DE69738483T2

DE69738483T2 - Polypeptide mit phytase-aktivität und sie kodierende nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69738483T2
Application number: DE69738483T
Authority: DE
Inventors: Randy M. Davis Berka; Michael W. Davis RAY; Alan V. Dixon KLOTZ
Original assignee: Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1996-03-18
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2017-03-19
Also published as: EP0904383A1; ES2301177T3; US5866118A; BR9708209A; WO1997035017A1; CA2248980A1; AU2077197A; AU717284B2; AU2539197A; JP4125375B2; DE69738483D1; ATE384798T1; JP2000507102A; CN1214081A; US6221644B1; EP0904383B1; WO1997035016A1

Description

Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Phytaseaktivität und isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide kodieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zum Herstellen der Polypeptide. Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen, die die Polypeptide umfassen, und Verfahren zur Verwendung davon.
Beschreibung des Standes der Technik
Phytasen (Myo-inositol-hexakisphosphat-phosphohydrolasen, EC 3.1.3.8) katalysieren die Hydrolyse von Phytat (Myo-inositolhexakisphosphat) zu (1) Myo-inositol, (2) Mono-, Di-, Tri-, Tetra- und Pentaphosphate davon, und (3) anorganischem Phosphat. Im Folgenden werden die vorstehend genannten Verbindungen abgekürzt manchmal als IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5, beziehungsweise P bezeichnet. Das heißt, dass durch die Wirkung einer Phytase IP6 zu anorganischem Phosphat und einem oder mehreren der Bestandteile IP5, IP4, IP3, IP2, IP1 und I abgebaut wird. Alternativ wird Myo-inositol, das insgesamt n Phosphatgruppen verbunden mit den Positionen p, q, r, ... trägt, als (Ins(p, q, r, ...)P_n) bezeichnet.
Zwei verschiedene Arten von Phytasen sind bekannt: Eine so genannte 3-Phytase (Myo-inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8) und eine so genannte 6-Phytase (Myoinositol-hexakisphosphat-6-phosphohydrolase, EC 3.1.3.26). Die 3-Phytase hydrolysiert zuerst die Esterbindung an der 3-Position, während die 6-Phytase zuerst die Esterbindung an der 6-Position hydrolysiert. Die verbleibenden Esterbindungen des sich ergebenden IP5-Substrats (sei es das 1, 2, 4, 5, 6-IP5 oder das 1, 2, 3, 4, 5-IP5) werden anschließend mit verschiedenen Geschwindigkeiten hydrolysiert. Es scheint auch die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Bestandteile IP4, IP3, IP2 und IP1 variabel, wenn sie überhaupt hydrolysiert werden.
Phytaseproduzierende Mikroorganismen schließen Bakterien wie Bacillus subtilis (Paver und Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102–1108) und Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207–1220); Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae (Navini und Marcakis, 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24–26); und Pilze der Gattung Aspergillus wie Aspergillus terreus (Yamada et al., 1986, Agricultural Biological Chemistry 322: 1275–1282) ein.
Das Klonieren und die Expression der Phytasegene aus Aspergillus niger var. awamori durch Piddington et al. (1993, Gene 133: 55–62) und Aspergillus niger (ficuum) durch van Hartingsveldt et al. (1993, Gene 127: 87–94; EP 420 358 ) wurden offenbart.
Phytinsäure ist die hauptsächliche Speicherform von Phosphat in Getreidekörnern, Hülsenfrüchten und Ölsamen wie Soja, die die Hauptbestandteile von Tierfuttermitteln sind. Jedoch ist das Vorhandensein von Phytinsäure in Tierfuttermitteln für monogastrische Tiere unerwünscht, weil die Phosphatreste der Phytinsäure wesentliche Mineralstoffe und möglicherweise Protein chelatieren, was sie als Nährstoffe unzugänglich macht. Weiterhin wandert Phytatposphor durch den Verdauungstrakt von monogastrischen Tieren und wird nicht verstoffwechselt. Da Phosphor ein wesentliches Element für das Wachstum aller Organismen ist, muss Viehfutter mit anorganischem Phosphat ergänzt werden. Daher wurde im Stand der Technik die Verwendung von Phytasen in Futtermitteln für monogastrische Tiere beschrieben.
