物饲料中补充肌醇六磷酸酶得到有效改善。肌醇六磷酸酶可催化肌醇六磷酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐，后者可被小肠吸收。除了降低磷补充及减少肌醇六磷酸污染物释放量，肌醇六磷酸酶可减少肌醇六磷酸的抗营养效应。

肌醇六磷酸酶可在动物及植物组织(主要是种子)及多种微生物中产生(美国专利No.3,297,548；Shieh and Ware,1968；Ware andShieh,1967)，尽管潜在的肌醇六磷酸酶源很多，只有土壤霉菌(黑曲霉(Aspergillus niger)或无花果曲霉(Aspergillus ficuum))用于商业生产肌醇六磷酸酶。无花果曲霉产生的肌醇六磷酸酶与已确定的由其他微生物(欧洲专利申请No.0,420,358(van Gorcum等，1991)和美国专利No.5,436,156(van Gorcum等，1995年7月25日发布))产生的肌醇六磷酸酶相比，前者具有更大的特异性活性(100单位/毫克蛋白(其中的单位定义为每分钟释放的磷酸盐的微摩尔数))和热稳定性。此无花果曲霉肌醇六磷酸酶是酸性肌醇六磷酸酶，当pH大于5.5时，其活性很小(Howson和Davis,1983；van Gorcum等，1991)。所以，其活性局限于单胃动物消化道这样一个相对小的区域，其中的pH为2-3(胃)-4-7(小肠)。

尽管在单胃动物饲料中补充肌醇六磷酸酶的想法在25年以前就被提出(美国专利No.3,297,548,Ware和Shieh,1967)，生产此酶的高成本使得肌醇六磷酸酶的应用仅局限于家畜工业。在北美，补充肌醇六磷酸酶比补充磷的成本更高。在某些情况下，使用肌醇六磷酸酶的成本通过由于使用此酶而降低了如钙这样的第二种营养成分的补充得以抵消。在北美，随着猪和家禽数量增加及公共要求降低由家畜生产引起的污染，肌醇六磷酸酶的应用在增加。补充磷成本高以及法律要求使用肌醇六磷酸酶使得此酶在欧洲及东方某些国家的应用比北美还普遍。荷兰、德国、南朝鲜及台湾政府已经颁布或正在颁布法律以降低由于单胃家畜生产引起的磷污染。

增加肌醇六磷酸酶应用的有效方法是降低成本。可通过降低生产成本和/或生产具有更优质活性的酶来降低肌醇六磷酸酶的成本。生物技术的新进展可通过提供可选择的、经济的生产此酶的方法以彻底改革商业酶工业。重组DNA技术的应用使生产者提高生产酶的产量和效率并开发出新产品。原初微生物的要求不再限制商业化酶的生产。编码优质酶的基因可从不适于商业生产的典型微生物如厌氧细菌和真菌中转移到典型的工业微生物宿主中(如曲霉和芽孢杆菌类)。同样，这些基因可被转移到新型植物和动物表达系统中。

不同于向单胃动物，反刍动物(如牛，羊)很容易利用植酸中的磷。已经证明，肌醇六磷酸酶存在于瘤胃，人们推断以谷物为食(富含肌醇六磷酸)的反刍动物由于反刍肌醇六磷酸酶的存在不需要在其饲料中补充磷。一例报道将此肌醇六磷酸酶的产生归功于反刍微生物(Raun等，1956)，但总的来说，反刍动物利用肌醇六磷酸的独特能力基本上被忽视了。Ruan等(1956)通过离心沉淀(Cheng等，1955)制备微生物悬液。这些微生物悬液肯定污染有植物材料的微颗粒。由于植物产生肌醇六磷酸酶，此研究不能确定是植物肌醇六磷酸酶还是微生物肌醇六磷酸酶产生了观察到的活性。尽管Raun等人提出反刍肌醇六磷酸酶的产生可能是反刍微生物，没有人进一步探索这种可能性。

纵观前述，需要一种具有适于用作动物饲料补充剂的生化特征的低成本的肌醇六磷酸酶。

                      发明概述

本发明者发现瘤胃是产生肌醇六磷酸酶微生物的丰富源泉，此肌醇六磷酸酶具有适于动物饲料和肌醇生产等工业应用的生物化学特征(如温度和pH稳定性，低金属离子敏感性及高特异性活性)。反刍微生物能忍受厌氧条件因此既可是兼性厌氧微生物也可是专性厌氧微生物。反刍微生物可以是原核生物(即细菌)或真核生物(即真菌，原生动物)。在此所用的术语“反刍微生物”包括从一种反刍动物的消化物或粪便中分离出的微生物。

已被确定的能够提供特定活性的肌醇六磷酸酶的反刍细菌包括反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)，普雷沃氏菌(Prevotellasp.)，布氏密螺旋体(Treponema bryantii)和埃氏巨球形菌(Megaphaera elsdenii)。普雷沃氏菌属和月形单胞菌属是Bacteriodaceae科的革兰氏阴性厌氧杆菌。

根据本发明，提供源于反刍微生物的编码新型有用的肌醇六磷酸酶的DNA序列。

源自反刍月形单胞菌株JY35的肌醇六磷酸酶基因(phyA)已被克隆和测序，提供了phyA的核苷酸序列。本发明延伸至编码肌醇六磷酸酶及能够在严格条件下与phyA基因序列杂交的DNA序列。在此所谓的“能够在严格条件下杂交”指与一个有关核苷酸序列或其互补链在标准条件下退火，标准条件即指高温和/或低盐，此条件对于无关序列的退火不利。此处所谓“低严格条件”指40-50℃,6×SSC及0.1％SDS的杂交和洗涤条件(显示约50-80％同源性)。此处所谓“中等严格条件”指50-65℃,1×SSC及0.1％SDS的杂交和洗涤条件(显示约80-95％同源性)。此处所谓“高严格条件”指65-68℃,0.1×SSC及0.1％SDS的杂交和洗涤条件(显示约95-100％同源性)。

此处所谓的“肌醇六磷酸酶”指能够催化从肌醇磷酸盐中移去掉无机磷的酶。

此处所谓的“肌醇磷酸盐”包括但不局限于，肌醇六磷酸盐，肌醇戊磷酸盐，肌醇四磷酸盐，肌醇三磷酸盐，肌醇二磷酸盐和肌醇磷酸盐。

此处所谓的“肌醇六磷酸盐”指肌醇六磷酸的盐。

本发明延伸至反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)，以及鉴定和分离此菌及其他具有肌醇六磷酸酶活性的反刍微生物的方法，以及以全部或部分phyA基因序列为探针，从具有肌醇六磷酸酶活性的反刍微生物中分离、克隆，表达肌醇六磷酸酶基因的方法。

本发明进一步包括测定由一种微生物产生的肌醇六磷酸酶活性的方法，此方法消除了由于微生物产酸导致的假阳性。微生物克隆在包含有肌醇六磷酸盐的生长培养基上生长。此培养基与氯化钴的水溶液接触，然后在培养基上检查透明区。优选地，不是直接检查培养基，首先移掉氯化钴，培养基与钼酸铵及矾酸铵接触后检测透明区。产酸微生物产生透明区导致的假阳性可被避免。

本发明延伸至表达构建体，此构建体包含由本发明的编码肌醇六磷酸酶的DNA，此DNA与一段可在合适的宿主细胞内指导此肌醇六磷酸酶表达的调控序列可操作地连在一起。

本发明进一步延伸至宿主细胞，它已转化并表达本发明的编码肌醇六磷酸酶的DNA序列，及生产这样的转化宿主细胞的方法。此处所谓的“宿主细胞”包括动物、植物、酵母、真菌、原生动物及原核宿主细胞。

本发明进一步延伸至转基因植物，此植物已转化了本发明的编码一种肌醇六磷酸酶的DNA以致转化的植物能够表达此肌醇六磷酸酶以及生产这样的转化植物的方法。此处所谓的“转基因植物”包括转基因植物、组织和细胞。

本发明的肌醇六磷酸酶可用于广泛的涉及肌醇六磷酸盐脱磷酸作用的应用。这样的应用包括应用于动物饲料添加剂，饲料调节，人类营养以及从肌醇六磷酸中生产肌醇。本发明的肌醇六磷酸酶也可用于将肌醇六磷酸盐的螯合金属的副作用降至最低。富含肌醇六磷酸盐的某些饲料如豆粉会降低其对于鱼、单胃动物、幼小反刍动物及婴儿做为蛋白源的营养价值，因为肌醇六磷酸盐可螯合矿物质，与氨基酸和蛋白质结合降低营养成分的生物可用性。用本发明的肌醇六磷酸酶处理饲料可通过此酶介导的去磷酸化作用降低饲料中肌醇六磷酸盐的含量，使得饲料更适于用作蛋白源。相应地，本发明延伸至一种新型饲料组合物，它包含有本发明的肌醇六磷酸酶处理的饲料以及包含有本发明一种肌醇六磷酸酶的饲料添加剂。这样的饲料组合物及添加剂也可包含其他酶如蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶和酸性磷酸酶。此肌醇六磷酸酶也可直接添加于未被处理的、做成球状的或用其他方式加工的饲料中，或它可与饲料分开提供，如以矿物块，片剂，凝胶形式，液体形式或将之添加于饮用水中。本发明延伸至饲料接种制剂，它包含有在正常生长条件下可表达本发明肌醇六磷酸酶冷冻干燥的微生物。至于饲料接种制剂，“正常生长条件”指收获及冷冻干燥微生物前的培养条件。在大规模发酵罐中，在微生物培养生长过程中这些微生物表达肌醇六磷酸酶。微生物中肌醇六磷酸酶活性可通过将包含有此肌醇六磷酸酶的收获的微生物浓缩物冷冻干燥得以保存。

本发明进一步延伸至提高动物饲料磷酸盐利用率的方法，它是通过饲喂动物有效量的本发明中肌醇六磷酸酶实现的。此处所谓肌醇六磷酸酶的有效量指的是可引起统计学上动物利用磷有明显改善的量。肌醇六磷酸酶的利用可以动物生长状况的改善和动物粪便中肌醇六磷酸盐的降低水平为证据。

                      附图简述

图1示复染含有肌醇六磷酸盐的琼脂培养基对由产酸或肌醇六磷酸酶活性产生的透明区的效应。以牛链球菌(S.bovis)(左侧平皿上部)和反刍月形单胞菌JY35(左侧平面下部)接种肌醇六磷酸盐琼脂并于37℃孵育5天。克隆被刮掉后，培养基以氯化钴和钼酸铵/矾酸铵溶液进行复染(右侧平皿)。

图2图示反刍月形单胞菌JY35在改良的Scott和Dehority(1965)培养基中的生长(蛋白)和肌醇六磷酸酶的产生。

图3A,3B和C展示了反刍月形单胞菌JY35中对数中期培养物细胞的透射电镜照片，培养此菌是为了观察以肌醇六磷酸钠为底物时肌醇六磷酸酶作用产物的积累。未被处理的对照细胞列于图3D,3E和3F以作比较。

图4为洗涤后的反刍月形单胞菌JY35细胞在5种不同缓冲液中的pH曲线图。

图5为反刍月形单胞菌JY35 MgCl₂细胞提取物在5种不同缓冲液中的pH曲线图。

图6为反刍月形单胞菌JY35 MgCl₂细胞提取物的温度曲线图。

图7示离子(10mM)对反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶活性的影响(Ctr=对照)。

图8示肌醇六磷酸钠浓度对反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶活性的影响。

图9为证实肌醇六磷酸酶活性的酶谱。反刍月形单胞菌JY35 MgCl₂提取物(B-E泳道)的浓缩液(10×)，低分子量标准(F泳道，BioRad Laboratories Canada Ltd,Mississauga,Ontario)和无花果曲霉肌醇六磷酸酶(Sigma,1.6U,A泳道)在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分析。泳道A-E染色以确定肌醇六磷酸酶活性同时F泳道以考马斯亮蓝染色。

图10为测定转化了pSrP.2(上部)，pSrP.2ΔSph1(下部左侧)及pSrPf6(下部右侧)的大肠杆菌DH5α的肌醇六磷酸酶活性的肌醇六磷酸盐水解板。平板在37℃孵育48小时后可见透明区。

