KR20010042138A - 피타제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 피타제 변이체, 그것의 제조방법 및 용도가 개시되는데, 이 피타제 변이체는 도 1 에 따라 배열될 때, 많은 위치들중 최소한 하나에서 모델 피타제와 비교하여 보정된다. 바람직한 모델 피타제는 담자균 및 자낭균 피타제, 예를 들면 페니오포라 피타제 및 아스페르길루스 피타제이다. 바람직한 피타제 변이체들은 보정된 활성 특성, 예를 들면 개선된 비활성 및/또는 개선된 열안정성을 나타낸다.

Description

피타제 변이체{PHYTASE VARIANTS}

〈110〉 NOVO NORDISK A/S

〈120〉 PHYTASE VARIANTS

〈130〉 1

〈150〉 0407/98

〈151〉 1998-03-23

〈150〉 PA 1998 00806

〈151〉 1998-06-19

〈150〉 PA 1998 01176

〈151〉 1998-09-18

〈150〉 PA 1999 00091

〈151〉 1999-01-22

〈160〉 2

〈170〉 KopatentIn 1.71

〈210〉 1

〈211〉 1570

〈212〉 DNA

〈213〉 Cladorrhinum foecundissimum

〈220〉

〈221〉 intron

〈222〉 (71)..(126)

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (20)..(70)

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (127)..(1563)

〈220〉

〈221〉 sig_peptide

〈222〉 (20)..(64)

〈400〉 1

aagcttgggc aaactcatc atg ctc atc ttg atg att cca ctg ttc agc tac 52

Met Leu Ile Leu Met Ile Pro Leu Phe Ser Tyr

1 5 10

ctg gct gct gct tct ctg tgggttcatc ctttgcccct gtctcgatgt 100

Leu Ala Ala Ala Ser Leu

15

taaaatacta aacatatttc accaga cgt gta ctc tcc cct cag cca gtg tcc 153

Arg Val Leu Ser Pro Gln Pro Val Ser

20 25

tgt gac agc ccg gag ctt ggt tac caa tgc gac cag cag aca acg cac 201

Cys Asp Ser Pro Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asp Gln Gln Thr Thr His

30 35 40

acc tgg ggt caa tac tca ccc ttc ttc tct gtc ccg tca gag atc tcc 249

Thr Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser

45 50 55

cct tcc gtt cct gat ggc tgc cgc ctc acc ttc gcc caa gtt ctc tcc 297

Pro Ser Val Pro Asp Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser

60 65 70

cgc cac ggc gcc cgc ttc cca acc ccg ggt aaa gcc gcc gcc atc tcc 345

Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser

75 80 85 90

gct gtc ctc acc aaa atc aaa acc tct gcc acc tgg tac ggt tcc gac 393

Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Gly Ser Asp

95 100 105

ttt cag ttc atc aag aac tac gac tat gta ctt ggc gta gac cac ctg 441

Phe Gln Phe Ile Lys Asn Tyr Asp Tyr Val Leu Gly Val Asp His Leu

110 115 120

acc gcg ttc ggc gag caa gaa atg gtc aac tcc ggc atc aag ttc tac 489

Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr

125 130 135

cag cgc tac tcc tcc ctc atc cag aca gaa gac tcg gat acg ctc ccc 537

Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Ile Gln Thr Glu Asp Ser Asp Thr Leu Pro

140 145 150

ttc gtc cgc gcc tct ggc cag gaa cgc gtc atc gcc tcc gcc gag aac 585

Phe Val Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Asn

155 160 165 170

ttc acc acc ggc ttc tac tcg gcc ctc tca gcc gac aag aac cct cct 633

Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu Ser Ala Asp Lys Asn Pro Pro

175 180 185

tcc tcc tta cca aga cca gaa atg gtc atc att tct gag gag cca aca 681

Ser Ser Leu Pro Arg Pro Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Glu Pro Thr

190 195 200

gcc aac aac acc atg cac cac ggc ctc tgc cgc tcc ttt gaa gat tcc 729

Ala Asn Asn Thr Met His His Gly Leu Cys Arg Ser Phe Glu Asp Ser

205 210 215

acc acc ggc gac caa gcc caa gcg gaa ttc atc gcc gcc acc ttc cca 777

Thr Thr Gly Asp Gln Ala Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ala Thr Phe Pro

220 225 230

ccc atc acc gcc cgt ctc aac gcc caa ggt ttc aaa ggc gtc acc ctc 825

Pro Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu

235 240 245 250

tcc aac acc gac gtc cta tca cta atg gac ctc tgc ccc ttt gac acc 873

Ser Asn Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Cys Pro Phe Asp Thr

255 260 265

gtc gcc tac ccc ctt tcc tcc ctc acc acc acc tct tcc gtt tct gga 921

Val Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly

270 275 280

ggc ggc aag tta tcc ccc ttc tgc tct ctt ttc act gcc agc gac tgg 969

Gly Gly Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala Ser Asp Trp

285 290 295

aca atc tac gat tac ctc cag tcc cta ggg aaa tac tac ggt ttc ggc 1017

Thr Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly Phe Gly

300 305 310

ccc ggt aat tcc cta gct gcc acc cag ggg gta ggg tac gtc aac gag 1065

Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu

315 320 325 330

ctt atc gcc cgc ttg atc cgt gct ccc gtc gta gat cac acg acg acc 1113

Leu Ile Ala Arg Leu Ile Arg Ala Pro Val Val Asp His Thr Thr Thr

335 340 345

aac tct act ctt gat ggc gac gaa aaa acg ttt ccg ttg aac aga acg 1161

Asn Ser Thr Leu Asp Gly Asp Glu Lys Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr

350 355 360

gtg tat gcg gat ttt tcc cat gat aat gat atg atg aat atc ctg act 1209

Val Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Asp Met Met Asn Ile Leu Thr

365 370 375

gct ttg cgg ata ttc gag cat atc agt ccg atg gat aac acc act atc 1257

Ala Leu Arg Ile Phe Glu His Ile Ser Pro Met Asp Asn Thr Thr Ile

380 385 390

ccg acc aac tat ggc cag aca gga gat gac ggg gtg aag gaa agg gat 1305

Pro Thr Asn Tyr Gly Gln Thr Gly Asp Asp Gly Val Lys Glu Arg Asp

395 400 405 410

ttg ttc aag gtt agt tgg gcg gtg ccc ttt gct ggg agg gtg tac ttt 1353

Leu Phe Lys Val Ser Trp Ala Val Pro Phe Ala Gly Arg Val Tyr Phe

415 420 425

gag aaa atg gtt tgt gat gcg gat ggg gat ggc aag att gat agt gat 1401

Glu Lys Met Val Cys Asp Ala Asp Gly Asp Gly Lys Ile Asp Ser Asp

430 435 440

gag gct cag aaa gag ttg gtg agg att ttg gtt aat gat cgg gtg atg 1449

Glu Ala Gln Lys Glu Leu Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Met

445 450 455

aga ttg aat ggg tgt gat gct gat gaa cag ggt agg tgt gga ttg gag 1497

Arg Leu Asn Gly Cys Asp Ala Asp Glu Gln Gly Arg Cys Gly Leu Glu

460 465 470

aag ttt gtg gag agt atg gag ttt gcg agg aga ggg ggg gag tgg gag 1545

Lys Phe Val Glu Ser Met Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Glu Trp Glu

475 480 485 490

gag agg tgt ttt gtt tag ctctaga 1570

Glu Arg Cys Phe Val

495

〈210〉 2

〈211〉 495

〈212〉 PRT

〈213〉 Cladorrhinum foecundissimum

〈400〉 2

Met Leu Ile Leu Met Ile Pro Leu Phe Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Leu Arg Val Leu Ser Pro Gln Pro Val Ser Cys Asp Ser Pro Glu Leu

20 25 30

Gly Tyr Gln Cys Asp Gln Gln Thr Thr His Thr Trp Gly Gln Tyr Ser

35 40 45

Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser Pro Ser Val Pro Asp Gly

50 55 60

Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Phe

65 70 75 80

Pro Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser Ala Val Leu Thr Lys Ile

85 90 95

Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Gly Ser Asp Phe Gln Phe Ile Lys Asn

100 105 110

Tyr Asp Tyr Val Leu Gly Val Asp His Leu Thr Ala Phe Gly Glu Gln

115 120 125

Glu Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Ser Ser Leu

130 135 140

Ile Gln Thr Glu Asp Ser Asp Thr Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Gly

145 150 155 160

Gln Glu Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Asn Phe Thr Thr Gly Phe Tyr

165 170 175

Ser Ala Leu Ser Ala Asp Lys Asn Pro Pro Ser Ser Leu Pro Arg Pro

180 185 190

Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Glu Pro Thr Ala Asn Asn Thr Met His

195 200 205

His Gly Leu Cys Arg Ser Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gly Asp Gln Ala

210 215 220

Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ala Thr Phe Pro Pro Ile Thr Ala Arg Leu

225 230 235 240

Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Val Leu

245 250 255

Ser Leu Met Asp Leu Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Tyr Pro Leu Ser

260 265 270

Ser Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly Gly Gly Lys Leu Ser Pro

275 280 285

Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala Ser Asp Trp Thr Ile Tyr Asp Tyr Leu

290 295 300

Gln Ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala

305 310 315 320

Ala Thr Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Ile

325 330 335

Arg Ala Pro Val Val Asp His Thr Thr Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gly

340 345 350

Asp Glu Lys Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Val Tyr Ala Asp Phe Ser

355 360 365

His Asp Asn Asp Met Met Asn Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe Glu

370 375 380

His Ile Ser Pro Met Asp Asn Thr Thr Ile Pro Thr Asn Tyr Gly Gln

385 390 395 400

Thr Gly Asp Asp Gly Val Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Val Ser Trp

405 410 415

Ala Val Pro Phe Ala Gly Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Val Cys Asp

420 425 430

Ala Asp Gly Asp Gly Lys Ile Asp Ser Asp Glu Ala Gln Lys Glu Leu

435 440 445

Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Met Arg Leu Asn Gly Cys Asp

450 455 460

Ala Asp Glu Gln Gly Arg Cys Gly Leu Glu Lys Phe Val Glu Ser Met

465 470 475 480

Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Glu Trp Glu Glu Arg Cys Phe Val

485 490 495

피트산 또는 미오-이노시톨 1,2,3,4,5,6-헥사키스 디하이드로겐 포스페이트 (또는 짧게는, 미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)는 식물 종자의 일차적인 이노시톨 공급원이고, 포스페이트의 기본적인 저장 형태이다. 피틴은 이노시톨의 혼합된 칼륨, 마그네슘 및 칼슘염이다.

피트산의 포스페이트 부분은 금속 이온, 즉 미량의 미네랄인 망간, 구리 및 몰리브덴뿐만 아니라 영양적으로 필수적인 칼슘, 철, 아연 및 마그네슘 이온과 같은 이가 및 삼가 양이온을 킬레이트화한다.

피트산과 그것의 염인 피테이트는 때로 대사가 되지 않는다, 즉 그것의 인이나 또는 킬레이트화된 금속 이온은 영양학적으로 전혀 활용이 되지 않는다.

따라서, 식품 및 사료 제제는 무기 포스페이트가 보충될 필요가 있고, 때로는 또한 철 및 칼슘 이온과 같은 영양학적으로 필수적인 이온이 반드시 보충이 되어야 한다.

또한 나아가 피테이트의 인은 그러한 동물의 위장관을 통과하고 비료와 함께 분비되어, 환경의 바람직하지 못한 포스페이트 공해를 유발하고, 그것은 예컨대 물 환경의 부영양화 및 조류 (algae)의 광범위한 성장을 초래한다.

다른 언급이 없는한, 본 발명에서 동의어적으로 또는 무작위로 사용되는 용어, 피트산 또는 피테이트는 피타제에 의해 분해될 수 있다.

미생물에 의해서뿐만 아니라 식물에 의한 피타제의 생성은 이미 보고된 바 있다. 미생물중에서 피타제 생성 박테리아가 피타제 생성 진균류와 함께 알려져 있다.

아스코미코타 (Ascomycota)의 진균류 문 (phylum)에 속하는 피타제 생성 필라멘트형 진균 (자낭균)에 대해서는 여러 가지로 설명되어 있다. 특히, 아스페르길루스 테레우스 (A. terreus)와 같은 아스페르길루스 속의 피타제 생성 자낭균에 대해서는 여러 참고문헌이 있다 (Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322:1275-1282). 또한, 아스페르길루스 니거의 변종 아와모리로부터 피타제 유전자를 클로닝하고 발현하는 것이 설명되어 있다 (Piddington et al., 1993, Gene 133:55-62). EP 0420358 호에는 아스페르길루스 피큠 (niger)의 피타제의 클로닝 및 발현이 개시되어 있다. EP 0684313 호에는 자낭균 아스페르길루스 니거, 미셀리오프토라 써모필라 (Myceliophtora thermophila), 아스페르길루스 테레우스의 피타제들의 클로닝 및 발현이 설명되어 있다. 또한, 아스페르길루스 니듈란스, 탈라로마이세스 써모필루스, 아스페르길루스 퓨미가투스 및 아스페르길루스 테레우스의 다른 스트레인의 피타제들의 일부의 부분 서열이 알려져 있다.

써모마이세스 라누기노수스 (Thermomyces lanuginosus)의 피타제의 클로닝 및 발현은 WO 97/35017에 기재되어 있다.

보정된 성질 또는 특성, 예컨대 증가된 열안정성, 변경된 pH 최적 (시험관내 프로세싱에 대해서는 높은 pH 최적이 바람직하고, 위장관에서의 생체내 프로세싱에 대해서는 낮은 pH 최적이 바람직하다), 및/또는 보다 높은 비활성을 가지고 있는 피타제가 현재 요구되고 있다.

발명의 요약

첫 번째 측면으로, 본 발명은 소위 모델 피타제와 비교하여 보정된 특성을 가지고 있는 피타제 변이체를 제공한다.

본원에 구체적으로 개시되어 있는 13 개의 모델 피타제와 특정한 유사성을 가지고 있는 어떠한 모델 피타제든지 그러한 변이체의 모델을 만들 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 클라도리늄 포에쿤디씨뮴 (Cladorrhinum foecundissimum)으로부터 유도된 신규한 피타제에 관한 것이다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 이들 피타제 변이체 및 이 피타제를 코드화하는 DNA 서열과, 그것들의 제조방법을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 또한 일반적으로 어떠한 피타제 기질로부터 인을 분리시키기 위한, 특히 피테이트 또는 피트산으로부터 무기 인을 분리시키기 위한 피타제 및 피타제 변이체들의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 피타제 (phytase)의 변이체, 특히 자낭균 (ascomycete) 피타제의 변이체 및 담자균 (basidiomycete) 피타제의 변이체, 상응하는 클론된 DNA 서열, 그러한 피타제 변이체의 제조방법, 및 많은 산업적인 용도를 위한 그것들의 용도에 관한 것이다.

하기의 상세한 설명은 도면을 참조로 이루어진다.

도 1 은 13 개의 특이한 피타제 서열의 배열을 도시한다 (프로그램 파일업; GapWeight: 3.000; GapLengthWeight: 0.100 에 따른 다중 서열 배열);

도 2 는 1997 년 11 월 28 일에 기탁된 팍실루스 인볼루투스 (Paxillus involutus)의 스트레인 CBS 100231 로부터 유도된 첫 번째 피타제 ("P_involutus-A1")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 발현 플라스미드 pYES 2.0 은 대장균 스트레인 DSM 11842 안으로 형질전환되었고, 그것은 1997 년 11 월 12 일에 기탁되었다 (WO 98/28409 참조).

도 3 은 1997 년 11 월 28 일에 기탁된 팍실루스 인볼루투스의 스트레인 CBS 100231 로부터 유도된 두 번째 피타제 ("P_involutus-A2")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 발현 플라스미드 pYES 2.0 은 대장균 스트레인 DSM 11843 안으로 형질전환되었고, 그것은 1997 년 11 월 27 일에 기탁되었다 (WO 98/28409 참조).

도 4 는 1997 년 11 월 28 일에 기탁된 트라메테스 퓨베센스 (Trametes pubescens)의 스트레인 CBS 100232 로부터 유도된 피타제 ("T_pubescens")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 발현 플라스미드 pYES 2.0 은 대장균 스트레인 DSM 11844 안으로 형질전환되었고, 그것은 1997 년 11 월 12 일에 기탁되었다 (WO 98/28409 참조).

도 5 는 1996 년 12 월 4 일에 기탁된 아그로시브 페디아데스 (Agrocybe pediades)의 스트레인 CBS 900.96 으로부터 유도된 피타제 ("A_pediades")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 발현 플라스미드 pYES 2.0 은 대장균 스트레인 DSM 11313 안으로 형질전환되었고, 그것은 1996 년 12 월 2 일에 기탁되었다 (WO 98/28409 참조).

도 6 은 1996 년 12 월 4 일에 기탁된 페니오포라 라이치 (Peniophora lycii)의 스트레인 CBS 686.96 으로부터 유도된 피타제 ("P_lycii")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 발현 플라스미드 pYES 2.0 은 대장균 스트레인 DSM 11312 안으로 형질전환되었고, 그것은 1996 년 12 월 2 일에 기탁되었다 (WO 98/28409 참조).

도 7 은 EP 0684313 호의 도 2 와 동일한 도면으로, 1997 년 3 월 14 일에 재기탁된 미셀리오프토라 써모필라의 스트레인 ATCC 48102 (=ATCC 74340)로부터 유도된 피타제 ("M_thermophila)의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다.

도 8 은 아스페르길루스 퓨미가투스의 스트레인 ATCC 13073 으로부터 유도된 피타제 ("A_fumigatus")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다 (EP 0897985 참조).

도 9 는 자낭균 일치 피타제 (본원에서 "consphyA" 로 불림)의 아미노산 ("Conphys") 및 DNA 서열을 도시한다 (EP 0897985 참조).

도 10 은 아스페르길루스 니듈란스의 스트레인 DSM 9743 으로부터 유도된 피타제 ("A_nidulans")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다 (EP 0897985 참조).

도 11 은 EP 0420358 의 도 8 과 동일한 도면으로, 아스페르길루스 피큠 스트레인 NRRL-3135로부터 유도된 피타제 ("A_ficuum")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다.

