CN1309699A - 植酸酶变体 - Google Patents

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Abstract

植酸酶变体、其制备及应用,当按照图1进行对齐排列时,此类植酸酶变体与模式植酸酶相比在许多位点中的至少一处被改变。优选的模式植酸酶为担子菌纲植酸酶和子囊菌纲植酸酶,例如隔孢伏革菌属植酸酶和曲霉属植酸酶。优选的植酸酶变体表现出改变的活性特征,例如改善的特异性活性和/或改善的热稳定性。

Description

植酸酶变体
发明领域
本发明涉及植酸酶的变体，特别是子囊菌纲植酸酶变体和担子菌纲植酸酶变体、相应的克隆的DNA序列、制备此类植酸酶变体的方法以及其在多种工业用途上的应用。
发明背景
植酸或肌醇-1,2,3,4,5,6-六二氢磷酸盐(或缩写为肌醇六磷酸盐)是植物种子中肌醇的主要来源和磷酸盐的基本储存形式。植酸钙镁是一种混合的肌醇钾、镁和钙盐。
植酸的磷酸盐部分螯合二价和三价阳离子，例如金属离子，即营养所必需的离子钙、铁、锌和镁以及痕量矿物质锰、铜和钼。
植酸及其盐，植酸盐，通常不被代谢，即其三价磷和螯合的金属离子均非营养上可利用的。
相应地，食物和饲料的制备需要补充无机磷酸盐，而且通常还必需补充营养所必需的离子，例如铁和钙。
此外，植酸盐的三价磷穿过这些动物的胃肠道并随粪尿排泄，引起不希望的环境磷酸盐污染，导致例如水环境的富养化和藻类的大量生长。
植酸或植酸盐，这些在本申请中除非另外指明，作为同义词使用或随机使用的术语，均通过植酸酶降解。
植物以及微生物的植酸酶产生已有报道。在微生物中，产植酸酶细菌以及产植酸酶真菌是已知的。
有一些对属于真菌门子囊菌纲的产植酸酶丝状真菌的描述。特别是，有几篇产植酸酶的子囊菌纲曲霉属，例如土曲霉的文献(Yamada等，1986，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.3221275-1282))。此外，黑曲霉变种泡盛曲霉的植酸酶基因的克隆和表达也已经被描述(Piddington等，1993，基因(Gene)133:55-62)。EP 0420358描述了无花果(黑)曲霉的植酸酶的克隆和表达。EP 0684313描述了子囊菌纲黑曲霉、嗜热毁丝霉、土曲霉的植酸酶的克隆和表达。此外还给出了构巢曲霉、嗜热踝节菌、烟曲霉以及另一株土曲霉的植酸酶的一些部分序列。
在WO 97/35017中描述了Thermomyces lanuginosus植酸酶的克隆和表达。
目前需要具有改变的性质或特性的植酸酶，例如热稳定性增加的、最佳pH改变的(体外处理需要一高的最佳pH，体内胃肠道中的处理需要一低的最佳pH)和/或较高特异性活性的植酸酶。
发明概述
在一方面，本发明提供植酸酶变体，其特性与所谓的模式植酸酶相比是改变的。
任何模式植酸酶，其与本文特别公开的十三种模式植酸酶具有某种相似性，都可以用作此类变体的模式。
在另一方面，本发明涉及衍生自Cladorrhinum foecundissimum的一种新型植酸酶。
在另一方面，本发明还提供编码这些植酸酶变体和该植酸酶的DNA序列，以及它们的制备方法。
最后，本发明大体上还涉及植酸酶和植酸酶变体从任何植酸酶底物中释放三价磷，特别是从植酸盐或植酸中释放无机磷酸盐的应用。
附图简述
在下面本发明的详细描述中，对图进行了说明，其中
图1是十三种特定植酸酶序列的对齐排列(多序列对齐排列，按照程序PileUp；空隙权(Gap Weight):3.000；空隙长度权(GapLength Weight):0.100)；
图2该图显示一种植酸酶(“P_involtus-A1”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年11月28日保藏的Paxillus involutus CBS 100231株；包含其全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0被转化到97年11月12日保藏的大肠杆菌DSM 11842株(见WO 98/28409)中；
图3该图显示另一种植酸酶(“P_involtus-A2”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年11月28日保藏的Paxillus involutus CBS 100231株；包含其全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0被转化到97年11月12日保藏的大肠杆菌DSM 11843株(见WO 98/28409)中；
图4该图显示一种植酸酶(“绒毛栓菌(T pubescens)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年11月28日保藏的绒毛栓菌CBS 100232株；包含其全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0被转化到97年11月12日保藏的大肠杆菌DSM 11844株(见WO 98/28409)中；
图5该图显示一种植酸酶(“平田头菇(A pediades)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自96年12月4日保藏的平田头菇CBS 900.96株；包含其全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0被转化到96年12月2日保藏的大肠杆菌DSM 11313株(见WO 98/28409)中；
图6该图显示一种植酸酶(“P_lycii”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自96年12月4日保藏的Peniophora lycii CBS 686.96株；包含其全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0被转化到96年12月2日保藏的大肠杆菌DSM11312株(见WO 98/28409)中；
图7该图等同于EP 0684313的图2，显示一种植酸酶(“嗜热毁丝霉(M_thermophila)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年3月14日重新保藏的嗜热毁丝霉ATCC 48102株(=ATCC 74340)；
图8该图显示一种植酸酶(“烟曲霉(A_fumigatus)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自烟曲霉ATCC 13073株(见EP 0897985)；
图9该图显示一种子囊菌属共有植酸酶(在本申请中称为“共有植酸酶A(consphyA)”)的氨基酸(“Conphys”)和DNA序列(见EP 0897985)；
图10该图显示一种植酸酶(“构巢曲霉(A_nidulans)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自构巢曲霉DSM 9743株(见EP 0897985)；
图11该图等同于EP 0420358的图8，显示一种植酸酶(“无花果曲霉(A_ficuum)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自无花果曲霉NRRL-3135株；
图12该图等同于EP 0684313的图1，显示一种植酸酶(“土曲霉(A_terreus)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自土曲霉CBS 220.95株；
图13该图显示一种植酸酶(“嗜热踝节菌(T_thermo)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年3月14日重新保藏的嗜热踝节菌ATCC 20186(=ATCC74338)株(见EP 0897985)；
图14该图等同于WO 97/35017的图2，显示一种植酸酶(“T_lanuginosa”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自Thermomyces lanuginosusCBS 586.94株；将包含其全长cDNA序列的质粒转化到96年2月23日保藏于NRRL的大肠杆菌DH5α(pMWR46)株B-21527中；
图15该图显示一种植酸酶(“C_foecundissimum”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自1997年1月23日保藏的Cladorrhinum foecundissimum CBS427.97株；将包含其全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0转化到1999年3月17日保藏的大肠杆菌DSM 12742株中；
图16该图显示C_foecundissimum植酸酶与作为模式植酸酶的嗜热毁丝霉的对齐排列，利用程序GAP gcg(空隙权3.000；长度权0.100)；以及
图17显示如何能将C_foecundissimum植酸酶粘贴于图1的对齐排列中。
发明详述
植酸酶
在本申请中，植酸酶是一种催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸盐以及(3)无机磷酸盐的酶。为了简短，在后文中上述化合物有时分别由IP6、I、IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和P指代。这意味着通过植酸酶的作用，IP6被降解成P加一个或多个IP5、IP4、IP3、IP2、IP1和I组分。或者，将共携有n个磷酸基团于p、q、r、……位点处的肌醇表示为Ins(p,q,r,..)Pn。为了方便，Ins(1,2,3,4,5,6)P6(植酸)缩写为PA。
根据酶命名法数据库ExPASy〔一个酶命名法相关信息的收集处，其主要基于国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会为描述每种类型鉴定过并为其提供了一个EC(酶学委员会(Enzyme Commission))编号的酶所提出的建议〕，已知有两种不同类型的植酸酶：一种被称为的3-植酸酶(肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和一种被称为的6-植酸酶(肌醇六磷酸盐6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。3-植酸酶首先水解D-3位的酯键，而6-植酸酶首先水解D-6或L-6位的酯键。
“植酸酶”或“表现植酸酶活性的多肽或酶”包括任何能够影响无机磷酸盐或三价磷从各种肌醇磷酸盐中释放的酶。此类肌醇磷酸盐(植酸酶底物)的实例是植酸及其任意盐，例如，植酸钠或植酸钾或混合盐。肌醇的单、二、三、四或五磷酸盐的任何立体异构体都可以用作植酸酶底物。优选的植酸酶底物是植酸及其盐。
根据上述的定义，可以利用其中采用了这些底物之一的任何测试来确定植酸酶的活性。在本申请中(除非另外指定)植酸酶活性是以FYT单位来确定的，一个FYT是在下述条件下：pH5.5；温度37℃；底物是浓度为0.0050mol/l的植酸钠(C6H6O24P6Na12)，每分钟释放1μmol无机正磷酸盐的酶的量。在试验部分描述了一种适当的植酸酶检测法。
本发明提供遗传工程植酸酶，如在所附的权利要求中所述。
遗传工程植酸酶是非自然存在的植酸酶，其与模式植酸酶，例如野生型植酸酶不同。遗传工程植酸酶包括，但不限于，通过定点诱变、基因重组、随机诱变等制备的植酸酶。
本发明还提供了DNA构建体、载体、宿主细胞以及制备这些遗传工程植酸酶和植酸酶变体的方法及其应用。
植酸酶变体是一种多肽或酶或其一个片段，其表现出植酸酶活性而且与模式植酸酶相比其被改变。
改变意指通过一个或多个氨基酸或肽的置换、缺失、插入和/或增加的方式(在每种情况下，一个或多个氨基酸发生改变)。此类置换、缺失、插入、加入可以通过本领域所知的任何方法来实现，例如基因重组、随机诱变、定点诱变等。
可衍生出植酸酶变体的模式或亲代植酸酶可以是任何植酸酶，例如，一种野生型植酸酶或其一种衍生物、突变体或变体，包括等位变体和物种变体，及其基因工程变体，它们可以通过例如定点诱变、随机诱变、重组等来制备。
在模式植酸酶概念中还包括任何杂交或嵌合植酸酶，即组合了至少两种植酸酶的部分氨基酸序列的植酸酶。
杂交植酸酶可能组合了至少两种子囊菌纲植酸酶、至少两种担子菌纲植酸酶或至少一种子囊菌纲植酸酶和至少一种担子菌纲植酸酶的部分氨基酸序列。这些可衍生出部分氨基酸序列的子囊菌纲和担子菌纲植酸酶可以是例如本文所提及的那些特定植酸酶中的任何一种。
在本申请中，单纯衍生自子囊菌纲植酸酶的杂交的、重组的、随机诱变的、定点诱变的或其它遗传工程改造的植酸酶仍然是子囊菌纲植酸酶；而单纯衍生自作为模式的担子菌纲植酸酶的杂交的、重组的、随机诱变的、定点诱变的或其它遗传工程改造的植酸酶仍然是担子菌纲植酸酶。将任何衍生自至少一种子囊菌纲植酸酶以及至少一种担子菌纲植酸酶的杂交体称为混合的子囊菌纲/担子菌纲植酸酶，而且此种植酸酶在本申请中也是一种模式植酸酶。
类似地，衍生自一种或多种曲霉类植酸酶的杂交的、重组的、随机诱变的、定点诱变的或其它遗传工程改造的植酸酶仍然是曲霉植酸酶；而衍生自本文提到的任何其它分类亚群的杂交的、重组的、随机诱变的、定点诱变的或其它遗传工程改造的植酸酶也将被指定为该分类亚群的植酸酶。
进而，在本申请中“衍生自”意指由所指定生物的一个株产生的或可产生的植酸酶，以及由分离自该株的DNA序列编码并在由该DNA序列转化的宿主生物中所产生的植酸酶。最后，该术语意指一种植酸酶，其由一合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码而且具有所指定植酸酶的鉴定特征。
模式植酸酶优选为一种可以按下述与图1中十三种植酸酶(均为特别优选的模式植酸酶)的任何一个进行对齐排列的植酸酶。
优选的野生型植酸酶(即，未经重组、或重排或其它遗传工程改造的植酸酶)与这十三种植酸酶中任一种的38-403号(隔孢伏革菌的编号)氨基酸序列具有至少40％，更优选至少50％，还更优选至少60％，特别是至少70％，尤其是至少80％的相似性或同源性，优选等同性，而在一最优选的实施方案中是至少90％的相似度。
优选的重组的或重排的或者其它遗传工程改造的模式植酸酶与这十三种植酸酶中任何一种的38-49、63-77、274-291、281-300以及389-403号(隔孢伏革菌的编号)部分序列具有至少60％，更优选至少70％，还更优选至少80％，特别是至少90％的相似性或同源性，优选等同性。
在一优选的实施方案中，相似性程度是基于与十三种植酸酶中任一种的完整氨基酸序列的比较。
相似性或同源性，或者等同性的程度可以利用任何本领域已知的对齐排列程序来确定。一个优选的对齐排列程序是在GCG版本8程序包(WisconsinPackage程序手册，版本8,1994年8月，遗传学计算机组，575 ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA 53711，还见Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志(Joumal of Molecular Biology),48,443-453)中提供的GAP。利用GAP按照下述设置进行多肽序列比较：3.000的空隙权和0.100的空隙长度权。
还优选的是一种野生型模式植酸酶，其包括一段由下述DNA序列编码的氨基酸序列，该DNA序列与编码图1中十三种特定植酸酶序列中任一种的38-403位(隔孢伏革菌的编号)氨基酸序列的DNA序列杂交。
更优选的模式植酸酶是一种遗传工程植酸酶，其包括一段由下述DNA序列编码的氨基酸序列，该DNA序列与编码图1中十三种特定植酸酶序列中任一种的38-49位、63-77位、274-291位、281-300位以及389-403位的氨基酸序列(隔孢伏革菌的编号)的DNA序列杂交。
在一优选的实施方案中，杂交是与十三种植酸酶中任何一种的完整植酸酶编码部分的杂交。
用于确定一给定的DNA或RNA序列是否与一特定的核苷酸或寡核苷酸探针“杂交”的适当试验条件包括在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中将含有待测DNA片段或RNA的滤膜预先浸泡10分钟，(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第二版，冷泉港，纽约)，并在5×SSC、5×Denhardt液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理鲑鱼精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交，随后在大约45℃于含有随机引物引发的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)132:6-13)32p-dCTP标记的(特异活性＞1×109cpm/μg)探针10ng/ml的相同溶液中杂交12小时。