图11为Southem印迹分析Sph1消化的pSrp.2 DNA(B泳道)及HindⅢ消化的反刍月形单胞菌JY35基因组DNA(C泳道)，探针为源自pSrP.2的2.7kb片段。A泳道为地高辛标记的HindⅢ/入DNA分子量标准。

图12为pSrP.2的物理图谱。源自由Sau3A部分消化反刍月形单胞菌JY35基因组DNA得到的2.7kb片段克隆到pUC18的BamHⅠ位点。此片段包括编码反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶的全基因。由于连接导致的BamHⅠ位点的丢失以方括号标出。

图13为反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶基因缺失分析简图。phyA的位置以水平箭头标出。影线盒代表由不同质粒衍生物携带的2.7kb的Sau3A片段。肌醇六磷酸酶活性在右侧的一列中标出。

图14为肌醇六磷酸酶活性的酶谱。大肠杆菌DH5α(pSrP.2)细胞(A泳道)，大肠杆菌DH5α(pSrP.2ΔSph1)细胞(B泳道)，及低分子量标准(C泳道，BioRad Laboratories)在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分析。A和B泳道染色以测肌醇六磷酸酶活性同时C泳道以考马斯亮蓝染色。

图15为反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶基因(phyA)(SEQ IDNO.1)的核苷酸序列及推测的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。核苷酸1相当于pSrP.2中2.7kb片段的第1232个核苷酸。推断的核糖体结合序列被下划线并且在序列上方标有R.B.S.。信号肽酶切割位点以↑标出。它是通过von Heijne(1986)的方法推测出的。由大肠杆菌(pSrPf6)分泌的肌醇六磷酸酶的N末端氨基酸序列被下划线。

                  优选实施方案详述

瘤胃是一个复杂的生态系统，其中生存着300多种细菌、真菌和原生动物。筛选这些生物的肌醇六磷酸酶活性需要区别单个分离物的肌醇六磷酸酶活性的能力。这可通过估价源自贮存收集物的纯培养物或分离并培养通过培养技术得到的单个细胞。培养技术例如划线平板，稀释和显微操作。针对细菌、真菌和原生动物的标准的无菌、厌氧技术也可用以达到这个目的。

对于从反刍流体样品和从培养收集物中筛选微生物分离物及克隆肌醇六磷酸酶基因而言，合适的酶测定是必需的。文献中已有有关测量溶液中肌醇六磷酸酶活性的测定方法。典型的测定样品溶液中肌醇六磷酸酶活性的方法是通过测量由肌醇六磷酸中释放的无机磷Pi(Raun等，1956；van Hartingsveldt等，1993)。肌醇六磷酸酶活性也可在固体培养基上测定。表达肌醇六磷酸酶的微生物在包含有肌醇六磷酸钠或肌醇六磷酸钙的琼脂培养基上产生透明区(Shieh和Ware,1968；Howson和Davis,1983)。然而文献中描述的固体培养基测定法在用以测定肌醇六磷酸酶活性以筛选反刍细菌时不适用，因为象牛链球菌这样的产酸细菌会导致假阳性产生。为了解决这个问题，发展了一种两步复染方法，其中含有固体培养基的平皿先覆以氯化钴溶液然后以钼酸铵/矾酸铵溶液覆盖培养基。处理后，只有由酶活性产生的透明区明显(图1)。

用上述溶液和固体培养基测定345份来自Lethbridge研究中心(Lethbridge,Alberta,Canada)的培养收集物，通过测定肌醇六磷酸酶活性筛选之(表1)。总共鉴定出29份有较大肌醇六磷酸酶活性的分离物，其中包括24份月形单胞菌属的和5份普雷沃氏菌属的培养物。12份培养物(11份为月形单胞菌分离物，1份为普雷沃氏菌分离物)具有比其他阳性培养物明显高的肌醇六磷酸酶活性(表2)。

反刍月形单胞菌JY35(于1996.5.24保藏于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852-1776，保藏号ATCC 55785)被选作进一步检测并与源自无花果曲霉NRRL 3135(vanGorcum等，1991和1995)的商品化的肌醇六磷酸酶比较(Gist-brocades nv,Delft,The Netherlands)。反刍月形单胞菌JY35(ATCC55785)的肌醇六磷酸酶组成型表达，从细胞内释放出来并与细胞表面相关联。反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶的pH值(图5)和温度(图6)曲线图表明它比源自商业化的无花果曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶更适应商业生产。以上结果表明反刍和厌氧微生物做为肌醇六磷酸酶源产生的酶比当前工业生产出的肌醇六磷酸酶更优质。

编码所选酶的微生物基因可以多种方法克隆。用标准方法(Sambrook等，1989；Ausubel等，1990)构建的基因文库(基因组DNA和/或cDNA)用以筛选目的基因。筛选的一套方法可利用异源探针，酶活或基因纯化过程中产生的结果，如N-末端和中间氨基酸序列数据及抗体。

利用发展的检测由反刍微生物产生的肌醇六磷酸酶活性的固体培养基肌醇六磷酸酶测定方法，反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的一个基因文库被用作筛选阳性克隆。6000个克隆被检测，通过克隆周围形成的巨大透明区确定了一个菌落为肌醇六磷酸酶阳性克隆。此克隆携带有5.5kb的质粒，此质粒包含有插入pUC18的一个2.7kb的Sau3A DNA片段。此新分离到的2.7kb Sau3A DNA片段用作Southern印迹杂交的探针。在高严格条件下，可在反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)中检测到一条分离的条带，而在普雷沃氏菌46/5²，大肠杆菌和无花果曲霉NRRL 3135中却检测不到这一条带。

从新近分离到克隆中分离质粒并通过转化将之转到大肠杆菌中产生出了氨苄抗性的、肌醇六磷酸酶阳性的CFU。携带有反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的2.7kb Sau3A DNA片段的大肠杆菌细胞提取物的酶谱分析表明一条分子量约为37kDa的单一活性条带。删除和DNA序列分析用以确定编码重组大肠杆菌克隆中具有肌醇六磷酸酶活性的基因(phyA)。具phyA基因的大肠杆菌表达的纯化的37kDa肌醇六磷酸酶的N-末端氨基酸序列与从克隆的phyA序列预测的成熟肌醇六磷酸酶的N-末端氨基酸序列一致。这可以确定编码肌醇六磷酸酶的核苷酸序列已被分离。核苷酸序列及推断的氨基酸序列列于图15。

同其他基因一样，用肌醇六磷酸酶的编码区在多种表达系统中进行商品酶生产是可能的。重组DNA技术使酶制造商增加酶生产的体积和效率并可制造出新产品。对最初微生物源的需求不再限制商品酶的生产。编码优质酶基因可从不适于商业生产的微生物如厌氧细菌和真菌转至典型的工业微生物生产宿主中(如曲霉属、毕赤酵母属、木霉属、芽孢杆菌属)。同样的，这些基因可被导入新型植物和动物表达系统中。

工业微生物株((如黑曲霉，无花果曲霉，泡盛曲霉(Aspergillusawamori)，米曲霉(Aspergillus oryzae),Trichoderma reesei，米赫毛霉(Mucor miehei)，乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))或植物宿主(如canola，大豆，玉米，土豆)可用以生产肌醇六磷酸酶。所有的系统利用相似的方法进行基因表达。表达构建体组装包括目的蛋白编码序列和控制序列如启动子，增强子和终止子。也可包括其他序列如信号序列和选择标记。为了使肌醇六磷酸酶表达于胞外，本发明的表达构建体利用一个分泌信号序列。如果胞浆表达可取，则信号序列不包含在表达构建体上。启动子和信号序列在宿主细胞内有功能且是为了编码序列产物表达和分泌提供的。转录终止子保证有效转录。增强表达和蛋白纯化的辅助序列也可包含于表达构建体中。

具肌醇六磷酸酶活性的蛋白质编码序列是从反刍微生物中得到的。此DNA对于表达宿主来说既可是同源的也可以是异源的。同源DNA在此指源自相同种的DNA。如，源自反刍月形单胞菌的DNA可以转化反刍月形单胞菌以提高原有特征而不引入原来此种不存在的特性。异源DNA指源自不同种的DNA。如，反刍月形单胞菌的phyA可被克隆至大肠杆菌并在其中表达。

在生物领域中众所周知，某此蛋白的氨基酸替换不会影响蛋白质的功能。通常，保守氨基酸替换不影响蛋白功能。相似氨基酸指大小或电荷相似的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸及异亮氨酸和缬氨酸为相似氨基酸对。本领域的多种方法可估价氨基酸对间的相似性。例如在参考文献《蛋白质序列和结构图集》，第5卷增补3，第22章345-352页中，Dayhoff等(1978)提供了用于估价氨基酸相似性的氨基酸替换频率表。Dayoff等的频率表是以比较进化上不同，而功能相同蛋白的氨基酸序列为基础的。

众所周知，小于全长的蛋白具有全蛋白的功能，如，缺少N-末端、中间或C-末端的截短的蛋白通常具有完整天然蛋白的生物和/或酶学活性。涉及phyA基因截短实验已证实截短蛋白具有全蛋白的功能。缺少N-末端氨基酸1-37或1058(SEQ ID NO.2)的表达PhyA的大肠杆菌克隆表现出肌醇六磷酸酶阳性表型。相反，表达缺失307-346氨基(SEQ ID NO.2)PhyA的克隆检测不到肌醇六磷酸酶活性。本领域的普通技术人员懂得如何制得截短蛋白或具有内部缺失的蛋白。利用下面描述的测定方法和本领域众所周知的知识，本发明中的截短的肌醇六磷酸酶蛋白或内部缺失的肌醇六磷酸酶很容易被检测。

基本上保持与此处特别描述的肌醇六磷酸酶相同酶活性的替换、内部缺失或截短的反刍肌醇六磷酸酶衍生物都被看做是例证中肌醇六磷酸酶的等价物并在本发明范围之内，特别是替换的、内部缺失的或截短的肌醇六磷酸酶衍生物具有特定例证中肌醇六磷酸酶的10％以上活性。利用此处讲述的测定方法和本领域内熟知的知识，熟练技术人员很容易测定一个反刍肌醇六磷酸酶、截短的、内部缺失的或替换肌醇六磷酸酶的活性。

本发明包括源自反刍微生物肌醇六磷酸酶的结构变异的肌醇六磷酸酶，特别是源自于此文特别描述的肌醇六磷酸酶，其功能与借助本领域已知知识利用此处描述的方法测定的肌醇六磷酸酶基本一致。本发明中肌醇六磷酸酶的结构变异体，功能相似物包括反刍微生物的肌醇六磷酸酶，它们具有如同此处描述的肌醇六磷酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的连续的氨基酸序列，特别是那些具有反刍微生物肌醇六磷酸酶至少连续25个氨基酸序列的肌醇六磷酸酶变异体。

本发明也提供了用于构建与此处分离到酶具有不同特性的肌醇六磷酸酶的起始材料。这些基因可用已知方法很容易突变(如，化学突变、定点突变、随机聚合酶链反应突变)以产生具有改变了特性的基因产物(如，最适温度或最适pH，比活性或底物特异性)。

根据本发明，可使用多种启动子(转录起始调节区)。合适启动子的选择依赖于假定的表达宿主。可供选择的启动子可包括与克隆蛋白编码序列相关的启动子，或在选择宿主中有功能的异源启动子。异源启动子的例子包括大肠杆菌tac和tn启动子(Brosius等，1985)，枯草杆菌sacB启动子和信号序列(Wong,1989)，源自巴斯德毕赤酵母(Ellis等，1985)的aox1和aox2启动子，及源自欧洲油菜(Brassicanapus)或拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的油质蛋白种子特异的启动子(van Rooijen和Moloney,1994)。启动子的选择也依赖于需要的多肽或蛋白生产效率和生产水平。象tac和aox1这样的可诱导启动子经常被用以大幅度提高蛋白表达水平。蛋白的过表达对宿主细胞有害。结果，宿主细胞生长受到限制。诱导型启动子的应用使得诱导基因表达前宿主细胞能够培养至可接受的密度，以此促进较高产品产量。如果蛋白编码序列通过基因替换(omega插入)整合至一个目的座位，启动子的选择受到与目的座位启动子同源程度的影响。