도 12 는 EP 0684313 의 도 1 과 동일한 도면으로, 아스페르길루스 테레우스의 스트레인 CBS 220.95 로부터 유도된 피타제 ("A_terreus")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다.

도 13 은 1997 년 3 월 14 일에 재기탁된 탈라로마이세스 써모필루스의 스트레인 ATCC 20186 (=ATCC 74338)으로부터 유도된 피타제 ("T_thermo")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다.

도 14 는 WO 97/35017 의 도 2 와 동일한 도면으로, 써모마이세스 라누기노수스의 스트레인 CBS 586.94 로부터 유도된 피타제 ("T_lanuginosa")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 플라스미드는 대장균 DH5α (pMWR46) 스트레인 B-21527 안으로 형질전환되었고, 그것은 1996 년 2 월 23 일에 기탁되었다.

도 15 는1997 년 1 월 23 일에 기탁된 클라도리늄 포에쿤디씨뮴의 스트레인 CBS 427.97 로부터 유도된 피타제 ("C_foecundissimum")의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다; 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하고 있는 발현 플라스미드 pYES 2.0 은 대장균 스트레인 DSM 12742 안으로 형질전환되었고, 그것은 1999 년 3 월 17 일에 기탁되었다.

도 16 은 프로그램 GAP gcg (Gap Weight 3.000; Length Weight 0.100)을 사용한, 모델 피타제 M_thermophila와 함께 배열된 피타제 C_foecundissimum을 도시한다.

도 17 은 C_foecundissimum 이 도 1 의 배열위로 지나가는 방법을 도시한다.

피타제

본 명세서에서, 피타제는 피테이트 (미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)의 (1) 미오-이노시톨 및/또는 (2) 그것의 모노-, 디-, 트리-, 테트라-, 및/또는 펜타-포스페이트 및 (3) 무기 포스페이트로의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 하기에서, 상기의 화합물들은 때로 짧게 각각 IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5 및 P 로 언급된다. 이것은 피타제의 작용에 의하여 IP6 이 P + IP5, IP4, IP3, IP2, IP1 및 I 중 하나 또는 두 개로 분해되는 것을 의미한다. 또는 달리, 위치 p, q, r, .. 에 부착되어 있는 총 n 개의 포스페이트기에 포함되어 있는 미오-이노시톨이 Ins(p,q,r,..)Pn 으로 표시되기도 한다. 편리를 위해서, Ins(1,2,3,4,5,6)P6 (프티산)을 PA 로 약칭한다.

효소 명명법 데이터베이스 ExPASy (그것에 대한 EC (Enzyme Commission) 번호가 제공되어 있는 특성확인된 효소의 각 타입을 설명하는, 일차적으로 노멘클래춰 코미티 오브 더 인터내셔날 유니온 오브 바이오케미스트리 앤드 몰레큘라 바이올로지 (IUBMB)의 추천을 토대로 한 효소의 명명법에 관련된 정보의 저장소)에 따라, 두 개의 상이한 타입의 피타제가 알려져 있다: 소위 3-피타제 (미오-이노시톨 헥사포스페이트 3-포스포하이드롤라제, EC 3.1.3.8) 및 소위 6-피타제 (미오-이노시톨 헥사포스페이트 6-포스포하이드롤라제, EC 3.1.3.26). 3-피타제는 먼저 D-3-위치에서 에스테르 결합을 가수분해하는 한편, 6-피타제는 먼저 D-6- 또는 L-6-위치에서 에스테르 결합을 가수분해한다.

표현 "피타제" 또는 "피타제 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 효소"는 다양한 미오-이노시톨 포스페이트로부터 무기 포스페이트 또는 인의 분리에 영향을 줄 수 있는 모든 효소를 커버하는 것으로 의도된다. 그러한 미오-이노시톨 포스페이트 (피타제 기질)의 실예는 피트산 및 그것의 모든 염, 예컨대 피트산 나트륨염 또는 피트산 칼륨염 또는 혼합염이다. 또한 미오-이노시톨의 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 또는 펜타-포스페이트중 어느 입체 이성질체든지 피타제 기질로서 작용할 수 있다. 바람직한 피타제 기질은 피트산 및 그것의 염이다.

상기 정의에 따라서, 피타제 활성은 이들 기질중 어느 하나가 사용되는 어떠한 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 명세서에서는 (다른 언급이 없는 한) 피타제 활성은 FYT 의 유니트로 측정되는데, 1 FYT 는 다음의 조건하에서 1 분당 1 ㎛의 무기 오르토-포스페이트를 분리시키는 효소의 양이다: pH 5.5; 온도 37 ℃; 기질: 0.0050 mol/l 의 농도의 피트산 나트륨 (C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂). 적당한 피타제 검정은 실시예 부분에서 설명된다.

본 발명은 첨부되는 청구범위에서 기재되는 바와 같은 유전공학적으로 제조된 피타제를 제공한다.

유전공학적으로 제조된 피타제는 모델 피타제, 예컨대 야생형 피타제와는 상이한, 비-천연 발생적인 피타제이다. 유전공학적으로 제조된 피타제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 부위-특정 돌연변이생성, 유전자 셔플링, 무작위 돌연변이 생성 등에 의하여 제조된 피타제들이 있다.

본 발명은 또한 DNA 구성물, 벡터, 숙주 세포, 및 이들 유전공학적으로 제조되는 피타제 및 피타제 변이체들의 제조 방법과, 또한 그것들의 용도를 제공한다.

피타제 변이체는 피타제 활성을 나타내고 모델 피타제와 비교하여 보정된 폴리펩티드 또는 효소 또는 그것의 단편이다.

보정되었다는 것은 하나 또는 둘 이상의 아미노산 또는 펩티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가 - 각각의 경우에 하나 또는 둘 이상의 아미노산에 의한 또는 -의 - 에 의해 변경된 것을 의미한다. 그러한 치환, 결실, 삽입, 첨가는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 방법, 예컨대 유전자 셔플링, 무작위 돌연변이생성, 부위-특정 돌연변이생성 등에 의하여 이루어질 수 있다.

그것으로부터 피타제 변이체가 유도되는 모델 또는 모 (parent) 피타제는 어떠한 피타제든지 될 수 있다, 예컨대 야생형 피타제 또는 대립성 및 종 변이체를 포함하는 그것의 유도체, 돌연변이체 또는 변이체, 및 예컨대 부위-특정 돌연변이생성, 무작위 돌연변이생성, 셔플링 등에 의해 제조될 수 있는 그것의 유전공학적으로 제조된 변이체일 수 있다.

모델 피타제의 개념에는 또한 어떠한 하이브리드 또는 키메릭 피타제, 즉 최소한 두 개의 피타제로부터 유도된 부분적인 아미노산 서열의 조합을 포함하는 피타제가 포함된다.

하이브리드 피타제는 최소한 두 개의 자낭균 피타제, 최소한 두 개의 담자균 피타제 또는 최소한 하나의 자낭균과 최소한 하나의 담자균 피타제로부터 유도되는 부분적인 아미노산 서열의 조합을 포함할 수 있다. 그것으로부터 부분적인 아미노산 서열이 유도되는 이들 자낭균과 담자균의 피타제는 예컨대 본원에서 언급되는 특이한 피타제들중 어느 하나일 수 있다.

본 명세서에서, 단지 자낭균 피타제로부터만 유도된 하이브리드, 셔플된, 무작위 돌연변이된, 부위-특정 돌연변이된 또는 다르게는 유전공학적으로 처리된 피타제는 또한 자낭균 피타제이다; 또 단지 담자균 피타제로부터만 유도된 하이브리드, 셔플된, 무작위 돌연변이된, 부위-특정 돌연변이된 또는 다르게는 유전공학적으로 처리된 피타제는 또한 담자균 피타제이다. 최소한 하나의 담자균 피타제 뿐만 아니라 최소한 하나의 자낭균 피타제로부터 유도된 모든 하이브리드는 혼합된 자낭균/담자균 피타제로 언급되고, 그러한 피타제는 또한 본 명세서에서 모델 피타제이다.

유사하게, 하나 또는 둘 이상의 아스페르길루스 피타제로부터 유도된 하이브리드, 셔플된, 무작위 돌연변이된, 부위-특정 돌연변이된 또는 다르게는 유전공학적으로 제조된 피타제는 또한 아스페르길루스 유도된 피타제이다; 본원에서 언급되는 어떠한 다른 분류학적 하위-그룹으로부터 유도된 하이브리드, 셔플된, 무작위 돌연변이된, 부위-특정 돌연변이된 또는 그렇지 않으면 유전공학적으로 제조된 피타제는 또한 상기 분류학적 하위-그룹으로부터 유도된 피타제로 표시될 것이다.

또한 본 명세서에서, "으로부터 유도된" 은 관심의 유기체의 스트레인에 의해 생성된 또는 생성될 수 있는 피타제뿐만 아니라, 그러한 스트레인으로부터 단리된 DNA 서열에 의하여 코드화되고, 상기 DNA 서열로 형질전환된 숙주 유기체에서 생성된 피타제를 가리키는 것으로 의도된다. 마지막으로, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 코드화되고 의문의 피타제의 확인된 특성을 가지고 있는 피타제를 가리키는 것으로 의도된다.

바람직하게도, 모델 피타제는 도 1 의 13 개의 피타제의 각각에 대해 하기에서 설명되는 바와 같이 배열될 수 있다 (특히 모델 피타제에 대해 바람직하다).

바람직한 야생형 모델 피타제 (즉, 재조합되거나, 또는 셔플되거나 또는 그렇지 않으면 유전공학적으로 제조된 피타제가 아닌 피타제)는 이들 13 개의 피타제의 어느 하나의 아미노산 서열 번호 38에서 403 까지 (Peniophora 번호)에 대해 어느 정도의 유사성 또는 상동성, 바람직하게는 동일성, 예컨대 최소한 40 %, 보다 바람직하게는 최소한 50 %, 보다 바람직하게는 최소한 60 %, 특히 최소한 70 %, 특히 최소한 80 %, 가장 바람직한 구체예에서는, 최소한 90 % 정도의 유사성을 갖는다.

바람직한 재조합 또는 셔플된 또는 그렇지 않으면 유전공학적으로 제조된 모델 피타제는 이들 13 개의 피타제의 어느 하나의 부분적인 아미노산 서열 번호 38 에서 49, 63 에서 77, 274 에서 291, 281 에서 300 및 389 에서 403 까지 (Peniophora 번호)에 대해, 최소한 60 %, 보다 바람직하게는 최소한 70 %, 여전히 보다 바람직하게는 최소한 80 %, 특히 최소한 90 % 정도의 유사성, 또는 상동성, 바람직하게는 동일성을 갖는다.

바람직한 구체예에서 유사성 정도는 13 개의 피타제중 어느 하나의 완전한 아미노산 서열과의 비교를 토대로 한다.

유사성 또는 상동성, 또는 다르게는 동일성의 정도는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 배열 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 배열 프로그램은 GCG 버전 8 프로그램 팩키지로 제공된 GAP 이다 (프로그램 매뉴얼 포 더 위스콘신 팩키지, 버전 8, 1994. 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). 폴리펩티드 서열 비교를 위해서는 다음의 세팅이 되어 있는 GAP을 사용한다: GAP Weight: 3.000 및 GAP Lengthweight: 0.100.

또한 도 1 의 13 개의 특이한 피타제 서열을 코드화하는 DNA 서열중 어느 하나의 아미노산 서열 38에서 403 까지 (Peniophora 번호)를 코드화하는 DNA 서열에 혼성화하는 DNA 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함하는 야생형 모델 피타제가 바람직하다.

또한 추가의 바람직한 모델 피타제는 유전공학적으로 제조된 피타제로, 이것은 도 1 의 13 개의 특이한 피타제를 코드화하는 DNA 서열들중 어느 하나의 아미노산 서열 38 에서 49를 코드화하는 DNA 서열에 대하여, 아미노산 서열 63 에서 77을 코드화하는 DNA 서열에 대하여, 아미노산 서열 274 에서 291을 코드화하는 DNA 서열에 대하여, 아미노산 서열 281 에서 300을 코드화하는 DNA 서열에 대하여, 및 아미노산 서열 389 에서 403 (Peniophora 번호)을 코드화하는 DNA 서열에 대하여 혼성화하는 DNA 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 혼성화는 13 개의 피타제중 어느 하나의 부분을 코드화하는 완전한 피타제에 대해 이루어진다.

주어진 DNA 또는 RNA 서열이 특정한 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 프로브에 "혼성화"하는 지의 여부를 측정하기 위한 적당한 실험 조건은 혼성화에 대해 조사하기 위한 DNA 단편 또는 RNA를 함유하고 있는 필터를 5 × SSC (염화 나트륨/시트르산 나트륨)에 10 분동안 예비침지하는 단계 (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York)와, 필터를 5 × SSC, 5 × 덴하르드트 용액 (Sambrook et al., 1989), 0.5 % 의 SDS 및 100 ㎍/ml의 변성된 초음파처리된 연어 정자 DNA (Sambrook et al., 1989)의 용액중에서 예비혼성화하는 단계, 그리고 이어서 10 ng/ml 농도의 무작위-프라임된 (Feinberg, A.P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13) 32P-dCTP-표지된 (비활성 〉 1 × 109 cpm/㎍) 프로브가 함유되어 있는 상기와 동일한 용액중에서 12 시간동안 대략 45 ℃에서 혼성화하는 단계를 포함한다.

그런 다음 필터는 30 분동안 2 × SSC, 0.5 % SDS 중에서 최소한 55 ℃에서 (낮은 엄격도), 최소한 60 ℃에서 (중간 엄격도), 최소한 65 ℃에서 (중간/높은 엄격도), 최소한 70 ℃에서 (높은 엄격도), 또는 최소한 75 ℃에서 (매우 높은 엄격도) 두 번 세척된다.

이들 조건하에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 분자들이 X-선 필름을 사용하여 검출된다.

특정의 특이한 피타제 변이체는 실제로는 특이한 모델 피타제로부터 제조될 필요가 없는데, 왜냐하면 이 모델 피타제는 본 명세서에서 "모델 피타제"로서 적합한 것으로 인정되기 때문임이 주지되어야 한다. 변이체는 앞으로 모델 피타제와 비교될 때 본원에서 표시된 보정사항들중 최소한 하나를 나타내는 것으로 충분하다.

도 1 의 배열은 3.000 의 GapWeight 와 0.100 의 GapLengthWeight를 사용하여 프로그램 PileUp (프로그램 매뉴얼 포 더 위스콘신 팩키지, 버전 8, 1994. 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)을 사용하여 만들어진다. 새로운 모델 피타제 또는 새로운 피타제 변이체가 배열될 때는 모든 13 개의 서열이 새로운 피타제 (변이체)와 함께 다중 배열중에 포함될 수 있거나, 또는 다르게는, 도 1 에 도시된 13 개의 서열들중 최소한 하나가 새로운 피타제 (변이체)와 함께 배열에 포함된다.

도 1 에 따라 새로운 모델 피타제 (또는 피타제 변이체)를 배열하기 위한 과정은 다음과 같다: 새로운 모델 피타제는 도 1 의 13 개의 서열중 새로운 모델 피타제가 가장 높은 정도의 상동성을 나타내는 바로 그 서열과 함께 배열된다. 상동성 정도를 계산하기 위하여, 및 두 서열의 "도 1 에 따른 배열"을 만들기 위해서는, 하기에서 언급되는 프로그램 GAP이 바람직하게 사용된다. 2 개의 서열이 배열되고 나면, 새로운 모델 피타제 (또는 변이체)가 첫 번째 배열의 결과를 사용하여 도 1 에서의 배열에 첨가되고 (지나가고) (배열에 의해 정해진 바와 같이 각각 상대방의 위에 동일하고 상동하는 아미노산 잔기들을 놓는다), 그 다음에 상응하는 위치들이 이제는 쉽게 확인가능하다.

하기의 실시예 7 은 새로운 모델 피타제를 도 1 의 배열에 첨가하는 방법 및 그것의 상응하는 피타제 변이체를 추론하는 방법의 실예를 보여준다.

다른 모델 피타제들도 배열될 수 있으며, 실시예 7 에서와 비슷하게 변이체들이 추론될 수 있다. 이것은 특히 다음의 모델 피타제에 대해 그러하다: 아스페르길루스 니거 변종 아와모리 (미국 특허 제 5,830,733 호); WO 98/06858 호의 바실루스 피타제; WO 98/20139 호의 대두 피타제; WO 98/05785 호의 옥수수 피타제; WO 97/38096 호의 아스페르길루스 피타제; WO 98/13480 호의 모나스쿠스 앙카의 피타제; EP 0699762 호의 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis)로부터 유도되는 피타제, 등.

본원에서 설명되는 바와 같은 배열을 사용하여 모델 피타제와 제안된 피타제 변이체를 비교할 때, 상응하는 아미노산 위치들이 확인될 수 있다, 즉 모델 피타제의 모델 위치와 변이체의 변이 위치 - 상응하는 모델 위치 및 변이 위치는 단순하게 배열의 다른 것 위에 놓이는 것이다. 보정은 만약 모델 위치의 모델 아미노산과 변이 위치의 변이체 아미노산이 상이하다면 주어진 위치에서 일어난 것으로 언급된다. 이들 위치의 바람직한 보정은 그것들 자체가 아미노산 치환, 결실 또는 첨가로서 명백하게 나타난다.

최소한 하나의 위치에서의 보정은 하나 또는 둘 이상의 위치, 즉 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘 등, 심지어 모든 열거되는 N 위치에서의 보정을 의미한다. 이 정의는 그것들의 어떠한 가능한 하위-조합, 예컨대 두가지 치환의 어떤 세트, 셋의 어떠한 세트, 넷의 어떠한 세트, 등 - (N-1) 위치의 어떠한 세트까지 -을 포함한다.

본 명세서에서, 모든 서열은 그 모델 피타제가 어떤 것이든지간에, 도 1 의 13 개의 서열을 포함하여, 피타제 P_lycii에 상응하는 넘버링을 사용하여 번호가 정해진다. 이들 "Peniophora 번호"는 "배열 번호"와 함께 도 1 에 표시된다. P_lycii 의 넘버링은 M1에서 출발하여 E439에서 끝난다.