然后在至少55℃(低严谨度)、至少60℃(中严谨度)、至少65℃(中/高严谨度)、至少70℃(高严谨度)或至少75℃(极高严谨度)将滤膜在2×SSC、0.5％ SDS中洗涤两次30分钟。
利用X线胶片可检测到在这些条件下寡核苷酸探针所杂交的分子。
需要注明的是，某种特定的植酸酶变体实际上不需要由特定的模式植酸酶来制备，因为在本申请中该模式植酸酶用作一种“样板植酸酶”。在后来与模式植酸酶比较时变体表现出至少一种本文所指的改变便足够了。
图1的对齐排列是利用程序PileUp(Wisconsin Package程序手册，版本8,1994年8月，遗传学计算机小组，575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)按照3.000的空隙权和0.100的空隙长度权作出。当排列一种新型模式植酸酶或一种新型植酸酶变体时，与新型植酸酶(变体)一起的可以包括所有十三个序列，或者与新型植酸酶(变体)一起的至少包括图1的十三个序列之一。
对图1的新型模式植酸酶(或植酸酶变体)进行对齐排列的优选程序如下：将新型模式植酸酶与图1的十三条序列中与新型模式植酸酶同源性程度最高的特定序列进行对齐排列。为了对两个序列进行同源性程度的计算以及“根据图1进行对齐排列”，优选利用下面提到的程序GAP。首先对齐排列两条序列，利用第一个对齐排列的结果(按照对齐排列所规定的，将相同和同源的氨基酸残基彼此对齐)，将新型模式植酸酶(或植酸酶变体)添加(粘贴)到图1的对齐排列中，随后相应位点便很容易判断。
实施例7显示一个如何向图1的对齐排列中增加一种新型模式植酸酶并推断其相应植酸酶变体的实例。
同实施例7类似，可以对齐排列其他模式植酸酶并推断变体。特别是对于下述模式植酸酶更是如此：黑曲霉变种泡盛曲霉的植酸酶(美国专利号5,830,733)；WO 98/06858的芽孢杆菌植酸酶；WO 98/20139的大豆植酸酶；WO 98/05785的玉米植酸酶；WO 97/38096的曲霉植酸酶；WO98/13480的亚克红曲霉植酸酶；EP 0699762的西方许旺氏酵母植酸酶等。
当利用本文所描述的对齐排列来比较一种模式植酸酶和一种推测的植酸酶变体时，可以鉴定相应的氨基酸位点，即模式植酸酶的模式位点和变体的变异位点——在对齐排列中只是简单地将相应的模式位点和变异位点一个置于另一个上方。如果模式位点的模式氨基酸同变异位点的变异氨基酸不同，则称在给定的位点发生了改变。这些位点优选的改变表现为氨基酸置换、缺失或增加。
在至少一个位点被改变意味着在一个或多个位点，即在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个等，高达所有列出的N个位点处被改变。该定义包括其任何可能的亚组合，例如任何有两个置换的组、任何有三个置换的组、任何有四个置换的组等，——直至任何有(N-1)个位点置换的组。
在本申请中，不论模式植酸酶为何，均利用同植酸酶P_lycii相应的编号对所有序列，以及包括图1的十三条序列进行编号。这些“隔孢伏革菌编号”同“对齐排列编号”一起在图1中标出。P_lycii的编号起始于M1，终止于E439处。
如上面所解释的，对齐排列揭示了在除P_lycii外的各种植酸酶序列中哪些位点同给出的P_lvcii位点等价或相应。
本文将氨基酸的置换标注为如“3S”，其表示在位点3处可以用氨基酸S置换“原始”或模式位点3处的氨基酸，不论其为何种氨基酸。因此，该置换可以在相应的变异位点产生一个S。现在鉴于图1上的对齐排列，对于所示各种植酸酶的类似如“3S”的置换将做如下解释(第一个标明的氨基酸是在“隔孢伏革菌位点”3处的“原始”或模式氨基酸)：
P_involtus_A1：         F3S(3号F由S置换)
P_involtus_A2：         L3S
绒毛栓菌：              M1S
平田头菇：              M1S
P_lycii：               多余的(已经为一S)
烟曲霉：                T5S
共有植酸酶A：           V5S
构巢曲霉：              T5S
无花果曲霉_NRRL3135：   A5S
土曲霉：                A5S
嗜热踝节菌：            L5S
T_lanuginosa：          V11S
嗜热毁丝霉：            G5S
然而，下文对上述的特定置换将做如下定义(始终采用隔孢伏革菌编号)：
P_involtus_A1：         F3S
P_involtus_A2：         L3S
绒毛栓菌：              M3S
平田头菇：              M3S
P_lycii：               多余的(已经为一S)
烟曲霉：                T3S
共有植酸酶A：           V3S
构巢曲霉：              T3S
无花果曲霉_NRRL3135：       A3S
土曲霉：                    A3S
嗜热踝节菌：                L3S
T_lanuginosa：              V3S
嗜热毁丝霉：                G3S
此外，类似如“3S,F,G”的符号意指将正讨论的模式植酸酶位点3(隔孢伏革菌编号)处的氨基酸由S、F或G的任何一个来置换,即，例如标示“3S,F,G”可以被认为完全等同于标示“3S,3F,3G”。
类似()3S的符号意指在该序列中与隔孢伏革菌3号相应的位点处增加了氨基酸S(在实际序列中的空隙处)，反之为缺失(S3())。
在隔孢伏革菌植酸酶序列比图1中某些其他植酸酶存在更大缺失的区域的情况下，例如在位点201和202(隔孢伏革菌编号)间的区域中，中间的位点(在其他序列中的氨基酸残基)通过在最后一个隔孢伏革菌位点编号处添加a、b、c、d等小写字母来编号，例如对于嗜热毁丝霉植酸酶：E201；G201a；P201b；Y201c；S201d；T201e；I201f；G202；D203等。
在本申请书的一个优先权申请中，有两个位点编号的小错误；根据上述定义，在第一个优先权申请中所提及的204和205位点(隔孢伏革菌编号)为错误指定；它们本应分别编号为203a和204。因此，在本申请中204由203a、205由204代替。
本发明的一个优选的植酸酶变体包括以下氨基酸序列，其包括，优选含有，一个或多个下述氨基酸置换：24C；27P；31Y；33C；39H,S,Q；40L,N；42S,G；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；44N；45D,S；47Y,F；49P；51E,A,R；56P；58D,K,A；59G；61R；62V,I；69Q；75W,F；78D,S；79G；80K,A；81A,G,Q,E；82T；83A,I,K,R,Q；84I,Y,Q,V；88I；90R,A；102Y；115N；116S；118V,L；119E；120L；122A；123N,Q,T；125M,S；126H,S,V；127Q,E,N；128A,S,T；132F,I,L；143N；148V,I；151A,S；152G；153D,Y；154D,Q,S,G；157V；158D,A；159T；160A,S；161T,N；162N；163W；170fH；170gA；171N；172P；173Q,S；184Q,S,P；185S；186A,E,P；187A；187aS；190A,P；193S；194S,T；195T,V,L；198A,N,V；
200G,V；201D,E；201a、201b、201c、201d、201e、201f中的至少一个，优选全部的缺失；201eT；202S,A；203R,K,S；203aY,T；204Q,E,S,A,V；205E；211L,V；215A,P；220L,N；223H,D；228N；232T；233E；235Y,L,T；236Y,N；237F；238L,M；242P,S；244D；246V；251eE,Q；253P；256D；260A,H；264R,I；265A,Q；267D；270Y,A,L,G；271D,N；273D,K；275F,Y；278T,H；280A,P；283P；287A,T；288L,I,F；292F,Y；293A,V；302R,H；304P,A；332F；336S；337T,G,Q,S；338I；339V,I；340P,A；343A,S,F,I,L；348Y；349P；352K；360R；362P；364W,F；365V,L,A,S；366D,S,V；367A,K；368K；369I,L；370V；373A,S；374S,A；375H；376M；383kQ,E；387P；393V；396R；404A,G；409R；411K,T；412R；417E,R；421F,Y；431E.
在一优选的实施方案中，这是以模式植酸酶在所指定的位点处并未包括上面提到的氨基酸置换或增加或缺失为条件的。或者，以每个位点的模式氨基酸尚不是此处提出的变异氨基酸为条件的。但由于“改变”的表述，可以说这些附加条件事实上已经为上述措辞所固有。
权利要求16-34的各种优选植酸酶变体包括(优选含有或具有)以下氨基酸序列，它们包括或含有在各权利要求中所列的一个或多个氨基酸的置换，增加或缺失。
在一优选的实施方案中，各种植酸酶变体包括这些置换中的1、2、3、4、5、6、7、8、9个或者甚至10个；或者10-15、15-20、20-30个或者甚至30-50个的大量置换；最终高达60、70、80或90个置换。
在另一优选的实施方案中，各种植酸酶变体的氨基酸序列包括本文下面所列置换亚群的一个或多个置换；或者归类至两个或多个亚群的置换的组合。
通常，由于被本文所描述的一个或多个置换所修饰，优选变体的氨基酸序列并非“包括”、“含有”或“具有”，而是“基本上由”或者“由”图1中特定模式植酸酶“组成”。
在本发明中，担子菌意指担子菌纲的微生物。此担子菌纲与诸如子囊菌纲一起，都属于真菌界。
分类学问题可以通过查阅下面所列的参考或通过查阅互联网的下述地址：http；//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html所提供的真菌分类数据库(NIH数据库(Entrez))来明确。
对于担子菌纲的定义，以Julich,1981，担子菌纲高级分类法(HigherTaxa of Basidiomycetes)；Ainsworth和Bisby’s(编)真菌字典(Dictionary of theFungi),1995,Hawksworth,D.L.,P.M.Kirk,B.C.Sutton和D.N.Pegler；或者Hansen和Knudsen(编)，Nordic Macromycetes，第2卷(1992)和第3卷(1997)作为参考。优选参考Hansen和Knudsen。
对于子囊菌纲的定义，以上面引用的Ainsworth和Brisby或者由Eriksson,O.E.和D.L.Hawksworth，第16卷，1998编辑的系统子囊菌纲(Systema Ascomycetum)作为参考。优选参考Eriksson等。
大体上，归类于以上所列参考(包括数据库)的子囊菌纲/担子菌纲的微生物是本申请中的子囊菌/担子菌。
一些曲霉菌株很难分类，因为它们是渐变的，因此它们应被归类为半知菌。然而，一旦发现有性配对部分，便按照分类法将其重新分类。例如，构巢曲霉的有性型是构巢皮胞囊果属(子囊菌门的不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科)。优选子囊菌门的这些亚群以及子囊菌门的核菌纲，粪壳目，Lasiosphaeriaceae科。
本文所用的“子囊菌纲”和类似物包括曲霉属、Thermomyces、毁丝霉属、踝节菌属的渐变的，并因此应被归类于半知菌的菌株。
优选的担子菌纲植酸酶是在WO 98/28409中以“发明详述”为标题的章节的最开始处所列举的那些。
按照在附图简述下所列各文献的指导，可以制备编码这十三种特别列举的模式植酸酶以及其他模式植酸酶的DNA序列。
利用本领域众所周知的各种方法可以从产生目的植酸酶的任何细胞或微生物中分离编码模式植酸酶的DNA序列。首先，应该利用来自产该植酸酶生物的染色体DNA或信使RNA构建一基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果已知该植酸酶的氨基酸序列，可以合成同源的标记寡核苷酸探针，并用来从由该生物制备的基因组文库中鉴定植酸酶编码克隆。或者，利用低严谨度的杂交和洗涤条件，可以将含有同一已知植酸酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用作探针，来鉴定植酸酶编码克隆。
另一种鉴定植酸酶编码克隆的方法还可以包括将基因组DNA片段插入到一表达载体，例如质粒中，利用所获的基因组DNA文库转化植酸酶阴性的细菌，然后将转化的细菌涂平板至含有植酸酶底物的琼脂上，由此可以鉴定表达植酸酶的克隆。
或者，可以通过已建立的标准方法来合成编码该酶的DNA序列，例如，由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所描述的磷酰胺方法或者由Matthes等(1984)所描述方法。在磷酰胺方法中，对寡核苷酸进行合成，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
最后，按照标准的技术，通过连接合成的、基因组的或cDNA来源的片段(若适当，这些片段对应于整个DNA序列的各个部分)所制备的DNA序列可以是基因组和合成混合来源的、合成和cDNA混合来源的或者基因组和cDNA混合来源的。也可以利用特定的引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备DNA序列如在美国专利4,683,202或R.K.Saiki等(1988)中所描述。
编码本发明中植酸酶变体的DNA可以通过本领域所知的方法来制备，例如定点诱变。一旦分离出编码目的模式植酸酶的DNA序列，并确定了预期的突变位点，就可以利用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有预期突变位点的侧翼核苷酸序列；在寡核苷酸合成过程中插入突变的核苷酸。在一特定的方法中，在一携带植酸酶编码基因的载体中建立一个桥接植酸酶编码序列的DNA单链空隙。随后将带有预期突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)补平其余的空隙，并用T4连接酶连接该构建体。该方法的一个特定的实例描述于Morinaga等(1984)中。US 4,760,025公开了通过进行基因盒的局部改动对编码多个突变的寡核苷酸的引入。然而，因为可以引入各种长度的多种寡核苷酸，所以利用Morinaga方法可以在任何时候引入更加多样的突变。
在Nelson和Long(1989)中描述了向编码一预期模式植酸酶的DNA序列中引入突变的另一种方法。其涉及一个3步产生的含有预期突变的PCR片段，这些突变是通过利用一化学合成的DNA链作为PCR反应中的引物之一来引入的。由PCR生成的片段，可以通过限制性核酸内切酶切割来分离携带该突变的DNA片段并将其重新插入到一表达质粒中。
突变编码一种模式植酸酶的DNA序列的另一方法是随机诱变。在翻译成所示氨基酸序列的基因的至少三个部分或在整个基因内适当地进行局部随机诱变或特定区域随机诱变。
利用本领域已知的任何方法可以方便地对编码模式植酸酶的DNA序列进行随机诱变。
同上面的相关，本发明进一步还涉及产生模式植酸酶的变体的方法，其中该变体优选表现出下述的改变的特征，该方法包括：
(a)使编码该模式植酸酶的DNA序列进行定点诱变，或用Nelson和LongPCR诱变方法诱变或者随机诱变，
(b)在宿主细胞中表达步骤(a)中获得的突变DNA序列，并
(c)筛选表达相对于该模式植酸酶性质改变的植酸酶变体的宿主细胞。
当利用随机诱变时，本发明上述方法的步骤(a)优选利用添加的引物进行。
例如，可以通过利用一种适宜的物理或化学诱变剂、利用一种适宜的寡核苷酸、或者通过将该DNA序列进行PCR生成的诱变来进行随机诱变。此外，可以通过利用这些诱变剂的任意组合来进行随机诱变。例如，该诱变剂可诱导转换、颠换、倒位、scrambling、缺失、和/或插入。
适于本目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、wycb甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸盐(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸以及核苷酸类似物。利用此类诱变剂时，通常通过在适于诱变发生的条件下于所选诱变剂存在下温育待诱变的编码亲代酶的DNA序列，并筛选具有预期性质的突变DNA来进行诱变。