根据本发明，多种信号序列也可使用。与要表达的蛋白编码序列同源的信号序列可被使用。另外，选择或设计用于提高表达宿主分泌的信号序列也可应用。例如，枯草芽孢杆菌sacB信号序列用以枯草芽孢杆菌分泌，啤酒糖酵母α-交配因子或巴斯德毕赤酵母用以巴斯德毕赤酵母分泌的酸性磷酸酶phol信号序列可被应用。如果蛋白编码序列要通过omega插入整合，与目的座位高度同源的信号序列是必需的。信号序列可通过编码信号肽酶切割位点的序列直接加入，或由十个以下密码子组成的短核苷酸桥连入。

已确定了对真核蛋白表达系统适用的增强表达转录(启动子活性)和翻译的元件。例如，将花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子置于异源启动子的任意一侧可提高转录水平10-400倍。表达构建体也应该包括合适的翻译起始序列。通过将Kozak共有序列作为合适的翻译起始点包括在改良的表达构建体中可将翻译水平提高10倍。

提高蛋白纯化的元件也可包含于表达构建体中。油质蛋白基因融合体产物是包含有与油质蛋白基因相连的目的基因的杂合蛋白。此融合蛋白保留有油质蛋白的亲脂性从而掺入到油体膜中(van Rooijen和Moloney,1994)。与油体相连这一性质易于重组油质蛋白融合蛋白的纯化(van Rooijen和Woloney,1994)。

选择标记通常被应用，它可是表达构建体的一部分或与它分开(如，被表达载体携带)，因此这个标记可在与目的基因不同的位点整合。本发明重组DNA分子转化宿主细胞可通过使用选择标记进行监控。这些标记的例子包括对抗生素的抗性(如bla使大肠杆菌宿主细胞对氨苄青霉素有抗性，nptll使欧洲油菜细胞对卡那霉素有抗性)或使宿主能在基本培养基上生长(如，HIS4使马斯德毕赤酵母GS115 His^-在缺少组氨酸时生长)。选择标记应有自己的转录和翻译起始点及终止调节区域以使标记自主表达。当抗生素用作选择标记时，用以选择的抗生素浓度依抗生素种类不同而异，通常为10-600μg抗生素/ml培养基。

利用已知的重组DNA技术装配表达构建体。限制性酶消化和连接是将两个DNA片段连在一起的基本步骤。DNA末端在连接需要修饰，这可通过补平突出端或用核酸酶(如，ExoⅢ)删除片段的末端部分，定点突变和用多聚酶链式反应(PCR)增加新碱基对来完成。可用多接头和衔接子加速所选片段的加入。典型表达载体的组装需要多轮限制性酶切、连接及转化大肠杆菌。有多种克隆载体用以构建表达构建物而特定的选择对本发明则无关紧要。用于将表达构建物转入宿主细胞的基因转移系统影响克隆载体的选择。在每一轮结束时，构建体可通过限制性酶切、DNA序列测定、杂交和PCR分析进行鉴定。

表达构建体可以线性或环形的克隆载体构建体或从克隆载体中卸下来并用作或在运送载体上导入宿主细胞运送载体易于表达构建体在所选宿主细胞类型的导入和维持。通过很多基因转移系统中的任何一种可将表达构建体转移到宿主细胞(如天然感受态，化学介导的转化，原生质体转化，电穿孔，biolistic转化，转染，接合作用)。基因转移系统依宿主细胞和所用的载体系统而定。

例如，可用原生质体转化或电穿孔法将表达构建体引入巴斯德毕赤酵母细胞。巴斯德毕赤酵母的电穿孔很容易完成并且转化效率可与原生质球法相比。用灭菌水洗涤巴斯德毕赤酵母并以低电导率溶液(如1M山梨聚糖溶液)。细胞悬液接受高压休克后会在细胞膜上产生瞬时孔，通过这些孔，转化的DNA(如，表达构建体)进入细胞。表达构建体通过同源重组整合到aox1(酒精氧化酶)座位而稳定维持在宿主中。

另外地，包含有与蛋白编码序列可控连接sacB启动子及信号序列的表达构建体携带于pUB110,pUB110为可在枯草杆菌中自主复制的质粒。得到的质粒通过转化导入枯草杆菌细胞。枯草杆菌在低营养条件下自发产生天然感受态。

第三个例子，欧洲油菜细胞通过土壤杆菌介导的转化法被转化。此表达构建体被插入到一个二元载体，它既可在根癌土壤杆菌中复制又可转移入植物细胞。产生的重组体被转化入具有减弱的Ti或“辅助质粒”的根癌土壤杆菌细胞中。当叶片感染了重组根癌土壤杆菌细胞时，通过双重质粒与表达构建体的接合转移作用，表达重组体被转移至欧洲油菜叶细胞中。表达构建体随机整合到植物细胞基因组中。

通过使用由表达载体或载体携带的选择标记及用包括杂交、PCR和抗体在内的多种技术证实目的基因的存在，鉴定携定携带表达构建体的宿主细胞(即转化的细胞)。

转化的微生物细胞可通过多种技术培养，包括在液体或半固体培养基上分批或连续发酵。转化的细胞在最大生产-成本比率的优化条件下增殖。通过控制培养参数如温度，pH，通气及培养基组成，产量会有大幅度的提高。精心控制和调节重组过表达大肠杆菌细胞的生长条件会产生培养物生物量和蛋白产量分别为150g细胞/L培养物(湿重)和5g不溶蛋白/L。低浓度的蛋白酶抑制剂(如苯甲基磺酰氟或抑胃酶肽)可用以减少过表达多肽或蛋白的蛋白酶水解作用。另外，可用蛋白酶缺失的宿主细胞以减少或消除目的蛋白的降解。

选择和筛选后，转化的植物细胞可被重新导入整个植物体，用已知方法已培育并养殖了多株转基因植物品系。此处所谓的“转基因植物”包括转基因植物，植物组织和植物细胞。

发酵后，微生物细胞可通过离心和过滤一类的下游程序从培养基中分离出来。如果目的产品被分泌，它可从营养培养基中提取出来。如果产品在细胞内，细胞先被收获然后通过使用机械力、超声、酶学、化学和/或高压破裂细胞使产品释放出来。如在高表达细胞系统中不溶性产品的产生可用于加速产品纯化。产品包含体可通过离心方法从破裂细胞中提取出来，用含有低浓度去污剂(如0.5-6M尿素，0.1-1％十二烷基磺酸钠或0.5-4.0M盐酸胍)缓冲液洗涤沉淀可去掉杂蛋白。洗涤后的包涵体在含有6-8M尿素，1-2％十二烷基磺酸钠或4-6M盐酸胍的溶液中溶解。溶解的产品可在透析过程中除掉变异性得以复性。

可通过研磨、匀浆、和/或化学处理方法从收获部分或植物整体中提取肌醇六磷酸酶。通过将油质融合蛋白分配于榨过的canola种子的油相从而与水相蛋白分开，种子特异的亲脂油质融合蛋白纯化加速(vanRooijen和Moloney,1994)。

如果必需，纯化产品的多种方法包括微生物的，发酵和植物萃取都可应用。这些方法包括沉淀(如，硫酸铵沉淀)，层析(凝胶过滤，离子交换，亲和液相层析)，超滤，电泳，溶剂-溶剂萃取(如丙酮沉淀)，及其组合，等。

全部或部分微生物培养物和植物可直接用于需要肌醇六磷酸酶的应用。也需要制备多种肌醇六磷酸酶的粗制品或纯化品制剂。这些酶中可加入其他蛋白(如明胶、脱脂奶粉)或化学试剂(如甘油、聚乙二醇、还原剂和乙醛)得以稳定。酶悬液可被浓缩(如切向流过滤)或干燥(喷雾鼓干燥、冷冻干燥)并通过已知的方法制成流体，粉状，颗粒，丸，矿物块和凝胶状。向明胶，藻胶，胶原，琼脂，果胶及角叉菜聚糖一类的凝胶剂可应用于此。

进一步，单独肌醇六磷酸酶不能完成肌醇六磷酸酶的脱磷酸作用。肌醇六磷酸酶不能够使低级肌醇磷酸盐脱磷酸。例如，在美国专利No.5,536,156(van Gorcum等，1995年，7月25日发布)中描述的无花果曲霉肌醇六磷酸酶对肌醇二磷酸或肌醇单磷酸具有低的或没有磷酸酶活性。在本发明的含有肌醇六磷酸酶的食物添加剂中加入如酸性磷酸酶一类的另一种磷酸酶有助于肌醇二磷酸和肌醇单磷酸脱磷酸。

目的产品的制剂可直接用于需要肌醇六磷酸酶的应用中。流体浓缩物、粉末和颗粒可直接加入到反应混合物、发酵物、谷物浸出液及磨碎的废品中。配制成的肌醇六磷酸酶可各种形式使动物服用，包括以饮用水、矿物块、作为一种盐、或作为粉末洒于饲料槽中或与食物混匀等多种形式。也可以已知的方法与其他饲料混匀、喷洒其他饲料或与其他饲料形成小丸。另外，具有合适启动子-增强子序列的肌醇六磷酸酶基因可整合到动物基因组中并且只是在一种器官或组织中(如唾液腺、胰或上皮细胞)，后者将肌醇六磷酸酶基因分泌到消化道内，由此不需要另外补充肌醇六磷酸酶。

在一个优选制剂中，本发明的肌醇六磷酸酶是以微生物饲料接种物形式出现的。具有天然肌醇六磷酸酶的微生物，如反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)或表达异源肌醇六磷酸酶基因的重组微生物在发酵罐中培养到一个高浓度然后收获并通过离心浓缩。食品级乳清和/或其他低温保护剂与细胞浓缩物混匀。按标准冷冻方法，最终的混合物低温冷冻并冷冻干燥以保持肌醇六磷酸酶活性。冷冻干燥培养物可进一步加工成成品，进一步的方法包括将培养物与懒性携带物混合以调整产品的活力。

本发明生产的全部或部分微生物培养物和植物可用于多种需要肌醇六磷酸酶的工业方法。这样的应用包括但不局限于以肌醇磷酸和肌醇为终产品的生产，饲料成分和非反刍动物(如猪、家禽、鱼、宠物食品)饲料添加剂，人类营养、及涉及包含有肌醇六磷酸酶饲料的其他工业(大豆和玉米加工，淀粉及发酵)。肌醇六磷酸盐的降解使动物和微生物利用无机磷和螯合的金属。肌醇六磷酸酶的作用提高了富含肌醇六磷酸盐的饲料成分和/或发酵底物的质量、价值及可用性。肌醇六磷酸酶的作用能够加速涉及玉米湿磨碎物的浸出过程和分离过程。

本发明的肌醇六磷酸酶基因可用于异源杂交和多聚酶链式反应实验，指导从其他微生物中分离肌醇六磷酸酶编码基因。此处的实施例是以举例形式给出的，完全不是限制本发明的范围。已尽努力保证所用数字的准确性(如，温度、pH、数量)但应该认识到某些实验中可能出现的变化和偏差。

实施例1反刍细菌的分离

从插有套管的Holstein牛中收集反刍流体至一个灭菌的Whirlpak^TM袋中。也可通过一根口胃(orogastric)管从瘤胃中抽取流体。在合适的厌氧气中(如，90％CO₂和10％H₂)，制备10倍稀释的瘤胃流体稀释液并将之分散于固体生长培养基的表面(如，Scott和Dehority,1955)，平板在39℃孵育18-72小时。用灭菌环挑起分离的克隆并将之涂到新鲜的琼脂培养基上以分离克隆。来自单个克隆的细胞通过形态学进行证实以代表一个纯的培养物并被培养且贮存于Lethbridge研究中心(“LRC”)培养收藏处或酶活性或遗传材料的源泉。