상술된 바와 같이, 배열은 P_lycii 이외의 다양한 피타제 서열에 있는 어떤 위치들이 주어진 P_lycii 위치와 동등한지 또는 상응하는 지를 나타낸다.

아미노산의 치환은 본원에서 예를 들면 "3S"로서 표시되는데, 이것은 위치 3에서 아미노산 S가 그것이 어떤 것이든지 "원래의" 또는 모델 위치 3 아미노산 대신 치환되어야 하는 것을 가리킨다. 그로써, 치환은 상응하는 변이체 위치에 S를 초래하여야 한다. 이제 도 1 에서의 배열을 고려하면, 예컨대 "3S"와 같은 치환은 제시된 각각의 피타제에 대하여 다음과 같이 해석되어야 한다 (처음에 표시된 아미노산은 "Peniophora 위치" 3의 "원래의" 또는 모델 아미노산이다):

P_involtus_A1: F3S (번호 3 F는 S에 의해 치환된다)

P_involtus_A2: L3S

T_pubescens: M1S

A_pediades: M1S

P_lycii: 과외 (이미 S)

A_fumigatus: T5S

consphyA: V5S

A_nidulans: T5S

A_ficuum_NRRL3135: A5S

A_terreus: A5S

T_thermo: L5S

T_lanuginosa: V11S

M_thermophila: G5S

그러나, 다음에서는 상기의 특이한 치환이 다음과 같이 표시될 것이다 (언제나 페니오포라 넘버링을 사용함):

P_involtus_A1: F3S

P_involtus_A2: L3S

T_pubescens: M3S

A_pediades: M3S

P_lycii: 과외 (이미 S)

A_fumigatus: T3S

consphyA: V3S

A_nidulans: T3S

A_ficuum_NRRL3135: A3S

A_terreus: A3S

T_thermo: L3S

T_lanuginosa: V3S

M_thermophila: G3S

또한 여전히, 예컨대 "3S,F,G"와 같은 표시는 관심의 모델 피타제의 위치 3 (페니오포라 번호)에 있는 아미노산이 S, F 또는 G 중 어느 하나로 치환됨을 의미한다, 즉 예컨대 표시 "3S,F,G"는 표시 "3S, 3F, 3G"와 완전히 동등한 것으로 간주된다.

()3S 와 같은 표시는 아미노산 S가 관심의 서열에 (실제 서열의 갭에서), 페니오포라 번호 3에 상응하는 위치에서 첨가되는 것을 의미한다 - 결실 (S3())에 대해서는 그 역이다.

페니오포라 피타제 서열이 도 1 의 다른 피타제들중 일부보다 더 큰 결실을 가지고 있는 영역의 경우에, 예컨대 위치 201 과 202 (페니오포라 번호)사이의 영역에서, 중간 위치 (다른 서열의 아미노산 잔기들)는 소문자로 a, b, c, d, 등을 마지막 페니오포라 위치 번호에 첨가함으로써 넘버링된다, 예컨대 피타제 M_thermophila에 대해: E201; G201a; P201b; Y201c; S201d; T201e; I201f; G202; D203 등이다.

본 발명의 선행 출원중 하나에는 두 개의 사소한 위치 넘버링 실수가 있다: 상기 정의에 따르면, 첫 번째 선행 출원에서 204 와 205 (피니오포라 번호)로서 언급된 위치들은 잘못된 것이다; 그것들은 각각 203a 와 204 로 넘버링되어야 했을 것이다. 그러므로, 본 출원을 통하여 204 는 203a 로 치환되고 205 는 204 로 교체되었다.

본 발명의 바람직한 피타제 변이체는 다음의 아미노산 치환중 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 바람직하게는 함유하는 아미노산 서열을 포함한다: 24C; 27P; 31Y; 33C; 39H,S,Q; 40L,N; 42S,G; 43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 44N; 45D,S; 47Y,F; 49P; 51E,A,R; 56P; 58D,K,A; 59G; 61R; 62V,I; 69Q; 75W,F; 78D,S; 79G; 80K,A; 81A,G,Q,E; 82T; 83A,I,K,R,Q; 84I,Y,Q,V; 88I; 90R,A; 102Y; 115N; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,Q,T; 125M,S; 126H,S,V; 127Q,E,N; 128A,S,T; 132F,I,L; 143N; 148V,I; 151A,S; 152G; 153D,Y; 154D,Q,S,G; 157V; 158D,A; 159T; 160A,S; 161T,N; 162N; 163W; 170fH; 170gA; 171N; 172P; 173Q,S; 184Q,S,P; 185S; 186A,E,P; 187A; 187aS; 190A,P; 193S; 194S,T; 195T,V,L; 198A,N,V; 200G,V; 201D,E; 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f 중 최소한 하나의 결실, 바람직하게는 전부; 201eT; 202S,A; 203R,K,S; 203aV,T; 204Q,E,S,A,V; 205E; 211L,V; 215A,P; 220L,N; 223H,D; 228N; 232T; 233E; 235Y,L,T; 236Y,N; 237F; 238L,M; 242P,S; 244D; 246V; 251eE,Q; 253P; 256D; 260A,H; 264R,I; 265A,Q; 267D; 270Y,A,L,G; 271D,N; 273D,K; 275F,Y; 278T,H; 280A,P; 283P; 287A,T; 288L,I,F; 292F,Y; 293A,V; 302R,H; 304P,A; 332F; 336S; 337T,G,Q,S; 338I; 339V,I; 340P,A; 343A,S,F,I,L; 348Y; 349P; 352K; 360R; 362P; 364W,F; 365V,L,A,S; 366D,S,V; 367A,K; 368K; 369I,L; 370V; 373A,S; 374S,A; 375H; 376M; 383kQ,E; 387P; 393V; 396R; 404A,G; 409R; 411K,T; 412R; 417E,R; 421F,Y; 431E.

바람직한 구체예에서, 이것은 모델 피타제가 표시된 위치에서 상기 제시된 아미노산 치환 또는 첨가를 이미 포함하고 있지 않다는 전제조건이다. 또는 각 위치에 대하여, 모델 아미노산이 이미 본원에 제시된 변이 아미노산이 아니라는 전제조건이다. 그러나 이들 전제조건은 "보정된"이라는 표현 때문에 실제로는 이미 상기 표현에서 고유한 것으로 말해질 수 있다.

첨부되는 청구범위 제 16 항 내지 34 항의 다양한 바람직한 피타제 변이체들은 각각의 청구범위에 열거된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실중 하나 또는 둘 이상을 포함 또는 함유하는 아미노산 서열을 포함, 바람직하게는 함유 또는 가지고 있다.

바람직한 구체예에서, 다양한 피타제 변이체들은 이들 치환중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어는 10 개의 치환; 또는 10 내지 15 개, 15 내지 20 개, 20 내지 30 개, 또는 심지어는 30 내지 50 개의 치환; 결국에는 60, 70, 80 또는 90 개까지의 치환을 포함하고 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 다양한 피타제 변이체들의 아미노산 서열은 하기에 열거되는 치환 하위-군의 하나 또는 둘 이상의 치환; 또는 둘 또는 그 이상의 하위-군으로 분류된 치환들의 조합을 포함한다.

일반적으로, "포함", "함유" 또는 "가진다"는 말 대신에, 바람직한 변이체들의 아미노산 서열은 본원에서 설명된 하나 또는 둘 이상의 치환에 의해 변형된 바와 같은, 도 1 의 특이한 모델 피타제로 "본질적으로 구성된다" 또는 "구성된다".

본 명세서에서 담자균은 바시디오미코타 문의 미생물을 의미한다. 이 바시디오미코타 문은 예컨대 아스코미코타 문 ("자낭균")과 함께 진균 계에 포함된다.

분류학적인 의문사항들은 하기에 열거된 참고문헌을 염두에 둠으로써 또는 다음의 주소: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html 를 가지고 있는 인터넷 온 월드 와이드 웹을 경유하여 활용이 가능한 진균 분류학 데이터베이스 (NIH 데이터 베이스 (Entrez))를 참조함으로써 분명해질 수 있다.

단자균의 정의를 위해서는, 다음의 참고문헌을 들 수 있다: Juich, 1981, Higher Taxa of Basidiomycetes; Ainsworth ＆ Bisby's (eds.) Dictionary of the Fungi, 1995, Hawksworth, D.L., P.M. Kirk, B.C. Sutton ＆ D.N. Pegler; 또는 Hansen ＆ Knudsen (Eds.), Nordic Macromycetes, vol. 2 (1992) 및 3 (1997). 바람직한 참고문헌은 한센과 쿠드센의 것이다.

자낭균의 정의에 대해서는, 다음의 참고문헌을 들 수 있다: Ainsworth ＆ Brisby, 상기 동일한 문헌; 또는 Systema Ascomycetum by Eriksson, O.E. ＆ D.L. Hawksworth, Vol. 16, 1998. 바람직한 참고문헌은 에릭슨 등에 의한 것이다.

일반적으로, 데이터베이스를 포함하여, 상기 열거된 문헌들중 어느 것에서든지 담자균/자낭균으로서 분류된 미생물은 본 명세서에서 담자균/자낭균이다.

일부의 아스페르길루스 스트레인들은 그것들이 비정형이고, 그로써 진균 임퍼펙티 (Fungi Imperfecti)로 분류될 수 있기 때문에 분류하기가 어렵다. 그러나, 일단 원형 (teleomorphous) 대응물이 발견되면, 그것은 분류학적으로 재-분류된다. 예를 들어, 아스페르길루스 니듈란스의 원형은 에메리셀라 니듈란스 (아스코미코타 문의 플렉토미세테스 강, 유로티알레스 목, 트리코코마세아에 과)이다. 이들 아스코미코타의 하위군 분류는 아스코미코타 문의 피레노미세테스 강, 소르다리알레스 목, 라시오스파에리아세아에 과와 함께 바람직하다.

본원에서 사용되는 표현 "자낭균" 및 유사한 용어는 비정형이고, 그러므로 진균 임퍼펙티로 분류될 수 있는 아스페르길루스, 써모마이세스, 미셀리오프토라, 탈라로마이세스의 어떠한 스트레인이든지 포함한다.

바람직한 담자균 피타제는 WO 98/28409 에, "발명의 상세한 설명"이라는 제목의 단원의 처음 도입부분에 열거된 것들이다.

13 개의 구체적으로 열거된 모델 피타제와 다른 모델 피타제들을 코드화하는 DNA 서열은 도면의 간단한 설명하에 열거된 각각의 문헌들의 교시를 따라 제조될 수 있다.

모델 피타제를 코드화하는 DNA 서열은 관심의 피타제를 생성하는 어떠한 세포 또는 미생물로부터, 당업계에 공지되어 있는 다양한 방법들을 사용하여 단리될 수 있다. 먼저, 게놈성 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리가 피타제를 생성하는 유기체로부터 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 사용하여 구성되어야 한다. 그런 다음, 만약 피타제의 아미노산 서열이 알려져 있다면, 상동하는, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 합성되어 의문의 유기체로부터 제조된 개놈 라이브러리로부터 얻어진 피타제-코드화 클론을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 또는 다르게는, 공지의 피타제 유전자에 상동하는 서열을 함유하고 있는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 엄격도가 낮은 혼성화 및 세척 조건을 사용하여, 피타제-코드화 클론을 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있을 것이다.

피타제-코드화 클론을 확인하는 또 다른 방법은 게놈 DNA의 단편을 예컨대 플라스미드와 같은 발현 벡터안에 삽입하고, 그 결과 형성된 게놈성 DNA 라이브러리로 피타제-네가티브 박테리아를 형질전환시키고, 그런 다음 형질전환된 박테리아를 피타제에 대한 기질을 함유하고 있는 아가위에 놓음으로써 피타제를 발현하는 클론들이 확인될 수 있도록 하는 것으로 이루어진다.

또는 달리, 효소를 코드화하는 DNA 서열은 수립되어 있는 표준 방법, 예컨대 뷰케이지와 카루터스에 의해 설명된 포스포로아미다이트 방법 (S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, 1981) 또는 매테스 등에 의해 설명된 것과 같은 방법 (Matthes et al., 1984)에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포로아미다이트 방법에서는, 올리고뉴클레오티드가, 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되며, 아닐링되고, 결찰된 후, 적절한 백터안에 클론된다.

마지막으로, DNA 서열은 표준 기법에 따라, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편들을 결찰시킴에 의해 제조되는 (필요에 따라 단편들은 전체의 DNA 서열의 다양한 부분들에 상응한다), 게놈과 합성 기원의 혼합형, 합성과 cDNA 기원의 혼합형 또는 게놈과 cDNA 기원의 혼합형일 수 있다. DNA 서열은 또한 특이한 프라이머, 예컨대 미국 특허 제 4,683,202 호에, 또는 사이키 등 (R.K. Saiki et al., 1988)에 의해 설명된 것과 같은 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 피타제 변이체를 코드화하는 DNA는 당업계에 공지되어 있는 방법들, 예컨대 부위-특정 돌연변이생성에 의해 제조될 수 있다. 일단 관심의 모델 피타제를 코드화하는 DNA 서열이 단리되고 돌연변이에 바람직한 부위들이 확인되면, 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드들은 원하는 돌연변이 부위 양옆에 있는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 있다; 돌연변이 뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드 합성중에 삽입된다. 특이한 방법으로, 피타제-코드화 서열을 연결하는 DNA의 단일-가닥의 갭이 피타제-코드화 유전자를 운반하는 벡터안에 생성된다. 그런 다음 원하는 돌연변이를 포함하고 있는 합성 뉴클레오티드가 단일-가닥의 DNA의 상동하는 부분에 아닐링된다. 그런 다음 남아있는 갭은 DNA 중합효소 I (클레노우 단편)으로 채워지고, 구성물은 T4 리가제를 사용하여 결찰된다. 이 방법의 구체적인 실예는 모리나가 등에 의해 설명된다 (Morinaga et al., 1984). 미국 특허 제 4,760,025 호에는 카세트에 대해 미미한 변경을 수행함에 의해 다중 돌연변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드를 도입시키는 것이 개시되어 있다. 그러나, 다수의 올리고뉴클레오티드, 다수의 다양한 길이가 도입될 수 있기 때문에 모리나가 방법에 의해 더 큰 다양한 돌연변이까지도 한번에 도입될 수 있다.

원하는 모델 피타제를 코드화하는 DNA 서열안에 돌연변이를 도입시키는 다른 방법이 넬슨과 롱에 의해 설명되었다 (Nelson and Long, 1989). 이 방법은 PCR 반응에서 프라이머중 하나로서 화학적으로 합성된 DNA를 사용함으로써 도입된 원하는 돌연변이를 함유하는 PCR 단편의 3-단계 생성을 포함한다. PCR-생성된 단편으로부터, 돌연변이를 포함하고 있는 DNA 단편이 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 절단에 의해 단리될 수 있고, 그것이 발현 플라스미드안에 재삽입될 수 있다.

모델 피타제를 코드화하는 DNA 서열을 돌연변이시키는 또 다른 방법은 무작위 돌연변이생성이다. 무작위 돌연변이생성은 의문의 제시된 아미노산으로의 유전자 번역 단계의 최소한 3 부분에서, 또는 전체 유전자내에서, 국소화된 또는 영역-특이적 무작위 돌연변이생성 중 어느 하나로서 적절하게 수행된다.

모델 피타제를 코드화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이생성은 당업계에 공지되어 있는 어떠한 방법이든지 사용함으로써 편리하게 수행될 수 있다.

상기와 관련하여, 본 발명의 추가의 측면은 모델 피타제의 변이체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 때 변이체는 바람직하게는 하기와 같은 보정된 특성들을 나타내며, 상기 방법은 다음 단계들로 이루어진다:

(a) 모델 피타제를 코드화하는 DNA 서열에 대하여 부위-특정 돌연변이생성, 또는 넬슨과 롱의 PCR 돌연변이생성 또는 무작위 돌연변이생성을 수행하는 단계,

(b) 단계 (a)에서 얻어진 돌연변이된 DNA 서열을 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 그리고

(c) 모델 피타제에 대하여 변경된 성질을 가지고 있는 피타제 변이체를 발현하는 숙주 세포에 대하여 스크리닝하는 단계.

무작위 돌연변이생성을 사용할 때, 본 발명의 상기 방법의 단계 (a)는 바람직하게는 도핑된 프라이머를 사용하여 수행된다.

예를 들어, 무작위 돌연변이생성은 적절한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제를 사용함으로써, 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 또는 DNA 서열에 대하여 PCR 생성된 돌연변이생성을 수행함으로써 수행될 수 있다. 나아가, 무작위 돌연변이생성은 이들 돌연변이 유발제의 어떠한 조합을 사용함으로써 수행될 수 있다. 돌연변이 유발제는 예컨대 전이, 변환, 역전, 스크램블링, 결실, 및/또는 삽입을 유도하는 것일 수 있다.

본 목적에 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 실예로는 자외선 (UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), O-메틸 히드록실아민, 질산, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS), 중아황산 나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체가 있다. 그러한 제제들이 사용될 때, 돌연변이생성은 전형적으로, 돌연변이될 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 선택된 돌연변이 유발제와 함께 돌연변이가 일어날 적당한 조건하에서 인큐베이션하는 단계와, 원하는 성질을 가지고 있는 돌연변이된 DNA 에 대해 선택하는 단계에 의해 수행된다.

돌연변이생성이 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 수행되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 합성중에 변화가 일어날 위치에서 모 세대의 것이 아닌 (non-parent) 3 개의 뉴클레오티드로 도핑되거나 또는 고정될 (spiked) 수 있다. 도핑 또는 스파이킹은 원하지 않는 아미노산에 대한 코돈을 피할 수 있도록 이루어질 수 있다. 도핑되거나 스파이크된 올리고뉴클레오티드는 피타제 효소를 코드화하는 DNA 안에, 어떠한 공개된 기법에 의하여, 예컨대 필요에 따라 PCR, LCR 또는 어떠한 DNA 중합효소 및 리가제를 사용함으로써 통합된다.