Da Phytinsäure weiterhin nicht durch monogastrische Tiere verstoffwechselt wird, wird sie im Dung ausgeschieden. Die Menge an Dung, die weltweit produziert wird, ist durch die ansteigende Viehproduktion signifikant angestiegen. Die Beseitigung von Dung hat auf Grund der Ansammlung von Phosphat insbesondere im Wasser ein Umweltproblem an verschiedenen Orten auf der Welt verursacht. Daher wurde im Stand der Technik auch die Verwendung von Phytasen zum Verringern der Phytatmenge in Dung beschrieben.
Es besteht ein Bedürfnis auf dem Gebiet nach neuen Phytasen mit verbesserten Eigenschaften, die in wirtschaftlich signifikanten Mengen hergestellt werden können.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue Klasse von Phytasen bereitzustellen, d. h. 3,6-Phytasen, d. h. Phytasen, die beide Bindungen eines Phosphoesters angreifen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit 3,6-Phytaseaktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% Identität mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 besitzt;
(b) einem Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter Bedingungen mittlerer Stringenz mit (i) der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1, oder (ii) ihrem komplementären Strang zu hybridisieren;
(c) einer allelischen Form von (b) oder (c) und
(d) einem Fragment von (b), (c) oder (d).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide kodieren, und Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, und Wirtszellen umfassend die Nukleinsäuresequenzen, sowie Verfahren zum Herstellen der Polypeptide. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung von Futtermitteln und Verfahren zum Verringern von Phytatspiegeln.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt ein Autoradiogramm einer Analyse durch Southern-Hybridisierung von genomischer DNA aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 mit einer Phytase-Gensonde.
2 zeigt die genomische DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Phytase aus Thermomyces lanuginsosus CBS 586.94 (SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 2).
3 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Phytasen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 und Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 (SEQ ID NO: 3).
4 zeigt eine Restriktionskarte von pDM 181.
5 zeigt eine Restriktionskarte von pMWR48.
6 zeigt einen Vergleich der Thermostabilität der Phytasen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 und Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135.
7 zeigt die pH-Aktivitätsprofile der Phytasen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 und Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135.
8 zeigt die Temperatur-Aktivitätsprofile der Phytasen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 und Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135.
9 zeigt NMR-Spektren als übereinander gestellte Darstellungen (bis zu 24 Stunden), die das Produktprofil einer Phytase aus Aspergillus niger (ficuum) zeigen.
10 zeigt NMR-Spektren als übereinander gestellte Darstellungen (bis zu 24 Stunden), die das Produktprofil einer Phytase aus Thermomyces lanuginosus zeigen.
11 zeigt NMR-Spektren als übereinander gestellte Darstellungen bis zu 4,5 Stunden, die das Produktprofil einer Phytase aus Aspergillus niger (ficuum) zeigen.
12 zeigt NMR-Spektren als übereinander gestellte Darstellungen bis zu 4,5 Stunden, die das Produktprofil einer Phytase aus Thermomyces lanuginosus zeigen.
13 zeigt NMR-Spektren, die das Produktprofil einer Phytase aus Aspergillus niger (ficuum) und einer Phytase aus Thermomyces lanuginosus nach 20 Minuten zeigen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Polypeptide mit Phytaseaktivität
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide mit 3,6-Phytaseaktivität. Damit gehören die Polypeptide dieses Aspekts der Erfindung zu einer neuen Klasse von Phytasen, die eine hohe anfängliche Affinität für die 6- sowie die 3-Position von Phytinsäure aufweisen, in anderen Worten handelt es sich weder um eine 3-Phytase noch eine 6-Phytase, sondern um eine, die weniger positionsspezifisch ist als bisher für sämtliche bekannten Phytasen berichtet. Vorzugsweise haben diese Polypeptide eine höhere anfängliche Affinität für die 3-Position als für die 6-Posititon. Weiterhin werden diese Polypeptide aus einem Pilzstamm erhalten, weiter bevorzugt einem filamentösen Pilzstamm. In einer am meisten bevorzugten Aus führungsform wird das Polypeptid aus Thermomyces erhalten, weiter bevorzugt aus Thermomyces lanuginosus, und am meisten bevorzugt aus dem Stamm CBS 586.94.