                      实施例2筛选具肌醇六磷酸酶活性的反刍细菌A．肌醇六磷酸酶活性测定

150μl样品溶液(培养物滤液，细胞悬液，裂解液洗液或灭菌水空白)与600μl底物液[0.2％(w/v)肌醇六磷酸钠溶于0.1M乙酸钠缓冲液中，pH5.0]37℃孵育30分钟以测定肌醇六磷酸酶活性。加以750μl 5％(w/v)三氯乙酸终止反应。反应混合物中释放的正磷酸以Fiske和Subbarow方法(1925)进行测定。新鲜制备的显色剂[750μl溶液中含有4体积溶于5.5％(w/v)硫酸溶液的1.5％(w/v)钼酸铵及1体积2.7％(w/v)硫酸亚铁]加入反应混合物，产生的钼酸磷在700nm处以分光光度计测定。结果与由无机磷测定的标准曲线相比。1个单位(“单位”)的肌醇六磷酸酶定义为在测定条件下每分钟释放1微摩尔无机磷(Pi)所需的酶量。

发展了一种改良的肌醇六磷酸酶平板测定法，它可以消除由于微生物产生酸导致的假阳性。细菌分离物于无氧条件下在改良的Scott和Dehority(1965)琼脂培养基上37℃培养5天，此培养基含有5％(v/v)瘤胃流体，1.8％(w/v)琼脂和2.0％(w/v)肌醇六磷酸钠。克隆从琼脂表面被洗掉，平皿以2％(w/v)氯化钴水溶液覆盖。室温下孵育5分钟后，氯化钴溶液被新鲜制备的溶液替代，此溶液包含有等体积的6.25％(w/v)钼酸铵水溶液和0.42％(w/v)矾酸铵溶液。孵育5分钟后，钼酸铵溶液/矾酸铵溶液被移掉，在平板上检测透明区。这种复染技术的效果示于图1。染色前含有肌醇六磷酸盐的琼脂培养基上，在产生肌醇六磷酸酶的反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)和产生乳酸的牛链球菌菌落周围有明显的透明区(图1，左侧平板)。由牛链球菌产酸形成的假阳性透明区通过以氯化钴和钼酸铵/矾酸铵溶液复染得以消除(图1，右侧平板)。B．反刍细菌的肌醇六磷酸酶活性

测定了源于LRC培养物收藏处的345株反刍细菌的肌醇六磷酸酶活性(表1)。由Bryant和Burkey(1953)改良的Hungate(1950)的厌氧技术，或在含90％CO₂和10％H₂的缺氧盒中培养LRC培养物收藏处的微生物。在含有5ml改良的Scott和Dehority培养基(1965)的Hungate管中，筛选无氧生长(100％CO₂)的分离物的肌醇六磷酸酶活性，此培养基含有5％(v/v)瘤胃流体，0.2％(w/v)葡萄糖，0.2％(w/v)纤维二糖及0.3％(w/v)淀粉。39℃孵育12-24小时后，检测全细胞或培养物上清中肌醇六磷酸酶活性。月形单胞菌是主要的肌醇六磷酸酶产生者(93％的分离物具有肌醇六磷酸酶活性，表1)。其他的能够检测到较大数量阳性培养物的属只有普雷沃氏菌(40个检测物中有11个肌醇六磷酸酶阳性)。总共确定了29个基本上有肌醇六磷酸酶活性的培养物。其中24个为月形单胞菌属，5个为普雷沃氏菌属。其中11个培养物(11个属于月形单胞菌属，1个为普雷沃氏菌属)的肌醇六磷酸酶比其他阳性培养物高(表2)。在所有情况下，肌醇六磷酸酶活性主要与细胞相关。

                      实施例3反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶活性A．生长及肌醇六磷酸酶的生产

在反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)生长过程中检测了肌醇六磷酸酶的产生。此菌在含5ml具5％(v/v)反刍流体的改良Scott和Dehority培养基(1965)的Hungate管中于39℃生长。生长(蛋白浓度)与肌醇六磷酸酶活性(与细胞相关的)在24小时内隔一定时间间隔监测。反刍月形单胞菌在接种后8-10小时时，其生长和肌醇六磷酸酶活性达到最大(图2)。肌醇六磷酸酶活性升高反映了细胞生长情况。B．肌醇六磷酸酶活性定位

据测定，反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶活性主要是细胞相关的。在培养上清及细胞洗液中几乎检测不到肌醇六磷酸酶活性。根据Cheng和Costerton的描述(1973)，反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶活性通过电子显微镜定位。通过离心收集细胞，以缓冲液洗涤之；包埋于4％(w/v)琼脂中，以0.5％戊二醛溶液预固定30分钟，然后于5％(v/v)戊二醛溶液中固定2小时。用二甲胂酸缓冲液(0.1M,pH7.2)洗涤样品5次并用2％(w/v)的四氧化锇处理样品，以二甲胂酸缓冲液洗样品5次，然后以梯度酒精脱水，然后包埋于Spurr′s树脂中(J.B.EM Services公司)。以Reichertmodel OM U3超薄切片机切成超薄切片并以2％(w/v)乙酸双氧铀和柠檬酸铝染色。用Hitachi H-500 TEM在75kV加速电压下观察标本。与未处理样品相比，与底物孵育以使反应产物沉积的反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)清楚地表明，肌醇六磷酸酶活性与细胞外膜表面相关(图3)。电子密度物质在经处理的细胞外膜表面的沉积是肌醇六磷酸酶活性的结果(图3A、B和C)。C．肌醇六磷酸酶的最佳pH

最初的确定反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶最佳pH的实验是整体细胞进行的。在pH4.0-5.5之间，肌醇六磷酸酶活性最佳。第二个pH曲线是以MgCl₂细胞提取液绘制的(图5)。用无菌水洗两次100ml过夜培养物细胞，以0.3体积的0.2M MgCl₂水溶液重悬细胞并在0℃孵育过夜。离心澄清溶液，得到的提取物用于肌醇六磷酸酶测定。四种不同的缓冲系统用以覆盖以下pH范围：甘氨酸(pH1.5-3.0)，甲酸(pH3.0-4.0)，乙酸(pH4.0-5.5)和琥珀酸(pH5.5-6.5)。D．肌醇六磷酸酶最适温度

在pH5.0(0.1M乙酸钠缓冲液)下，用MgCl₂细胞提取液测定反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的最适温度。在37-55℃范围内，此酶保留50％的活性(图6)。E．离子和底物浓度对肌醇六磷酸酶活性的影响

在pH5.0(0.1M乙酸钠缓冲液)时，测定了各种离子(10mM)和底物浓度对全细胞肌醇六磷酸酶活性的影响。Ca⁺⁺,Na⁺,K⁺和Mg⁺⁺可刺激肌醇六磷酸酶活性，而Fe⁺⁺,Zn⁺⁺和Mn⁺⁺抑制其活性，Co⁺⁺和Ni⁺⁺对其活性无影响(图7)。底物浓度对反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)MgCl₂细胞提取液的影响列于图8。F．分子量

通过酶谱分析测定了反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶分子大小。10倍浓缩的粗MgCl₂提取物粗制品与20μl上样缓冲液(Laemmli,1970)在微量离心管中混合，此离心管于沸水浴中放置5分钟。变性的MgCl₂抽提液在10％分离胶上进行分析，分离胶上方为4％堆积胶(Laemmli,1970)电泳后，将凝胶浸入1％Triton X-100中室温下放置1小时并在0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)中4℃放置1小时以复性肌醇六磷酸酶。将凝胶在含有4％肌醇六磷酸钠的0.1M乙酸钠缓冲液中(pH5.0)中孵育16小时以检测肌醇六磷酸酶的活性。用实施例2中描述的肌醇六磷酸酶平板测定法，以氯化钴和钼酸铵/矾酸铵染色程序处理凝胶。观察到一条明显的活性条带，相当于分子量约35-45kDa。

                      实施例4从反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)中克隆肌醇六磷酸酶基因(phyA)A．分离肌醇六磷酸酶阳性大肠杆菌克隆

根据发表的程序(Hu等，1991；Sambrook等，1989)，制备了反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的基因组文库。利用改良的Priefer等(1984)描述的方法，从反刍月形单胞菌JY35(ATCC55785)过夜培养物中提取基因组DNA。反刍月形单胞菌JY35(ATCC55785)的基因组被Sau3A部分消化并用凝胶纯化以产生2-10kb的DNA片段。将BamHⅠ切割的、去磷酸化的pUC18与反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)Sau3A基因组DNA片段相连以构建基因组文库。将连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Gibco BRL,Mississauga,ON)并且在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB筛选琼脂上筛选6000个带有插入克隆的肌醇六磷酸酶活性(透明区)，LB筛选琼脂包含有LB培养基，1.0％肌醇六磷酸钠(过滤除菌)，100mM HEPES(pH6.0-6.5)，及0.2％CaCl₂。肌醇六磷酸酶阳性的SrP.2被分离到并且其肌醇六磷酸酶通过酶测定得以证实(图10)。在培养基和大肠杆菌细胞相关部分都检测到了很高的肌醇六磷酸酶活性(表3)。从克隆SrP.2分离到的质粒DNA带有一个5.5kb的质粒，命名为pSrP.2，包含有2.7kbSau3A插入片段的pUC18组成。B．源于反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)2.7kb插入片段的确证

pSrP.2中的源于反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的2.7kb的插入通过Southern印迹杂交(Sambrook等，1989)得以证实。从反刍月形单胞菌分离的基因组DNA用EcoRⅠ或HindⅢ酶切后，在0.8％琼脂糖凝胶上分开。转移到Zeta-probe膜上后(BioRad Laboratones)，在严格条件下(2×SSC,65℃)与地高辛标记的pSrP.2中的2.7kb片段杂交过夜。(DIG DNA标记和检测试剂盒，Boehringer MannheimCanada Ltd.,Laval,PQ)。印迹以2×SSC在室温下洗两次；0.1％SDS中放置5分钟以0.1×SSC洗两次；0.1％SDS在65℃作用20分钟。根据DIG DNA标记和检测试剂盒提供的方法对印迹显色(BoehringerMannheim Canada Ltd)。

探针与一个14kb HindⅢ(图11)和一个23kb EcoRⅠ(数据未显示)的基因组DNA片段反应并且证明2.7kb片段源自反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)及基因组只存在有一个同源序列。与反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)的2.7kb片段同源的拷贝也存在于反刍月形单胞菌HD86,HD141和HD4的基因组中(数据未显示)。然而反刍月形单胞菌HD86(9-和23-kb EcoRⅠ片段)和反刍月形单胞菌HD4(3-kb EcoRⅠ片段和一个20kb HindⅢ片段)中存在着限制性酶切片段多态性。来自pSrP.2的2.7kb的标记片段不能与从普雷氏菌46/5²；大肠杆菌DH5α或无花果曲霉NRRL 3135的基因组DNA杂交(数据未显示)。

                      实施例5反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶基因的特征描述A．肌醇六磷酸酶基因克隆证据

以质粒pUC18和pSrP.2分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Gibco BRL Mississauga,ON)。产生的氨苄青霉素转化子用于在LB肌醇六磷酸酶检测琼脂上测定肌醇六磷酸酶活性。只有转化了pSrP.2的大肠杆菌DH5α细胞能够在LB肌醇六磷酸酶筛选琼脂上产生透明区。B．pSrP.2的限制性和删除分析

限制性酶和删除分析表明肌醇六磷酸酶基因位于2.7kb的Sau3A插入片段上(Ausubel等，1990；Sambrook等，1989)。携带有质粒pSrP.2ΔSph1，是通过从pSrP.2上删除1.4kb的Sph1片段得到的，它缺乏肌醇六磷酸酶活性(图12和图13，表3)。C．酶谱分析

酶谱分析确定大肠杆菌DH5α(pSrP.2)表达的肌醇六磷酸酶的分子量。1ml的过夜培养物转至一个1.5ml微量离心管中。离心收获细胞并用0.1M乙酸钠(pH5.5)洗涤细胞。细胞沉淀重悬于80μl上样缓冲液中(Laemmli,1970)，并且微量离心管在沸水浴中放置5分钟。得到的细胞抽提物在10％分离凝胶上进行SDS-PAGE分离，分离胶上层为4％堆积胶(Laemmli,1970)并以实施例3F描述的方法，染胶以测定肌醇六磷酸酶活性。观察到单一的明显活性带，相当于分子量约37kDa(图14,A泳道)。在大肠杆菌DH5α(pSrP.2ΔSph1)细胞未观察到相应的活性带(图14,B泳道)。D.pSrP.2的DNA序列分析

pSrP.2中的2.7kb片段的全序列被测定。制备的用于DNA测序的样品通过用Taq DyeDeoxy^TM终止于循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)在Applied Biosystems的Model 373A DNA测序系统(Applied Biosystems,Inc.,Mississauga,ON)上进行分析。用Wizard^TM minipreps DNA纯化系统(Promega Corp.,Madison,WI)从过夜培养的大肠杆菌DH5α(pSrP.2)中提取模板DNA。引物步行法产出了互相重叠的序列。用MacDNASIS DNA软件(HitachiSoftware Engineering Co,Ltd,San Bruno,CA)分析DNA序列数据。