바람직하게는, 도핑은 "일정한 무작위 도핑"을 사용하여 수행되는데, 이 방법에서 각 위치에서의 야생형과 돌연변이의 백분율은 미리 규정된다. 나아가, 도핑은 특정 뉴클레오티드의 도입이 선호되는 쪽으로 지시될 수 있으며, 그로써 하나 또는 둘 이상의 특이한 아미노산 잔기의 도입이 우선시된다. 도핑은 예컨대 90 % 의 야생형과 10 % 의 돌연변이가 각 위치에 도입되는 것이 가능하도록 이루어질 수 있다. 도핑 계획의 선택에서 추가의 고려사항은 단백질-구조적 제한 뿐만 아니라 유전자 제한을 기초로 한다. 도핑 계획은 무엇보다도 중지 코돈의 도입이 저지되는 것을 확실하게 해주는 DOPE 프로그램을 사용함으로써 이루어질 수 있다.

PCR-생성된 돌연변이생성이 사용되는 경우, 모델 피타제를 코드화하는 화학적으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 유전자에 대해, 뉴클레오티드의 잘못된 통합을 증가시키는 조건하에서 PCR 이 수행된다 (Deshler, 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15).

대장균의 돌연변이 유발 스트레인 (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), 맥주효모균 또는 어떠한 다른 미생물 유기체의 돌연변이 유발 스트레인이 모델 피타제를 코드화하는 DNA의 무작위 돌연변이생성을 위해, 예컨대 모 글리코실라제를 함유하고 있는 플라스미드를 돌연변이 유발 스트레인안에 형질전환시키고, 플라스미드를 함유한 돌연변이 유발 스트레인을 성장시킨 후, 돌연변이 유발 스트레인으로부터 돌연변이된 플라스미드를 단리함에 의해 사용될 수 있다. 돌연변이된 플라스미드는 계속해서 발현 유기체안에 형질전환될 수 있다.

돌연변이될 DNA 서열은 편리하게도 모델 피타제를 발현하는 유기체로부터 제조된 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 존재할 수 있다. 또는 달리, DNA 서열은 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 적당한 벡터상에 존재할 수 있으며, 그러한 벡터들은 그 자체로서 돌연변이 유발제와 함께 또는 그렇지 않으면 돌연변이 유발제에 노출된 상태로 인큐베이션될 수 있다. 돌연변이될 DNA 는 또한 숙주 세포의 게놈에 통합됨으로써 또는 숙주 세포안에 은닉되어 있는 벡터상에 존재함으로써 숙주 세포에 존재할 수 있다. 결국, 돌연변이될 DNA 는 단리된 형태로 있을 수 있다. 무작위 돌연변이 생성을 수행받는 DNA 서열은 바람직하게는 cDNA 또는 게놈 DNA 서열임이 인지될 것이다.

어떤 경우에, 발현 단계 b) 또는 스크리닝 단계 c) 전에 돌연변이된 DNA 서열을 증폭시키는 것이 편리할 수 있다. 그러한 증폭은 당업계에 공지되어 있는 방법들을 따라 수행될 수 있으며, 현재 바람직한 방법은 모 효소의 DNA 또는 아미노산 서열을 토대로 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR-생성된 증폭 방법이다.

돌연변이 유발제와 함께 또는 돌연변이 유발제에 노출된 상태에서의 인큐베이션에 이어서, 돌연변이된 DNA는 DNA 서열을 포함하고 있는 적당한 숙주 세포를 발현이 일어나는 것을 허용하는 조건하에서 배양함으로써 발현된다. 이 목적을 위해 사용되는 숙주 세포는 임의로 벡터상에 존재하는 돌연변이된 DNA 서열로 형질전환된 세포, 또는 돌연변이 생성 처리중에 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 세포이다. 적당한 숙주 세포의 실예는 다음과 같다: 그람 포지티브 박테리아, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 렌투스, 바실루스 브레비스, 바실루스 스테아로써모필루스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스, 바실루스 코아귤란스, 바실루스 써큘란스, 바실루스 라우투스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 튜링기엔시스, 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 뮤리누스; 및 그람 네가티브 박테리아, 예컨대 대장균.

돌연변이된 DNA 서열은 또한 돌연변이된 DNA 서열의 발현을 허용하는 기능들을 코드화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.

무작위 돌연변이생성은 유리하게도 국소화된 무작위 돌연변이생성을 사용하여 의문의 모델 피타제의 부분에 국소화될 수 있다. 이것은 예를 들면 효소의 특정 영역이 주어진 효소의 성질에 대하여 특별히 중요한 것으로 확인된 경우, 및 변형이 개선된 성질을 가지는 변이체를 초래할 것으로 예상되는 경우에 유리할 것이다. 그러한 영역은 모 효소의 삼차 구조가 설명되었고 그것이 효소의 기능과 관련된 경우에 정상적으로 확인될 수 있다.

국소화된, 또는 영역-특이적인 무작위 돌연변이생성은 상술된 바와 같은 PCR 생성된 돌연변이 생성 기법 또는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 다른 적당한 기법을 사용함으로써 편리하게 수행될 수 있다. 또는 달리, 변형될 DNA 서열의 부분을 코드화하는 DNA 서열이 예컨대 적당한 벡터안으로의 삽입에 의해 단리될 수 있으며, 상기 부분은 계속해서 상기에서 논의된 돌연변이 생성법들중 어느 하나를 사용함으로써 돌연변이가 생성될 수 있다.

예컨대 모델 피타제의 비활성을 보정하는 관점에서 영역-특이적 무작위 돌연변이생성을 위해서는, 도 1 에 도시된 아미노산 서열로부터 얻어지는 다음의 아미노산 잔기들에 상응하는 코돈 위치들이 적절하게 표적화될 수 있다:

잔기: 41-47, 68-80, 83-84, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 184-185, 191-193, 198-201e, 202-203, 205, 235-236, 238-239, 242-243, 270-279, 285, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394.

영역: 41-47, 68-80, 120-128, 149-163, 270-279, 332-343, 364-375.

무작위 돌연변이생성은 다음의 단계들에 의하여 수행될 수 있다:

1. 모 효소에서 변형을 위한 관심의 영역을 선택하는 단계

2. 선택된 영역에서 돌연변이 부위와 비-돌연변이 부위를 결정하는 단계

3. 예컨대 구성될 변이체의 원하는 안정성 및/또는 성능의 관점에서 어떤 종류의 돌연변이가 일어나야 할 지 결정하는 단계

4. 구조적으로 타당한 돌연변이를 선택하는 단계

5. 단계 4 의 견지에서 단계 3 에 의해 선택된 잔기들을 조정하는 단계

6. 적당한 도프 알고리듬을 사용함으로써 뉴클레오티드 분포를 분석하는 단계

7. 필요에 따라, 예컨대 중지 코돈의 도입을 피하기 위하여 유전자 코드로부터 유발되는 제한사항을 고려하여 원하는 잔기를 현실적인 유전자 코드로 조정하는 단게; 당업자는 일부의 코돈 조합은 실제로는 사용될 수 없으며 상황에 따라 고쳐질 필요가 있음을 깨닫게 될 것이다.

8. 프라이머를 만드는 단계

9. 프라이머의 사용에 의하여 무작위 돌연변이생성을 수행하는 단계

10. 그 결과 형성된 피타제 변이체를 원하는 개선된 성질에 대하여 스크리닝함으로써 선택하는 단계.

단계 6에서 사용하기에 적당한 도프 알고리듬은 당업계에 잘 알려져 있다. 한가지 그러한 알고리듬은 문헌에 설명되어 있다 (Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11:29-38). 또 다른 알고리듬은 DOPE 이다 (Jensen, L.J., Andersen, K.V., Svendsen, A. and Kretzschmar, T. (1998) Nucleic Acids Research 26:697-702).

본 발명의 모델 피타제 또는 피타제 변이체를 코드화하는 DNA 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호, 및 임의로 리프레서 유전자 또는 다양한 활성화 유전자를 코드화하는 조절 서열을 포함하고 있는 발현 벡터, 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현될 수 있다.

재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정을 수행받을 수 있는 것이면 어떠한 것이든지 좋고, 벡터의 선택은 때로 그것이 도입될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 그러므로, 벡터는 자동적으로 복제하는 벡터, 예컨대 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체-외재성 엘레먼트일 수 있다. 또는 달리, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때, 숙주 세포 게놈안에 통합되어, 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.

벡터에서, DNA 서열은 적당한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 것이면 어떠한 DNA 서열이든지 될 수 있고, 숙주 세포에 동종성이거나 또는 이종성인 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 피타제 변이체를 코드화하는 DNA 서열의 전사를, 특히 박테리아 숙주에서 지시하기 위한 적당한 프로모터의 실예는 대장균의 lac 오페론의 프로모터이다. 진균류 숙주에서의 전사를 위해 유용한 프로모터의 실예는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제를 코드화하는 유전자로부터 유도된 것들이다.

본 발명의 발현 벡터는 또한 적당한 전사 터미네이터와, 진핵세포에서, 본 발명의 피타제 변이체를 코드화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 같은 공급원으로부터 적절하게 유도될 수 있다.

벡터는 또한 추가로 의문의 숙주 세포에서 벡터가 복제하는 것을 가능하게 만드는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 그러한 서열의 실예로는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702 의 복제기원이 있다.

벡터는 또한 선택가능한 마아커, 예컨대 그것의 생성물이 숙주 세포에서의 결핍을 보충하는 유전자, 예를 들면 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스로부터 얻어지는 dal 유전자, 또는 암피실린 내성과 같은 항생물질 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 나아가, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 sC 와 같은 아스페르길루스 선택 마아커를 포함할 수 있으며, 또는 선택은 예를 들어 WO 91/17243에서 설명된 바와 같이 공-형질전환에 의하여 이루어질 수도 있다.

피타제 변이체, 프로모터, 터미네이터 및 다른 엘레먼트들을 각각 코드화하는 본 발명의 DNA 구성물을 결찰시키기 위한, 그리고 그것들을 복제에 필요한 정보를 함유하고 있는 적당한 벡터안에 삽입시키기 위한 과정들은 당업자들에게 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., 1989 참조).

상기에서 규정된 바와 같은 본 발명의 DNA 구성물 또는 발현 벡터중 하나를 포함하고 있는 본 발명의 세포는 유리하게도 본 발명의 피타제 변이체의 재조합 제조과정에서 숙주 세포로서 사용된다. 세포는 변이체를 코드화하는 본 발명의 DNA 구성물로, 편리하게는 DNA 구성물 (하나 또는 둘 이상의 복사물)을 숙주의 염색체안에 통합시킴으로써 형질전환될 수 있다. 이러한 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포에서 더 안정하게 유지되는 것으로 보이기 때문에 장점으로서 간주된다. 숙주의 염색체 안으로의 DNA 구성물의 통합은 종래의 방법에 따라, 예컨대 동종성 또는 이종성 재조합에 의하여 수행될 수 있다. 또는 달리, 세포는 숙주 세포의 상이한 유형에 관련하여 상술된 바와 같이 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.

단리된 DNA 분자 또는, 다르게는, "클론된 DNA 서열", "DNA 구성물", "DNA 절편" 또는 "단리된 DNA 서열"은 DNA 절편을 그것의 원래 위치로부터 그것이 복제될 상이한 부위로 재위치시키기 위하여 유전자 공학에 사용된 표준 클로닝 과정에 따라 클론될 수 있는 DNA 분자 또는 서열을 의미한다. 이 용어는 일반적으로 본질적으로 다른 핵산 서열이 없는 핵산 서열, 예컨대 아가로스 겔 전기영동에 의해 측정되는 바, 최소한 약 20 % 순수한, 바람직하게는 최소한 약 40 % 순수한, 보다 바람직하게는 약 60 % 순수한, 보다 바람직하게는 약 80 % 순수한, 가장 바람직하게는 약 90 % 순수한, 한층 더 가장 바람직하게는 약 95 % 순수한 핵산 서열을 말한다. 클로닝 과정은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 원하는 핵산 단편의 절출 및 단리, 그 단편의 벡터 분자안으로의 삽입, 및 그곳에서 다수의 복사물 또는 핵산 서열의 클론들이 복제될 숙주 세포 안으로의 재조합 벡터의 통합을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원의 것이거나, 또는 이것들의 어떠한 조합일 수 있다.

용어 "벡터"는 "핵산 구성물", "DNA 구성물", "발현 벡터" 또는 "재조합 벡터"와 같은 용어/개체를 포함하는 것으로 의도된다.

핵산 구성물은 조절 서열과 부합할 수 있는 조건하에서 적당한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 하나 또는 둘 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함한다.

"핵산 구성물"은 본원에서 자연 발생적인 유전자로부터 단리된, 또는 그렇지 않다면 자연계에는 존재하지 않을 방식으로 조합되고 병렬배치된 핵산의 절편을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자로서 규정된다.

용어 핵산 구성물은 핵산 구성물이 본 발명의 코딩 서열의 발현에 필요한 모든 조절 서열을 함유할 때 용어 발현 카세트와 동의어로 사용될 수 있다.

용어 "코딩 서열"은 본원에서, 주로 상기 언급된 조절 서열의 조절하에 놓일 때 mRNA로 전사되고 본 발명의 폴리펩티드로 번역되는 서열을 포함하는 것으로 규정된다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 5'-말단에 있는 번역 출발 코돈 ATG 와 3'-말단에 있는 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA, 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 이것들에 한정되는 것은 아니다.

용어 "조절 서열"은 본원에서 핵산 서열의 코딩 서열의 발현에 필요한 또는 유익한 모든 성분을 포함하는 것으로 규정된다. 각각의 조절 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 대해 천연적인 것이거나 외래적인 것이다. 그러한 조절 서열로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 및 전사 터미네이터가 있다. 최소한의 조절 서열은 프로모터와, 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 조절 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 코딩 영역과 조절 서열과의 결찰을 용이하게 해주는 특이한 제한 부위들을 도입시킬 목적으로 링커와 함께 제공될 수 있다.

"숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 복제되는 동안 일어나는 돌연변이 때문에 모 세포와는 동일하지 않은 모세포의 어떠한 자손을 포함한다.

세포는 바람직하게는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되며, 이어서 벡터의 숙주 염색체안으로의 통합이 일어난다.

"형질전환"은 본 발명의 핵산 서열을 포함하고 있는 벡터를, 벡터가 염색체 통합체로서 또는 자체-복제하는 염색체-외재성 벡터로서 유지되도록 숙주 세포안으로 도입시키는 것을 의미한다. 통합은 일반적으로 핵산 서열이 세포에서 더 안정하게 유지되는 것 같기 때문에 유익한 것으로 간주된다. 숙주 염색체안으로의 벡터의 통합은 상술된 바와 같이 동종성 또는 비-동종성 재조합에 의하여 일어날 수 있다.

숙주 세포는 단세포적 미생물, 예컨대 원핵생물, 또는 비-단세포적 미생물, 예컨대 진핵생물일 수 있다. 진핵 세포의 실예는 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 진균 세포이다. 유용한 포유류 세포로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, COS 세포, 또는 예컨대 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션으로부터 활용할 수 있는 어떠한 번호 (승인 번호)의 다른 불멸의 셀라인이 있다.

바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 진균 세포이다.

진균 세포는 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 공지된 방식 자체대로의 세포벽의 재생을 포함하는 과정에 의하여 형질전환될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 피타제를 발현 또는 생성하기 위하여 상기 효소를 코드화하는 DNA 서열로 형질전환되어 있는 트란스제닉 식물, 식물 부분, 예컨대 식물 종자, 또는 식물 세포에도 관한 것이다. 또한 그러한 식물 또는 식물 부분의 조성물 및 용도, 특히 본 발명의 용도 및 식품/사료 청구항의 연장선상에서 그러한 식물 또는 식물 부분의 사료 및 식품 또는 그것을 위한 첨가제로서의 용도도 본 발명의 범주내에 포함된다.

트란스제닉 식물은 쌍자엽식물 또는 단자엽식물일 수 있다. 일차적인 관심이 있는 것은 잠재적인 식품 또는 사료 성분이면서 피트산을 포함하고 있는 그러한 식물이다. 사료 성분의 정상적인 피트산 수준은 0.1 내지 100 g/kg 이며, 보다 통상적으로는 0.5 내지 50 g/kg, 가장 보편적으로는 0.5 내지 20 g/kg 이다. 단자엽식물의 실예는 목초, 예컨대 각종 풀 (블루 그래스, 포아 풀), 페스튜카와 같은 마초, 로리움, 온대성 풀, 예컨대 아그로스티스, 및 곡물류, 예컨대 밀, 귀리, 호밀, 보리, 쌀, 수수 및 옥수수이다.

쌍자엽 식물의 실예는 콩과 식물, 예컨대 루핀콩, 완두콩, 콩 및 대두, 및 십자화과 (겨자과) 식물, 예컨대 콜리플라워, 지방 종자 평지 및 밀접하게 관련된 모델 유기체인 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)가 있다.

그러한 트란스제닉 식물 등은 그 자체의 피트산을 분해할 수 있고, 따라서 그러한 식물을 포함하고 있는 식품 또는 사료에 그러한 효소를 첨가할 필요가 경감된다. 바람직하게도, 식물 또는 식물 부분, 예컨대 종자는 실제 사용에 효소적 분해의 속도를 적응시키는 관점에서, 식품 또는 사료에 첨가되기 전에 또는 그것의 사용, 예컨대 섭취전에 갈거나 분쇄되고, 또한 아마도 침지된다.

원한다면, 식물에서 생성된 효소는 또한 식물로부터 회수될 수 있다. 특정한 경우에 식물로부터의 회수는 강력한 후속되는 펠릿화 과정에서 열에 안정한 제형을 확실하게 한다는 관점에서 바람직하다.

식물 부분의 실예는 줄기, 칼루스, 잎, 뿌리, 과실, 종자, 관 (tuber) 등이 있다. 그러나 또한 어떠한 식물 조직이든지 본 정의내에 포함된다.

조직의 기원이 어떠하든지, 어떠한 식물 세포도 상기 식물 세포의 정의에 포함된다.