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide, welche eine Aminosäuresequenz besitzen, die einen Grad an Identität zur Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 von mindestens etwa 60%, bevorzugt mindestens etwa 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 80%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95%, und noch am meisten bevorzugt mindestens etwa 97% besitzt, welche qualitativ die Phytaseaktivität der Polypeptide (nachstehend "homologe Polypeptide") beibehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz, welche sich durch 5 Aminosäuren, bevorzugt durch 4 Aminosäuren, weiter bevorzugt durch 3 Aminosäuren, noch weiter bevorzugt durch 2 Aminosäuren, und am meisten bevorzugt durch 1 Aminosäure von der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 unterscheidet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Grad an Identität zwischen 2 Aminosäuresequenzen durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151–153) mit einer Identitätstabelle, einer Gap-Penalty von 10, und einer Gap-Length-Penalty von 10 bestimmt.
Die Aminosäuresequenzen der homologen Polypeptide unterscheiden sich von der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, durch Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten und/oder durch Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten durch unterschiedliche Aminosäurereste. Bevorzugt sind die Aminosäureänderungen von geringer Art, d. h. konservative Aminosäuresubsitutionen, die die Faltung und/oder die Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale Erweiterungen, wie ein aminoterminaler Methioninrest; ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20–25 Resten; oder eine kleine Erweiterung, die die Reinigung erleichtert durch Ändern der Nettoladung oder einer anderen Funktion wie ein Poly-Histidinteil, ein antigenes Epitop oder eine Bindedomäne.
Beispiele für konservative Substitutionen befinden sich innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin und Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin und Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäuresubstitutionen, die nicht allgemein die spezifische Aktivität verändern, sind im Stand der Technik bekannt und werden z. B. durch H. Neurath und R. L. Hill, 1979 in The Proteins, Academic Press, New York beschrieben. Die am häufigsten vorkommenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly, sowie diese in umgekehrter Reihenfolge.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit 3,6-Phytaseaktivitä mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2, und allelischen Formen und Fragmenten davon, welche Phytaseaktivität beibehalten. Vorzugsweise enthält ein Fragment mindestens 400 Aminosäurereste, weiter bevorzugt mindestens 425 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 475 Aminosäurereste.
In einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit 3,6-Phytaseaktivität, welche durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die die Fähigkeit besitzen, unter Bedingungen hoher, mittlerer oder geringer Stringenz mit einer Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, die unter denselben Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang hybridisiert (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York), und allelischen Formen und Fragmenten davon. Eine Hybridisierung zeigt an, dass die analoge Nukleinsäuresequenz mit der Oligonukleotidsonde hybridisiert, die dem das Polypeptid kodieren Teil der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 entspricht, unter Bedingungen geringer bis hoher Stringenz (z. B. Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA, und entweder 50, 35 oder 25% Formamid, für hohe, mittlere, beziehungsweise geringe Stringenz), unter Befolgung von Standardverfahren für Southern-Blotting.
Die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäure-Teilsequenz davon können verwendet werden, um eine Oligonukleotidsonde zu entwerfen, oder es kann eine Nukleotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, wie die Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder eine Untersequenz davon, verwendet werden, um DNA, die Polypeptide mit Phytaseaktivität kodiert, aus Stämmen oder verschiedenen Gattungen oder Arten gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren zu identifizieren und zu klonieren. Insbesondere können solche Sonden für die Hybridisierung mit der genomischen oder der cDNA der interessierenden Gattung oder Art verwendet werden, unter Befolgung von Standardverfahren für Southern-Blotting, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Sonden können beträchtlich kürzer als die ganze Sequenz sein, sollten aber mindestens 15, bevorzugt mindestens 25, und weiter bevorzugt mindestens 40 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können auch verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden werden typischerweise markiert, um das entsprechende Gen nachzuweisen (z. B. mit ³²P, ³H, ³⁵S, Biotin oder Avidin).