测定了2.7kb插入片段的序列，DNA结构分析确定了一个读码框架(ORF2,1493-2503碱基)与2.7kb Sau3A插入片段的Sphl位点重叠而足以编码37kDa的肌醇六磷酸酶。缺失1518碱基至2.7kb Sau3A片段末端序列(pSrPr6，表3，图13)则失去肌醇六磷酸酶活性。这是通过将测序引物SrPr6(CGG GAT GCT TCT GCC AGT AT,SEQID NO.3,1518-1538碱基的反向互补序列)与M13正向引物(CGCCAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC)之间的来自pSrP.2的PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega Corp)完成的。pSrP.2的PCR产物亚克隆，引物SrPf6(1232-1252碱基，CGT CCA CGG AGTCAC CCT AC)SEQ ID NO.4和M13反向引物(AGC GGA TAA CAATTT CAC ACA GGA)之间的序列包括ORF2及Sphl切割上游的252个碱基仍具有肌醇六磷酸酶活性(表3，图13)。

反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶基因(phyA)的序列和翻译示于图15。ORF2的翻译将导致一个346氨基酸多肽的表达，预测其分子量为39.6kDa(图15)。起始的31个残基为典型的原核信号序列，包含a碱性N-末端和中间疏水核心(von Heijne,1986)。运用von Heijne(1986)方法预测的信号肽酶切割位点很可能发生在Ala²⁸或Pro³¹之前。通过测定凝胶纯化的源于DH5α(pSrPf6)培养上清的N-末端氨基酸序列得以证实(图15)。分泌型的成熟蛋白可能的质量为36.5kDa。

与MasDNASIS SWISSPROT数据库中已知蛋白序列相比，PhyA氨基酸与已发表的序列无明显的相似性，包括黑曲霉肌醇六磷酸酶基因phyA和phyB。

                      实施例6大肠杆菌表达的phyA产品的部分纯化和特征描述

从大肠杆菌(pSrPf6)过夜培养物中制备的无细胞上清以3∶1(v/v)与Ni⁺⁺-NTA琼脂糖混合，后者以0.1M Tris(pH7.9),0.3M NaCl缓冲液预平衡过。混合物在室温下孵育0.5小时并以0.1MTris(pH7.9),0.3M NaCl缓冲液洗3次。以1体积的0.1M乙酸钠(pH5.0),0.3M NaCl洗涤树脂以洗脱肌醇六磷酸酶。当在SDS-PAGE凝胶上分离并以考马斯亮蓝染色时，70％以上的洗脱蛋白形成一条37kDa的蛋白带。酶谱及N端氨基酸序列分析证实了37-kDa条带与克隆的反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)phyA编码的肌醇六磷酸酶一致。Ni⁺⁺-NTA琼脂糖纯化的肌醇六磷酸酶特异性活性为200-400μmol释放的磷酸/分钟/mg蛋白。它比报道的纯化的无花果曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶特异性活性高2-4倍(van Gorcum等，1991,1995；van Hartingsveldt等，1993)。

                      实施例7反刍月形单胞菌phyA基因的过表达

从反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)中分离和定性phyA基因使得可用已知的方法在任一原核(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)或真核(如真菌-毕赤酵母属，糖酵母属，曲霉属，木霉属，植物-芥属，玉米(茄属)，或动物-家禽，猪或鱼)表达系统中大规模生产蛋白PhyA。下面将提供在大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和欧洲油菜中构建和表达phyA的方法。相似的方法可用于在其他原核和真核生物中表达反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶。A．反刍月形单胞菌phyA在大肠杆菌中的克隆-特定的表达构建体

一个表达构建体被构建，其中编码成熟PhyA的区域与tac启动子转录上融合在一起(Brosius等，1985)。此启动子序列可被在大肠杆菌中提供高效表达的其他启动子替代。此表达构建体通过转化被导入大肠杆菌细胞。

ⅰ．大肠杆菌表达载体的构建

很多以tac或相关启动子为基础的大肠杆菌表达载体都商品化了。此实施例中，构建体从Pharmacia生物公司的pKK 223-3(Uppsala,Sweden)制备而来。编码成熟PhyA的phyA区域(除掉信号肽后多肽被分泌)被寡核苷酸引物MATE2(GC GAA TTC ATG GCC AAG GCGCCG GAG CAG AC)(SEQ ID NO.5)和M13反向引物扩增。寡核苷酸MATE2(SEQ ID NO.5)的末端设计有合适的限制性位点使扩增产物直接装配入pKK 223-3。以MATE2(SEQ ID NO.5)和M13反向引物扩增的phyA区域被EcoRⅠ和SmaⅠ消化并与被同样切割的pKK223-3相连接。

ⅱ．大肠杆菌的转化和PhyA的表达

pKK 223-3∷phyA连接混合物用以转化大肠杆菌感受态细胞。适于高水平表达蛋白的菌株如SG 13009,CAG 926或CAG 929(如pREP4一类质粒上携带lacl基因)被利用。将转化的细胞涂于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂上并在37℃孵育过夜。通过提取pDNA并将pDNA进行琼脂糖凝胶电泳和限制性酶切分析，筛选氨苄抗性克隆以得到所要的pKK 223-3∷phyA构建体。阳性克隆可进一步通过PCR和DNA序列分析验证。

反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶在转化的大肠杆菌的表达可以下述方法检测，首先在含有适当的抗生素选择物的合适的液体培养基(如LB或2×YT)中37℃剧烈通气状况下培养细菌直至光密度(600nm处)为0.5-1.0。通过将终浓度为0.1-2mM的IPTG加入到培养基中以诱导tac启动子。细胞继续培养2-4小时并离心收集之。蛋白的表达通过SDS-PAGE,Western印迹/免疫检测技术被监测。通过破碎(如超声处理或机械破碎)大肠杆菌细胞以提取表达的PhyA。PhyA包涵体可通过离心收获并溶于1-2％SDS。SDS可通过透析、电洗脱或超滤除掉。制备的细胞裂解物中的肌醇六磷酸酶活性可以实施例2中描述的标准方法进行测定。B．反刍月形单胞菌phyA在巴斯德毕赤酵母中的克隆-特定的表达构建体

一个表达构建体的构建，其中的编码成熟PhyA的区域与巴斯德毕赤酵母表达载体的分泌信号序列转录上融合(Pichia Expression KitInstruction Manual,Invitrogen Corporation,San Diego,CA)以使表达的反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶为分泌形式。启动子和分泌信号序列可被在毕赤酵母属中提供高效表达的其他启动子替代。此表达构建体通过转化被导入巴斯德毕赤酵母细胞。

ⅰ．巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

很多以aox1启动子和α-因子或phol信号序列为基础的巴斯德毕赤酵母表达载体都商品化了。在此实施例中，构建体是从Invitrogen公司的pPIC9制备而来。编码成熟PhyA的phyA区域被寡核苷酸引物MATE(GC GAA TTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(SEQ ID NO.6)和M13反向引物扩增。寡核苷酸MATE(SEQ ID NO.6)的末端设计有合适的限制性酶切位点以使扩增产物直接装配到pPIC9。以MATE(SEQ ID NO.6)和M13反向引物扩增的phyA区被EcoRⅠ消化并与相似切割的pPIC9相连接。

ⅱ．巴斯德毕赤酵母的转化和PhyA表达

pPIC9∷phyA连接混合物用以转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化的细胞涂于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂上并与37℃孵育过夜。通过提取pDNA并将pDNA进行琼脂糖凝胶电泳和限制性酶切分析，筛选氨苄阳性克隆以得到所要的pPIC9∷phyA构建体。阳性克隆进一步通过PCR和DNA序列分析验证。从1L携带所要的pPIC9∷phyA构建体的大肠杆菌克隆过夜培养物中制备质粒DNA。以BglⅡ消化pDNA并通过琼脂糖凝胶电泳分析以证实载体消化完全。消化的pDNA经过酚：氯仿抽提，乙醇沉淀后，以1μg/ml的终浓度重悬于无菌蒸馏水中。为了转化，巴斯德毕赤酵母GS115或KM71细胞在YPD培养基中于30℃培养24小时。离心收集100μl培养物中的细胞并将之悬于100μl转化缓冲液中(0.1M LiCl,0.1M DTT,45％聚乙二醇4000),100μl转化缓冲液中含有10μg鲑精DNA和10μg线性化的pPIC9∷phyA。此混合物于37℃孵育1小时，涂于巴斯德毕赤酵母基本琼脂培养基上并孵育2-5天。将在基本培养基上生长的克隆划线纯化并用PCR和Southern印迹杂交的方法分析整合phyA是否存在。

反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶在转化的巴斯德毕赤酵母细胞中的表达可以下列方法检测，在合适培养基中(如缓冲性复合甘油培养基如BMGY)在剧烈通气状况下于30℃培养直至培养物的光密度(600nm)达到2-6。收获细胞并将之以OD₆₀₀=1.0重悬于诱导培养基(如缓冲性复合甲醇培养基，BMMY)并进一步孵育3-5天。分别收集细胞和无细胞培养上清，并以酶测定，SDS-PAGE和Western印迹/免疫检测等技术监控蛋白表达情况。C．反刍月形单胞菌phyA在巴斯德毕赤酵母中的克隆-特定表达载体-一个进一步实施例

一个表达载体的构建，其中编码成熟PhyA的区域与巴斯德毕赤酵母表达载体(如，Pichia Expression Kit Instruction Manual,Invitrogen公司，San Diego,CA)上的分泌信号序列在转录上融合以使表达的反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶为分泌形式。启动子和分泌信号序列可被能在毕赤酵母属中提供高效表达的其他启动子替代。此表达构建体通过转化被导入巴斯德毕赤酵母细胞。

ⅰ．巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

很多以aox1启动子和α-因子或pho1信号序列为基础的巴斯德毕赤酵母表达载体都已商品化。在此实施例中的构建体是以Invitrogen公司的pPICZαA制备而来。编码成熟phyA的phyA区域(即，信号肽去除后的分泌多肽)被寡核苷酸引物MATE(GC GAA TTC GCC AAGGCG CCG GAG CAG AC SEQ ID NO.6)和M13反向引物扩增。寡核苷酸MATE(SEQ ID NO.6)的末端设计有EcoRⅠ限制性位点以使扩增产物直接装配到pPICZαA中。以MATE(SEQ ID NO.6)和M13反向引物扩增的phyA区域被EcoRⅠ消化与相似相割的pPICZαA相连接。

ⅱ．巴斯德毕赤酵母的转化

pPICZαA∷phyA连接混合物用以转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化的细菌涂于含有Zeocin(25mg/ml)的LB琼脂上并于37℃孵育过夜。通过pDNA并将之进行琼脂糖凝胶电泳和限制性分析筛选Zeocin抗性的克隆以获得所要的pPICZαA∷phyA构建体。阳性克隆进一步进行PCR和DNA序列分析验证。从1L携带有所要pPICZαA∷phyA构建体的大肠杆菌过夜培养物中制备质粒DNA。以BglⅡ消化pDNA并通过琼脂糖凝胶电泳证实载体消化完全。消化的pDNA经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀后以1μg/μl终浓度重悬于无菌蒸馏水中。