또한 본 발명의 범주에는 그러한 식물, 식물 부분 및 식물 세포의 자손도 포함된다.

당업자는 의문의 식물안에 삽입하기 위하여, 조직 특이적인 방법으로 효소가 분비되어야 하는지의 여부에 주의를 기울이면서, DNA 발현 구성물을 어떻게 제조하는 지를 알 것이다. 이런 평가와 관련되는 것은 식물의 발현 구획안에서의 피타제의 안정성 (pH-안정성, 내인성 프로테아제에 의한 분해성 등)이다. 당업자는 또한 프로모터 및 터미네이터 서열, 및 필요에 따라 신호 또는 전이 서열과 같은 적절한 조절 서열을 선택할 수 있다 (Tague et al., Plant Phys., 86, 506, 1988).

식물, 식물 부분 등은 어떠한 공지의 방법을 사용하여 이 DNA 구성물로 형질전환될 수 있다. 그러한 방법의 실예는 본 발명이 피타제를 코드화하는 유전자를 포함하도록 유전공학적으로 제조된 아그로박테리움 속의 박테리아 종과 같은 박테리아 또는 바이러스 벡터에 의한 형질전환이다. 또한 식물 세포 또는 식물 조직안에 피타제 DNA를 직접적으로 도입시키는 방법들이 당업계에 알려져 있는데, 그러한 방법으로는, 예를 들면 미소 주사 및 일렉트로포레이션이 있다 (Gasser et al., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al., Nature, 338, 274, 1989).

형질전환에 이어서, 형질전환체들은 당업자들에게 공지되어 있는 어떠한 방법에 의하여 스크린되고, 이어서 그것들은 전체 식물로 재생된다.

이들 식물 들뿐만 아니라 그것들의 자손은 그런 다음 그것들의 유전적 장비의 일부분으로서 피타제 코드화 DNA를 포함한다 (일반적인 참조: WO 9114782A 및 WO 9114772A).

아그로박테리움 튜메파시엔스 중재된 유전자 전달은 트란스제닉 쌍자엽식물을 재생하기 위해 선택된 방법이지만 (Hooykas ＆ Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19:15-38), 이 방법은 단자엽식물을 형질전환시키기 위해서도 사용될 수 있다. 그러나, 숙주 범위의 한계 때문에, 단자엽식물을 아그로박테리움 튜메파시엔스의 도움을 받아 형질전환시키는 것은 일반적으로 가능하지 않다. 그러므로, 다른 방법이 사용되어야 한다. 트란스제닉 단자엽식물을 생성하기 위하여 선택된 방법은 배의 콜리 (embryonic calli) 또는 발생중인 배의 입자 충격 (형질전환시키는 DNA로 코팅된 미세한 금 또는 텅스텐 입자)이다 (Christou, 1992, Plant J. 2:275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10:667-674).

유리 DNA를 이들 식물안에 수송하기 위한 다른 시스템으로는 다음과 같은 방법들이 바람직하다: 바이러스 벡터 (Joshi ＆ Joshi, 1991, FEBS Lett. 281:1-8), 폴리에틸렌 글리콜 또는 일렉트로포레이션을 통한 원형질체 형질전환 (Potyrkus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225), 엽육 원형질체 안으로의 DNA 의 미소주입 (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:79-85), 및 곡물 식물의 어린 꽃과 같은 새싹으로의 DNA 의 미소주입 (de la Pena et al., 1987, Nature 325:274-276).

일반적으로, 본 발명의 피타제 변이체를 코드화하는 cDNA 또는 유전자는 표적 식물에서 활성인 적당한 프로모터와 적당한 터미네이터 (전사의 종결)로 구성되는 발현 카세트 (예컨대 Pietrzak et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14:5857-5868)에 놓인다. 이 카세트 (이것은 물론 적당한 선택 마아커를 포함한다, 하기 참조)는 단자엽식물의 경우에서처럼 입자 충격을 통하여 식물 안으로 형질전환될 것이다. 쌍자엽식물인 경우에, 발현 카세트는 먼저 T-DNA 경계선과 적당한 선택 마아커를 제공하는 적당한 벡터안에 놓이게 되고, 그것이 계속해서 아그로박테리움 튜메파시엔스안으로 형질전환된다. 쌍자엽식물은 발현 카세트와 T-DNA 가 양 옆에 있는 선택 마아커를 포함하고 있는 아그로박테리움을 통하여 표준 프로토콜을 따라 형질전환될 것이다 (Akama et al., 1992, Plant Cell Reports 12:7-11). 아그로박테리움으로부터 식물 세포로의 T-DNA의 수송에 대해서는 이미 검토가 되어 있다 (Zupen ＆ Zambryski, 1995, Plant Physiol. 107:1041-1047). 아그로박테리움을 통한 식물의 형질전환을 위한 벡터는 상업적으로 이용할 수 있는 것이거나 또는 그러한 벡터를 제조하는 많은 실험실로부터 얻을 수 있다 (Deblaere et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13:4777-4788; Klee et al., 1987, Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486).

활용가능한 식물 프로모터: 조작이 이루어지는 과정에 따라, 적절한 발생학적 및 환경적인 조절뿐만 아니라 기관- 및/또는 세포-특이적인 발현이 요구될 수 있다. 예를 들면, 피타제 cDNA 가 옥수수의 내배유에서 발현되는 것이 바람직한 것 등이다. 가장 흔하게 사용되는 프로모터는 구성성 35S-CaMV 프로모터이다 (Frank et al., 1980, Cell 21:285-294). 발현은 전체 식물을 통하여 다소간에 같을 것이다. 이 프로모터는 제초제- 및 병원균-내성 식물을 조작하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다 (Stitt ＆ Sonnewald, 1995, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46:341-368). 기관-특이적인 프로모터는 예컨대 종자, 감자의 관, 및 과실과 같은 저장 싱크 조직에 대해 (Edwards ＆ Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24:275-303), 그리고 분열조직과 같은 대사 싱크 조직에 대해 (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:863-878) 보고되었다.

형질전환된 숙주 세포를 배양하기 위하여 사용된 배지는 관심의 숙주 세포를 성장시키기에 적당하기만 하면 어떠한 종래의 배지든지 사용될 수 있다. 발현된 피타제는 편리하게도 배양 배지로 분비되고, 그것으로부터 잘 알려져 있는 방법들, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의한 배지로부터의 세포의 분리, 암모늄 술페이트와 같은 염에 의하여 배지의 단백성 성분을 침전시키는 것, 그리고 이어지는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피적 과정에 의해 회수될 수 있다.

바람직한 숙주 세포는 푸사리움, 한세눌라, 트리코더마 또는 아스페르길루스의 스트레인들로, 특히 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 베네나툼, 푸사리움 세레알리스, PCT/US95/07743에서 추가로 설명되는 바와 같은, 푸사리움 ATCC 20334의 확인된 특성을 가지고 있는 푸사리움 종, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 하르지아눔 또는 트리코더마 레세이, 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 오리자에가 바람직하다.

한세뉼라 폴리모르파에서의 발현에 대해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다: Gellissen, G., Piontek, M., Dahlems, U., Jenzelewski, V., Gavagan, J.E., DiCosmio, R., Anton, D.I. ＆ Janowicz, Z.A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst). 시금치의 글리콜레이트 산화효소 (GO) 및 맥주효모균의 카탈라제 T (CTT1) 유전자의 공동발현에 대해서는 Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:46-54를 참조한다.

본 발명에 따르는 피타제 변이체의 몇가지 보다 특이한 용도는 PCT/DK97/00568, 본 명세서의 상세한 설명의 뒷부분으로부터 분명해진다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 피타제 변이체는 본질적으로 다른 비-피타제 폴리펩티드가 없다. 즉 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바, 최소한 약 20 %, 바람직하게는 최소한 약 40 %, 보다 바람직하게는 약 60 %, 보다 더 바람직하게는 약 80 %, 가장 바람직하게는 약 90 %, 더욱 더 바람직하게는 약 95 % 순수하다. 때로 그러한 폴리펩티드는 다른 표현으로 "정제된" 및/또는 "단리된" 피타제로서 언급된다.

본 발명의 피타제 변이체를 포함하는 피타제 폴리펩티드에는 다른 폴리펩티드가 폴리펩티드 또는 그것의 단편의 N-말단 또는 C-말단에서 융합되는 융합된 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드가 포함된다. 융합된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 (또는 그것의 일부)을 본 발명의 피타제 변이체를 코드화하는 핵산 서열 (또는 그것의 일부)에 융합시킴으로써 제조된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 기법들은 당해 기술분야에 공지이며, 그러한 방법으로는 폴리펩티드를 코드화하는 코딩 서열들을 그것들이 프레임내에 있고 융합된 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 터미네이터의 조절하에 놓이도록 결찰시키는 방법이 있다.

"사료" 및 "식품"은 각각 어떠한 천연적인 또는 인공적인 규정식, 식사 등 또는 각각 동물 및 사람에 의해 식사되고, 흡수되고, 소화되도록 의도된 또는 그렇게 되기에 적당한 그러한 식사의 성분들을 의미한다.

본 발명의 피타제 변이체는 그것의 효과를 시험관내에서 또는 생체내에서, 즉 각각 개체에 의해 섭취되기 전에 또는 개체의 위에서 발휘할 수 있다. 또한 조합된 작용도 가능하다.

본 발명에 따르는 피타제 조성물은 언제나 최소한 하나의 본 발명의 피타제를 포함하고 있다.

일반적으로, 피타제 조성물은 액체 또는 건조된 상태이다.

액체 조성물에는 바람직하게도 고도로 정제된 형태의 피타제 효소외에 어떠한 다른 것이 함유될 필요가 없다. 그러나 통상적으로, 글리세롤, 소르비톨 또는 모노프로필렌 글리콜과 같은 안정화제가 첨가되기도 한다. 액체 조성물에는 또한 다른 첨가제, 예컨대 염, 당, 보존제, pH-조정제, 단백질, 피테이트 (피타제의 기질)가 포함될 수 있다. 전형적인 액체 조성물은 수용액이거나 오일-기저 슬러리이다. 액체 조성물은 임의로 펠릿화된 후에 식품 또는 사료에 첨가될 수 있다.

건조 조성물은 분무-건조된 조성물일 수 있으며, 그러한 경우 조성물에는 건조 형태의 효소이외에 다른 성분이 함유될 필요가 없다. 그러나 통상적으로, 건조 조성물은 예컨대 식품 또는 사료 성분들과 쉽게 혼합될 수 있는, 또는 보다 바람직하게는 프리믹스의 성분을 형성할 수 있는 소위 과립상태이다. 효소 과립의 입자 크기는 바람직하게는 혼합물의 다른 성분들의 입자 크기와 부합할 수 있는 것이 좋다. 이것은 효소를 예컨대 동물의 사료에 혼입하는 안전하고 편리한 수단을 제공해준다.

덩어리 과립은 충전재와 효소가 함께 응집되어 과립을 형성하는 고전단 혼합기 (예컨대 Lodige)에서 응집 기술을 사용하여 제조된다. 흡수 과립은 담체 물질의 코아를 효소에 의해 흡수되거나/코팅되도록 함으로써 제조된다.

전형적인 충전재는 황산 이나트륨과 같은 염이다. 다른 충전재로는 카올린, 탈크, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 셀룰로스 섬유와 같은 것이 있다. 임의로, 덱스트린과 같은 결합제가 또한 응집 과립에 포함된다.

전형적인 담체 물질은 예컨대 카사바, 옥수수, 감자, 쌀 및 밀 형태의 전분이다. 그것들의 염도 또한 사용될 수 있다.

임의로, 과립은 코팅 혼합물로 코팅된다. 그러한 혼합물에는 코팅제, 바람직하게는 소수성 코팅제, 예를 들면 수소화된 팜유 및 비프 탤로우와, 필요에 따라 다른 첨가제, 예를 들면 탄산 칼슘 또는 카올린이 포함된다.

또한, 피타제 조성물에는 다른 치환성분, 예를 들면 착색제, 방향성 화합물, 안정화제, 비타민, 미네랄, 다른 사료 또는 식품 증강 효소, 즉 사료/식품의 영양학적 성질을 증가시키는 효소 등이 함유될 수 있다. 이것은 특히 소위 프리-믹스인 경우 그러하다.

"식품 또는 사료 첨가제"는 본질적으로 식품 또는 사료에 첨가되기에 적절하게 의도된 순수한 화합물 또는 다중 성분의 조성물이다. 특히, 그것은 그것의 의도된 용도에 의하여 식품 또는 사료의 성분이 되거나 또는 식품 또는 사료 제품의 어떠한 특성에 영향을 주는 물질이다. 그것은 상술된 피타제 조성물에 대하여 표시된 바와 같이 조성된다. 전형적인 첨가제는 통상 비타민, 미네랄 또는 사료 증강 효소 및 적당한 담체 및/또는 부형제와 같은 화합물을 하나 또는 둘 이상 포함한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 피타제 조성물에는 추가로 유효량의 하나 또는 둘 이상의 사료 증강 효소, 특히 α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 특히 락타제, 다른 피타제, β-글루카나제, 특히 엔도-β-1,4-글루카나제 및 엔도-β-1,3(4)-글루카나제, 셀룰라제, 크실로시다제, 갈락타나제, 특히 아라비노갈락탄 엔도-1,4-β-갈락토시다제 및 아라비노갈락탄 엔도-1,3-β-갈락토시다제, 엔도글루카나제, 특히 엔도-1,2-β-글루카나제, 엔도-1,3-α-글루카나제, 및 엔도-1,3-β-글루카나제, 펙틴 분해 효소, 특히 펙티나제, 펙틴에스테라제, 펙틴 리아제, 폴리갈락투로나제, 아라비나제, 람노갈락투로나제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난-α-람노시다제, 펙테이트 리아제, 및 α-갈락투로니시다제, 만난나제, β-만노시다제, 만난 아세틸 에스테라제, 크실란 아세틸 에스테라제, 프로테아제, 크실라나제, 아리비녹실라나제 및 리파제, 포스포리파제 및 큐티나제와 같은 지방분해성 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 사료 증강 효소가 포함된다.

본 발명의 동물 사료 첨가제는 규정식 전에 또는 규정식과 동시에 위가 하나인 (단-위) 동물에게 보충된다. 바람직하게도, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 규정식과 동시에 단-위 동물에게 제공된다. 보다 바람직한 구체예에서, 동물 사료 첨가제는 과립 또는 안정화된 액체 형태로 규정식에 첨가된다.

식품 또는 사료중의 피타제의 유효량은 약 10 내지 20,000 FYT/kg, 바람직하게는 약 10 내지 15,000 FYT/kg, 보다 바람직하게는 약 10 내지 10,000 FYT/kg, 특히 약 100 내지 5,000 FYT/kg, 특히 약 100 내지 약 2,000 FYT/kg 이다.

본 발명의 피타제의 다른 특이한 용도의 실예는 간장 가공처리 및 이노시톨 또는 그것의 유도체의 제조이다.

본 발명은 또한 동물 비료의 피타제 수준을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 그 방법에서는 동물에게 유효량의 본 발명의 피타제를 포함하고 있는 사료가 공급된다.

또한 본 발명에는 식품 또는 사료 제제 또는 첨가제의 제조중에 본 발명의 피타제의 용도가 포함되는데, 즉, 피타제는 그것의 피타제 활성을 제조중에만 발휘하며 최종 식품 또는 사료 제품에서는 활성을 나타내지 않는다. 이런 측면은 예컨대 반죽 제조 및 베이킹에 관련된다.

본 발명은 도 1 에 따라 배열될 때, P_lycii 에 상응하는 위치 넘버링을 사용하여, 최소한 다음의 위치들중 하나에서 모델 피타제와 비교할 때 보정된 피타제 변이체에 관한 것이다: 24; 27; 31; 33; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 49; 51; 56; 58; 59; 61; 62; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 88; 90; 102; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 132; 143; 148; 149; 150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 170f; 170g; 171; 172; 173; 184; 185; 186; 187; 187a; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 198; 199; 200; 201; 201a; 201b; 201c; 201d; 201e; 201f; 202; 203; 203a; 204; 205; 211; 215; 220; 223; 228; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 242; 243; 244; 246; 251e; 253; 256; 260; 264; 265; 267; 270; 271; 272; 273; 274; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 283; 285; 287; 288; 292; 293; 302; 304; 332; 333; 334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 348; 349; 352; 360; 362; 364; 365; 366; 367; 368; 369; 370; 371; 372; 373; 374; 375; 376; 383k; 387; 393; 394; 396; 404; 409; 411; 412; 413; 417; 421; 431.

이들 변이체들로부터 본 발명자들은 보정된 특성, 바람직하게는 보정된 활성 특성을 예상한다. 실제로, 여러개의 변이체에 대하여 그렇게 보정된 특성은 이미 나타났다 (실시예 부분 참조). 상기와 같이 "보정된"은 모델 피타제와 비교된 것을 의미한다. "보정된 활성 특성"은 최소한 하나의 피타제 활성 관련된 측면, 예를 들면 (비-배타적인 리스트): pH 안정성, 온도 안정성, pH 프로필, 온도 프로필, 비활성 (특히 pH 및 온도와 관련하여), 기질 특이성, 기질 절단 패턴, 기질 결합, 위치 특이성, 옥수수로부터 포스페이트의 방출 속도 및 수준, 반응 속도, 피테이트 분해 속도), 도달된 방출된 포스페이트의 최종 수준이 보정된 것을 의미한다.

바람직한 보정된 활성 특성은 보정된 비활성, 바람직하게는 증가된, 또 바람직하게는 3, 4, 5 또는 6 의 pH에서 증가된; 보정된 pH 또는 온도 프로필; 및/또는 보정된, 바람직하게는 증가된 열안정성, 예컨대 DSC를 사용하여 측정되는 바 증가된 용융온도이다.

바람직한 피타제 변이체들은 도 1 에 따라 배열될 때, P_lycii 에 상응하는 위치 넘버링을 사용하여, 최소한 다음의 위치들중 하나에서 모델 피타제와 비교할 때 보정된 피타제 변이체들이다: 43; 44; 47; 51; 58; 62; 78; 80; 83; 88; 90; 102; 143; 148; 153; 154; 186; 187a; 195; 198; 201e; 204; 205; 211; 215; 220; 242; 244; 251e; 260; 264; 265; 267; 270; 273; 278; 302; 336; 337; 339; 352; 365; 373; 383k; 404; 417.