当利用寡核苷酸来进行诱变时，在寡核苷酸合成过程中于该寡核苷酸待改变的位点处应添加或增强标定三种非亲代核苷酸。实施添加或增强标定或以避开无用氨基酸的密码子。通过任何公开的技术，利用认为适当的如PCR、LCR或者任何DNA聚合酶和连接酶，可以将添加或增强标定的寡核苷酸整合到编码植酸酶的DNA中。
优选利用“持续随机添加”进行添加，其中在每个位点上的野生型和突变的百分比是预先确定的。此外，根据对某些核苷酸引入的优选以及由此的对一个或多个特定氨基酸残基的优选可以指导添加。例如，添加可在每个位点引入90％野生型和10％突变。在选择添加设计时还应根据遗传学以及蛋白质结构限制加以考虑。添加设计可以通过利用DOPE程序来进行，其特别保证防止引入终止密码子。
在利用PCR生成的诱变时，在增加核苷酸错误增强标定的条件下对编码模式植酸酶的化学处理或非处理的基因进行PCR(Deshler 1992；Leung等，技术(Technique)，第1卷，1989,11-15页)。
通过例如向一诱变株中转化一含有亲代糖基化酶的质粒，培养转有质粒的诱变株并从诱变株中分离突变的质粒，大肠杆菌(Fowler等，分子普通遗传学(Molec.Gen.Genet.),133,1974,179-191页)、酿酒酵母或任何其他微生物的诱变株可以用于对编码模式植酸酶DNA进行随机诱变,即通过例如向一诱变株中转化一含有亲代糖基化酶的质粒，培养转有质粒的诱变株并从诱变株中分离突变的质粒。随后可以将突变的质粒转化到表达生物体中。
待诱变的DNA序列可以方便地存在于由表达该模式植酸酶的生物体所制备的基因组或cDNA文库中。或者，该DNA序列可以存在于一适当的载体上，例如质粒或噬菌体，其本身可以同诱变剂进行温育或者暴露于诱变剂。待诱变的DNA还可以通过整合到细胞的基因组中或者通过存在于驻留细胞中的一种载体上而存在于该宿主细胞中。最后，待诱变的DNA可以处于分离的形式。当然待进行随机诱变的DNA序列优选为一cDNA或一基因组DNA序列。
有些情况下，在进行表达步骤b)或筛选步骤c)之前扩增突变DNA序列可能是方便的。此类扩增可以按照本领域已知的方法进行，目前优选的方法是利用基于亲代酶的DNA或氨基酸序列制备的寡核苷酸引物进行PCR生成的扩增。
在同诱变剂进行温育或暴露于诱变剂后，通过在便于表达的条件下培养携带该DNA序列的适当宿主细胞来表达该突变DNA。用于此目的的宿主细胞可以是由选择性地存在一载体上的突变DNA序列转化的那种，或者是在诱变处理过程中携带编码亲代酶DNA序列的那种。适宜的宿主细胞的实例如下：革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；以及革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。
突变的DNA序列进而可以包括编码允许该突变DNA序列表达的功能的一段DNA序列。
利用局部随机诱变可以将随机诱变便利地定位于模式植酸酶的一部分。例如，当已经确定了酶的某些区域对于该酶的一已知特性特别重要时，以及当预计修饰会产生具有改变特性的变体时，这可能是有益的。在亲代酶的三级结构已被阐明而且同酶的功能相关时通常可以确定此类区域。
通过利用上面所描述的PCR生成的诱变技术或本领域所知的任何其他适当的技术可以方便地进行局部的或者区域特定的随机诱变。或者，编码待修饰的DNA序列中一部分的DNA序列可以被分离，例如通过插入到一适当的载体中，随后通过利用上面讨论的任何诱变方法可以对该部分进行诱变。
为了改变如模式植酸酶的特异性活性而进行区域特定的随机诱变时，可以适当地针对同图1中所列氨基酸序列的下述氨基酸残基相应的密码子位点而进行：
残基：41-47、68-80、83-84、115-118、120-126、128、149-163、184-185、191-193、198-201e、202-203、205、235-236、238-239、242-243、270-279、285、288、332-343、364-367、369-375、394。
区域：41-47、68-80、120-128、149-163、270-279、332-343、364-375。
随机诱变可以通过下面的步骤进行：
1．在亲代酶中选择待修饰的目的区域
2．在选定的区域中确定突变位点和非突变位点
3．例如根据待构建变体的预期的稳定性和/或特性，确定应进行哪类突变
4．选择结构上合理的突变
5．根据步骤4调整通过步骤3选定的残基
6．利用一适当的添加算法分析核苷酸分布
7．如果必要，根据遗传密码的实践调整所需的残基，例如考虑到由遗传密码产生的限制，如为了避免终止密码子的引入；技术人员将清楚一些密码子的组合在实践中不能使用并将需要调整。
8．制备引物。
9．利用这些引物进行随机诱变
10．通过筛选预期的改善的性质来选择所获的植酸酶变体
用于步骤6中的适宜的添加算法是本领域众所周知的。Tomandl,D.等，1997，计算机辅助分子设计杂志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)11:29-38描述了一种此类算法。另一种算法是DOPE(Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A和Kretzschmar,T(1998)核酸研究(NucleicAcids Research)26:697-702)。
编码本发明的模式植酸酶或植酸酶变体的DNA序列可以利用表达载体，重组表达载体来表达，该表达载体通常包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译启始信号的控制序列以及选择性地一个抑制子基因或各种激活子基因。
重组表达载体应该是可以方便地进行重组DNA操作的任何载体，而且载体的选择通常将有赖于其将被引入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自主复制载体，例如质粒、噬菌体或者染色体外元件。或者，载体可以是当引入宿主细胞时被整合到宿主细胞基因组中并同其整合于其中的染色体一起复制的那种。
在载体中，DNA序列应该是可操作地同一适当的启动子序列相连。启动子可以是在选定的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，而且可以来自编码宿主细胞同源或者异源性蛋白质的基因。用于指导编码本发明中植酸酶变体的DNA序列转录，特别是在一细菌宿主中转录的适当启动子的一个实例是大肠杆菌的lac乳糖操纵子。对于在真菌宿主中的转录，有效启动子的实例是来自编码米曲霉TAKA淀粉酶基因的那些。
本发明的表达载体还可以包括一个适当的转录终止子以及在真核细胞中可操纵地连接至编码本发明中植酸酶变体DNA序列的的多聚腺苷酸化序列。终止和多聚腺苷酸化序列可以适当地衍生自同启动子相同的来源。
载体进一步可以包括使载体能够在所选宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体还可能包括一可筛选的标志，例如，其产物在宿主细胞中弥补一缺陷的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素抗性。进而，载体可以包括曲霉筛选标记，如amdS、argB、niaD和sC，或者筛选可以通过共转化来完成，例如按照在WO91/17243所描述的。
用于分别连接本发明中编码植酸酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件并将它们插入到含有复制所需信息的适当载体中的方法，对于本领域的技术人员是众所周知的(参阅，例如，Sambrook等，(1989))。
本发明的细胞，其包括按照上面所确定的其包括本发明的DNA构建体或表达载体，在本发明的植酸酶变体的重组制备中便利地用作宿主细胞。通过将本发明中编码变体的DNA构建体整合到宿主染色体中(一个或多个拷贝)，可以方便地用该DNA构建体转化该细胞。这种整合通常被认为具有优势，因为DNA序列更有可能稳定地保留在细胞中。可以按照传统的方法，例如通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。或者，可以用如上所述的与不同的宿主细胞类型相关表达载体来转化该细胞。
一种分离的DNA分子或者一段“克隆的DNA序列”、“一个DNA构建体”、“一段DNA片段”或“一段分离的DNA序列”指一种DNA分子或序列，其可以按照在遗传工程中用来将DNA片段由其天然位置重新定位至其将被复制的一不同位点的标准的克隆方法来进行克隆。该术语通常指基本上没有其他核酸序列的一段核酸序列，例如通过琼脂糖凝胶电泳确定的；至少大约20％的纯度，优选至少40％的纯度，更优选大约60％的纯度，还要更优选80％的纯度，最优选大约90％的纯度，更加更优选大约95％的纯度。克隆的步骤可能包括切除和分离含有编码该多肽的核酸序列的预期核酸片段，将该片段插入一载体分子，以及将重组载体整合到一种宿主细胞中，在该宿主细胞中该核酸序列的多个拷贝或克隆将被复制。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或者其任意的组合。
术语“载体”规定为包括象“核酸构建体”、“DNA构建体”、“表达载体”或“重组载体”那样的术语/对象。
核酸构建体包括本发明中可操作地连接至一个或多个调控序列的核酸序列，这些调控序列能够指导编码序列在同调控序列相容的条件下于一种合适的宿主细胞中表达。
本文“核酸构建体”定义为一段核酸分子，单链或双链，其分离自一个天然存在的基因或者其经修饰含有以自然界不会存在的方式结合或并置的核酸片段。
在核酸构建体含有本发明中编码序列表达所需的所有调控序列时，术语核酸构建体与术语表达基因盒应该是同义的。
本文所定义的术语“编码序列”首先包括一段序列，当将其置于上述调控序列的调控下时，其被转录成mRNA并翻译成本发明的一种多肽。编码序列的边界一般是通过5’-末端的翻译启始密码子ATG和3’-末端的翻译终止密码子来确定的。编码序列可以包括，但不限于，DNA、cDNA以及重组核酸序列。
术语“调控序列”本文定义为包括所有对于核酸序列的编码序列表达所必需或有利的所有成分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是原来或外来的。此类调控序列包括，但不限于，一个先导序列、一个多聚腺苷酸化序列、一个前肽序列、一个启动子、一个信号序列以及一个转录终止子。至少，调控序列包括一个启动子以及转录和翻译终止信号。为了引入便于连接调控序列和编码多肽的核酸序列编码区的特定限制性酶切位点，调控序列可以带有接头。
“宿主细胞”或“重组宿主细胞”包括亲代细胞的任何子代，其因在复制过程中发生的突变而与亲代细胞不同。
细胞优选被包括本发明核酸序列的载体转化，随后该载体整合到该宿主染色体中。
“转化”意指在宿主细胞中引入包括本发明核酸序列的载体，以便该载体作为染色体整合子或自我复制的染色体外载体来保持。整合通常被认为是一种优势，因为核酸序列更可有能在细胞中稳定保持。载体在宿主染色体中的整合可以通过如上所述的同源或非同源重组来进行。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者非单细胞微生物，例如真核生物。真核生物细胞的实例是哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。有用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或者例如可由美国典型培养物保藏中心所提供的许多其他的永生化细胞系。
在一优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法，按照其原本的形式进行转化。
本发明还涉及转基因植物、植物的部分例如植物的种子或者植物细胞，其已经由编码本发明中植酸酶的DNA序列所转化以便表达或产生该酶。根据本发明的使用和食物/饲料权利要求，此类植物或植物部分的组合物和应用也属于本发明的范围，特别是其用做饲料和食物或者其添加剂。
转基因植物可以是双子叶或单子叶的，简称为双的子叶或单子叶植物。主要的兴趣是，可作为潜在的食物或种子组分，而且含有植酸的此类植物。种子组分的正常植酸水平为0.1-100g/kg，或者更通常为0.5-50g/kg，最通常为0.5-20g/kg。单子叶植物的实例是禾本科植物，例如草地早熟禾(早熟禾属)，禾本科牧草，如狐茅属、黑麦草属，温带禾本，如，剪股颖属，以及禾谷类，如小麦属、燕麦属、黑麦属、大麦属、稻属、高粱属和玉米属(玉米)。
双子叶植物的实例是豆科植物，例如羽扇豆属、豌豆属、菜豆属和大豆，以及十字花科植物(十字花科)，例如花椰菜、油籽油菜以及密切相关的模式生物拟南芥。
此类转基因植物等能够降解其自身的植酸，相应地减低了对于向含有这类植物的食物或饲料中添加此类酶的需要。优选将植物或植物部分，例如种子，磨碎或粉碎，并且可能在添加至食物或饲料前或者在应用，如摄入前还要浸泡，以便使酶促降解的速度适应实际应用。
如果需要，还可以从植物中回收植物所产生的酶。在某些情况下；优选从植物中回收，以便在随后可能的沉淀步骤中保证制剂的热稳定性。
植物部分的实例是茎、胼胝、叶、根、果实、种子、块茎等。但是任何植物组织也都包括在本定义中。
任何植物细胞，不论组织来源，都包括在上面植物细胞的定义中。
在本发明的范围内还包括这些植物、植物部分和植物细胞的子代。
技术人员将知道如何构建一个DNA表达构建体来插入指定植物，特别是考虑到是否该酶应以一种组织特异性的方式来分泌。同这个评价有关的是在植物的表达室中植酸酶的稳定性(pH稳定性、由内源性蛋白酶的可降解性等)。如果需要的话，他还将能够选择适当的调节序列，如启动子和终止子序列以及信号或转位序列(Tague等，植物，生理，(Plant,Phys.),86,506,1988)。
利用任何已知的方法，可以用该DNA构建体转化植物、植物部分等。这种方法的一个实例是通过病毒或细菌载体的转化，例如经遗传学设计而包括编码本发明中植酸酶的基因的农杆菌属的细菌种。直接将植酸酶DNA引入植物细胞或植物组织的方法在本领域也是已知的，例如显微注射和电穿孔(Gasset等，科学(Science),244,1293；Potrykus，生物/技术(Bio/Techn.)8,535,1990；Shimamoto等，自然(Nature),338,274,1989)。
在转化后，利用技术人员已知的任何方法筛选转化子，随后将它们再生成为完整的植物。
然后，这些植物等以及它们的子代携带植酸酶编码DNA作为它们遗传学部件的一部分。
大体上，以WO 9114782A和WO 9114772A作为参考。
根癌农杆菌介导的基因转移是选择来产生转基因双子叶植物的方法(综述见Hooykas和Schilperoort,1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)19:15-38)，然而，其还可以用于转化单子叶植物。由于宿主范围的限制，在根癌农杆菌辅助下转化单子叶植物通常是不可能。此处需使用其他的方法。选择来产生转基因单子叶植物的方法是对胚胎胼胝或发育中胚胎的微粒轰击(包被有转化DNA的显微金或钨颗粒)(Christou,1992.植物杂志(PlantJ.)2:275-281；Shimatoto,1994.生物技术的当前观点(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；Vasil等，1992.生物技术(Bio/Technology)10:667-674)。
用于将游离DNA转移入这些植物的其他系统也是优选的方法，包括病毒载体(Joshi和Joshi,1991.FEBS Lett.281:1-8)、通过聚乙二醇或电穿孔的原生质体转化(综述见Potyrkus,1991.植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)42:205-225)、向叶肉原生质体中的DNA显微注射(Crossway等，1986.Mol.Gen.Genet.202:79-85)以及向禾谷类植物嫩的花分檗中的DNA显微注射(de la Pena等，1987.自然325:274-276)。
通常将编码本发明植酸酶变体的cDNA或基因置于由在目标植物中有活性的一适当启动子和一适当终止子(转录的终止)组成的一个表达基因盒中(例如Pietrzak等，1986.核酸研究(Nuleic Acids Res.)14:5857-5868)。单子叶植物通过微粒轰击将该基因盒(当然包括合适的筛选标志，见下面)转化入该植物。如果是双子叶植物，首先将表达基因盒置于一提供T-DNA边界以及一个合适的筛选标志的适宜载体中，该载体又被转化入根癌农杆菌。双子叶植物将通过载有由T-DNA为侧翼的表达基因盒以及筛选标志的农杆菌按照标准的方法(例如Akama等，1992.植物细胞报道(Plant Cell Reports)12:7-11)来转化。最近对T-DNA由农杆菌向植物细胞的转移已经进行了综述(Zupan和Zambryski,1995.植物生理学(Plant Physiol.)107:1041-1047)。用于通过农杆菌进行植物转化的载体是商品化的或者可以从许多构建此类载体的实验室获得(例如，Deblaere等，1985.核酸研究13:4777-4788；综述见Klee等，1987.植物生理学年鉴(Annu.Rev.Plant Physiol.)38:467-486)。