Somit kann eine genomische, cDNA- oder eine Bibliothek aus kombinatorischer Chemie aus solchen anderen Organismen hergestellt und auf DNA gescreent werden, die mit den vorstehend beschriebenen Sonden hybridisiert, und welche ein Polypeptid mit Phytaseaktivität kodiert. Genomische und andere DNA aus solchen anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamid-Geleelektrophorese oder anderen Trenntechniken getrennt werden. DNA aus den Bibliotheken oder die aufgetrennte DNA kann auf Nitrozellulose oder ein geeignetes anderes Trägermaterial transferiert und immobilisiert werden. Um einen Klon oder DNA zu identifizieren, welche/welcher homolog mit SEQ ID NO: 1 ist, wird das Trägermaterial in einem Southern-Blot verwendet, in welchem das Trägermaterial schließlich 3 Mal jeweils 30 Minuten lang unter Verwendung von 2 × SSC, 0,2% SDS gewaschen wird, bei bevorzugt nicht mehr als 50°C, weiter bevorzugt nicht mehr als 55°C, noch weiter bevorzugt nicht mehr als 60°C, und am meisten bevorzugt nicht mehr als 65°C. Moleküle, mit denen die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die isolierten erfindungsgemäßen Polypeptide durch Nukleinsäuresequenzen kodiert, welche die Fähigkeit besitzen, unter Bedingungen mittlerer Stringenz mit einer Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, welche unter denselben Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang und allelischen Formen und Fragmenten davon hybridisiert. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden die isolierten erfindungsgemäßen Polypeptide durch Nukleinsäuresequenzen kodiert, die die Fähigkeit besitzen, unter Bedingungen hoher Stringenz mit einer Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, welche unter denselben Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang und allelischen Formen und Fragmenten davon hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide mit immunochemischer Identität oder teilweiser immunochemischer Identität zu dem Polypeptid, das nativ bezüglich Thermomyces lanu ginosus CBS 586.94 ist. In dieser Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Polypeptid verwendet, um Antikörper herzustellen, die immunreaktiv gegenüber Epitopen sind oder an Epitope des Polypeptids binden. Ein Polypeptid mit immunochemischer Identität zum Polypeptid, das nativ bezüglich Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 ist, bedeutet, dass ein Antiserum, das Antikörper gegen das Polypeptid enthält, welches nativ bezüglich Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 ist, mit dem anderen Polypeptid in einer identischen Weise reagiert, wie eine gesamte Fusion von Präzipitaten, identischer Morphologie eines Präzipitats, und/oder identischer elektrophoretischer Mobilität unter Verwendung einer speziellen immunchemischen Technik. Eine weitere Erklärung von immunochemischer Identität wird beschrieben durch Axelsen, Bock, und Krøll, in N. H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 10. Teilweise immunochemische Identität bedeutet, dass ein Antiserum, das Antikörper gegen das Polypeptid enthält, das nativ bezüglich Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 ist, mit dem anderen Polypeptid in einer teilweise identischen Weise reagiert, wie eine teilweise Fusion von Präzipitaten, teilweise identischer Morphologie eines Präzipitats, und/oder teilweiser identischer elektrophoretischer Mobilität unter Verwendung einer speziellen immunochemischen Technik. Eine weitere Erklärung von teilweiser immunochemischer Identität wird beschrieben durch Bock und Axelsen, in N. H. Axelsen, J. Krøll, und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 11. Die immunochemischen Eigenschaften werden durch immunologische Kreuzreaktions-Identitätstests durch das gut bekannte Ouchterlony-Doppel-Immundiffusionsverfahren bestimmt. Genauer wird ein Antiserum gegen das erfindungsgemäße Polypeptid durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagetieren) erzeugt, gemäß des Verfahrens beschrieben in Harboe und Ingild, in N. H. Axelsen, J. Krøll, und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer Seiten 27–31).
Polypeptide, welche durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, welche die Fähigkeit besitzen, mit einer Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, die mit der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang und allelischen Formen und Fragmenten davon hybridisiert, die homologen Polypeptide, und Polypeptide mit identischen oder teilweise identischen immunologischen Eigenschaften können aus Mikroorganismen einer beliebigen Gattung erhalten werden. Bevorzugt werden sie aus einer bakteriellen Quelle erhalten. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Polypeptide aus einer Pilzquelle erhalten. Quellen für solche Polypeptide sind Stämme der Gattung Thermomyces und Arten davon, die in öffentlichen Hinterlegungsstellen erhältlich sind. Weiterhin können solche Polypeptide aus anderen Quellen identifiziert und erhalten werden, einschließlich Mikroorganismen, die in der Natur (z. B. Erde, Kompost, Wasser, etc.) unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonden isoliert werden. Techniken zum Isolieren von Mikroorganismen aus natürlichen Lebensräumen sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann dann erhalten werden durch ähnliches Screenen einer cDNA-Bibliothek eines anderen Mikroorganismus, insbesondere ein Pilz, wie ein Stamm eines Aspergillus sp., insbesondere ein Stamm von Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae, ein Stamm von Trichoderma sp., insbesondere ein Stamm von Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride, oder ein Stamm von Fusarium sp., insbesondere ein Stamm von Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sulphureum, oder Fusarium venenatum, oder ein Stamm von einer Humicola sp., oder ein Stamm einer Aureobasidium sp., einer Cryptococcus sp., einer Filibasidium sp., einer Magnaporthe sp., einer Myceliophthora sp., einer Neocallimastix sp., einer Paecilomyces sp., einer Piromyces sp., einer Talaromyces sp., einer Thermoascus sp., einer Thielavia sp., oder einer Schizophyllum sp. Sobald eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, mit der Sonde/den Sonden nachgewiesen wurde, kann die Sequenz isoliert oder kloniert werden durch Verwendung von Techniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, supra).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise aus Arten von Thermomyces erhalten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Thermomyces ibadanensis, Thermomyces lanuginosus, Thermomyces stellatus, und Thermomyces verrucosus. Stämme dieser Arten sind der Öffentlichkeit in einer Anzahl von Kultursammlungen leicht zugänglich, wie der American Type Culture Collection (ATCC), der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), und der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Polypeptid aus Thermomyces lanuginosus, und am meisten bevorzugt aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 oder einem mutierten Stamm davon erhalten, z. B. das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann weiterhin aus anderen Pilzen erhalten werden, die Synonyme von Thermomyces sind, wie beschrieben durch S. C. Jong, J. M. Birmingham, und G. Ma in ATCC Names of Industrial Fungi, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 1994 oder M. B. Ellis in Dematiaceous Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Institute, Surrey, England, 1971. Zum Beispiel schließen Synonyme von Thermomyces lanuginosus Acremoniella thennophila, Humicola lanuginosa, Monotospora lanuginosa, und Sepedonium lanuginosum ein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Phytasen, die aus Pilzen erhalten werden, die Teleomorphe von Thermomyces sind. Die Gattung Thermomyces ist ein in Erde vorkommendes Mitglied der Gruppe der dematiaceenartigen Hyphomyceten-Pilze. Die Kolonien sind ausgebreitet, flaumig oder samtig, und grau, grünlichgrau, gelbbraun, dunkelschwärzlichbraun, oder schwarz. Myzelien sind teilweise oberflächlich, teilweise versunken. Konidiophoren sind mikronematös oder semi-makronematös, mononematös, unverzweigt oder unregelmäßig verzweigt, gerade oder gekrümmt, farblos oder braun und glatt. Konidiogene Zellen sind monoblastisch, integriert und terminal oder diskret, bestimmt, zylindrisch oder lageniform. Konidien sind solitär, trocken, acrogen, einfach, sphärisch bis subsphärisch oder eckig und lappig, blass bis dunkelschwärzlichbraun, glatt oder warzig, und O-septiert. Kein phialidisches Stadium ist bekannt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "erhalten aus" wie hierin verwendet in Verbindung mit einer bestimmten Quelle bedeuten, dass das Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle, in die ein Gen aus der Quelle insertiert wurde, hergestellt wird.
Wie hierin definiert ist ein "isoliertes" Polypeptid ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen nicht-Phytase-Polypeptiden ist, z. B. mindestens etwa 20% rein, bevorzugt mindestens etwa 40% rein, weiter bevorzugt etwa 60% rein, noch weiter bevorzugt etwa 80% rein, am meisten bevorzugt etwa 90% rein, und noch am meisten bevorzugt etwa 95% rein ist, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dadurch charakterisiert, dass sie eine hohe Aktivität bei hohen Temperaturen haben. Noch genauer haben diese Polypeptide maximale Phytaseaktivität nahe 65°C und teilweise Aktivität sogar bei 75°C. Im Gegensatz dazu ist Phytase aus Aspergillus niger bei 65°C im Wesentlichen inaktiv.
Nukleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid erhalten aus Thermomyces, z. B. Thermomyces lanuginosus, und in einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz erhalten aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94, z. B. die Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Sequenz, die im Plasmid pMWR46 enthalten ist, welches in Escherichia coli NRRL B-21527 enthalten ist. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, welche ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 kodieren, die sich von SEQ ID NO: 1 auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Untersequenzen von SEQ ID NO: 1, die ein Fragment von SEQ ID NO: 2 kodieren, welches Phytaseaktivität beibehält. Vorzugsweise enthält eine Untersequenz mindestens 1200 Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 1275 Nukleotide, und am meisten bevorzugt mindestens 1425 Nukleotide.