A_fumigatus 의 다음의 변이체들은 하위군: Q43L; Q270L; G273D,K; N336S; A205E; Y278H; Q43L+Q270L; Q43L+Q270L+G273D; Q43L+Q270L+G273D+N336S; G273K+A205E; G273K+A205E+Y278H (EP 0897010 참조)를 구성한다.

일반적으로, 본 발명의 변이체들은 다음과 같이 추론되거나 확인될 수 있다: 도 1 에 따른 배열을 볼 때, 두 서열을 비교하면, 그 중 하나는 성질이 개선된 모델 피타제이고, 관련된 위치/영역의 아미노산 차이가 확인되며, 모델로부터 다른 피타제 서열로 관련된 위치의 아미노산 서열이 전달된다 (그것으로 치환된다).

본 발명은 또한 상기 방법을 포함하고, 또한 추가로 상응하는 DNA 서열의 추론 및 합성, 숙주 세포의 형질전환, 숙주 세포의 배양 및 피타제 변이체의 회수를 포함하는 피타제 변이체의 제조 방법에 관한 것이다.

관련된 위치/영역은 비활성, 열안정성, pH 활성/안정성과 같은 중요한 피타제 활성 특성과 관련하여 하기에서 언급되는 것들이다.

본 발명은 또한 상기에서 대략적으로 설명된 방법에 의하여 얻을 수 있는, 바람직하게는 얻어지고, 보정된 특성/성질을 타나낼 것으로 예상되는, 바람직하게는 그러한 보정된 특성, 예컨대 개선된 비활성을 나타내는 피타제 변이체 (본원에서 규정된 바와 같은 모델 피타제에 따라 변이된)에 관한 것이다.

최소한 담자균 모델 피타제 P_lycii 및 T_pubescens 는 (본원의 실시예 2 의 방법을 사용하여 측정되는 바) 높은 비활성을 나타낸다.

이것은 다른 피타제, 예컨대 도 1 에 열거된 다른 피타제, 특히 A_pediades 및 자낭균 피타제, 예컨대 A_fumigatus, A_ficuum, consphyA 에, 상기에서 언급된 것과 같은 추론 방법에 의하여 전달될 수 있는 바람직한 성질의 실예이다.

그러므로, 보정된 비활성, 특히 개선된 비활성, 특히 낮은 pH 및/또는 높은 온도에서의 개선된 비활성이 관련 영역, 즉 (i) 절단된 활성 부위를 가리키는 아미노산 잔기들; 또는 (ii) 이들 활성 부위 잔기들에 가깝게 인접한 아미노산 잔기들에서 보정되어 있는 변이체들로부터 예상된다. 바람직하게도, 가깝게 인접함은 활성 부위 잔기들로부터 10 Å 아내에 있는 것을 의미한다.

pdb 파일 1IHP (18.03.98 re 1IHP의 브룩하벤 데이터베이스 엔트리, Structure of Phosphomonoesterases, D. Kostrewa; 또는 Nature Structural Biology, 4, 1997, p.185-190)로부터, 활성 부위 영역이, 몰리큘라 시뮬레이션 (MSI)(San Diego, CA)으로부터의 프로그램 INSIGHTII 와 하위세트 코맨드를 사용하여 확인될 수 있고, "활성 부위 쉘"은 촉매활성 잔기들에 가까이 놓여 있는 그런 아미노산 잔기들, 예컨대 A. ficuum 피타제에서 H59, D339 및 R58 로서 규정된 (각각 페니오포라 번호 H71, D335 및 R70 에 상응함) 아미노산들을 포함하는 것으로 규정된다. "활성 부위 쉘 (10 Å)"은 상기 촉매활성 잔기들로부터 10Å 이내에 놓여 있는 그런 잔기들을 포함한다.

H71과 D335로부터 10 Å내에 있는 잔기들은 다음과 같다 (페니오포라 번호를 사용함): 41-47, 68-77, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 185, 191-193, 199, 243, 270-271, 273-275, 277-279, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394 ("활성 부위 쉘 (10 Å)").

바람직하게도, "기질 결합 쉘"이 또한 기질 결합 부위에 매우 근접하고, 따라서 기질과 접축할 것으로 예상되는 그런 잔기들을 포함하는 것으로 규정될 수 있다.

이런 정보는 피틴에 유사한 당을 절단된 활성 부위에 도킹함으로써, 상술된 바와 같이 추론될 수 있다 (잔기들은 활성 부위의 표면을 구성한다). 만약 포스페이트기가 하나도 없는 당이 절단된 활성 부위안에 도킹된다면, 예컨대 알파-D-글루코스 (의자 형태, 구조는 INSIGHTII 프로그램에 의해 제공됨)가 하기에서 제시되는 바와 같이 고정된 거리를 사용하여 도킹된다면, 절단된 활성 부위를 가리키는 잔기들은 하위세트 코맨드와 기질 유사체로부터 10Å의 거리를 사용하여 축출될 수 있다. 또는 달리, 화합물 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트 (브룩하벤 데이터베이스 파일 1djx. 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트)가 절단된 활성부위에 도킹될 수 있다. 그러나, 이 화합물과 글루코스는 다소간에 겹칠 수 있다.

알파-D-글루코스의 6 위치에 있는 산소 원자로부터의 옹스트롬 (Å)으로 표시되는 거리는 다음과 같다:

H59 의 원자 ND1: 5.84

R58 의 원자 NH2: 6.77

R142 의 원자 NH2: 5.09

N340 의 원자 ND2: 3.00

H59 의 원자 ND1: 7.76

R58 의 원자 NH2: 8.58

(상기 잔기들의 페니오포라 번호는 다음과 같다: 각각 H71, R70, R155, N336, H71 및 R70).

이런 방법으로, 기질과 접촉하는 잔기들은 다음과 같이 확인된다 (페니오포라 번호): 43-44; 70-80; 83-84; 115; 153; 155-156; 184; 191-192; 198-202; 205; 235; 238; 242; 270; 272-273; 275-277; 332-336; 338; 369; 371 ("기질 결합 쉘 (10Å)").

(1) 활성 부위 쉘 또는 (2) 기질 결합 쉘의 하나 또는 둘 이상이 보정된 변이체들은 보정된 비활성을 가질 것으로 강하게 예상된다. 이것은 다음의 위치들의 결합 그룹화를 유도한다 (페니오포라 번호 및 10 Å 쉘): 41-47, 68-80, 83-84, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 184-185, 191-193, 198-201e, 202-203, 205, 235-236, 238-239, 242-243, 270-279, 285, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394.

바람직하게도, 활성 부위 쉘과 기질 결합 쉘은 도 1 의 담자균 모델 피타제를 사용하여 상술된 바와 같이 규정되며, 페니오포라 피타제가 바람직한 모델이다. 다른 모델 피타제의 상응하는 변이체들의 추론도 도 1 의 배열을 사용하여 가능하다.

바람직한 구체예에서, 하위세트 코맨드에서 5 Å의 거리가 사용되고, 그로써 보다 제한된 크기의 활성 부위 및 기질 결합 쉘이 규정된다. 예컨대 활성 부위 쉘은 잔기 43-44, 69-74, 117, 125, 155-156, 159, 274, 332-340, 370-374 (H71 및 D335 로부터 5 Å)를 포함하며, "활성 부위 쉘 (5Å))"으로 표시된다.

일반적으로 활성 부위 쉘과 기질 결합 쉘 영역은 무작위 돌연변이생성 영역을 선택하는 기초를 형성한다. 바람직한 무작위 돌연변이생성 영역의 실예는 다음과 같다:

영역 69-74, 332-340, 370-374, 첨가될 도핑 (5Å 접근); 및

영역 57-62, 142-146, 337-343, 첨가될 도핑 (10Å 접근).

현재 이들 위치중 어느 하나의 어떠한 보정은 보정된 특성, 예컨대 보정된 비활성을 가지는 피타제를 유도할 것으로 예상된다.

상기 표현 "위치들중 하나의 어떠한 보정"은 각 위치와 각 치환을, 예컨대 상기 하위-그룹 41-47 에 대하여 다음과 같이 열거하는 것과 완전히 동등한 것으로 간주된다:

41A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;

42A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;

43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;

44A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;

45A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;

46A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;

47A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y.

바람직한 구체예에서, 보정된 비활성은 다음의 변이체들로부터 예상된다:

42S,G; 43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 45D,S; 47Y,F; 51E,A; 75W,F; 78S,D; 79G; 80K,A; 83I,Q; 84Q,V; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,T; 125S; 126H,S; 127Q,E; 128A,T; 151A,S; 152G; 153D,Y; 154Q,D,G; 157V; 158D,A; 159T; 160A,S; 161T,N; 162N; 163W; 184Q,S; 186A,E; 198A,N; 200G,V; 201D; 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f 중 하나 또는 둘 이상의 결실-바람직하게는 전부;202S; 205Q,E; 235Y,L; 238L,M; 242P; 270Y,A,L; 271D; 273D,K; 275F,Y; 278T,H; 332F; 336S; 337T,Q; 339V; 340P,A; 343A,S; 364W,F; 365V,L; 366D,V; 367K; 368K; 369I,L; 370V; 373S; 374A; 375H; 376M; 393V.

특히 바람직한 변이체들은 다음과 같다: 78S; 79G; 80A; 83I,Q; 84Q,V; 198A,N; 200G,V; 201D; 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f 중 하나 또는 둘 이상의 결실-바람직하게는 모든 결실; 202S; 205Q,E; 235Y,L; 238L,M; 242P; 273D; 275F,Y.

특히 바람직한 다른 변이체들은 다음과 같다: 43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 특히 43M,P; 75W,F; 80K; 153D; 184Q,S; 270Y,A; 332F; 369I,L.

다음의 변이체들이 특히 바람직하다: 43L,G,N,V,A,I,T; 78D; 153Y; 154G; 270L; 273D,K. 이중 및 삼중 변이체들 (43L/270L); (43L/270L/273D); (43L/78D) 및 (43L/153Y/154G)이 또한 특히 바람직하다. 다른 바람직한 변이체들은 205E; 278H; 336S 이다.

이들 특별히 바람직한 단일, 이중 및 삼중 변이체들은 도 1 에 배열될 수 있는 모델 피타제의 바람직한 변이체, 특히 도 1 에 열거된 특이한 모델 피타제의 변이체들이다.

최소한 consphyA 는 높은 열안정성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 P_lycii 의 열안정성도 상당히 높다.

이것은 다른 피타제, 예를 들면 도 1 에 열거된 다른 피타제, 특히 P_lycii 및 A_pediades 와 같은 담자균 피타제로, 상기에서 언급된 것과 같은 추론 방법에 의하여 전달될 수 있는 바람직한 성질의 실예이다.

이런 점을 바탕으로 하여 보정된 열안정성, 특히 개선된 열안정성이 다음의 변이체들로부터 예상된다: 39H,S; 40L,N; 43P; 47Y,F; 49P; 51E,A; 56P; 58D; 61R; 62V; 80K; 83A; 84Y; 172P; 184P; 195T; 198A; 204V; 211L; 223D; 236Y; 242P; 246V; 253P; 264R; 265Q; 280A,P; 283P; 287A; 292F,Y; 293A; 302R; 304P; 337S; 348Y; 387P; 396R; 409R; 411K; 412R; 417E; 421F,Y.

보정된 열안정성을 가지는 다음의 변이체들이 특히 바람직하다: 39S; 40N; 47Y,F; 51A; 83A; 195T; 204V; 211L; 242P; 265A.

보정된 열안정성을 가지는 추가의 변이체들은 다음과 같다: 42G; 434T,L,G; 44N; 58K,A; 59G; 62I; 69Q; 75F; 78D; 79G; 80A; 81A,G; 82T; 83K,R; 84I; 88I; 90R,A; 102Y; 115N; 118V; 122A; 123Q,N; 125M,S; 126V,S; 127N,Q; 128S,A; 143N,K; 148V,I; 154S; 158D; 170fH; 170gA; 171T,N; 172N; 173W; 184S; 186A; 187A; 187aS; 193S; 195V,L; 198V; 201E; 201eT; 202A; 203aT; 204A; 211V; 215P,A; 220L,N; 223H; 228N; 232T; 322E; 235T; 236N; 242S; 244D; 251eQ,E; 256D; 264I; 260A,H; 265A; 267D; 270G; 271D; 273K,D; 278T,H; 287T; 293V; 302H; 337T,G; 338I; 339V,I; 340A; 352K; 365A,S; 366S; 367A; 369L; 373S,A; 374S; 376M; 383kE,Q; 404G,A; 411T; 417R; 431E.

피타제에 대하여 개선된 열안정성을 부여할 것으로 예상될 수 있는 본 발명의 다른 개념은 다음과 같다 - 본원에서 대략적으로 설명된 바와 같이 앞서 언급된 1IHP 구조를 고려하고, 도 1 에 따른 배열을 통하여 전달된다:

(A) 프롤린의 공간적인 이면각이 충족되고 수소 결합 네트워크가 방해받지 않으며 입체적인 충돌이 관찰되지 않는 공간적인 위치로의 프롤린 잔기의 도입.

(B) 구멍을 채움: 내부의 공간에 있는 더 큰 잔기들에 대하여 치환함으로써 때로 안정성의 개선이 얻어질 수 있다.

(C) 시스틴 가교: 시스틴 가교는 때로 단백질을 보다 견고하게 만들고 풀림 에너지를 증가시킨다.

그것으로부터 상기 (A)부터 (C) 까지의 개념에 따라 보정된 열안정성이 예상되는 추가의 변이체들은 다음과 같다: 27P, 31Y, 132F, 132I, 132L, 184P, 186P, 190P, 280P, 343F, 343I, 343L, 349P, 362P 및 (33C 및 24C).

개념 (A): 27P, 184P, 186P, 190P, 349P, 362P.

개념 (B): 343F,I,L; 31Y; 132F,I,L; 273F.

개념 (C): 33C/24C.

보정된 pH 활성 또는 안정성, 바람직하게는 특히 낮은 pH에서, 특히 개선된 안정성은 도 1 에 따라 배열하고 개선된 pH 프로필을 가지고 있는 모델로부터 다른 피타제로 전달됨으로써 전달될 수 있는 다른 바람직한 성질이다 - 상기에서 대략적으로 설명된 바와 같음.

피타제에 대하여 낮은 pH에서 개선된 안정성을 부여할 것으로 예상될 수 있는 본 발명의 다른 개념은 다음과 같다 - 본원에서 대략적으로 설명된 바와 같이 앞서 언급된 1IHP 구조를 고려하고, 도 1 에 따른 배열을 통하여 전달된다:

(D) 표면 전하: 음전하 또는 양전하의 클러스터를 피하기 위하여, 및 너무 밀접한 동일 전하의 잔기들을 피하기 위하여 낮은 pH에서 더 좋은 분포를 나타냄.

(E) 탈아미드화의 방지: 음전하의 잔기에 대해 밀접하게 접촉되는 표면 노출된 Q 또는 N.

낮은 pH에서 개선된 pH 안정성/활성을 가지고 있는 피타제 변이체들은 다음과 같을 것으로 예상된다: 39H; 39Q; 80A; 203R; 271N; 51R; 154S; 185S; 194S; 194T; 288L; 288I; 288F; 360R; 173Q,S; 204Q,S; 303K,S; 81Q,E.

개념 (D): 203R, 271N, 51R, 185S, 360R; 173Q,S; 204Q,S; 303K,S; 81Q,E.

개념 (E): 154S; 194S,T; 288L,I,F.

(D) 및 (E)의 개념에 대하여 바람직한 모델 피타제는 P_lycii 이다.

낮아진 pH 최적을 가지는 것으로 실험을 통하여 증명된 것은 자낭균 피타제의 변이체 80A, 특히 A_fumigatus 및 consphyA 이다.

특히 바람직한 단일, 이중 및 삼중 변이체들은 43L; (43L/270L) 및 (43L/270L/273D)이다. 이들 변이체들은 변화된 pH 프로필을 가지고 있다. 그것들은 바람직하게는 도 1 에 열거된 특이한 모델 피타제의 변이체들이다.

상기에서 열거된 모든 바람직한 변이체들에 대하여:

안정성은 바람직하게는 높은 온도, 즉 50 내지 100 ℃, 특히 60 내지 90 ℃, 보다 바람직하게는 70 내지 90 ℃ 범위의 온도에서 보정된다;

활성은 바람직하게는 동물의 위장관 시스템에서 사용되기 위한 것과 관련된 온도 범위, 예컨대 30 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 32 내지 38 ℃, 가장 바람직하게는 35 내지 38 ℃ 의 온도 범위에서 보정된다;

안정성은 바람직하게는 낮은 pH, 즉 pH 1.5 내지 7, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 3 내지 5 의 pH 범위에서 보정된다;

활성은 바람직하게는 pH 1.5 내지 5.5, 보다 바람직하게는 2.5 내지 4.5, 보다 더 바람직하게는 3 내지 5 의 pH 범위에서 보정된다.

보정된 피타제 특성에 대한 시험들, 예컨대 상기에서 언급된 것과 같은 시험 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떠한 그런 시험도 피타제 변이체의 성능을 피타제 모델과 비교하기 위하여 사용될 수 있다.

비활성에 대한 바람직한 시험은 하기 실시예 2 에 제공된다. pH 및 온도 활성 및 안정성에 대한 바람직한 시험은 하기 실시예 3 에 제공된다. 열 안정성에 대한 보다 더 바람직한 시험은 하기 실시예 4 의 DSC 방법이다.

WO 98/28409 에는 또한 위치 특이성과 같은 다양한 다른 매개변수에 대한 시험이 개시되어 있다. WO 98/28409 에 있는 모든 시험이 바람직한 시험이다.

일반적으로, 물론 모든 이들 시험이 원하는 pH 값 및 온도에서 수행될 수 있다.