可利用的植物启动子：根据操作的步骤，可能需要器官和/或细胞特异性的表达以及适当的发育控制和环境控制。例如，理想的是在玉米胚乳等中表达植酸酶cDNA。最常用的启动子是组成型的35S-CaMV启动子(Franck等，1980.细胞(Cell)21:285-294)。表达在植物各部位中将或多或少是等同的。该启动子已经成功地用于改造除草剂和病原体抗性植物(综述见Stitt和Sonnewald,1995.植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.)46:341-368)。器官特异性启动子已经被报道用于储存性沉降组织(sink tissue)，例如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards和Coruzzi,1990.遗传学年鉴(Annu.Rev.Genet.)24:275-303)，以及用于代谢性沉降组织，例如分生组织(Ito等，1994.植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24:863-878)。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适于所选宿主细胞生长的任何常规培养基。所表达的植酸酶可以方便地分泌到培养基中，并且可以通过众所周知的方法从中回收，包括通过离心或过滤将细胞同培养基分离，用盐，如硫酸铵沉淀培养基的蛋白成分，随后进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。
优选的宿主细胞是镰孢属、汉逊氏酵母属、木霉属或曲霉属的菌株，特别是禾谷镰孢、毒性镰孢(Fusarium venenatum)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、具有镰孢ATCC20334株的鉴别特征的进一步描述于PCT/US/95/07743中的各种镰孢菌种、多形汉逊氏酵母、harzianum木霉(Trichoderma harzianum)或reesei木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉或米曲霉中的一株。
在多形汉逊氏酵母中表达的参考:Gellissen,G.、Piontek,M.、Dahlems,U.、Jenzelewski,V.、Gavagan,J.E.、DiCosimo,R.、Anton,D.I.和Janowicz,Z.A.(1996)。重组的多形汉逊氏酵母作为生物催化剂：菠菜乙醇酸酯氧化酶(GO)以及酿酒酵母催化酶T(CTT1)基因的共表达。应用微生物学生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)46,46-54。
根据本发明植酸酶变体的一些更特定的应用登载于PCT/DK97/00568,发明详述部分的最后数页。
在一优选的实施方案中，本发明的植酸酶变体基本上不含其他非植酸酶多肽，例如，通过SDS-PAGE确定的至少大约20％的纯度、优选至少大约40％的纯度、更优选大约60％的纯度、还要更优选大约80％的纯度、最优选大约90％的纯度而且更加更优选大约95％的纯度。有时此类多肽或者指一种“纯化的”和/或“分离的”植酸酶。
含有本发明植酸酶变体的植酸酶多肽包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于该多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通过将编码另一多肽的核酸序列(或其一部分)融合至编码本发明一种植酸酶变体的核酸序列(或其一部分)来制备的。用于制备融合多肽的技术在本领域是已知的，而且包括连接编码多肽的编码序列，以便它们在同一阅读框架中而且融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制下。
“饲料”和“食物”分别指预期或适合分别被动物或人食用、摄取、消化的任何天然的或人工的饮食、膳食或诸如此类或者此类膳食的组分。
本发明的植酸酶变体可以在体外或体内发挥其效应，即分别在摄入前或在机体的胃中。也可能是联合作用。
根据本发明的植酸酶组合物通常包括至少一种本发明的植酸酶。
通常，植酸酶组合物是液态的或干燥的。
液态组合物不需要含有除植酸酶外的任何组分，优选处于一种高度纯化的形式。然而，通常也加入一种稳定剂如甘油、山梨醇或单丙二醇。液态组合物还可以包括其他添加剂，例如盐、糖、防腐剂、pH调节剂、蛋白质、植酸盐(植酸酶底物)。典型的液态组合物是基于水或油的粘合液。液态组合物在其选择性沉淀后可以加至食物或饲料中。
干燥的组合物可以是喷雾干燥的组合物，在这种情况下组合物不需要含有除干燥形式的酶以外的任何组分。然而，通常干燥的组分就是所谓的颗粒可能易于同例如食物或饲料组分混合，或者更优选形成预混合料的组分。酶颗粒的颗粒大小优选同混合物中其他组分的大小一致。这提供了将酶掺进例如动物饲料中的一种安全而且方便的方式。
在一高剪切力的搅拌机(例如Lodige)中利用团聚技术制备团聚颗粒，在此过程中一种填充剂材料同酶团聚成颗粒。通过使载体材料的核心吸收酶/被酶包被来制备吸收颗粒。
典型的填充剂材料是盐，例如硫酸钠。其他填充剂为陶土、滑石、硅酸镁铝以及纤维素纤维。选择性地，粘合剂，例如糊精也包括在团聚颗粒中。
典型的载体材料是淀粉，例如木薯、玉米、马铃薯、大米和小麦。盐也可以使用。
选择性地，颗粒由包被混合物来包裹。此类混合物包括包被剂，优选疏水包被剂，例如氢化棕榈油和牛油，以及必要时加其他添加剂，例如碳酸钙或陶土。
另外，植酸酶组合物可以含有其他替代物，例如生色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其他饲料或食物强化酶，即提高饲料/食物的营养性质的酶，等。特别是对于所谓的预混合料就是如此。
“食物或饲料添加剂”是用来或适于添加到食物或饲料中的基本上纯的化合物或多组分组合物。特别是其是一种物质，其预期的用途是成为一种食物或饲料产品的组分或影响一种食物或饲料产品的任何特征。其由如上面对植酸酶组合物所说明的所组成。典型的添加剂通常包括一种或多种化合物，例如维生素、矿物质或饲料强化酶以及适当的载体和/或赋形剂。
在一优选的实施方案中，本发明的植酸酶组合物额外包括有效数量的一种或多种饲料强化酶，特别是选自由α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，特别是乳糖酶，其他植酸酶、β-葡聚糖酶，特别是内-β-1,4-葡聚糖酶和内-β-1,3(4)葡聚糖酶，纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖内-1,4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内-1,3-β-半乳糖苷酶，内葡聚糖酶，特别是内-1,2-β-葡聚糖酶、内-1,3-α-葡聚糖酶和内-1,3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，特别是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶、果胶酸盐裂解酶和α-半乳糖醛酸苷酶，甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯糖基木聚糖酶以及脂解酶例如脂肪酶、磷脂酶和角质酶所组成组合的饲料强化酶。
本发明的动物饲料添加剂是在进食前或进食同时添加给单胃动物。本发明的动物饲料添加剂优选在进食的同时添加给单胃动物。在一更优选的实施方案中，动物饲料添加剂以颗粒或稳定液体的形式添加到膳食中。
在食物或饲料中植酸酶的有效数量是从大约10到20,000；优选从大约10到15,000，更优选从大约10到10,000，特别是从大约100到5,000，尤其是从大约100到大约2,000 FYT/kg饲料或食物。
本发明植酸酶的其他特定用途的实例是在大豆加工或在肌醇或其衍生物的生产中。
本发明还涉及用于降低动物粪尿中植酸盐水平的方法，其中给动物喂养含有有效数量的本发明植酸酶的饲料。
本发明还包括在食物或饲料制品或添加剂的制备过程中对本发明植酸酶的应用，即植酸酶仅在生产过程中发挥其植酸酶活性而在最终食物或饲料产品中没有活性。该方面与例如调面和烘烤相关。
本发明涉及一种植酸酶变体，当利用同P_lycii相应的位点编号按照图1对齐排列时，同一模式植酸酶相比，其在至少下述位点之一处是改变的：24；27；31；33；39；40；41；42；43；44；45；46；47；49；51；56；58；59；61；62；68；69；70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；88；90；102；115；116；117；118；119；120；121；122；123；124；125；126；127；128；132；143；148；149；150；151；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；170f；170g；171；172；173；184；185；186；187；187a；190；191；192；193；194；195；198；199；200；201；201a；201b；201c；201d；201e；201f；202；203；203a；204；205；211；215；220；223；228；232；233；234；235；236；237；238；239；242；243；244；246；251e；253；256；260；264；265；267；270；271；272；273；274；275；276；277；278；279；280；283；285；287；288；292；293；302；304；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；342；343；348；349；352；360；362；364；365；366；367；368；369；370；371；372；373；374；375；376；383k；387；393；394；396；404；409；411；412；413；417；421；431.
从这些变体，我们预期改变的特征，优选改变的活性特征。事实上，几种变体已经表现出此类改变的特征(见实验部分)。同上面相似，“改变”意指同模式植酸酶相比。“改变的活性特征”意指在至少一个植酸酶活性相关方面被改变，例如(非排他性列举)：pH稳定性、温度稳定性、pH适应性、温度适应性、特异性活性(特别是同pH和温度相关的)、底物特异性、底物切割模式、底物结合、位点特异性、磷酸盐从玉米释放的速度和水平、反应率、植酸盐降解率、释放的磷酸盐所达到的最终水平。
优选的改变活性特征是改变的特异性活性，优选提高的活性，而且优选在pH 3、4、5或6下提高的活性；改变的pH或温度适应性；和/或改变的，优选提高的热稳定性，例如如DSC所测定的提高的熔解温度。
优选的植酸酶变体是：当利用同P_lycii相应的位点编号根据图1对齐排列时，同一模式植酸酶相比，其在至少下述位点之一处是改变的植酸酶变体：43；44；47；51；58；62；78；80；83；88；90；102；143；148；153；154；186；187a；195；198；201e；204；205；211；215；220；242；244；251e；260；264；265；267；270；273；278；302；336；337；339；352；365；373；383k；404；417.
下述烟曲霉的变体组成一个亚群：
Q43L；Q270L；G273D,K；N336S；A205E；Y278H；Q43L+Q270L；Q43L+Q270L+G273D；Q43L+Q270L+G273D+N336S；G273K+A205E；G273K+A205E+Y278H(see EP 0897010)。
通常，如下可以推断或鉴定出本发明的变体：观察根据图1的对齐排列，比较两个序列，其中一个为一种有改变性质的模式植酸酶，确定在相关位点/区域的氨基酸差异并将在相关位点处的氨基酸从模式植酸酶转移到(置换)另一植酸酶序列。
本发明还涉及制备植酸酶变体的方法，其包括上面的方法，而且进一步包括相应DNA序列的推断和合成、宿主细胞的转化、宿主细胞的培养以及植酸酶变体的回收。
相关的位点/区域包括下面提到的同重要的植酸酶活性特征，如特异性活性、热稳定性、pH活性/稳定性相关的那些。
本发明还涉及植酸酶变体(本文所定义的各种模式植酸酶)，其是通过上面概述的步骤可获得的，优选获得的，并且其预期表现改变的特征/性质，优选表现例如改善的特异性活性等此类改变的特征。
至少担子菌纲模式植酸酶P_lvcii和绒毛栓菌表现出一种高度特异性的活性(如本文实施例2的方法所确定的)。
这是预期性质的一个实例，通过那种例如上面提到的推断步骤，可以将其转移至其他植酸酶，例如在图1中所列举的其他植酸酶，特别是A_pediades和子囊菌纲植酸酶例如烟曲霉、无花果曲霉、共有植酸酶A。
因此，变体预期具有改变的特异性活性，特别是改善的特异性活性，特别是在低pH和/或高温下，其中变体已经在相关区域被改变，即(ⅰ)在指向活性位点裂口的氨基酸残基；或者(ⅱ)在紧邻这些活性位点残基处的氨基酸残基。优选，紧邻意指在距离活性位点残基10以内。
由pdb文件1IHP(布鲁克海文数据库(Brookhaven Database)条目18.03.98re lIHP，磷酸单酯酶的结构，D.Kostrewa；或者如在自然结构生物学(NatureStructural Biology)4,1997,185-190页中所发表的)可以鉴定活性位点区域，利用来自分子模拟MSI，圣迭哥，加利弗尼亚的程序INSIGHTII并利用子命令，可以确定一个“活性位点外框”，其包括那些位置靠近催化残基的氨基酸残基，在无花果曲霉植酸酶中确定为H59、D339和R58(分别同隔孢伏革菌编号H71、D335和R70相对应)。一个“活性位点外框(10)”包括那些位于距离上述催化残基10以内的残基。
距离H71和D335在10以内的残基如下(利用隔孢伏革菌编号)：41-47、68-77、115-118、120-126、128、149-163、185、191-193、199、243、270-271、273-275、277-279、288、332-343、364-367、369-375、394(“活性位点外框(10)”)。
优选，还可以确定一个“底物结合外框”，其包括那些紧邻底物结合位点因而预期可能同底物接触的残基。
如上面所描述可以通过在活性位点裂口(形成活性位点的表面的残基)中接入一种植酸钙镁的糖类似物来推断这些信息。如果一种没有任何磷酸基团的糖例如，α-D-葡萄糖(椅式构象，由INSIGHTII程序提供的结构)接入活性位点裂口中，利用如下所示的一个固定距离，利用子命令以及距底物类似物10的距离可以得出指向活性位点裂口的残基。或者，化合物肌醇-1,4,5-三磷酸酯(布鲁克海文数据库文件1djx，肌醇-1,4,5-三磷酸酯)可以接入活性位点裂口中。然而，该化合物和葡萄糖或多或少是可叠加的。
以埃()计的距离为：从α-D-葡萄糖6号位处的氧原子到
H59的原子ND1：    5.84
R58的原子NH2：    6.77
R142的原子NH2：   5.09
N340的原子ND2：   3.00
H59的原子ND1：    7.76
R58的原子NH2：    8.58。
(上述残基的隔孢伏革菌编号分别为：H71、R70、R155、N336、H71和R70。)
这样，将与底物接触的残基鉴定如下(隔孢伏革菌编号)：43-44；70-80；83-84；115；153；155-156；184；191-192；198-202；205；235；238；242；270；272-273；275-277；332-336；338；369；371(“底物结合外框(10)”)。
在一个或多个(1)活性位点外框或(2)底物结合外框处被改变的变体被强烈预期具有改变的特异性活性。这引起下面位点的联合分组(仍为隔孢伏革菌编号和10的外框)：
41-47,68-80,83-84,115-118,120-126,128,149-163,184-185,191-193,198-201e,202-203,205,235-236,238-239,242-243,270-279,285,288,332-343,364-367,369-375,394.