为了转化，接种有巴斯德毕赤酵母GS115细胞的50ml YPD肉汤在28℃250RPM孵育1天。随后，将5ml的1天培养物接种到50ml新鲜YPD肉汤中。培养物于28℃,250RPM扩增过夜。次日早上，将5ml培养物接种50ml新鲜的YPD肉汤。培养物继续在28℃250RPM孵育直至OD₆₀₀值达到约1.2(约6小时)。离心收集20ml新鲜培养物中的酵母细胞，以室温下含10mM Tris,1mM EDTA,0.1M LiCl,0.1M dTT的缓冲液(pH7.4)洗涤细胞并用1ml同样的缓冲液重悬细胞。在30℃孵育1小时后，用1ml冰冷的水和1ml冰冷的1M山梨醇分别洗涤细胞1次。细胞重悬于160μl冰冷的1M山梨醇(细胞浓度约为10¹⁰细胞/ml)。线性化的pPICZαA∷phyA(5-10μg)与80μl细胞混合，加于预冷的电穿孔杯中(电极间距离0.2cm)并在冰上孵育5分钟。以Bio-Rad Gene Pulser^TM对小杯使以高压脉冲(1.5kV,25μF,200 Ohms)。脉冲后立即向小杯中加入1ml冰冷的1M山梨醇，随后将之在30℃孵育2小时。细胞悬液(100-200μl/平板)涂于含Zeocin(100μg/ml)YPD琼脂培养基上并于30℃孵育2-4天。在选择培养基上生长的克隆划线纯化并以PCR和/或Southern印迹杂交检测整合的phyA是否存在。

ⅲ．反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶基因在巴斯德毕赤酵母的表达

反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶基因在转化的巴斯德毕赤酵母细胞中表达的检测可以下述方法进行，转化细胞在缓冲性复合甘油培养基中(如缓冲性复合甘油培养基BMGY,Pichia Expression KitInstruction Manual)于28℃,250 RPM培养过夜后被转移到诱导培养基(如缓冲性复合甘油培养基，BMMY)中。从BMGY中收获的细胞以BMMY培养基洗涤1次，并以OD₆₀₀=1.0重悬于BMMY且在28℃,250RPM继续培养3-5天。每隔24小时加1次甲醇(0.005体积)。分别收集细胞和无细胞上清以测定肌醇六磷酸酶活性。

在BMMY培养基中培养96小时后，16个巴斯德毕赤酵母pPICZαA∷MATE转化子用以检测肌醇六磷酸酶活性。活性的最大的转化子命名为克隆17被选做进一步研究。在9天中监测巴斯德毕赤酵母pPICZαA∷MATE克隆17和阴性克隆(巴斯德毕赤酵母pPICZαA)的生长和肌醇六磷酸酶产生情况。在10ml BMGY(甘油)培养基中过夜培养分离物(28℃,250RPM)以制备促酵物。细胞收获并通过将细胞以OD₆₀₀=2.5重悬于50ml BMMY(甲醇)培养基而制备双份培养物。得到的培养物被转到500ml三角瓶中并在28℃ 250RPM下孵育。每隔24小时向培养基中加入终浓度为0.5％甲醇。在实验过程中测量光密度和肌醇六磷酸酶活性。结果列于表4。只在携带有反刍月形单胞菌phyA基因的培养物中检测到了肌醇六磷酸酶活性。在培养了210.5小时后，这些培养物产生的肌醇六磷酸酶高达22.5单位/ml。

通过改进诱导方法和培养基组合物，摇动三角瓶培养物的肌醇六磷酸酶活性有所提高。通过提高诱导培养基中最初细胞密度(OD₆₁₀=36.0)，克隆17的肌醇六磷酸酶活性有很大改进。在培养接近4天时(91.5h)总体培养物和无细胞上清样品的肌醇六磷酸酶活性分别在40单位/ml和20单位/ml以上。这些培养物的光密度(OD₆₁₀)在62和69之间。实验结果表明甲醇诱导时培养物量越大，重组肌醇六磷酸酶的产量越大。在富含氧的、最佳生长条件下紧密控制的发酵罐系统中培养的毕赤酵母属，其生物量可高达150g/L(干重)或光学密度为1500。

毕赤酵母属肌醇六磷酸酶的产量可通过在培养基中加入Tween-80得以提高。以前有报道，表面活性物质可影响碳黑曲霉(AspergillusCarbonarius)的肌醇六磷酸酶的产量(Al-Asheh和Duvnjak,1994)。将0,0.02,0.1或0.5％的Tween-80加入到培养巴斯德毕赤酵母pPICZαA∷MATE克隆17的培养中对肌醇六磷酸酶产量的影响列于表5。从培养了2天的YPD培养物中收获细胞并重悬于BMMY中(OD₆₁₀=8.3)。每种浓度的Tween-80准备三份并于28℃,250RPM孵育。每天往三角瓶中加入甲醇(0.005体积)。含有较高浓度Tween-80的培养基中肌醇六磷酸酶活性升高更快。而且，当较高浓度Tween-80使用时，大部分的肌醇六磷酸酶活性存在于上清。在补充0.5％Tween-80的BMMY培养基中培养克隆17 9天后，摇动三角瓶中培养物的肌醇六磷酸酶产量可高达298单位/ml。

SDS-PAGE分析细胞和上清中的蛋白以证实由巴斯德毕赤酵母产生的PhyA。当5μl的上清在12％SDS-PAGE凝胶上分离时，可明显看到一条37kDa蛋白带。细胞蛋白样品中也可看到一条37kDa的带而其量不到相应的上清中量的10％。除了PhyA，克隆17的上清中有很少其他蛋白(毕赤酵母属表达的有用的特征)。重组PhyA蛋白占分泌蛋白的95％以上(从SDS-PAGE凝胶电泳估计)。在阴性对照培养物(巴斯德毕赤酵母pPICZαA)的上清或细胞中都没有37kDa的蛋白带。

表达反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶(PhyA)重组巴斯德毕赤酵母细胞的摇动三角瓶实验表明了这种蛋白生产系统的潜力。通过在发酵罐中培养和诱导克隆17，肌醇六磷酸酶的产量有很明显的提高。通过进一步筛选独立的转化子或使用多拷贝载体系统增加基因拷贝数从而使肌醇六磷酸酶的产量还会有所增加。毕赤酵母属中1/10-1/100的转化子发生自发的多质粒整合。通过控制肌醇六磷酸酶基因拷贝数量和发酵参数，有望使肌醇六磷酸酶产生提高10倍(如3000单位/ml)。这会使其生产水平可与商业化无花果曲霉肌醇六磷酸酶生产系统相比。据说这些系数的产量约为3000000单位(释放的μmol P_i/分钟)肌醇六磷酸酶活性/L培养物。

ⅳ．重组反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶(PhyA)对谷物底物的活性

检测了由巴斯德毕赤酵母生产的反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶使谷物释放的磷。谷物饲料被磨碎并通过一个网孔筛以得到大小为1-3mm的颗粒。将磨碎的谷物(0.5g)称重后加入灭菌的15ml Falcon管中，并将此管中加入2ml 0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)。加入肌醇六磷酸酶后，反应混合物于37℃孵育。通过测量上清中磷酸量确定释放的磷酸。为测量背景磷酸，制备反应混合物后立即加入5％TCA终止反应。所有实验都有三份。

在乙酸缓冲液中孵育谷物导致随着时间的进行，磷的释放量也增加(表6)。尽管肌醇六磷酸酶的加入会明显增加磷的释放量，磷释放率随时间进行减慢。

加入到孵育混合物中的肌醇六磷酸酶的浓度影响磷的释放量。将肌醇六磷酸酶浓度从0.08单位提高到0.48单位/g谷物导致上清中磷水平的增加(表7)。应注意到，将肌醇六磷酸酶的浓度从0.32提高到0.48单位则释放磷的增加量微乎其微。D．反刍月形单胞菌phyA基因在欧洲油菜种子中的克隆-特定表达构建体

已发展了针对多种单子叶和双子叶作物的转化和基因表达方法。在此实施例中，构建了一个反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶表达构建体，其中编码成熟PhyA的区域与一个油质蛋白编码基因融合以使目的种子油体专门表达反刍月形单胞菌肌醇六磷酸酶。启动子和/或分泌信号序列可被能够在欧洲油菜或其他转化植物中提供高效表达的启动子取代。此表达构建体通过土壤细菌介导的转化导入欧洲油菜细胞。

ⅰ．欧洲油菜表达载体的构建

文献(Gelvin等，1993)描述了多种在欧洲油菜起作用的表达载体。在此实施例中，用编码phyA成熟CDS的片段替代pCGOBPGUS(van Rooijen和Moloney,1994)中的大肠杆菌的β-葡糖苷酸酶从而制备构建体。这可通过将pCGOBPGUS的PstⅠ KpnⅠ片段亚克隆到PstⅠKpnⅠ消化的pUCBM20上完成，pCGOBPGUS包含有油质蛋白启动子∷油质蛋白CDS∷β-葡糖苷酸酶∷NOS区，pUCBM20为Boehringer Mannheim Canada,Laval,PQ的产品。此质粒被称为pBMOBPGUS。编码成熟PhyA的phyA区域被寡核苷酸引物MATN(GA GGA TCC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(SEQ IDNO.7)和M13反向引物扩增。寡核苷酸MATN(SEQ ID NO.7)的末端设计有合适的限制性酶切位点使扩增产物直接装配到消化后的pBMOBPGUS中。以MATN(SEQ ID NO.7)和M13反向引物扩增的phyA片段被NcoⅠSstⅠ消化并被连入以相似切割的pBMOBPGUS以产生质粒pBMOBPphyA。欧洲油菜表达载体，pCGOBPphyA，是通过用pBMOBPphyA的PstⅠKpnⅠ片段替代pCGOBPGUS的PstⅠKpnⅠ片段制备成的，pBMOBPphyA包含有油质蛋白启动子∷油质蛋白CDS∷phyA CDS∷NOS片段。

ⅱ．欧洲油菜的转化及PhyA的表达

根据van Rooijen和Moloney(1994)描述的方法制备转基因欧洲油菜。用电穿孔法将pCGOBPphyA转入根癌土壤杆菌EHA101(pCGOBPphyA)。在外植体上使转基因植物再生，外植体植根于含有20μg/ml卡那霉素的无激素MS培养基中。测定幼小植物体的NPTⅡ活性，生长至成熟，自花传粉并结种子。收集来个单个转化子的种子，部分种子用以测定其肌醇六磷酸酶活性并与未转化植物的种子相比较。用具最高活性肌醇六磷酸酶活性的克隆种子繁殖第二代植物(T2)。选择NPTⅡ为纯合子(phyA也为纯合子)的T2植物种子并用以大量繁殖植物(T3),T3能够产生最高量的肌醇六磷酸酶。

                      实施例8其他微生物中肌醇六磷酸酶相关基因的鉴定

为了鉴定与phyA相关的肌醇六磷酸酶基因，可用杂交分析筛选来自一个或多个目的反刍分离物的核苷酸，所用的方法为实施例4B所描述的技术(Sambrook,1989；Ausubel,1990)，探针为phyA(SEQID NO.1)或其一部分。用已知的方法克隆相关核苷酸。为了提高分析的敏感性，当被筛选的生物基因组比较复杂时，可用放射性同位素(即32P)。多聚酶链式反应(PCR)可用于鉴定phyA相关基因。用SEQ IDNO.1的序列设计的寡核苷酸引物进行PCR(或变异PCR如RT-PCR)以优先扩增纯的或混合培养物中的相关序列。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳观察并用已知方法克隆。可用这些技术检测多种材料，如细胞，克隆，斑，及提取的核酸(如DNA、RNA)，以观察相关序列的存在情况。另外，可用PhyA(SEQ ID NO.2)特异的抗体的免疫检测技术以筛选整个细胞或提取的目的蛋白以观察相关的肌醇六磷酸酶的存在情况。表1．瘤胃细菌的肌醇六磷酸酶活性

肌醇六磷酸酶活性	微生物	检测分离物的数量
			很强强中等阴性	普雷沃氏菌类反刍月形单胞菌栖瘤胃普雷沃氏菌反刍月形单胞菌芽孢杆菌类埃氏巨球形菌栖瘤胃普雷沃氏菌反刍月形单胞菌密螺旋体菌解脂厌氧弧菌芽孢杆菌类溶纤维丁酸弧菌梭菌类粪球菌类肠球菌类真杆菌类产琥珀酸丝状杆菌梭杆菌类多对毛螺菌乳杆菌类埃氏巨球菌消化链球菌类栖瘤胃普雷沃氏菌嗜淀粉瘤胃杆菌白色瘤胃球菌生黄瘤胃球菌反刍月形单胞菌牛链球菌米氏链球菌葡萄球菌溶糊精琥珀酸弧菌密螺旋体菌类不明的筛选的总分离物	1114131763712447134783420714147104481612128345