본원에서 구체적으로 개시된 13 개의 모델 피타제중 5 개를 기초로 한 몇개의 바람직한 피타제 변이체가 종속항에서 구체화된다.

유사한 방법으로, 남아있는 8 개의 구체적으로 개시된 모델 피타제를 기초로 한 다른 바람직한 변이체들이, 도 1 의 상응하는 각각의 서열과 제시된 보정을 조합함으로써 쉽게 추론될 수 있다. 이들 바람직한 변이체들은 본 발명에 구체적으로 포함되며, 그것들은 쉽게 추론된다. 즉, 다음과 같다:

팍실루스 (Paxillus), 바람직하게는 팍실루스 인볼루투스로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 CBS 100231로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 P_involtus-A1의 변이체의 서열이 도 2 에 도시되어 있으며, 이 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

팍실루스 속의 종, 바람직하게는 팍실루스 인볼루투스 종, 바람직하게는 스트레인 CBS 100231 로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 P_involtus-A2 의 변이체의 서열이 도 3 에 도시되어 있으며, 상기 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

트라메테스속의 종, 바람직하게는 트라메테스 퓨베센스종으로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 CBS 100232로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 T_pubescens 의 변이체의 서열이 도 4 에 도시되어 있으며, 상기 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

아스페르길루스속의 종, 바람직하게는 아스페르길루스 니듈란스종으로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 DSM 9743 으로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 A_nidulans 의 변이체의 서열이 도 10 에 도시되어 있으며, 상기 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

아스페르길루스의 종, 바람직하게는 아스페르길루스 테레우스종으로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 CBS 220.95로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 A_terreus 의 변이체의 서열이 도 12 에 도시되어 있으며, 상기 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

탈라로마이세스의 종, 바람직하게는 탈라로마이세스 써모필루스종으로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 ATCC 20186 또는 ATCC 74338 로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 T_thermo 의 변이체의 서열이 도 13 에 도시되어 있으며, 상기 변이체들은 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

써모마이세스의 종, 바람직하게는 써모마이세스 라누기노수스종으로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 DBS 586.94 로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 T_lanuginosa 의 변이체의 서열이 도 14 에 도시되어 있으며, 상기 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

미셀리오프토라의 종, 바람직하게는 미셀리오프토라 써모필라종으로부터 유도된, 바람직하게는 스트레인 ATCC 48102 또는 ATCC 74340 으로부터 유도된 모델 피타제의 변이체, 바람직하게는 M_thermophila 의 변이체의 서열이 도 7 에 도시되어 있으며, 상기 변이체는 다음의 보정중 최소한 하나를 포함한다:

본 발명은 또한 클라도리늄의 스트레인, 즉 클라도리늄 포에쿤디씨뮴으로부터 유도된 새로운 피타제를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 피타제 활성을 가지고 있고, SEQ ID NO:2 또는 그것의 성숙한 부분 (아미노산 16 내지 495)을 포함하는 폴리펩티드; 또는 상기 규정된 바와 같은 세팅 및 프로그램 GAP을 사용하여 측정되는 바, 그것에 최소한 70 %, 바람직하게는 75 %, 보다 바람직하게는 80, 85, 90, 95 % 상동하는 (상기 상동성은 유사성, 바람직하게는 동일성을 의미한다) 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 피타제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 구성물에 관한 것으로, 상기 DNA 구성물은 SEQ ID NO:1 또는 그것의 뉴클레오티드 번호 20 내지 70 및 207 내지 1560; 또는 그것의 뉴클레오티드 번호 20 내지 70 과 207 내지 1563; 또는 그것의 뉴클레오티드 번호 65 내지 70 과 207 내지 1560; 또는 그것의 뉴클레오티드 65 내지 70 과 207 내지 1563; 또는 이들 뉴클레오티드 서열의 어느 하나에 대하여 최소한 70, 75, 80, 85, 90, 95 % 상동하는 DNA 구성물 또는 분자를 포함하며; 상동성은 유사성, 바람직하게는 동일성을 의미하는 것으로, GCG 프로그램 팩키지로 제공되는 GAP (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)와 같은 당업계에 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정된다 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48:443-453). DNA 서열을 비교하기 위하여 다음과 같이 세팅되어 있는 GAP 을 사용한다: GAP 크리에이션 패널티 5.0 및 GAP 익스텐젼 패널티 0.3. 본 발명은 또한 상기에서 언급된 조건하에 상기 DNA 서열들중 어느 하나와 혼성화하는 DNA 구성물에 관한 것이다.

실시예 1

피타제 활성 검정 (FYT)

피타제 활성은 다음의 검정을 사용하여 측정할 수 있다:

10 ㎕의 희석된 효소 샘플 (0.1 M 의 아세트산 나트륨, 0.01 %의 트윈 20, pH 5.5 에 희석됨)을 250 ㎕의 0.1 M 의 아세트산 나트륨, 0.01 % 의 트윈 20, pH 5.5 중의 5 mM 의 피트산 나트륨 (Sigma)에 첨가하고 (pH 는 피트산 나트륨을 녹인 후에 조정하고; 기질은 미리 가열한다), 30 분동안 37 ℃에서 인큐베이션한다. 반응을 250 ㎕의 10 % 의 TCA를 첨가함으로써 중지시키고, 유리 포스페이트를 100 ml 의 몰리브덴 시약 (8 ml 의 H₂SO₄중의 2.5 g 의 (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 이것을 250 ml 로 희석함)중의 500 ㎕ 의 7.3 g 의 FeSO4를 첨가함으로써 측정하였다. 흡광도를 750 nm에서 96 웰 미소적정 플레이트에 담겨있는 200 ㎕의 샘플에 대하여 측정한다. 기질과 효소 블랭크를 포함한다. 포스페이트 표준 곡선을 또한 포함한다 (0 내지 2 mM 의 포스페이트). 1 FYT는 주어진 농도에서 1 분동안 1 ㎛의 포스페이트를 방출하는 효소의 양과 같다.

실시예 2

비활성에 대한 시험

비활성은 다음과 같이 측정할 수 있다:

고도로 정제된 피타제 샘플을 사용한다 (순도는 단지 한 성분만의 존재를 보여주는 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 사전에 체크한다).

피타제 샘플중의 단백질 농도는 다음과 같이 아미노산 분석에 의하여 측정한다: 일정액의 피타제 새플을 6 N 의 HCl, 0.1 % 의 페놀중에서 16 시간동안 110 ℃에서 진공 유리 튜브안에서 가수분해한다. 그 결과의 아미노산을 제조자의 지시를 따라 작동되는 어플라이드 바이오시스템스 420A 아미노산 분석 시스템을 사용하여 정량한다. 아미노산의 양으로부터 가수분해된 일정액중의 단백질의 총 질량 - 및 그로써 또한 농도까지 -을 계산할 수 있다.

활성은 FYT 단위로 측정한다. 1 FYT 는 pH 5.5 , 37 ℃에서1 분동안 피테이트 (5 mM 의 피테이트)로부터 1 마이크로몰의 무기 포스페이트를 방출시키는 효소의 양과 같다; 검정은 예컨대 실시예 1에서 설명된다.

비활성은 FYT/mg 효소 단백질의 값이다.

실시예 3

온도 및 pH 활성 및 안정성에 대한 시험

온도 및 pH 활성 및 안정성은 다음과 같이 측정될 수 있다:

온도 프로필 (즉 온도 활성 관계)은 다양한 온도에서 (기질은 예열하여 놓음) 실시예 1 의 FYT 검정을 수행함으로써 측정한다.

온도 안정성은 잔류 활성을 측정하기 전에 다양한 온도에서 0.1 M의 인산 나트륨, pH 5.5 중에서 피타제를 예비-인큐베이션함으로써 측정한다.

pH-안정성은 잔류 활성을 측정하기 전에 효소를 pH 3 (25 mM 글리신-HCl), pH 4 내지 5 (25 mM 아세트산 나트륨), pH 6 (25 mM MES), pH 7 내지 9 (25 mM 트리스-HCl)에서 1 시간동안 40 ℃에서 인큐베이션함으로써 측정한다.

pH-프로필 (즉 pH 활성 관계)은 동일한 완충-시스템 (50 mM, pH 는 기질을 용해할 때 다시 조정함)을 사용하여 다양한 pH에서 검정을 수행함으로써 측정한다.

실시예 4

열안정성에 대한 바람직한 시험으로서의 DSC

열안정성 또는 용융 온도, Tm 은 다음과 같이 측정할 수 있다:

DSC에서 샘플-세포에서 일정한 온도 증가를 유지하기 위하여 소모된 열은 대조 세포와 관련하여 측정된다. 일정한 가열속도가 유지된다 (예컨대 90 ℃/시간). 흡열 반응 (열 소모 반응 - 예컨대 효소/단백질의 풀림)은 일정한 온도 증가를 유지하기 위하여 세포에 전달되는 열의 증가로서 관찰된다.

DSC 는 MicroCal 사 제품인 MC2-장치를 사용하여 수행할 수 있다. 세포는 20 ℃에서 20 분동안 평형화된 후, 90 ℃에서 90。/시간의 스캔 속도로 스캐닝된다. 예컨대 0.1 M 의 아세트산 나트륨, pH 5.5 중의 약 2.5 mg/ml 피타제의 샘플이 로딩된다.

실시예 5

활성 특성이 보정된 피타제 변이체

아스페르길루스 퓨미가투스 모델 피타제 (스트레인 ATCC 13073 으로부터 유도된 야생형 피타제)의 변이체를 EP 98104858.0 (EP-A-0897010)의 실시예 2 와 3 및 5에서 설명된 바와 같이 제조하고, 피타제 활성을 상기 문헌의 실시예 7에서 설명된 바와 같이 측정하였다. pH- 및 온도 최적과 용융점을 EP 98113176.6 (EP-A-0897985)의 실시예 9 와 10에서 설명된 바와 같이 측정하였다.

하기 표 1에서, pH 5.0에서 개선된 비활성을 가지는 변이체들을 열거한다. 하기 표 2 에는 pH 3.0에서 개선된 상대 활성을 나타내는 변이체들이 열거되고, 하기 표 3 에는 개선된 열안정성 (온도 최적, 예컨대 DSC 에 의해 측정됨)을 가지는 변이체들이 열거된다.

보정된 위치	치환 타입	pH 5.0에서의 비활성 (U/mg)
43	43L	83.4
	43N	45.5
	43T	106.9
	43I	91.2
	43V	35.0
	43A	27.3
	43G	59.6
43 과 270	43L, 270L	88.7
43 및 270 및 273	43L, 270L, 273D	92.3
43 및 78	43L, 78D	118.5
43 및 153 및 154	43L, 153Y, 154G	193.0
아스페르길루스 퓨미가투스 야생형 피타제	-	26.5

보정된 위치	치환 타입	pH 3.0에서의 상대 피타제 활성
205	205E	41 %
273	273K	61 %
278	278H	75 %
273 및 205	273K, 205E	65 %
273 및 278	273K, 278H	100 %
273 및 205 및 278	273K, 205E, 278H	96 %
아스페르길루스 퓨미가투스 야생형 피타제	-	32 %

보정된 위치	치환 타입	온도 최적 (℃)	Tm (℃)(DSC)
43, 47, 88, 102, 220, 242, 267	43T, 47Y, 88I, 102Y, 220L, 242P, 267D	60	67
3, 47, 88, 102, 220, 242, 267, 51, 302, 337, 373, 115	43T, 47Y, 88I, 102Y, 220L, 242P, 267D, 51A, 302H, 337T, 373A, 115N	63	-
아스페르길루스 퓨미가투스 야생형 피타제	-	55	62.5

실시예 6

활성 특성이 보정된 추가의 피타제 변이체

도 9 의 자낭균 일치 서열 "conphys" 의 변이체들을 EP 98113176.6 (EP-A-0897985)의 실시예 4 내지 8에서 설명된 바와 같이 제조하였다. pH- 및 온도 최적, 및 용융 온도를 포함한 피타제 활성을 상기 문헌의 실시예 9 와 10에서 설명된 바와 같이 측정하였다.

하기의 표는 보정된 할성 특성을 가지는 변이체들을 열거한 것이다. 즉,

표 4 는 pH 6.0에서 개선된 비활성을 가지는 변이체들이고, 표 5 는 보정된 pH 최적을 가지는 변이체를 나타내며 (표시된 pH-최적은 대략적인 값으로, 그 pH-값 (pH 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 및 7.0 으로 이루어지는 군으로부터 선택됨)과 같이 측정되며, 그 때 최대의 피타제 활성이 얻어진다), 표 6 은 개선된 열안정성을 가지는 변이체들이고 (차등 스캐닝 비색계 (DSC)에 의해 측정되는 바, 용융점에 의하여 표시됨), 표 7 은 보정된 열안정성 (온도 최적)을 가지는 변이체들이다: "+" 또는 "-"는 각각 1 ℃ 정도까지 온도 최적에 미치는 긍정적 또는 부정적 효과를 나타내고; "++" 또는 "--"는 각각 1 내지 3 ℃ 정도까지 온도 최적에 미치는 긍정적 또는 부정적 효과를 나타낸다.

보정된 위치	치환 타입	pH 6.0에서의 비활성 (U/mg)
43	43T	130
	43L	205
Conphys	-	62

보정된 위치	치환 타입	pH 최적, 대략
43	43T	6.0
	43L	5.5
	43G	6.5
43 과 44	43L, 44N	6.0
	43T, 44N	5.5
Conphys	-	6.0

보정된 위치	치환 타입	Tm (℃)
43	43T	78.9
Conphys	-	78.1

보정된 위치	치환 타입	온도 최적 보정	보정된 위치	치환 타입	온도 최적 보정
51	A	+	148	V	--
58	K	+	186	A	--
220	N	+	187a	S	-
195	L	++	198	V	-
201e	T	++	204	A	--
244	D	+	211	V	-
264	I	+	215	P	--
302	H	+	251e	Q	-
337	T	++	260	A	-
352	K	+	265	A	-
373	A	++	339	V	-
47	F	-	365	A	--
62	I	-	383k	E	-
83	K	-	404	G	--
90	R	-	417	R	--
143	N	-	Conphys	-	0

보정된 위치	치환 타입	Tm (℃)(DSC)	pH 5.0에서의 비활성 (U/mg)
43, 51, 220, 244, 264, 302, 337, 352, 373	51A, 220N, 244D, 264I, 302H, 337T, 352K, 373A, 43T	84.7	105
43, 51, 220, 244, 264, 302, 337, 352, 373, 80	51A, 220N, 244D, 264I, 302H, 337T, 352K, 373A, 43T, 80A	85.7	180
Conphys	-	78.1	30

실시예 7

클라도리늄 포에쿤디씨뮴의 피타제의 클로닝

클라도리늄 포에쿤디씨뮴 CBS 427.97 로부터 얻어지는 피타제를 코드화하는 DNA를, 본질적으로는 WO 98/28409에서 설명된 바와 같이 클론하였고, 효소를 단리하여 정제하였다.

도 15 는 pA2phy8 에서의 HindIII/XbaI 클론된 PCR 생성물의 DNA 서열을 도시한다. 클론된 PCR 생성물은 클라도리늄 포에쿤디씨뮴 CBS 427.97 phyA 유전자를 코드화하는 게놈 영역으로부터 증폭된다. 잠재적인 인트론은 GT-AG 규칙을 따라 절출-결찰 지점의 이중 밑줄에 의해 표시된다 (R. Breathnach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) pp 4853-4857). 클로닝에 사용된 제한 부위들은 밑줄로 표시된다.

SignalP V1.1 예상 (Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, StrenBrunak and Gunnar von Heijne: "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites", Protein Engineering 10, 1-6 (1997))에 따르면, 아미노산 번호 1 내지 15 에 상응하는 효소의 신호 펩티드 부분, 따라서 성숙한 효소는 아미노산 번호 16 내지 495 이다.

효소는 대략 pH 6 근처에서 pH 최적을 나타내며, 낮은 pH (pH 3)에서는 활성을 보이지 않지만, pH 7.5 까지는 상당한 활성을 보인다. 그러므로, 이 피타제는 아스페르길루스 피큠 피타제와 비교할 때 더 알칼리성이다.

60 ℃ 근처의 온도 최적은 pH 5.5 에서 발견되었다. 그러므로, 이 피타제는 아스페르길루스 피큠 피타제보다 더 열에 안정하다.

실시예 8

도 1 에 따르는 새로운 모델 피타제의 배열

실시예 7에서 설명된 바와 같은 클라도리늄 포에쿤디씨뮴의 피타제 서열을 상기에서 언급한 GAP 버전 8을 사용하여 3.000 의 GAP weight와 0.100 의 GAP lenthweight를 사용하여 도 1 의 13 개의 모델 피타제와 비교한다. 완전한 아미노산 서열을 비교한다. M_thermophila 피타제 서열이 가장 상동하는 서열인 것으로 나타났으며, 클라도리늄 포에쿤디씨뮴 서열에 대하여 70.86 % 의 유사성을 나타냈다.

GAP 프로그램과 상기에서 언급한 매개변수를 사용하여, 피타제 서열 "C_foecundissimum"을 "M_thermophila" 피타제에 대하여 배열한다 - 도 16 참조. 평균 매치는 0.540 이다; 평균 미스매치는 -0.396 이다; 퀄리티 445.2; 길이 505; 비율 0.914; 갭 9; % 유사성 70.860; % 동일성 53.878.

다음 단계 (도 17 참조)로, C_foecundissimum을 도 1 의 배열위로 바닥에 있는 줄과 같이 지나가게 한다 (또는 단순히 쓴다). 이것은 도 16 에 있는 배열에 따르는 아미노산 잔기가 동일하거나 (수직선으로 표시됨) 또는 유사한 것이 상호간에 서로의 위에 놓여 있음 (하나 또는 두 개의 점으로 표시됨)을 확증해준다. 서열을 따라 5 개의 지점에서, C_foecundissimum 서열은 "과잉" 아미노산 잔기를 포함하는데, 그곳에서 도 1 의 배열은 방 (room)을 만들지 못한다. 도 17에서, 이들 과잉 잔기는 다음 줄로 전달된다 (그러나 그것들은 다중 배열에 포함될 수 있으며, 앞서 위치와 관련된 단원에서 설명된 바와 같이 넘버링된다 (a, b, c 등을 사용하여)).