优选，如上所述利用图1的担子菌纲模式植酸酶(隔孢伏革菌植酸酶为一种优选的模式)来确定活性位点外框和底物结合外框。利用图1的对齐排列可推断其他模式植酸酶的相应变体。
在一优选的实施方案中，在子命令中利用了一个5的距离，因此确定具有一更有限大小的活性位点和底物结合外框，例如包括残基43-44、69-74、117、125、155-156、159、274、332-340、370-374(距离H71和D3355)的一个活性位点外框，“活性位点外框(5)”。
通常活性位点外框和底物结合外框区域构成用于选择随机诱变区域的基础。优选的随机诱变区域的实例为
区域69-74、332-340、370-374，待加入添加剂(一个5的距离)；以及
区域57-62、142-146、337-343，待加入添加剂(一个10的距离)。
目前预计在这些位点的任意一个中的任何改变将产生一种具有改变的特征，例如改变的特异性活性的植酸酶。
上面的描述“在这些位点的任意一个中的任何改变”被认为完全等价于列举的每个位点以及每个置换，例如对于上面的亚群41-47如下：
41A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
42A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
44A,C,D,E,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
45A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y,
46A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
47A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y.
在一优选的实施方案中,改变的特异性活性预期来自下面的变体：
42S,G；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；45D,S；47Y,F；51E,A；75W,F；78S,D；79G；80K,A；83I,Q；84Q,V；116S；118V,L；119E；120L；122A；123N,T；125S；126H,S；127Q,E；128A,T；151A,S；152G；153D,Y；154Q,D,G；157V；158D,A；1S9T；160A,S；161T,N；162N；163W；184Q,S；186A,E；198A,N；200G,V；201D；
201a、201b、201c、201d、201e、201f中一个或多个——优选全部的缺失；
202S；205Q,E；235Y,L；238L,M；242P；270Y,A,L；271D；273D,K；275F,Y；278T,H；332F；336S；337T,Q；339V；340P,A；343A,S；364W,F；365V,L；366D,V；367K；368K；369I,L；370V；373S；374A；375H；376M；393V.
特别优选的变体如下：78S；79G；80A；83I,Q；84Q,V；198A,N；200G,V；201D；201a、201b、201c、201d、201e、201f中一个或多个——优选全部的缺失；202S；205Q,E；235Y,L；238L,M；242P；273D；275F,Y。
其他特别优选的变体如下：43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；特别是43M,P；75W,F；80K；153D；184Q,S；270Y,A；332F；369I,L。
下面的变体是非常优选的：43L,G,N,V,A,I,T；78D；153Y；154G；270L；273D,K。双重或三重变体(43L/270L)；(43L/270L/273D)；(43L/78D)以及(43L/153Y/154G)也是非常优选的。其他优选的变体是205E；278H；336S。
这些非常优选的单重、双重和三重变体优选为可以在图1对齐排列的模式植酸酶的变体,特别是在图1中所列举的特定模式植酸酶的变体。
至少已知共有植酸酶A具有一高的热稳定性。进一步P_lvcii的热稳定性也是相当高的。
这是一个能通过诸如上述的推断步骤转移到其他植酸酶,例如在图1中所列举的其他植酸酶,特别是担子菌纲植酸酶,例如P_lvcii和A_pediades中的所需特性的实例。
根据这个背景,下述变体预期具有改变的热稳定性，特别是提高的热稳定性：
39H,S；40L,N；43P；47Y,F；49P；51E,A；56P；58D；61IR；62V；80K；83A；84Y；172P；184P；195T；198A；204V；211L；223D；236Y；242P；246V；253P；264R；265Q；280A,P；283P；287A；292F,Y；293A；302R；304P；337S；348Y；387P；396R；409R；411K；412R；417E；421F,Y.
特别优选下述具有改变的热稳定性的变体：39S；40N；47Y,F；51A；83A；195T；204V；211L；242P；265A。
具有改变的热稳定性的变体还有如下：
42G；43T,L,G；44N；58K,A；59G；62I；69Q；75F；78D；79G；80A；81A,G；82T；83K,R；84I；88I；90R,A；102Y；115N；118V；122A；123Q,N；125M,S；126V,S；127N,Q；128S,A；143N,K；148V,I；154S；158D；170fH；170gA；171T,N；172N；173W,184S；186A；187A；187aS；193S；195V,L；198V；201E；201eT；202A,203aT；204A；211V,215P,A；220L,N；223H；228N；232T；322E；235T；236N；242S；244D；251eQ,E；256D；264I；260A,H；265A；267D；270G；271D；273K,D；278T,H；287T；293V；302H；337T,G；338I；339V,I；340A；352K；365A,S；366S；367A；369L；373S,A；374S；376M；383kE,Q；404G,A；411T；417R；431E.
预期能使植酸酶的热稳定性提高的本发明的其它构想如下-参照前文引用的1IHP结构并通过本文所概述的按图1之对齐排列进行的转移：
(A)在间隙位点引入脯氨酸，这些位点是能充满脯氨酸特异性双面夹角，和不阻碍氢原子结合网络，而且未发现空间冲突的位点。
(B)填补孔洞：通过置换内部空腔中较大的残基通常可以使稳定性提高。
(C)半胱氨酸桥：半胱氨酸桥通常将使蛋白质具有更大的刚性，而且增加伸展能。
根据(A)至(C)的这些构想预期具有改变的热稳定性变体进一步还有：27P、31Y、132F、132I、132L、184P、186P、190P、280P、343F、343I、343L、349P、362P以及(33C和24C)。
构想(A)：27P、184P、186P、190P、349P、362P。
构想(B)：343F,I,L、31Y、132F,I,L、273F。
构想(C)：33C/24C。
另一个预期的性质是pH活性或稳定性的改变，优选稳定性的改变，特别是在低pH下的改变，而且特别是提高，其可以通过按图1进行对齐排列以及从pH适应性提高的模式植酸酶传递至其他植酸酶来被传递-如上述。
预期能使植酸酶在低pH时的稳定性提高的本发明其它构想如下-参照前文引用的1IHP结构并通过本文所概述的按图1之对齐排列进行的转移：
(D)表面电荷：在低pH下的更好的分布来避免负或正电荷的聚集，并避免带有相同电荷的残基过于靠近。
(E)脱酰氨基作用：暴露Q或N的表面同带有负电荷的残基紧密接触。
在低pH下pH稳定性/活性提高的植酸酶变体预期为：39H；39Q；80A；203R；271N；51R；154S；185S；194S；194T；288L；288I；288F；360R；173Q,S；204Q,S；303K,S；81Q,E。
构想(D)：203R、271N、51R、185S；360R；173Q,S；204Q,S；303K,S；81Q,E。
构想(E)：154S；194S,T；288L,I,F。
对于(D)和(E)这些构想的优选的模式植酸酶为P_lycii。
实验证实最佳pH值降低的是：子囊菌纲植酸酶变体80A，特别是烟曲霉的植酸酶和共有植酸酶A。
非常优选的单重、双重和三重变体为43L；(43L/270L)和(43L/270L/273D)。这些变体具有一改变的pH适应性。它们优选为在图1中所列举的特定模式植酸酶的变体。
对于上面所列举的所有优选变体：
稳定性优选在高温下被改变，即在50-100℃，特别是60-90℃的温度范围内，更优选在70-90℃的范围内。
活性优选在适用于动物胃肠道系统的相应温度范围内被改变，例如30-40℃，更优选32-38℃，最优选在35-38℃的范围内。
稳定性优选在低的pH下被改变，即在pH1.5-7，优选2-6，更优选3-5的范围内。
活性优选在pH1.5-5.5，更优选在pH2.5-4.5，还更优选3-5的范围内被改变。
对于如上提到的改变的植酸酶特征的测试法是本领域众所周知的，而且任何此类测试都可以用来比较植酸酶变体和模式植酸酶的性能。
在实施例2中给出了特异性活性的优选测试法。在实施例3中给出了pH和温度活性以及稳定性的优选测试法。热稳定性的更优选测试法为实施例4的DSC方法。
WO 98/28409也公开了各种其他参数如位点特异性的测试。WO98/28409的所有测试法都为优选的测试法。
当然总体上所有这些测试法都可以在预期的pH值和温度下进行。
在附属的权利要求中，详细说明了基于本文明确公开的十三种模式植酸酶中五种的一些优选的植酸酶变体。
用类似的方式可以很容易推断出基于剩余八种明确公开的模式植酸酶的其他优选变体，方法是对图1中每一相应序列作上述改变。这些优选的变体明确地包括在本发明中，而且它们很容易推断，即如下：
衍生自Paxillus，优选Paxillus involutus，其中又优选CBS 100231株的模式植酸酶变体，优选P_involtus-Al的植酸酶变体，其序列示于图2中，上述的变体包括至少下列改变之一：()24C；T27P；F31Y；I33C；R39H,S,Q；N40L；S42G；
P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；A51E,R；A58D；K；Q61R；I62V；F75W；S78D；A80K；T81Q,E,G,A；R83A,I,Q,K；I84Y,Q,V；L88I；K90R,A；F102Y；S115N；D116S；V118L；P119E；F120L；A123N,T,Q；S125M；F126H,S,V；D127Q,E,N；A128T,S；A132F,I,L；I148V；D151A,S；S153D,Y；D154Q,S,G；D158A；S159T；A160S；T161N；()170fH；()170gA；S171N；H172P；N173Q,S；P184Q,S；Q185S；T186A,E,P；G187A；()187aS；T190P,A；D193S；N194S,T；M195T,V,L；A198N,V；G200V；D201E；()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；V205E；V211L；S215A,I；L220N；A223D,H；D233E；F235Y,L,T；N236Y；L237F；V238L,M；A242P,S；M244D；()251eE,Q；D253P；T256D；P260A,H；E264R,I；A265Q；A267D；G270Y,A,L；D271N； D273K；F275Y；T278H；Y280A,P；E283P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；V293A；N302R,H；A304P；N336S；L337T,Q,S,G；M338I；V339I；A340P；S343A,F,I,L；F348Y；R349P；A352K；P360R；R362P；W364F；R365V,L,A,S；T366D,V,S；S367K,A；S368K；L369I；S373A；G374A,S；R375H；()383kQ,E；T387P；Q396R；G404A；L409R；T411K；L412R；E417R；F421Y.
衍生自Paxillus属，优选Paxillus involutus种，其中又优选CBS 100231株的模式植酸酶变体，优选P_involtus-A2的植酸酶变体，其序列示于图3中，上述的变体包括至少下列改变之一：P24C；I27P；F31Y；I33C；R39H,S,Q；N40L；S42G；
P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；A51E,R；A58D,K；E61R；I62V；F75W；S78D；A80K；A81Q,E,G；R83A,I,Q,R,K；I84Y,Q,V；L88I；K90R,A；F102Y；S115N；D116S；V118L；P119E；F120L；A123N,T,Q；S125M；F126H,S,V；D127Q,E,N；A128T,S；V132F,I,L；D143N；I148V；D151A,S；S153D,Y；D154Q,S,G；D158A；A160S；T161N；()170fH；()170gA；S171N；R172P；N173Q,S；P184Q,S；Q185S；T186A,E,P；G187A；()187aS；T190P,A；D193S；N194S,T；M195T,V,L；A198N,V；G200V；E201D；()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；V205E；S211L,V；S215A,P；L220N；A223D,H；A232T；F235Y,L,T；N236Y；L237F；V238L,M；P242S；M244D；()251eE,Q；D253P；T256D；P260A,H；E264R,I；A265Q；A267D；G270Y,A,L；D271N；D273K；F275Y；T278H；Y280A,P；A283P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；I293A,V；N302R,H；A304P；N336S；L337T,Q,S,G；M338I；V339I；340P,A；A343S,F,I,L；F348Y；R349P；A352K；P360R；R362P；W364F；L365V,A,S；T366D,V,S；S367K,A；S368K；V369I,L；S373A；R375H；()383kQ,E；T387P；Q396R；G404A；L409R；A411K,T；L412R；E417R；Y421F.
衍生自栓菌属的一个种，优选绒毛栓菌种，其中又优选CBS 100232株的模式植酸酶变体，优选绒毛栓菌的植酸酶变体，其序列示于图4中，上述的变体包括至少下列改变之一：R24C；T27P；L31Y；V33C；Q39H,S；S40L,N；S42G；
M43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；A51E,R；A58D,K；S59G；Q61R；I62V；E75W；S78D；A80K；A81Q,E,G；R83A,I,Q,K；I84Y,Q,V；V88I；K90R,A；L102Y；D115N；V118L；T123N,Q；S125M；S126H,V；E127Q,N；A128T,S；A132F,I,L；D143N；V148I；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；A158D；A160S；N161T；()170fH；()170gA；S171N；S172P；N173Q,S；S184Q,P；E185S；A186E,P；G187A；()187aS；T190P,A；N194S,T；M195T,V,L；A198N,V；G200V；()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；V205E；Q211L,V；P215A；L220N；G223D,H；D233E；Y235L,T；N236Y；L237F；L238M；P242S；E244D；()251eE,Q；E253P；Q260A,H；D264R,I；A265Q；A267D；A270Y,L,G；D271N；D273K；F275Y；T278H；Y280A,P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；I293A,V；A302R,H；N304P,A；N336S；Q337T,S,G；M338I；V339I；A340P；S343A,F,I,L；F348Y；N349P；A352K；P360R；R362P；F364W；L365V,A,S；V366D,S；K367A；I369L；A373S；A374S；R375H；()383kQ,E；Q387P；A396R；G404A；V409R；T411K；L412R；E417R；Y421F.
衍生自曲霉属的一个种，优选构巢曲霉种，其中又优选DSM 9743株的模式植酸酶变体，优选构巢曲霉的植酸酶变体，其序列示于图10中，上述的变体包括至少下列改变之一：V24C；A27P；H39S,Q；V40L,N；G42S；
Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；S49P；E51A,R；V56P；H58D,K,A；E61R；V62I；S69Q；Y75W,F；E78D,S；S79G；K80A；S81Q,E,A,G；K82T；A83I,Q,K,R；Y84Q,V,I；A90R；D115N； D116S；T118V,L；I119E；F120L；E122A；N123T,Q；M125S；V126H,S；D127Q,E,N；S128A,T；F132I,L；K143N；I148V；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；A158D；S159T；A160S；E161T,N；K162N；F163W；G170fH；S1709A；()171N；()172P；K173Q,S；P184Q,S；E185S；I186A,E,P；D187A；G187aS；T190P,A；H193S；S194T；S198A,N,V；
R201f()(缺失至少201d、201e、201f之一，优选全部)；A202S；D203R,K,S；E203aV,T；I204Q,E,S,A,V；I211L,V；P215A；L220N；D223H；K228N；E232T；N233E；I235Y,L,T；Y236N；L237F；M238L；S242P；M246V；E251eQ；A256D；E260A,H；L264R,I；Q270Y,A,L,G；S271D,N；S273D,K；Y275F；G278T,H；A280P；A287T；Q288L,I,F；F292Y；T293A,V；Q302R,H；P304A；N336S；S337T,Q,G；M338I；I339V；S340P,A；F343A,S,I,L；N349P；Q352K；S360R；Q362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；S367K,A；W368K；T369I,L；G373S,A；A374S；R375H；A376M；E383kQ；A404G；T411K；L412R；E417R；F421Y；K431E.