表2．所选瘤胃细菌分离物的肌醇六磷酸酶活性

分离物	肌醇六磷酸酶活性(mU*/ml)
		反刍月形单胞菌JY35反刍月形单胞菌KJ118反刍月形单胞菌BS131反刍月形单胞菌HD141反刍月形单胞菌HD86反刍月形单胞菌JY135反刍月形单胞菌D反刍月形单胞菌HD16反刍月形单胞菌BS114反刍月形单胞菌JY4普雷沃氏菌46/55栖瘤胃普雷沃氏菌JY97栖瘤胃普雷沃氏菌KJ182栖瘤胃普雷沃氏菌JY106埃氏巨球形菌JY91	646485460361286215695247273216861495

*U=释放的P_i微摩尔数/分钟表3．反刍月形单胞菌¹肌醇六磷酸酶在重组大肠杆菌DH5α中的表达

株	样品组成	单位2/ml	比活性(单位/mg蛋白)
				大肠杆菌(pSrP.2)大肠杆菌(pSrPf6)大肠杆菌(pSrP.2 Sphl)	细胞上清细胞上清细胞上清	0.30(0.08)30.308(0.21)0.91(0.41)5.10(058)ND4ND	1.56(0.41)2.64(1.51)6.42(0.64)22.83(1.67)NDND

¹反刍月形单胞菌JY35是一种杆状、新月性、专性厌食微生物，发酵葡萄糖过程中产生丙酸，能发酵乳糖，不发酵甘油，甘露醇(见Bergey′s系统细菌学手册，John G.Holt编辑，Williams and Wilkins,Baltimore,1984)

²单位=释放P_i的微摩尔数/分钟

³括号内的数字为标准误

⁴ND=未被检测表4．转化了pPICZαA(阴性对照)或pPICZαA∷MATE(克隆17)

的巴斯德毕赤酵母细胞的生长和肌醇六磷酸酶活性

培养物	时间(小时)	光密度(610mm)	肌醇六磷酸酶活性(微摩尔数/分钟/毫升)
								培养物	上清
巴斯德毕赤酵母(pPICZαA)巴斯德毕赤酵母(pPICZαA∷MATE)	0.020.542.568.091.0138.5210.50.020.542.568.091.0138.5210.5	2.610.117.817.028.539.346.72.511.313.912.915.718.318.7	0.00.00.00.00.00.00.00.01.94.48.04.712.622.5	0.00.00.00.00.00.00.00.00.11.52.70.55.312.5

表5．Tween-80浓度对转化有pPICZαA∷MATE(克隆17)的巴斯德

毕赤酵母的生长和肌醇六磷酸酶活性的影响

时间(天)	样品(％Tween-80)	光密度(610nm)	肌醇六磷酸酶活性微摩尔数/分钟/毫升		上清/培养物活性
									培养物	上清
248	0.00.020.10.50.00.020.10.50.00.020.10.5	24.324.425.124.431.231.031.829.232.830.433.933.8	4.14.85.24.96.98.210.310.310.614.820.222.1	2.22.73.23.24.75.56.99.15.99.817.218.9	0.550.570.610.650.690.670.670.880.550.670.860.86

表6．孵育时间及重组反刍月形单胞菌JY53肌醇六磷酸酶

(2单位/克谷物)对从谷物中释放磷酸的影响

样品	孵育时间(小时)	磷酸浓度(微摩尔数/毫升)
			无肌醇六磷酸酶肌醇六磷酸酶	1234512345	0.851.722.563.774.354.766.837.728.418.49

表7．重组反刍月形单胞菌JY35肌醇六磷酸酶浓度对从谷物中

释放磷酸的影响

肌醇六磷酸酶活性(单位/克谷物)	肌醇六磷酸酶浓度(微摩尔数/克玉米)
		0.080.160.240.320.400.480.560.640.72	11.814.822.523.023.223.823.823.623.8

                  参考文献

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此处列出的发表物体现了与本发明相关的领域内熟练技术人员的技术水平。此处的发表物通过参考文献连为一体如同每一篇发表物都通过参考文献显示出来。

尽管前述发明通过举例和实施例的方式进行了详细地描述，举例和实施例是为了清晰和便于理解，很明显，某些变化和改良在权利要求范围之内。

                            序列表(1)一般信息

(ⅰ)申请人：Cheng,Kuo-Joan

            Selinger,Leonard B.

            Yanke,Lindsey J.

            Bae,Hee-Dong

            Zhou,Lu Ming

            Forsberg,Cecil W.

(ⅱ)发明题目：编码反刍微生物肌醇六磷酸酶的DNA序列

(ⅲ)序列数：7

(ⅵ)通讯地址

   (A)收信人：McKay-Carey&Company

   (B)街道：2125,10155-102 St.

   (C)城市：Edmonton

   (D)州：Alberta

   (E)国家：加拿大

   (F)邮编：T5J 4G8

(ⅴ)计算机可读形式：

   (A)介质形式：软盘

   (B)计算机：IBM PC兼容机

   (C)可操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：PatentIn Release #1.0 Version #1.30

(ⅵ)目前申请数据：

   (A)申请号：

   (B)入档日期：May 23,1997

   (C)分类：

(ⅷ)律师/代理人信息：

   (A)姓名：Mary Jane Mckay-Carey

   (B)注册号码：

   (C)参考/备案号：37003WO0

(ⅸ)联系信息：

   (A)电话：(403)424-0222

   (B)传真：(403)421-0834(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：1401个碱基对

   (B)类型：核苷酸

   (C)链型：双链

   (D)拓扑学：环性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组的)

(ⅲ)推断的：不是

(ⅳ)反义的：不是

(ⅵ)最初出处：

   (A)生物：反刍月形单胞菌

   (B)株：JY35

(ⅶ)最近出处：

   (A)文库：基因组DNA文库

   (B)克隆：pSrP.2

(ⅳ)特征：

   (A)名称/关键词：CDS

   (B)位置：231-1268

   (C)鉴定方法：实验的

   (D)其他信息：/密码子_起始=231/功能=“肌醇六磷酸脱磷酸作用”/产物=“肌醇六磷酸酶”/证据=实验的/基因=“phyA”/数量=1/标准名字=“肌醇六磷酸磷酸水解酶”/引用名=([1])

(ⅳ)特征：

    (A)名称/关键词：信号肽

(B)位置：231..311

(C)鉴定方法：实验

(D)其他信息：/密码子_起始=1/功能=“肌醇六磷酸酶分泌”/产物=“信号肽”/证据=实验的/引用=([1])

(ⅳ)特征：

   (A)名称/关键词：成熟肽

   (B)位置：312..1268

   (C)鉴定方法：实验的

   (D)其他信息：/密码子_起始=312/产物=“肌醇六磷酸酶”/证据=实验的/数量=2/引用=([1])

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CGTCCACGGA GTCACCCTAC TATACGACGT ATGTGAAGTT CACGTCGAAG TTCTAGGGAA   60TCACCGATTC GTGCAGGATT TTACCACTTC CTGTTGAAGC GGATGAGAAG GGGAACCGCG  120AAGCGGTGGA AGAGGTGCTG CACGACGGAC GATCGCGCTG AATGAATCAG TGCTTCCTAA  180CTATTGGGAT TCCGCGCAGA CGCGCGGATG GAGTAAAGGA GTAAGTTGTT ATG AAA     236

                                                   Met Lys

                                                   -27TAC TGG CAG AAG CAT GCC GTT CTT TGT AGT CTC TTG GTC GGC GCA TCC    284Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly Ala Ser-25                 -20                 -15                 -10CTC TGG ATA CTG CCG CAG GCC GAT GCG GCC AAG GCG CCG GAG CAG ACG    332Leu Trp Ile Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu Gln Thr

            -5                    1                   5GTG ACG GAG CCC GTT GGG AGC TAC GCG CGC GCG GAG CGG CCG CAG GAC    380Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro Gln Asp

         10                  15              20TTC GAG GGC TTT GTC TGG CGC CTC GAC AAC GAC GGC AAG GAG GCG TTG   428Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Asn Asp Gly Lys Glu Ala Leu

 25                  30                  35CCG CGT AAT TTC CGC ACG TCG GCT GAC GCG CTG CGC GCG CCG GAG AAG   476Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro Glu Lys40                  45                  50                  55AAA TTC CAT CTC GAC GCC GCG TAT GTA CCG TCG CGC GAG GGC ATG GAT   524Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly Met Asp

             60                  65                  70GCA CTC CAT ATC TCG GGC AGT TCC GCA TTC ACG CCG GCG CAG CTC AAG   572Ala Leu His Ile Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln Leu Lys

         75                  80                  85AAC GTT GCC GCG AAG CTG CGG GAG AAG ACG GCT GGC CCC ATC TAC GAT   620Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro Ile Tyr Asp

     90                  95                 100GTC GAC CTA CGG CAG GAG TCG CAC GGC TAT CTC GAC GGT ATC CCC GTG   668Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly Ile Pro Val

105                 110                 115AGC TGG TAC GGC GAG CGC GAC TGG GCA AAT CTC GGC AAG AGC CAG CAT   716Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser Gln His120                 125                 130                 135GAG GCG CTC GCC GAC GAG CGG CAC CGC TTG CAC GCA GCG CTC CAT AAG   764Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu His Lys

            140                 145                 150ACG GTC TAC ATC GCG CCG CTC GGC AAG CAC AAG CTC CCC GAG GGC GGC   812Thr Val Tyr Ile Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly

        155                 160                 165GAA GTC CGC CGC GTA CAG AAG GTG CAG ACG GAA CAG GAA GTC GCC GAG   860Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val Ala Glu

    170                 175                 180GCC GCG GGG ATG CGC TAT TTC CGC ATC GCG GCG ACG GAT CAT GTC TGG   908Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg Ile Ala Ala Thr Asp His Val Trp

185                 190                 195CCA ACG CCG GAG AAC ATC GAC CGC TTC CTC GCG TTT TAC CGC ACG CTG   956Pro Thr Pro Glu Asn Ile Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg Thr Leu200                 205                 210                 215CCG CAG GAT GCG TGG CTC CAT TTC CAT TGT GAA GCC GGT GTC GGC CGC  1004Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val Gly Arg

            220                 225                 230ACG ACG GCG TTC ATG GTC ATG ACG GAT ATG CTG AAG AAC CCG TCC GTA  1052Thr Thr Ala Phe Met Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro Ser Val

        235                 240                 245TCG CTC AAG GAC ATC CTC TAT CGC CAG CAC GAG ATC GGC GGC TTT TAC   1100Ser Leu Lys Asp Ile Leu Tyr Arg Gln His Glu Ile Gly Gly Phe Tyr

    250                 255                     260TAC GGG GAG TTC CCC ATC AAG ACG AAG GAT AAA GAT AGC TGG AAG ACG   1148Tyr Gly Glu Phe Pro Ile Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp Lys Thr

265                 270                     275AAA TAT TAT AGG GAA AAG ATC GTG ATG ATC GAG CAG TTC TAC CGC TAT   1196Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys Ile Val Met Ile Glu Gln Phe Tyr Arg Tyr280                 285                     290             295GTG CAG GAG AAC CGC GCG GAT GGC TAC CAG ACG CCG TGG TCG GTC TGG   1244Val Gln Glu Asn Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser Val Trp

            300                     305             310CTC AAG AGC CAT CCG GCG AAG GCG TAAAAGCGCA GGCGGCGGCT CGGAGTCAGG  1298Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala

        315GAAATGGCGC TGCCAGCACG GGACGCGCGG CGGCGGATGC TGCGCCGGTC AGGGATGATT 1358GACGACAGCC AGAGAAGAAA GGATGGTTTT ATGAGGTGGA TCC                   1401(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：346个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑学：线型

  (ⅱ)分子类型：蛋白质

  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Lys Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly-27     -25                 -20                 -15Ala Ser Leu Trp Ile Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu

-10                 -5                    1               5Gln Thr Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro

             10                  15                  20Gln Asp Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Ash Asp Gly Lys Glu

         25                  30                  35Ala Leu Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro

     40                  45                  50Glu Lys Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly

 55                  60                  65Met Asp Ala Leu His Ile Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln70                  75                  80                  85Leu Lys Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro Ile

             90                  95                 100Tyr Asp Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly Ile

        105                 110                 115Pro Val Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser

    120                 125                 130Gln His Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu

135                 140                 145His Lys Thr Val Tyr Ile Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu150                 155                 160                 165Gly Gly Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val

            170                 175                 180Ala Glu Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg Ile Ala Ala Thr Asp His

        185                 190                 195Val Trp Pro Thr Pro Glu Asn Ile Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg

    200                 205                 210Thr Leu Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val

215                 220                 225Gly Arg Thr Thr Ala Phe Met Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro230                 235                 240                 245Ser Val Ser Leu Lys Asp Ile Leu Tyr Arg Gln His Glu Ile Gly Gly

            250                 255                 260Phe Tyr Tyr Gly Glu Phe Pro Ile Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp

        265                 270                 275Lys Thr Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys Ile Val Met Ile Glu Gln Phe Tyr

    280                 285                 290Arg Tyr Val Gln Glu Ash Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser

295                 300                 305Val Trp Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala310                 315(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：20个碱基对

   (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

  (A)描述：/desc=“寡核苷酸SrPr6”

(ⅲ)推断的：不是

(ⅳ)反义的：不是

(ⅵ)最初出处：

  (A)生物：反刍月形单胞菌

  (B)株：JY35

(ⅶ)最近出处：

  (A)文库：基因组DNA文库

  (B)克隆：pSrP.2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:CGGGATGCTT  CTGCCAGTAT                                    20(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：20个碱基对

   (B)类型：核苷酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

  (A)描述：/desc=“寡核苷酸SrPf6”

(ⅲ)推断的：不是

(ⅳ)反义的：不是

(ⅵ)最初出处：

  (A)生物：反刍月形单胞菌

  (B)株：JY35

(ⅶ)最近出处：

  (A)文库：基因组DNA文库

  (B)克隆：pSrP.2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CGTCCACGGA GTCACCCTAC                                     20(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅱ)序列特征：

  (A)长度：31个碱基对

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

  (A)描述：/desc=“寡核苷酸MATE2”

(ⅲ)推断的：不是

(ⅳ)反义的：不是

(ⅵ)最初出处：

  (A)生物：反刍月形单胞菌

  (B)株：JY35

(ⅶ)最近出处：

  (A)文库：基因组DNA文库

  (B)克隆：pSrP.2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:GCGAATTCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C                        31(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：28个碱基对

   (B)类型：核苷酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

   (A)描述：/desc=“寡核苷酸MATE”

(ⅲ)推断的：不是

(ⅳ)反义的：不是

(ⅵ)最初出处：

  (A)生物：反刍月形单胞菌

  (B)株：JY35

(ⅶ)最近出处：

  (A)文库：基因组DNA文库

  (B)克隆：pSrP.2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:GCGAATTCGC CAAGGCGCCG GAGCAGAC                            28(2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：31个碱基对

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

  (A)描述：/desc=“寡核苷酸MATN”

(ⅲ)推断的：不是

(ⅳ)反义的：不是

(ⅵ)最初出处：

  (A)生物：反刍月形单胞菌

  (B)株：JY35

(ⅶ)最近出处：

  (A)文库：基因组DNA文库

  (B)克隆：pSrP.2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:GAGGATCCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C                        31

Claims (77)

1．纯化和分离的DNA，它编码反刍微生物肌醇六磷酸酶。

2．权利要求1的纯化和分离的DNA，其中的反刍微生物是一种原核生物。

3．权利要求1纯化和分离的DNA，其中的反刍微生物可以是月形单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属或巨球形菌属。

4．权利要求1纯化和分离的DNA，其中的反刍微生物可以是反刍月形单胞菌，栖瘤胃普雷沃氏菌，布氏密螺旋体或埃氏巨球形菌。

5．权利要求1纯化和分离的DNA，其中的反刍微生物是反刍月形单胞菌。

6．权利要求1纯化和分离的DNA，其中的反刍微生物是反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)。

7．权利要求1纯化和分离的DNA，该DNA能够与包括SEQ ID NO.1核苷酸序列中至少连续25个核苷酸的探针在严格条件下杂交。

8．权利要求1纯化和分离的DNA，该肌醇六磷酸酶包含有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。

9．权利要求1纯化和分离的DNA，该DNA包含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

10．权利要求1纯化和分离的DNA，该DNA包含有SEQ ID NO.1的312-1268位核苷酸。

11．权利要求1纯化和分离的DNA，其中所编码的肌醇六磷酸酶具有以下特征：

a)其分子量为37kDa；

b)在pH3.0-6.0之间，有活性；且

c)在4-55℃温度范围，有活性。

12．权利要求11纯化和分离的DNA，其中所编码的肌醇六磷酸酶在约20-55℃时有活性。

13．权利要求11纯化和分离的DNA，其中所编码的肌醇六磷酸酶在约35-40℃时有活性。

14．权利要求11纯化和分离的DNA，其中所编码的肌醇六磷酸酶还有以下特征：

d)测量释放无机磷酸的量表明，其比活性比源自无花果曲霉NRRI3135的肌醇六磷酸酶活性高至少两倍。

15．能够在合适的宿主细胞中指导肌醇六磷酸酶表达的表达构建体，该表达构建体包含有编码反刍微生物肌醇六磷酸酶的DNA，此DNA与能与宿主相容的控制序列可操纵地连在一起。

16．权利要求15的表达构建体，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

17．权利要求15的表达构建体，其中所编码的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

18．转化有编码反刍微生物肌醇六磷酸酶的DNA的宿主细胞，因而这个宿主细胞可以表达该DNA编码的肌醇六磷酸酶。

19．权利要求18中转化的宿主细胞，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

20．权利要求18的转化的宿主细胞，其中所编码的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

21．权利要求18的转化的宿主细胞，其中的宿主细胞为真核生物。

22．权利要求18转化的宿主细胞，其中的宿主细胞为原核生物。

23．权利要求18转化的宿主细胞，其中的宿主细胞为巴斯德毕赤酵母细胞。

24．权利要求18的宿主细胞，其中的宿主细胞为枯草芽孢杆菌细胞。

25．权利要求18的宿主细胞，其中的宿主细胞为大肠杆菌细胞。

26．反刍月形单胞菌JY35(ATCC 55785)。

27．转化了编码反刍微生物肌醇六磷酸酶DNA的转基因植物，从而由该DNA所编码的肌醇六磷酸酶可由此植物表达。

28．权利要求27的转基因植物，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

29．权利要求27的转基因植物，其中所编码的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

30．一种反刍微生物肌醇六磷酸酶。

31．权利要求30的肌醇六磷酸酶，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

32．权利要求30的肌醇六磷酸酶具有以下特征：

a)分子量为37kDa；

b)在pH3.0-6.0有活性；且

c)在约4-55℃温度有活性。

33．权利要求32的肌醇六磷酸酶还具有以下特征：

d)测量释放的无机磷酸表明其比活性比无花果曲霉NRRI 3135肌醇六磷酸酶活性高至少两倍。

34．权利要求30的肌醇六磷酸酶，包含有氨基酸序列SEQ ID NO.2内的连续氨基酸残基。

35．权利要求30的肌醇六磷酸酶，包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

36．一种饲料组合物，包含有一种由反刍微生物肌醇六磷酸酶处理的饲料营养成分。

37．权利要求36的饲料组合物，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

38．权利要求36的饲料组合物，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。

39．权利要求36的饲料组合物，包含有足够量的肌醇六磷酸酶，每千克饲料组合物可提供高达约2000单位(释放磷酸的μmol数/分钟)的肌醇六磷酸酶活性。

40．权利要求36的饲料组合物，包含有足够量的肌醇六磷酸酶活性，每千克饲料组合物可提供高达约1000单位的肌醇六磷酸酶活性。

41．权利要求36的饲料组合物，包含有足够数量的肌醇六磷酸酶，每千克饲料组合物可提供约50-800单位的肌醇六磷酸酶活性。

42．权利要求36的饲料组合物，包含有足够数量的肌醇六磷酸酶，每千克饲料组合物可提供约300-800单位的肌醇六磷酸酶活性。

43．一种饲料添加剂，包含有冷冻干燥微生物制品，该微生物在正常生长条件下表达反刍微生物肌醇六磷酸酶。

44．权利要求43的饲料添加剂，其中所述的微生物为反刍月形单胞菌。

45．权利要求43的饲料添加剂，其中的微生物是转化有编码反刍微生物肌醇六磷酸酶DNA的重组微生物。

46．权利要求45的饲料添加剂，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

47．权利要求45的饲料添加剂，其中表达的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

48．处理饲料营养成分的饲料添加剂，该饲料添加剂包含有一种反刍微生物肌醇六磷酸酶。

49．权利要求48的饲料添加剂，其中的微生物为反刍月形单胞菌。

50．权利要求48的饲料添加剂，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。

51．生产肌醇六磷酸酶的方法，包括：

a)将编码反刍微生物肌醇六磷酸酶的DNA转化到至少一种宿主细胞，因而此宿主细胞能表达该肌醇六磷酸酶；并且

b)在有助于宿主细胞表达该肌醇六磷酸酶的条件下培养该宿主细胞。

52．权利要求51的方法，进一步包括以下步骤：

c)从培养物中提取该肌醇六磷酸酶。

53．权利要求51的方法，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

54．权利要求51的方法，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

55．生产转基因植物的方法，包括：

a)将编码一种反刍微生物肌醇六磷酸酶的DNA转化到植物中，因而此植物可表达该肌醇六磷酸酶；并且

b)在有助于此植物表达该肌醇六磷酸酶的条件下培养该植物。

56．权利要求55的方法，其中的反刍微生物为反刍月形单胞菌。

57．权利要求55的方法，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

58．改善动物饲料中肌醇六磷酸盐利用状况的方法，包括在饲喂动物的饮食中包含有效量的反刍微生物肌醇六磷酸酶。

59．权利要求58的方法，其中的反刍微生物是反刍月形单胞菌。

60．权利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

61．权利要求58的方法，其中的饮食包括饮用水并且该肌醇六磷酸酶包含于饮用水中。

62．权利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶以矿物块形式提供以供动物消耗。

63．权利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶以药丸的形式提供以供动物消耗。

64．权利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶以凝胶制剂的形式提供以供动物消耗。

65．权利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶可以液体制剂喷洒于饲料中以供动物消耗。

66．权利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶可以饲料丸的形式提供以供动物消耗。

67．权利要求58的方法，其中供动物消耗的饲料以冷冻干燥的微生物制剂处理，该微生物在正常生长条件下可表达该肌醇六磷酸酶。

68．测定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：

a)提供一种已长有微生物克隆的生长培养基，该培养基包含有一

种肌醇六磷酸盐源；

b)以氯化钴水溶液处理该培养基；并且

c)在该培养基上检测透明区，

由此可消除由微生物产生的酸引起的假阳性。

69．权利要求68的方法，经过步骤(b)后，以一种钼酸铵水溶液和一种矾酸铵水溶液处理该培养基。

70．权利要求68的方法，其中培养基需要以氯化钴水溶液处理至少约5分钟。

71．权利要求68的方法，其中培养基以钼酸铵水溶液和矾酸铵水溶液处理至少约5分钟。

72．权利要求68的方法，其中培养基以钼酸铵水溶液和矾酸铵水溶液同时处理。

73．权利要求68的方法，其中氯化钴水溶液的浓度约为2％(重量/体积)。

74．权利要求69的方法，其中钼酸铵水溶液的浓度约为6％(重量/体积)并且矾酸铵水溶液的浓度约为0.5％(重量/体积)。

75．鉴定生物体核酸分子的方法，该核酸分子编码一种肌醇六磷酸酶，该方法包括以下几步：

a)从该生物体中分离核酸分子；

b)在中等至高严格条件下，在核酸分子中和标记探针之间进行核酸杂交并标记杂交探针，该探针具有包含有SEQ ID NO.1的至少25个连续核苷酸的核苷酸序列。

76．权利要求75的方法，其中的杂交条件为中等严格条件。

77．权利要求75的方法，其中的杂交条件为高度严格条件。

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