그런 다음 피타제 C_foecundissimum 의 상응하는 변이체들이 도 17을 기초로 쉽게 추론될 수 있다. 몇가지 실예: 변이체들은 일반적으로 "K80A" 와 "Q43T" 에 상응하여 각각 C_foecundissimum에서 "80K,A" 및 "43T" 로 표시된다.

Claims (47)

1. 도 1 에 따라 배열했을 때, P_lycii 에 상응하는 위치 넘버링을 사용하여, 다음의 위치들중 최소한 하나에서 모델 피타제와 비교하여 보정된 피타제 변이체:

   24; 27; 31; 33; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 49; 51; 56; 58; 59; 61; 62; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 88; 90; 102; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 132; 143; 148; 149; 150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 170f; 170g; 171; 172; 173; 184; 185; 186; 187; 187a; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 198; 199; 200; 201; 201a; 201b; 201c; 201d; 201e; 201f; 202; 203; 203a; 204; 205; 211; 215; 220; 223; 228; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 242; 243; 244; 246; 251e; 253; 256; 260; 264; 265; 267; 270; 271; 272; 273; 274; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 283; 285; 287; 288; 292; 293; 302; 304; 332; 333; 334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 348; 349; 352; 360; 362; 364; 365; 366; 367; 368; 369; 370; 371; 372; 373; 374; 375; 376; 383k; 387; 393; 394; 396; 404; 409; 411; 412; 413; 417; 421; 431.
2. 도 1 에 따라 배열했을 때, P_lycii 에 상응하는 위치 넘버링을 사용하여, 모델 피타제와 비교하여 다음의 보정들중 최소한 하나를 포함하는 피타제 변이체:

   24C; 27P; 31Y; 33C; 39H,S,Q; 40L,N; 42S,G; 43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 44N; 45D,S; 47Y,F; 49P; 51E,A,R; 56P; 58D,K,A; 59G; 61R; 62V,I; 69Q; 75W,F; 78D,S; 79G; 80K,A; 81A,G,Q,E; 82T; 83A,I,K,R,Q; 84I,Y,Q,V; 88I; 90R,A; 102Y; 115N; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,Q,T; 125M,S; 126H,S,V; 127Q,E,N; 128A,S,T; 132F,I,L; 143N; 148V,I; 151A,S; 152G; 153D,Y; 154D,Q,S,G; 157V; 158D,A; 159T; 160A,S; 161T,N; 162N; 163W; 170fH; 170gA; 171N; 172P; 173Q,S; 184Q,S,P; 185S; 186A,E,P; 187A; 187aS; 190A,P; 193S; 194S,T; 195T,V,L; 198A,N,V; 200G,V; 201D,E; 201a(); 201b(); 201c(); 201d(); 201e(); 201f(); 201eT; 202S,A; 203R,K,S; 203aV,T; 204Q,E,S,A,V; 205E; 211L,V; 215A,P; 220L,N; 223H,D; 228N; 232T; 233E; 235Y,L,T; 236Y,N; 237F; 238L,M; 242P,S; 244D; 246V; 251eE,Q; 253P; 256D; 260A,H; 264R,I; 265A,Q; 267D; 270Y,A,L,G; 271D,N; 273D,K; 275F,Y; 278T,H; 280A,P; 283P; 287A,T; 288L,I,F; 292F,Y; 293A,V; 302R,H; 304P,A; 332F; 336S; 337T,G,Q,S; 338I; 339V,I; 340P,A; 343A,S,F,I,L; 348Y; 349P; 352K; 360R; 362P; 364W,F; 365V,L,A,S; 366D,S,V; 367A,K; 368K; 369I,L; 370V; 373A,S; 374S,A; 375H; 376M; 383kQ,E; 387P; 393V; 396R; 404A,G; 409R; 411K,T; 412R; 417E,R; 421F,Y; 431E.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 자낭균 피타제로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
4. 제 3 항에 있어서, 아스페르길루스 피타제로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
5. 제 4 항에 있어서, 모델 피타제는 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 피큠, 아스페르길루스 니듈란스, 아스페르길루스 퓨미가투스, 아스페르길루스 테레우스의 스트레인인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
6. 제 5 항에 있어서, 모델 피타제가 아스페르길루스 니듈란스 DSM 9743; 또는 아스페르길루스 테레우스의 다음의 스트레인: CBS 116.46, DSM 9076, CBS 220.95 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
7. 제 6 항에 있어서, 모델 피타제가 도 10 에 도시된 아스페르길루스 니듈란스 피타제 서열; 또는 도 12 에 도시된 아스페르길루스 테레우스 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
8. 제 3 항에 있어서, 모델 피타제가 써모마이세스 라누기노수스, 탈라로마이세스 써모필루스, 또는 미셀리오프토라 써모필라의 스트레인인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
9. 제 8 항에 있어서, 모델 피타제가 써모마이세스 라누기노수스 CBS 586.94 이거나; 또는 다음의 탈라로마이세스 써모필루스 스트레인: ATCC 20186, ATCC 74338 중 어느 하나; 또는 다음의 미셀리오프토라 써모필라 스트레인: ATCC 34625, ATCC 74340 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
10. 제 9 항에 있어서, 모델 피타제가 도 14 에 도시된 써모마이세스 라누기노수스 피타제 서열; 또는 도 13 에 도시된 탈라로마이세스 써모필루스 서열; 또는 도 7 에 도시된 미셀리오프토라 써모필라 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
11. 제 3 항에 있어서, 모델 피타제가 자낭균 일치 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 담자균 피타제로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
13. 제 12 항에 있어서, 모델 피타제가 팍실루스 인볼루투스, 트라메테스 퓨베센스, 아그로사이브 페디아데스, 또는 페니오포라 라이치의 스트레인인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
14. 제 13 항에 있어서, 모델 피타제가 트라메테스 퓨베센스 CBS 100232 또는 팍실루스 인볼루투스 CBS 100231 인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
15. 제 14 항에 있어서, 모델 피타제가 도 4 의 트라메테스 퓨베센스 피타제 서열 또는 도 2 및 3 의 팍실루스 인볼루투스 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 다음의 보정중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체:

    R24C; V27P; H39Q,S; L40N; G42S; Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y; Y44N; A45D,S; F47Y; S49P; A51E,R; V56P; A58D,K; V62I; S69Q; Y75W,F; D78S; S79G; K80A; G81A,Q,E; K82T; K83A,I,R,Q; Y84Q,I,V; E90R,A; D115N; D116S; T118V,L; P119E; F120L; E122A; Q123N,T; L125S,M; V126H,S; N127Q,E; S128A,T; F132I,L; I148V; S151A; S153D,Y; S154Q,D,G; I157V; A158D; S159T; G160A,S; K161T,N; K162N; F163W; R170fH; Q171N; G173Q,S; S184P,Q; E185S; A186E,P; S187A; T190P,A; P193S; G194S,T; T195V,L; V198A,N; E200G,V; D201E; S201d(); E201e(),T; L201f(); 바람직하게는 세 개의 모든 결실; A202S; D203R,K,S; D203aV,T; V204Q,E,S,A; T211L,V; S215AP; L220N; D223H; T228N; T235Y,L; Y236N; L237F; M238L; S242P; I246V; K251eE,Q; H260A; I264R; N265Q,A; Q270Y,A,L,G; S271D,N; K273D; Y275F; H278T; A280P; T287A; Q288L,I,F; Y292F; A293V; H302R; P304A; N336S; G337S,T,Q; I339V; S340P,A; F343A,S,F,I,L; N349P; N360R; T362P; F364W; S365V,L,A; S366D,V; A367K; A368K; T369I,L; A373S; S374A; R375H; L376M; Q383kE; P404A,G; T411K; R417E; F421Y; A431E.
17. 제 16 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 아스페르길루스로부터 유도된 피타제, 바람직하게는 아스페르길루스 피큠 또는 아스페르길루스 니거로부터 유도된 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
18. 제 17 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 아스페르길루스 피큠 (니거) NRRL 3135, 아스페르길루스 니거 ATCC 9142, 또는 아스페르길루스 니거 ATCC 74337 중 어느 하나로부터 유도된 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
19. 제 18 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 도 11 의 아스페르길루스 피큠 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 다음의 보정중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체:

    A24C; V27P; H39,S,Q; L40N; G42S; Q43C,D,E,F,H,K,M,P,R,S,W,Y; Y44N; S45D; F47Y; S49P; E51A,R; L56P; K58D,A; D59G; I62V; S69Q; Y75W,F; S78D; S79G; K80A; S81A,G,Q,E; K82T; K83A,I,Q,R; Y84Q,V,I; V88K; A90R; F102Y; D115N; D116S; T118V,L; P119E; F120L; E122A; Q123N,T; L125S,M; V126H,S; N127Q,E; S128A,T; F132I,L; S143N; I148V; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G; I157V; A158D; S159T; G160A,S; E161T,N; K162N; F163W; R170fH; ()171N; N173Q,S; T172P; P184Q,S; E185S; S186A,E,P; E187A; T187aS; T190P,A; G194S,T; V195L,T; K198A,N,V; E200G,V; A201D,E; S201d(); Q201e(),T; L201f(); 바람직하게는 세 개의 모든 결실; G202S,A; D203R,K,S; E203aV,T; V204Q,E,S,A; A205E; L211V; A220L,N; H223D; T228N; E232T; D233E; V235Y,L,T; V236Y,N; L237F; M238L; C242P,S; T246V; Q251eE,Q; Q256D; H260A; K264R,I; K265Q,A; N267D; Q270Y,A,L,G; S271D,N; G273D,K; Y275F; Y278T,H; A280P; A287T; Q288L,I,F; F292Y; T293A,V; R302H; P304A; F332F; N336S; S337T,G,Q; M338I; V339I; S340P,A; F343A,S,I,L; N349P; E352K; S360R; K362P; Y364W,F; S365V,L,A; A366D,V,S; S367A,K; W368K; V369I,L; G373S,A; R375H; A376M; K383kQ,E; D404A,G; T411K; I393V; L412R; K417E,R; W421F,Y; G431E.
21. 제 20 항에 있어서, 아스페르길루스 피타제로부터, 바람직하게는 아스페르길루스 퓨미가투스로부터 유도된 모델 피타제를 사용하여 유도되는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
22. 제 21 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 다음의 아스페르길루스 퓨미가투스 스트레인: ATCC 13073, ATCC 32722, ATCC 58128, ATCC 26906 또는 ATCC 32239 중 어느 하나로부터 유도된 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
23. 제 22 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 도 8 의 아스페르길루스 퓨미가투스 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
24. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 피타제 변이체가 다음의 보정중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체:

    G24C; V27P; H39S,Q; L40N; G42S; Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; Y44N; S45D; Y47F; S49P; E51A,R; V56P; D58K,A; D59G; V62I; S69Q; Y75W,F; S78D; S79G; K80A; S81A,G,Q,E; K82T; A83I,Q,K,R; Y84,Q,I,V; A90R; D115N; S116S; T118V,L; F119E; P120L; E122A; N123Q,T; M125S; V126H,S; N127Q,E; S128A,T; Y132F,I,L; K143N; I148V; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G; I157V; A158D; S159T; A160S; E161T,N; K162N; F163W; G170fH; S170gA; Q171N; H173Q,S; P184Q,S; E185S; G186A,E,P; S187A; G187aS; T190P,A; H193S; G194S,T; T195V,L; A198N,V; E200G,V; D201E; S201d(); E201e(),T; L201f(); 바람직하게는 세 개 모두; G202S,A; D203R,K,S; D203aV,T; V204Q,S,A,E; L211V; A215P; L220N; D223H; T228N; E232T; D233E; V235Y,L,T; Y236N; L237F; M238L; P242S; E244D; E251e,Q; A256D; H260A; R264I; Q265A; Q270Y,A,L,G; S271D,N; G273D,K; Y275F; Y278T,H; A280P; A287T; Q288L,I,F; F292Y; A293V; R302H; P304A; N336S; S337T,Q,G; M338I; I339V; S340P,A; F343A,S,I,L; N349P; A352K; S360R; E362P; Y364W,F; S365V,L,A; A366D,V,S; S367K,A; W368K; T369I,L; G373S,A; A374S; R375H; A376M; Q383kE; A404G; K411T; E417R; F421Y; A431E.
25. 제 24 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 자낭균 일치 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
26. 제 25 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 도 9 의 자낭균 일치 서열 "conphys" 인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
27. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 피타제 변이체가 다음의 보정중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체:

    V24C; F27P; ()31Y; F33C; D39H,S,Q; S40L,N; A42S,G; A43C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; Y44N; T45D,S; Y47F; Q51E,A,R; K58D,A; K61R; I62V; F75W; S78D; A80K; G81A,Q,E; R83A,I,Q,K; I84Y,Q,V; V88I; K90R,A; L102Y; D115N; D116S; V118L; P119E; F120L; L123N,T,Q; S125M; S126H,V; Q127E,N; A128S,T; T132F,I,L; E143N; V148I; S151A; S152G; S153D,Y; N154D,Q,S,G; D158A; S159T; A160S; T161N; ()170fH; ()170gA; ()171N; H173Q,S; H172P; S184Q,P; E185S; S186A,E,P; L187A; ()187aS; T190P,A; D193S; A194S,T; M195T,V,L; N198A,V; G200V; S201D,E; ()201eT; S202A; D203R,K,S; P203aV,T; Q204E,S,A,V; T205E; I211L,V; P215A; L220N; Q223D,H; A232T; D233E; S235Y,L,T; N236Y; L237F; I238L,M; A242P,S; E244D; I246V; ()251eE,Q; N256D; P260A,H; A264R,I; Q265A; E267D; G270Y,A,L; L332F; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; Y283P; V287A,T; Q288L,I,F; Y292F; I293A,V; E302R,H; P304A; L332F; N336S; Q337T,S,G; M338I; I339V; A340P; S343A,F,I,L; F348Y; N349P; S352K; P360R; R362P; W364F; V365L,A,S; T366D,V,S; S367K,A; R368K; T369I; T370V; S373A; A374S; R375H; S383kQ,E; T387P; A396R; G404A; L409R; T411K; L412R; E417R; Y421F.
28. 제 27 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 아그로사이브 페디아데스로부터 유도되는 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
29. 제 27 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 아그로사이브 페디아데스 CBS 900.96 으로부터 유도되는 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
30. 제 29 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 도 5 의 아그로사이브 페디아데스 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
31. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 피타제 변이체가 다음의 보정중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 피타제 변이체:

    F24C; V27P; L31Y; I33C; S39H,Q; N40L; G42S; P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y; Y44N; D45S; F47Y; E51A,R; E58D,K,A; T61R; V62I; W75F; S78D; A80K; R81Q,E,G,A; S82T; R83A,I,Q,K; Q84Y,V,I; V88I; K90R,A; A115N; D116S; L118V; P119E; F120L; N123T,Q; S125M; H126S,V; Q127E,N; T128A,S; M132F,I,L; G143N; V148I; A151S; D153Y; Q154D,S,G; D158A; S159T; S160A; T161N; ()170fH; ()170gA; S171NG172P; E173Q,S; Q184S,P; E185S; E186A,P; G187A; ()187aS; T190P,A; N193S; N194S,T; M195T,V,L; N198A,V; V200G; D201E; ()201eT; G202S,A; D203R,K,S; ()203aV,T; E204Q,S,A,V; S205E; V211L; N215A,P; L220N; A223D,H; S232T; D233E; L235Y,T; T236Y,N; L237F; M238L; P242S; L246V; ()251eE,Q; A260H; V264R,I; S265Q,A; E267D; Y270A,L,G; D271N; D273K; F275Y; G278T,H; P280A; A283P; T287A; Q288L,I,F; Y292F; V293A; G302R,H; A304P; N336S; T337Q,S,G; M338I; V339I; P340A; A343S,F,I,L; F348Y; N349P; A352K; E360R; R362P; W364F; V365L,A,S; D366V,S; S367K,A; L369I; S373A; G374A,S; ()383kQ,E; E387P; A396R; G404A; V409R; E411K,T; L412R; E417R; Y421F; A431E.
32. 제 31 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 페니오포라 라이치로부터 유도된 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
33. 제 32 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 페니오포라 라이치 CBS 686.96 으로부터 유도된 피타제인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
34. 제 33 항에 있어서, 그것의 모델 피타제가 도 6 의 페니오포라 라이치 피타제 서열인 것을 특징으로 하는 피타제 변이체.
35. 선행하는 항들중 어느 하나를 따르는 피타제 변이체를 포함하는 피타제 폴리펩티드.
36. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항을 따르는 피타제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구성물.
37. 제 36 항을 따르는 DNA 구성물을 포함하는 재조합 발현 벡터.
38. 제 36 항을 따르는 DNA 구성물 또는 제 37 항을 따르는 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
39. 제 38 항을 따르는 숙주 세포를 피타제 변이체의 생성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 배양 육즙으로부터 피타제를 회수하는 단계로 이루어지는, 피타제 변이체의 제조 방법.
40. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항의 피타제 변이체를 최소한 하나 포함하는 식품 또는 사료.
41. 최소한 하나의 피타제 변이체를 식품 또는 사료 성분에 첨가하는 것으로 이루어지는, 제 40 항에 따르는 식품 또는 사료의 제조 방법.
42. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항의 피타제 변이체를 최소한 하나 포함하는 조성물.
43. 제 42 항에 있어서, 식품 또는 사료 제제에 사용하기에 적당한 조성물.
44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 동물 사료 첨가제인 것을 특징으로 하는 조성물.
45. 동물에게 제 40 항에 따르는 또는 제 41 항에 따라 얻을 수 있는 사료의 유효량을 공급하는 것으로 이루어지는, 동물 비료중의 피타제 수준을 감소시키는 방법.
46. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항의 피타제 변이체; 또는 제 42 항 또는 43 항의 조성물을 피타제 기질로부터 인을 분리시키기 위하여 사용하는 피타제 또는 조성물의 용도.
47. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 따르는 피타제 변이체를 발현할 수 있는 트란스제닉 식물 또는 식물 부분.