衍生自曲霉属的一个种，优选土曲霉种，其中又优选CBS 220.95株的模式植酸酶的变体，优选土曲霉的植酸酶变体，其序列示于图12中，上述的变体包括至少下列改变之一：
G24C；V27P；H39S,Q；K40L,N；G42S；
L43A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；A45D,S；Y47F；S49P；Q51E,A,R；V56P；P58D,K,A；D59G；H61R；I62V；A69Q；S75W,F；H78D,S；S79G；K80A；T81Q,E,A,G；A83I,Q,K,R；Y84Q,V,I；A90R；E115N；E116S；T118V,L；P119E；F120L；R122A；N123T,Q；L125S,H；R126H,S,V；D127Q,E,N；L128A,T,S；F132I,L；H143N；V148I；T151A,S；D152G；A153D,Y；S154D,Q,G；H157V；E158D,A；S159T；A160S；E161T,N；K162N；F163W；H173Q,S；P184Q,S；E185S；G186A,E,P；S187A；A187aS；T190P,A；H193S；S194T；L195T,V；A198N,V；E200G,V；S201D,E；S201d()；T201e()；V201f()；G202S,A；D203R,K,S；D203aV,T；A204Q,E,S,V；V205E；V211L；A215P；L220N；D223H；Q228N；D232T；D233E；V235Y,L,T；N236Y；L237F；M238L；P242S；E244E；T251eE,Q；A260H；T264R,I；Q265A；N267D；L270Y,A,G；S271D,N；K273D；Y275F；H278T；G280A,P；V287A,T；Q288L,I,F；W292F,Y；A293V；Q302H；P304A；N337T,Q,S,G；L338I；V339I；S340P,A；W343A,S,F,I,L；N34 9P；A352K；S360R；S362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；A367K；W368K；T369I,L；A373S；A374S；R375H；A376M；R383kQ,E；P404A,G；K411T；A417E,R；F421Y；A431E.
衍生自踝节菌属的一个种，优选嗜热踝节菌种，其中又优选ATCC 20186或ATCC 74338株的模式植酸酶的变体，优选嗜热踝节菌的植酸酶变体，其序列示于图13中，上述的变体包括至少下列改变之一：H24C；V27P；H39S,Q；S40L,N；G42S；
Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；F47Y；S49P；A51E,R；V56P；Q58D,K,A；N59G；K61R；I62V；Y75W,F；S78D；S79G；K80A；T81Q,E,A,G；E82T；L83A,I,Q,R,K；Y84Q,V,I；R90A；D116S；T118V,L；P119E；F120L；E122A；N123T,Q；M125S；I126H,S,V；Q127E,N；L128A,T,S；F132I,L；V148I；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；I157V；A158D；S159T；G160A,S；R161T,N；L162N；F163W；S170gA；D171N；K172P；H173Q,S；E184Q,S,P；E185S；G186A,E,P；D187A；T190P,A；T193S；G194S,T；S195T,V,L；V198A,N；E200G,V；D201E；S201d()；S201e(),T；S201f()；G202S,A；H203R,K,S；D203aV,T；A204Q,E,S,V；Q205E；Q211L,V；A215P；I220N,L；H223D；D228N；S232T；D233E；P235Y,L,T；Y236N；M237F；D238L,M；P242S；E244D；L246V；()251eE,Q；A256D；Q260A,H；Q264R,I；A265Q；Q270Y,A,L,G；S271D,N；G273D,K；Y275F；N278T,H；G280A,P；A287T；Q288L,I,F；F292Y；V293A；H302R；P304A；N336S；T337Q,S,G；M338I；T339V,I；S340P,A；A343S,F,I,L；N349P；A352K；S360R；E362P；Y364W,F；S365V,L,A；A366D,V,S；A367K；W368K；T369I,L；G373S,A；G374A,S；R375H；A376M；D383kQ,E；E404A；K411T；R417E；F421Y.
衍生自Thermomyces属的一个种，优选Thermomyces lanuginosus种，其中又优选DBS 586.94株的模式植酸酶的变体，优选T-lanuginosa的植酸酶变体，其序列示于图14中，上述的变体包括至少下列改变之一：K24C；()27P；()31Y；()33C；R39H,S,Q；H40L,N；G42S；
Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；F47Y；S49P；A51E,R；V56P；K58D,A；V62I；S69Q；Y75W,F；A78D,S；H79G；K80A；S81Q,E,A,G；E82T；V83A,I,Q,K,R；Y84Q,V,I；L88I；R90A；F102Y；D115N；N116S；T118V,L； R119E；F120L；E122A；E123N,T,Q；M125S；M126H,S,V；E127Q,N；S128A,T；F132I,L；E143N；V148I；A151S；S153D,Y；A154D,Q,S,G；I157V；A158D；S159T；A160S；E161T,N；F162N；F163W；R170fH；S170gA；K172P；D173Q,S；S184Q,P；E185S；E186A,P；T187A；G187aS；T190P,A；G193S；L194S,T；T195V,L；A198N,V；E200G,V；E201D；A201d()；P201e(),T；D202S,A；P203R,K,S；T2C3aV；Q204E,S,A,V；P205E；V211L；R215A,P；I220L,N；H223D；E232T；D233E；P235Y,L,T；L236Y,N；M238L；P242S；Q251eE；H256D；Q260H；M264R,I；A265Q；Y270A,L,G；T271D,N；D273K；Y275F；H278T；G280A,P；A283P；S287A；R288L,I,F；F292Y；V293A；G302R,H；P304A；N336S；T337Q,S,G；M338I；T339V,I；G340P,A；S343A,F,I,L；N349P；P360R；T362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；S367K,A；W368K；T369I,L；A373S；A374S；R375H；A376M；E383kQ；R404A,G；R411K,T；K417E,R；F421Y；D431E.
衍生自毁丝菌属的一个种，优选嗜热毁丝菌种，其中又优选ATCC 48102或ATCC 74340株的模式植酸酶的变体，优选嗜热毁丝菌的植酸酶变体，其序列示于图7中，上述的变体包括至少下列改变之一：S24C；F31Y；H39S,Q；F40L,N；G42S；
Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；S49P；p51E,A,R；I56P；D58K,A；D59G；E61R；V62I；S69Q；A75W,F；L78D,S；K79G；R80K,A；A81Q,E,G；A82T；S83A,I,Q,K,R；Y84Q,V,I；R90A；D115N；E116S；T118V,L；R119E；T120L；Q122A；Q123N,T；M125S；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；F132I,L；K143N；V148I；A151S；Q153D,Y；D154Q,S,G；H158D,A；S159T；A160S；E161T,N；G170fH；S170gA；T171N；F163W；V172P；R173Q,S；P184Q,S；E185S；T186A,E,P；G187aS；T190P,A；N193S；D194S,T；L195T,V；A198N,V；E200G,V；E201D；G201a()；P201b()；Y201c()；S201d()；T201e()；I201f()；G202S,A；D203R,K,S；D203aV,T；A204Q,E,S,V；Q205E；T211L,V；P215A；V220N,L；N223D,H；A232T；D233E；V235Y,L,T；A236Y,N；L237F；M238L；P242S；E244D；A251eE,Q；R256D；E260A,H；R264I；A265Q；Q270Y,A,L,G；S271D,N；K273D；Y275F；Y278T,H；P280A；T287A；Q288L,I,F；F292Y；V293A；()302R,H；P304A；N336S；D337T,Q,S,G；M338I；M339V,I；G340P,A；G343A,S,F,I,L；D349P；P352K；D360R；E362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；S367K,A；W368K；A369I,L；A373S；A374S；R375H；I376M；E383KQ；E387P；G404A；M409R；T411K；L412R；E417R；F421Y；D431E.
本发明还提供了一种新型植酸酶，其衍生自Cladorrhinum的一个株，即C.Foecundissimum。相应地，本发明还涉及一种具有植酸酶活性的多肽，而且其包括SEQ ID NO:2或其成熟部分(16-495位氨基酸)；或者一种与之至少70，更优选75、80、85、90、95％同源的多肽；同源性意指相似性，优选同一性，是通过利用程序GAP和本文上面所确定的设置来确定的。本发明涉及一种DNA构建体，其编码一种具有植酸酶活性的多肽，该DNA构建体包括一种DNA分子，其包括SEQ ID NO:1或其20-70和207-1560号核苷酸；或者其20-70和207-1563号核苷酸；或者其65-70和207-1560号核苷酸；或者其65-70和207-1563号核苷酸；或者一种DNA构建体或分子，其同这些核苷酸序列中任何一种至少70、75、80、85、90、95％同源；同源性意指相似性，优选同一性，是通过利用本领域已知的计算机程序，例如在GCG程序包中提供的GAP(威斯康星包的程序手册，版本8,1996年8月，遗传学计算机组，575 Science Drive,Madison,Wisconsin，美国53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志(Joumal ofMolecular Biology),48,443-453)来确定的。利用GAP按照下列设置进行DNA序列比较：5.0的GAP形成补偿和0.3的GAP延伸补偿。本发明还涉及一种DNA构建体，其在本文上面提到的条件下同上述DNA序列中的任何一个杂交。
实施例
实施例1
植酸酶活性检测(FYT)
利用下面的检测可以测定植酸酶活性：
将10μl稀释的酶样品(稀释于0.1M乙酸钠、0.01％吐温20,pH5.5)加入到在0.1M乙酸钠、0.01％吐温20、pH5.5中的5mM植酸钠(Sigma)250μl(植酸钠溶解后调节pH；预热底物)中并于37℃温育30分钟。通过加入250μ1 10％TCA来终止反应，并通过加入在100ml钼酸盐试剂(将在8mlH2SO4中溶解的2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O稀释至250ml)中溶解的7.3gFeSO4500μl来测定游离磷酸根。在一96孔微量滴定板中测定200μl样品在750nm处的吸光度。同时测定的有底物和酶的空白对照。还包括一个磷酸根的标准曲线(0-2mM磷酸根)。1FYT等于在给定的条件下每分钟释放1μmol磷酸根的酶的量。
实施例2
对特异性活性的测试
按照下述方法可以确定特异性活性：
利用一种高度纯化的植酸酶样品(预先在一SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测纯度，表现出仅有一种组分存在)。
按照下述方法通过氨基酸分析确定在植酸酶样品中的蛋白质浓度：在一抽真空的玻璃试管中于110℃将一份植酸酶样品在6N HCl、0.1％苯酚中水解16小时。利用Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统按照制造商的说明进行操作对所获的氨基酸定量。根据氨基酸的量可以计算出水解样品中蛋白质的总质量-从而还有浓度。
以FYT为单位确定活性。一个FYT等于在pH5.5、37℃下每分钟从植酸盐(5mM植酸盐)释放1微摩尔无机磷酸根的酶的量；测试法描述于例如实施例1中。
特异性活性是FYT/mg酶蛋白的值。
实施例3
对温度和pH活性及稳定性的测试
温度和pH活性及稳定性可以按照下述的方法确定：
温度适应性(即温度活性关系)通过在各种温度下进行实施例1的FYT测试(预热底物)而定。
温度稳定性通过在检测残存活性前在各种温度下于0.1M磷酸钠、pH5.5中预温育植酸酶而定。
pH稳定性通过在检测残存活性前在40℃于pH3(25mM盐酸甘油)、pH4-5(25mM乙酸钠)、pH6(25mM MES)、pH7-9(25mM Tris-HCl)下温育酶1小时而定。
pH适应性(即pH活性关系)通过利用相同的缓冲液系统(50mM、在溶解底物时重新调节的pH)在各种pH下进行测试。
实施例4
DSC作为对热稳定性的一个优选的测试
热稳定性或熔解温度，Tm，可以按照如下的方法确定：
在DSC中，测定样品池相对于参考池保持恒速升温所消耗的热量。保持恒定的加热速率(例如90℃/小时)。将吸热过程(热消耗过程-例如酶/蛋白质的展开)看作是为了保持恒速升温而传递至该池的热量的增加。
利用MicroCal的MC2-仪可以进行DSC。在以90℃/h的扫描速率扫描至90℃前将池在20℃平衡20分钟。装载例如在0.1M乙酸钠，pH5.5中的大约2.5mg/ml植酸酶样品。
实施例5
具有改变的活性特征的植酸酶变体
按照在EP 98104858.0(EP-A-0897010)实施例2-3和5中所述制备烟曲霉的模式植酸酶(衍生自ATCC 13073株的一种野生型植酸酶)的变体，而且按照其实施例7中所述测定植酸酶活性。pH和温度最佳值以及熔点按照在EP98113176.6(EP-A-0897985)实施例9和10中所描述的来测定。
在表1中，列举了在pH5.0下具有改善的特异性活性的变体。表2列举了在pH3.0下具有改善的相对活性的变体，而表3列举了具有改善的热稳定性的变体(通过例如DSC测定的最佳温度)。
表1
    改变的位点编号     置换为 在pH5.0下的特异性活性(U/mg)
    43     43L     83.4
    43N     45.5
    43T     106.9
    43I     91.2
    43V     35.0
    43A     27.3
    43G     59.6
    43和270     43L、270L     88.7
    43和270以及273     43L、270L、273D     92.3
    43和78     43L、78D     118.5
    43和153以及154     43L、153Y、154G     193.0
烟曲霉野生型植酸酶          -     26.5
表2
改变的位点编号     置换为 在pH3.0下的相对植酸酶活性
    205     205E     41％
    273     273K     61％
    278     278H     75％
    273和205     273K、205E     65％
    273和278     273K、278H     100％
273和205以及278  273K、205E、278H     96％
烟曲霉野生型植酸酶         -     32％
表3
    改变的位点编号     置换为 最佳温度(℃) Tm(℃)(DSC)
    43、47、88、102、220、242以及267   43T、47Y、88I、102Y、220L、242P、267D     60     67
    同上再加51、302、337、373以及115     同上再加51A、302H、337T、373A、115N     63     -
    烟曲霉野生型植酸酶            -     55     62.5
实施例6
具有改变的活性特征的其它植酸酶变体
按照在EP98113176.6(EP-A-0897985)，实施例4-8中所描述的来制备图9中子囊菌纲共有序列“共有植酸酶”的变体。植酸酶活性，包括最佳pH和最佳温度以及熔点，分别按照在其实施例9和10中所描述的来测定。
下面的表列举出具有改变的活性特征的变体，即
表4在pH6.0下具有改善的特异性活性的变体；
表5具有改变的最佳pH的变体(所指的最佳pH是一个近似值，确定为在此pH下获得最大植酸酶活性的那个pH值(选自由pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0组成的一组))；
表6具有改善的热稳定性的变体(通过由差异扫描测热法(DSC)所测定的熔点来表示)；以及
表7具有改变的热稳定性(最佳温度)的变体；“+”或“-”分别表示对高达1℃的最佳温度的正或负影响；而“++”和“--”分别指对在1和3℃之间的最佳温度的正或负影响。
表4
改变的位点编号     置换为 在pH6.0下的特异性活性(U/mg)
    43     43T     130
    43L     205
    共有植酸酶      -     62
表5
改变的位点编号     置换为     最佳pH大约
    43     43T     6.0
    43L     5.5
    43G     6.5
    43和44     43L、44N     6.0
    43T、44N     5.5
    共有植酸酶        -     6.0
表6
改变的位点编号     置换为     Tm(℃)
    43     43T     78.9
    共有植酸酶改变的位点编号      -表7置换为     78.1最佳温度的改变
    51     A     +
    58     K     +
    220     N     +
    195     L     ++
    201e     T     ++
    244     D     +
    264     I     +
    302     H     +
    337     T     ++
    352     K     +
    373     A     ++
    47     F     -
    62     I     -
    83     K     -
    90     R     -
    143     N     -
    148     V     --
    186     A     --
    187a     S     -
    198     V     -
    204     A     --
    211     V     -
    215     P     --
    251e     Q     -
    260     A     -
    265     A     -
    339     V   -
    365     A   --
    383k     E   -
    404     G   --
    417     R   --
    共有植酸酶     -   0
表8
改变的位点编号     置换为 Tm(℃)(DSC) 在pH5.0下的特异性活性(U/mg)
43、51、220、244、264、302、337、352以及373  51A、220N、244D、264I、302H、337T、352K、373A、43T     84.7     105
  同上再加80     同上再加80A     85.7     180
  共有植酸酶          -     78.1     30
实施例7
Cladorrhinum foecundissimum植酸酶的克隆
基本上按照在WO 98/28409中所描述的对编码Cladorrhinumfoecundissimum CBS 427.97的植酸酶的DNA进行了克隆，并对该酶进行了分离和纯化。
图15显示在pA2phy8中HindⅢ/XbaⅠ克隆的PCR产物的DNA序列。所克隆的PCR产物扩增自编码Cladorrhinum foecundissimum CBS 427.97中phyA基因的基因组区域。推测的内含子通过符合GT-AG构想的剪切-连接位点处的双下划线标明(R.Brethnach等，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75(1978)4853-4857页)。用于克隆的限制性位点标有下划线。
根据SignalP V1.1的预测(Henrik Nielsen、Jacob Engelbrecht、StrenBrunak和Gunnar von Heijne：“原核和真核信号肽的鉴定和它们的切割位点的预测”，蛋白质工程(Protein Engineering)10,1-6(1997))，该酶的信号肽部分对应于1-15位氨基酸，相应地成熟的酶是16-495位氨基酸。
该酶表现出在pH6左右有最佳pH而在低pH(pH3)下没有活性，但较高活性保持至pH7.5；因此，同无花果曲霉植酸酶相比其是一种更碱性的植酸酶。
在pH5.5下发现一个60℃左右的最佳温度。因此，该植酸酶比无花果曲霉植酸酶热稳定性更好。
实施例8
根据图1一种新型模式植酸酶的对齐排列
利用上面引用的GAP版本8，按照3.000的空隙权和0.100的空隙长度权，将在实施例7中所公开的Cladorrhinum foecundissimum的植酸酶序列同图1中的13种模式植酸酶进行比较。比较了完整的氨基酸序列。嗜热毁丝霉植酸酶序列被证明是最同源的序列，表现出同C.foecundissimum序列70.86％的相似度。
仍利用GAP程序以及上面提到的参数，现在将植酸酶序列“C_foecundissimum”同“嗜热毁丝霉”植酸酶进行对齐排列——见图16。平均匹配为0.540；平均错配为-0.396；质量(quanlity)445.2，长度505，比率0.914，空隙9个，相似百分比70.860，同一性百分比53.878。
在下一个步骤中，见图17，将C_foecundissimum粘贴(或者其可以简单地写)到图1的对齐排列上作为最底行，保证那些根据图16的对齐排列为相同(通过一个垂直线标明)或相似(通过一个或两个点标明)的氨基酸残基一一置于其上。在沿着序列的5个位置处C_foecundissimum序列包括“多余”的氨基酸残基，图1的对齐排列没有为其提供位置。在图17中，将这些多余的残基转移至下一行(但是它们能包括在多序列对齐排列中，而且按照前面在位点编号相关段落中所描述的进行编号(利用符号a、b、c等))。
然后，基于图17很容易地推断出C_foecundissimum植酸酶相应的变体。一些实例：在C_foecundissimum中通常表示为“80K,A”和“43T”的变体分别对应于“K80A”和“Q43T”。
                         序列表<212>DNA<213>Cladorrhinum foecundissimum<220><221>内含子<222>(71)..(126)<220><221>CDS<222>(20)..(70)<220><221>CDS<222>(127)..(1563)<220><221>信号肽<222>(20)..(64)<400>1aagcttgggc aaactcatc atg ctc atc ttg atg att cca ctg ttc agc tac   52
                 Met Leu Ile Leu Met Ile Pro Leu Phe Ser Tyr
                   1               5                  10ctg gct gct gct tct ctg tgggttcatc ctttgcccct gtctcgatgt          100Leu Ala Ala Ala Ser Leu
         15taaaatacta aacatatttc accaga cgt gta ctc tcc cct cag cca gtg tcc  153
                         Arg Val Leu Ser Pro Gln Pro Val Ser
                                  20                  25tgt gac agc ccg gag ctt ggt tac caa tgc gac cag cag aca acg cac   201Cys Asp Ser Pro Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asp Gln Gln Thr Thr His
         30                  35                  40acc tgg ggt caa tac tca ccc ttc ttc tct gtc ccg tca gag atc tcc   249Thr Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser
     45                  50                 55cct tcc gtt cct gat ggc tgc cgc ctc acc ttc gcc caa gtt ctc tcc   297Pro Ser Val Pro Asp Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser
 60                  65                  70cgc cac ggc gcc cgc ttc cca acc ccg ggt aaa gcc gcc gcc atc tcc   345Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser75                  80                  85                  90gct gtc ctc acc aaa atc aaa acc tct gcc acc tgg tac ggt tcc gac   393Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr ser Ala Thr Trp Tyr Gly Ser Asp
             95                 100                 105ttt cag ttc atc aag aac tac gac tat gta ctt ggc gta gac cac ctg   441Phe Gln Phe Ile Lys Asn Tyr Asp Tyr Val Leu Gly Val Asp His Leu
        110                 115                 120acc gcg ttc ggc gag caa gaa atg gtc aac tcc ggc atc aag ttc tac   489Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr
    125                 130                 135cag cgc tac tcc tcc ctc atc cag aca gaa gac tcg gat acg ctc ccc   537Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Ile Gln Thr Glu Asp Ser Asp Thr Leu Pro
140                 145                 150ttc gtc cgc gcc tct ggc cag gaa cgc gtc atc gcc tcc gcc gag aac   585Phe Val Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Asn155                 160                 165                 170ttc acc acc ggc ttc tac tcg gcc ctc tca gcc gac aag aac cct cct   633Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu Ser Ala Asp Lys Asn Pro Pro
            175                 180                 185tcc tcc tta cca aga cca gaa atg gtc atc att tct gag gag cca aca   681Ser Ser Leu Pro Arg Pro Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Glu Pro Thr
        190                 195                 200gcc aac aac acc atg cac cac ggc ctc tgc cgc tcc ttt gaa gat tcc   729Ala Asn Asn Thr Met His His Gly Leu Cys Arg Ser Phe Glu Asp Ser
    205                 210                 215acc acc ggc gac caa gcc caa gcg gaa ttc atc gcc gcc acc ttc cca   777Thr Thr Gly Asp Gln Ala Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ala Thr Phe Pro
220                 225                 230ccc atc acc gcc cgt ctc aac gcc caa ggt ttc aaa ggc gtc acc ctc   825Pro Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu235                 240                 245                 250tcc aac acc gac gtc cta tca cta atg gac ctc tgc ccc ttt gac acc   873Ser Asn Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Cys Pro Phe Asp Thr
            255                 260                 265gtc gcc tac ccc ctt tcc tcc ctc acc acc acc tct tcc gtt tct gga   921Val Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly
        270                 275                 280ggc ggc aag tta tcc ccc ttc tgc tct ctt ttc act gcc agc gac tgg   969Gly Gly Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala Ser Asp Trp
    285                 290                 295aca atc tac gat tac ctc cag tcc cta ggg aaa tac tac ggt ttc ggc   1017Thr Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly Phe Gly
300                 305                 310ccc ggt aat tcc cta gct gcc acc cag ggg gta ggg tac gtc aac gag   1065Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val Gly Tyt Val Asn Glu315                 320                 325                 330ctt atc gcc cgc ttg atc cgt gct ccc gtc gta gat cac acg accg acc  1113Leu Ile Ala Arg Leu Ile Arg Ala Pro Val Val Asp His Thr Thr Thr
            335                 340                 345aac tct act ctt gat ggc gac gaa aaa acg ttt ccg ttg aac aga acg   1161Asn Ser Thr Leu Asp Gly Asp Glu Lys Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr
        350                 355                 360gtg tat gcg gat ttt tcc cat gat aat gat atg atg aat atc ctg act   1209Val Tyr Ala Asp Phe ser His Asp Asn Asp Met Met Asn Ile Leu Thr
    365                 370                 375gct ttg cgg ata ttc gag cat atc agt ccg atg gat aac acc act atc   1257Ala Leu Arg Ile Phe Glu His Ile Ser Pro Met Asp Asn Thr Thr Ile
380                 385                 390ccg acc aac tat ggc cag aca gga gat gac ggg gtg aag gaa agg gat   1305Pro Thr Asn Tyr Gly Gln Thr Gly Asp Asp Gly Val Lys Glu Arg Asp395                 400                 405                 410ttg ttc aag gtt agt tgg gcg gtg ccc ttt gct ggg agg gtg tac ttt   1353Leu Phe Lys Val Ser Trp Ala Val Pro Phe Ala Gly Arg Val Tyr Phe
            415                 420                 425gag aaa atg gtt tgt gat gcg gat ggg gat ggc aag att gat agt gat   1401Glu Lys Met Val Cys Asp Ala Asp Gly Asp Gly Lys Ile Asp Ser Asp
        430                 435                 440gag gct cag aaa gag ttg gtg agg att ttg gtt aat gat cgg gtg atg   1449Glu Ala Gln Lys Glu Leu Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Met
    445                 450                 455aga ttg aat ggg tgt gat gct gat gaa cag ggt agg tgt gga ttg gag   1497Arg Leu Asn Gly Cys Asp Ala Asp Glu Gln Gly Arg Crs Gly Leu Glu
460                 465                 470aag ttt gtg gag agt atg gag ttt gcg agg aga ggg ggg gag tgg gag   1545Lys Phe Val Glu Ser Met Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Glu Trp Glu475                 480                 485                 490gag agg tgt ttt gtt tag ctctaga                                   1570Glu Arg Cys Phe Val
            495<210>2<211>495<212>PRT<213>Cladorrhinum foecundissimum<400>2Met Leu Ile Leu Met Ile Pro Leu Phe Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Ser1               5                  10                  15Leu Arg Val Leu Ser Pro Gln Pro Val Ser Cys Asp Ser Pro Glu Leu
         20                  25                  30Gly Tyr Gln Cys Asp Gln Gln Thr Thr His Thr Trp Gly Gln Tyr Ser
     35                  40                  45Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser Pro Ser Val Pro Asp Gly50                  55                  60Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu ser Arg His Gly Ala Arg Phe65                  70                  75                  80Pro Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser Ala Val Leu Thr Lys Ile85                  90                  95Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Gly Ser Asp Phe Gln Phe Ile Lys Asn100                 105                 110Tyr Asp Tyr Val Leu Gly Val Asp His Leu Thr Ala Phe Gly Glu Gln115                 120                 125Glu Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Ser Ser Leu130                 135                 140Ile Gln Thr Glu Asp Ser Asp Thr Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Glyl45                 150                 155                 160Gln Glu Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Asn Phe Thr Thr Gly Phe Tyr165                 170                 175Ser Ala Leu Ser Ala Asp Lys Asn Pro Pro Ser Ser Leu Pro Arg Pro180                 185                 190Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Glu Pro Thr Ala Asn Asn Thr Met His195                 200                205His Gly Leu Cys Arg Ser Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gly Asp Gln Ala210                 215                 220Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ala Thr Phe Pro Pro Ile Thr Ala Arg Leu225                 230                 235                 240Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Val Leu240                 250                 255Ser Leu Met Asp Leu Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Tyr Pro Leu Ser260                 265                 270Ser Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly Gly Gly Lys Leu Ser Pro275                 280                 285Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala Ser Asp Trp Thr Ile Tyr Asp Tyr Leu290                 295                 300Gln Ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala305                 310                 315                 320Ala Thr Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Ile325                 330                 335Arg Ala Pro Val Val Asp His Thr Thr Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gly            340                 345                 350Asp Glu Lys Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Val Tyr Ala Asp Phe Ser355                 360                 365His Asp Asn Asp Met Met Asn Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe Glu
370                 375                 380His Ile Ser Pro Met Asp Asn Thr Thr Ile Pro Thr Asn Tyr Gly Gln385                 390                 395                 400Thr Gly Asp Asp Gly Val Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Val Ser Trp
            405                 410                 415Ala Val Pro Phe Ala Gly Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Val Cys Asp
        420                 425                 430Ala Asp Gly Asp Gly Lys Ile Asp Ser Asp Glu Ala Gln Lys Glu Leu
    435                 440                 445Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Met Arg Leu Asn Gly Cys Asp
450                 455                 460Ala Asp Glu Gln Gly Arg Cys Gly Leu Glu Lys Phe Val Glu Ser Met465                 470                 475                 480Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Glu Trp Glu Glu Arg Cys Phe Val
            485                 490                 495

Claims (47)

1、一种植酸酶变体，当按照图1进行对齐排列时，利用与P_lycii相应的位点编号，与模式植酸酶相比，其在至少下列位点之一处被改变：24；27；31；33；39；40；41；42；43；44；45；46；47；49；51；56；58；59；61；62；68；69；70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；88；90；102；115；116；117；118；119；120；121；122；123；124；125；126；127；128；132；143；148；149；150；151；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；170f；170g；171；172；173；184；185；186；187；187a；190；191；192；193；194；195；198；199；200；201；201a；201b；201c；201d；201e；201f；202；203；203a；204；205；211；215；220；223；228；232；233；234；235；236；237；238；239；242；243；244；246；251e；253；256；260；264；265；267；270；271；272；273；274；275；276；277；278；279；280；283；285；287；288；292；293；302；304；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；342；343；348；349；352；360；362；364；365；366；367；368；369；370；371；372；373；374；375；376；383k；387；393；394；396；404；409；411；412；413；417；421；431.
2、一种植酸酶变体，当按照图1进行对齐排列时，利用与P_lycii相应的位点编号，与模式植酸酶相比，其包括至少下列改变之一：24C；27P；31Y；33C；39H,S,Q；40L,N；42S,G；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；44N；45D,S；47Y,F；49P；51E,A,R；56P；58D,K,A；59G；61R；62V,I；69Q；75W,F；78D,S；79G；80K,A；81A,G,Q,E；82T；83A,I,K,R,Q；84I,Y,Q,V；88I；90R,A；102Y；115N；116S；118V,L；119E；120L；122A；123N,Q,T；125M,S；126H,S,V；127Q,E,N；128A,S,T；132F,I,L；143N；148V,I；151A,S；152G；153D,Y；154D,Q,S,G；157V；158D,A；159T；160A,S；161T,N；162N；163W；170fH；1709A；171N；172P；173Q,S；184Q,S,P；185S；186A,E,P；187A；187aS；190A,P；193S；194S,T；195T,V,L；198A,N,V；200G,V；201D,E；201a()；201b()；201c()；201d()；201e()；201f()；201eT；202S,A；203R,K,S；203aV,T；204Q,E,S,A,V；205E；211L,V；215A,P；220L,N；223H,D；228N；232T；233E；235Y,L,T；236Y,N；237F；238L,M；242P,S；244D；246V；251eE,Q；253P；256D；260A,H；264R,I；265A,Q；267D；270Y,A,L,G；271D,N；273D,K；275F,Y；278T,H；280A,P；283P；287A,T；288L,I,F；292F,Y；293A,V；302R,H；304P,A；332F；336S；337T,G,Q,S；338I；339V,I；340P,A；343A,S,F,I,L；348Y；349P；352K；360R；362P；364W,F；365V,L,A,S；366D,S,V；367A,K；368K；369I,L；370V；373A,S；374S,A；375H；376M；383kQ,E；387P；393V；396R；404A,G；409R；411K,T；412R；417E,R；421F,Y；431E.
3、权利要求1或2中任一项的植酸酶变体，其衍生自子囊菌纲植酸酶。
4、权利要求3的植酸酶变体，其衍生自曲霉属植酸酶。
5、权利要求4的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为黑曲霉、无花果曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、土曲霉的菌株。
6、权利要求5的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为构巢曲霉DSM9743；或者土曲霉以下菌株之任一：CBS 116.46、DSM 9076、CBS220.95。
7、权利要求6的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为示于图10中的构巢曲霉植酸酶序列；或者示于图12中的土曲霉植酸酶序列。
8、权利要求3的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为Thermomyceslanuginosus、嗜热踝节菌或嗜热毁丝霉的菌株。
9、权利要求8的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为Thermomyceslanuginosus CBS 586.94；或者嗜热踝节菌以下菌株之任一：ATCC 20186、ATCC 74338；或者嗜热毁丝霉以下菌株之任一：ATCC 34625、ATCC74340。
10、权利要求9的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为示于图14中的Thermomyces lanuginosus植酸酶序列；或者示于图13中的嗜热踝节菌植酸酶序列；或者示于图7中的嗜热毁丝霉植酸酶序列。
11、权利要求3的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为子囊菌纲共有植酸酶序列。
12、权利要求1或2中任一项的植酸酶变体，其衍生自担子菌纲植酸酶。
13、权利要求12的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为Paxillusinvolutus、绒毛栓菌、平田头菇或Peniophora lycii的菌株。
14、权利要求13的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为绒毛栓菌CBS100232或Paxillus involutus CBS 100231。
15、权利要求14的植酸酶变体，其中所述模式植酸酶为图4中的绒毛栓菌植酸酶序列或者图2或3中的Paxillus involutus植酸酶序列。
16、权利要求1或2中任一项的植酸酶变体，其包括至少下述改变之一：R24C；V27P；H39Q,S；L40N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；A45D,S；F47Y；S49P；A51E,R；V56P；A58D,K；V62I；S69Q；Y75W,F；D78S；S79G；K80A；G81A,Q,E；K82T；K83A,I,R,Q；Y84Q,I,V；E90R,A；D115N；D116S；T118V,L；P119E；F120L；E122A；Q123N,T；L125S,M；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；F132I,L；I148V；S151A；S153D,Y；S154Q,D,G；I157V；A158D；S159T:G160A,S；K161T,N；K162N；F163W；R170fH；Q171N；G173Q,S；S184P,Q； E185S；A186E,P；S187A；T190P,A；P193S；G194S,T；T195V,L；V198A,N；E200G,V；D201E；S201d()；E201e(),T；
L201f()；优选所有三个缺失；A202S；D203R,K,S；D203aV,T；V204Q,E,S,A；T211L,V；S215AP；L220N；D223H；T228N；T235Y,L；Y236N；L237F；M238L；S242P；I246V；K251eE,Q；H260A；I264R；N265Q,A；Q270Y,A,L,G；S271D,N；K273D；Y275F；H278T；A280P；T287A；Q288L,I,F；Y292F；A293V；H302R；P304A；N336S；G337S,T,Q；I339V；S340P,A； F343A,S,F,I,L；N349P；N360R；T362P；F364W；S365V,L,A；S366D,V；A367K；W368K；T369I,L；A373S:S374A；R375H；L376M；Q383kE；P404A,G；T411K；R417E；F421Y；A431E.
17、权利要求16的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自曲霉的植酸酶，优选衍生自无花果曲霉或黑曲霉。
18、权利要求17的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自无花果(黑)曲霉NRRL 3135、黑曲霉ATCC 9142或黑曲霉ATCC 74337之任一的植酸酶。
19、权利要求18的植酸酶变体，其模式植酸酶为图11的无花果曲霉植酸酶序列。
20、权利要求1或2中任一项的植酸酶变体，其植酸酶变体包括至少下述改变之一：A24C；V27P；H39,S,Q；L40N；G42S；Q43C,D,E,F,H,K,M,P,R,S,W,Y；Y44N；S45D；F47Y；S49P；E51A,R；L56P；K58D,A；D59G；I62V；S69Q；Y75W,F；S78D；S79G；K80A；S81A,G,Q,E；K82T；K83A,I,Q,R；Y84Q,V,I；V88K；A90R；F102Y；D115N；D116S；T118V,L；P119E；F120L；E122A；Q123N,T；L125S,M；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；F132,I,L；S143N；I148V；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；I157V；A158D；S159T；G160A,S；E161T,N；K162N；F163W；G170fH；()17IN；N173Q,S；T172P；P184Q,S；E185S；S186A,E,P；E187A；T187aS；T190P,A；G194S,T；V195L,T；K198A,N,V；E200G,V；A201D,E；S201d()；Q201e(),T；L201f()；优选所有三个缺失；G202S,A；D203R,K,S；E203aV,T；V204Q,E,S,A；A205E；L211V；A220L,N；H223D；T228N；E232T；D233E；V235Y,L,T；V236Y,N；L237F；M238L；C242P,S；T246V；Q251eE,Q；Q256D；H260A；K264R,I；K265Q,A；N267D；Q270Y,A,L,G； S271D,N；G273D,K；Y275F；Y278T,H；A280P；A287T；Q288L,I,E；F292Y；T293A,V；R302H；P304A；F332F；N336S；S337T,G,Q；M338I；V339I；S340P,A；F343A,S,I,L；N349P；E352K；S360R；K362P；Y364W,F；S365V,L,A；A366D,V,S；S367A,K；W368K；V369I,L；G373S,A；R375H；A376M；K383kQ,E；D404A,G；K411T；I393V；L412R；K417E,R；W421F,Y；G431E.
21、权利要求20的植酸酶变体，其衍生自曲霉属植酸酶，优选利用衍生自烟曲霉的模式植酸酶。
22、权利要求21的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自烟曲霉以下菌株之任一的植酸酶：ATCC 13073、ATCC 32722、ATCC 58128、ATCC26906或ATCC 32239。
23、权利要求22的植酸酶变体，其模式植酸酶为图8的烟曲霉植酸酶序列。
24、权利要求1或2中任一项的植酸酶变体，其植酸酶变体包括至少下述改变之一：G24C；V27P；H39S,Q；L40N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；S49P；E51A,R；V56P；D58K,A；DS9G；V62I；S69Q；Y75W,F；S78D；S79G；K80A；S81A,G,Q,E；K82T；A83I,Q,K,R；Y84,Q,I,V；A90R；D115N；D116S；T118V,L；F119E；P120L；E122A；N123Q,T；M125S；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；Y132F,I,L；K143N；I148V；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；I157V；A158D；S159T；A160S；E161T,N；K162N；F163W；G170fH；S1709A；Q171N；H173Q,S；P184Q,S；E185S；G186A,E,P；S187A；G187aS；T190P,A；H193S；G194S,T；T195V,L；
A198N,V；E200G,V；D201E；S201d()；E201e(),T；L201f()；优选所有三个；G202S,A；D203R,K,S；D203aV,T；V204Q,S,A,E；L211V：A215P；L220N；D223H,T228N；E232T；D233E；V235Y,L,T；Y236N；L237F；M238L；P242S；E244D；E2S1e,Q；A256D；H260A；R264I；Q265A；Q270Y,A,L,G；S271D,N；G273D,K；Y275F；Y278T,H；A280P；A287T；Q288L,I,F；F292Y；A293V；R302H；P304A；N336S；S337T,Q,G；M338I；I339V；S340P,A；F343A,S,I,L；N349P；A352K；S360R；E362P；Y364W,F；S365V,L,A；A366D,V,S；S367K,A；W368K；T369I,L；G373S,A；A374S；R375H；A376M；Q383kE；A404G；K411T；E417R；F421Y；A431E.
25、权利要求24的植酸酶变体，其模式植酸酶为一种子囊菌纲共有植酸酶。
26、权利要求25的植酸酶变体，其模式植酸酶为图9的子囊菌纲共有序列“conphys”。
27、权利要求1或2中任一项的植酸酶变体，其植酸酶变体包括至少下述改变之一：V24C；F27P；()31Y；F33C；D39H,S,Q；S40L,N；A42S,G；A43C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；T45D,S；Y47F；Q51E,A,R；K58D,A；K61R；162V；F75W；S78D；A80K；G81A,Q,E；R83A,I,Q,K；I84Y,Q,V；V88I；K90R,A；L102Y；D115N；D116S；V118L；P119E；F120L；L123N,T,Q；S125M；S126H,V；Q127E,N；A128S,T；T132F,I,L；E143N；V148I；S151A；S152G；S1S3D,Y；N154D,Q,S,G；D158A；S159T；A160S；T161N；()170fH；()170gA；()171N；H173Q,S；H172P；S184Q,P；E185S；S186A,E,P；L187A；()187aS；T190P,A；D193S；A194S,T；M195T,V,L；N198A,V；G200V；S201D,E ()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；T205E；I211L,V；P215A；L220N；Q223D,H；A232T；D233E；S235Y,L,T；N236Y；L237F；I238L,M；A242P,S；E244D；I246V；()251eE,Q；N256D；P260A,H；A264R,I；Q265A；E267D；G270Y,A,L；L332P；D271N；D273K；F275Y；T278H,Y280A,P；Y283P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；I293A,V；E302R,H；P304A；L332F；N336S；Q337T,S,G；M338I；I339V；A340P；S343A,F,I,L；F348Y；N349P；S352K；P360R；R362P；W364F；V365L,A,S；T366D,V,S；S367K,A；R368K；L369I；T370V；S373A；A374S；R375H；S383kQ,E；T387P；A396R；G404A；L409R；T411K；L412R；E417R；Y421F.
28、权利要求27的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自平田头菇的植酸酶。
29、权利要求27的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自平田头菇CBS900.96的植酸酶。
30、权利要求29的植酸酶变体，其模式植酸酶为图5的平田头菇植酸酶序列。
31、权利要求1-2中任一项的植酸酶变体，其植酸酶变体包括至少下述改变之一：F24C；V27P；L31Y；I33C；S39H,Q；N40L；G42S；P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；D45S；F47Y；E51A,R；E58D,K,A；T61R；V62I；W75F；S78D；A80K；R81Q,E,G,A；S82T；R83A,I,Q,K；Q84Y,V,I；V88I；K90R,A；A115N；D116S；L118V；P119E；F120L；N123T,Q；S125M；H126S,V；Q127E,N；T128A,S；M132F,I,L；G143N；V148I；A151S；D153Y；Q154D,S,G；D158A；S159T；S160A；T161N；()170fH；()170gA；S171NG172P；E173Q,S；Q184S,P；E185S；E186A,P；G187A；()187aS；T190P,A；N193S；N194S,T；M195T,V,L；N198A,V；V200G；D201E；()201eT；G202S,A；D203R,K,S；()203aV,T；E204Q,S,A,V；S205E；V211L；N215A,P；L220N；A223D,H；S232T；D233E；L235Y,T；T236Y,N；L237F；M238L；P242S；L246V；()251eE,Q；A260H；V264R,I；S265Q,A；E267D；Y270A,L,G；D271N；D273K；F275Y；G278T,H；P280A；A283P；T287A；Q288L,I,F；Y292F；V293A；G302R,H；A304P；N336S；T337Q,S,G；M338I；V339I；P340A；A343S,F,I,L；F348Y；N349P；A352K；E360R；R362P；W364F；V365L,A,S；D366V,S；S367K,A；L369I；S373A；G374A,S；()383kQ,E；E387P；A396R；G404A；V409R；E411K,T；L412R；E417R；Y421F；A431E.
32、权利要求31的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自Peniophora lycii的植酸酶。
33、权利要求32的植酸酶变体，其模式植酸酶为衍生自PeniophoralyciiCBS 686.96的植酸酶。
34、权利要求33的植酸酶变体，其模式植酸酶为图6中的Peniophoralycii植酸酶序列。
35、一种植酸酶多肽，其包括根据上述权利要求中任一项的植酸酶变体。
36、一DNA构建体，其包括编码根据权利要求1-34中任一项的植酸酶变体的DNA序列。
37、一种重组表达载体，其包括根据权利要求36的DNA构建体。
38、一种宿主细胞，其由根据权利要求36的DNA构建体或根据权利要求37的载体转化。
39、一种用于制备植酸酶变体的方法，该方法包括在允许产生植酸酶变体的条件下培养根据权利要求38的宿主细胞，以及从培养液中回收植酸酶。
40、一种饲料或食物，其包括至少一种根据权利要求1-34中任一项的植酸酶变体。
41、一种用于制备根据权利要求40的饲料或食物的方法，其中将上述至少一种植酸酶变体添加至食物或饲料组分中。
42、一种组合物，其包括至少一种根据权利要求1-34中任一项的植酸酶变体。
43、权利要求42的组合物，其适用于制备食物或饲料。
44、权利要求42-43中任一项的组合物，其为一种动物饲料添加剂。
45、一种用于降低动物粪尿中植酸盐水平的方法，其包括用有效量的根据权利要求40的饲料或根据权利要求41可获得的饲料来喂养动物。
46、权利要求1-34中任一项的植酸酶变体；或者权利要求42-43中任一项的组合物用于从植酸酶底物释放三价磷的应用。
47、一种转基因植物或植物部分，其能够表达根据权利要求1-34中任一项的植酸酶变体。
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