Wie vorstehend beschrieben können die Nukleinsäuresequenzen aus Mikroorganismen erhalten werden, die Synonyme oder Teleomorphe von Thermomyces sind, wie definiert durch M. B. Ellis, 1971, supra, oder Jong et al., 1994, supra.
Die Techniken, die verwendet werden, um eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, zu isolieren oder zu klonieren, sind im Stand der Technik bekannt und schließen Isolierung aus genomischer DNA, Zubereitung aus cDNA oder eine Kombination davon ein.
Das Klonieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aus solcher genomischer DNA kann z. B. durch Verwendung der gut bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Antikörperscreening von Expressionsbibliotheken ausgeführt werden, um klonierte DNA-Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen nachzuweisen. Siehe z. B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Andere Nukleinsäure-Vervielfältigungsverfahren wie Ligasekettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und nukleinsäurebasierte Vervielfältigung (NASBA) können verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann aus einem Stamm von Thermomyces kloniert werden, der das Polypeptid herstellt oder aus einem anderen oder verwandten Organismus, und kann somit z. B. eine allelische oder Art-Variante der das Polypeptid kodierenden Region der Nukleinsäuresequenz sein.
Der Begriff "isolierte" Nukleinsäuresequenz wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuresequenzen ist, z. B. mindestens etwa 20% rein, bevorzugt etwa 40% rein, weiter bevorzugt etwa 60% rein, noch weiter bevorzugt etwa 80% rein, am meisten bevorzugt etwa 90% rein, und sogar noch weiter bevorzugt etwa 95% rein, wie durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Zum Beispiel kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz durch Standard-Klonierungsverfahren, die in der Gentechnik verwendet werden, erhalten werden, um die Nukleinsäuresequenz von ihrem natürlichen Ort an eine andere Stelle zu übertragen, wo sie reproduziert wird. Die Klonierungsverfahren können das Ausschneiden und Isolieren eines gewünschten Nukleinsäurefragments, das die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, umfasst, eine Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und ein Einbringen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle beinhalten, wo vielfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden. Die Nukleinsäuresequenz kann aus genomischem, cDNA, RNA, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, oder einer beliebigen Kombination davon sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz besitzen, welche einen Grad an Identität zur Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 von mindestens etwa 60%, bevorzugt mindestens etwa 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 80%, noch weiter bevorzugt mindestens etwa 90%, am meisten bevorzugt mindestens etwa 95%, und sogar noch weiter bevorzugt mindestens etwa 97% hat, welche ein aktives Polypeptid kodiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Grad an Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151–153) mit einer Identitätstabelle, einer Gap-Penalty von 10, und einer Gap-Length-Penalty von 10 bestimmt.
Eine Modifikation der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, kann zur Synthese von Polypeptiden nötig sein, die im Wesentlichen bezüglich des Polypeptids ähnlich sind. Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich" bezüglich des Polypeptids bezieht sich auf nicht natürlicherweise vorkommende Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich in irgendeiner manipulierten Weise vom Polypeptid, das aus seiner nativen Quelle isoliert wird, unterscheiden. Zum Beispiel kann es von Interesse sein, Varianten des Polypeptids unter Verwendung von z. B. orts gerichteter Mutagenese zu synthetisieren, wobei sich die Varianten in spezifischer Aktivität, Thermostabilität, pH-Optimum, oder ähnlichem unterscheiden. Die analoge Sequenz kann auf der Basis der Nukleinsäuresequenz geschaffen werden, die als der das Polypeptid kodierende Teil von SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, z. B. einer Untersequenz davon, und/oder durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, welche zu keiner anderen Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch die Nukleinsäuresequenz kodiert wird, führen, aber das der Codon-Verwendung des Wirtsorganismus, der zur Herstellung des Enzyms beabsichtigt ist, entspricht, oder durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, welche zu einer verschiedenen Aminosäuresequenz führen können. Für eine allgemeine Beschreibung von Nukleotidsubstitutionen siehe z. B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purifcation 2: 95–107.
Es wird dem Fachmann offensichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen gemacht werden können, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, und immer noch ein aktives Polypeptid zum Ergebnis haben. Aminosäurereste, die wesentlich für die Aktivität des Polypeptids sind, das von der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, und deswegen vorzugsweise nicht einer Substitution unterzogen werden, können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren identifiziert werden, wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning Mutagenese (siehe z. B. Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081–1085). In der letzteren Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest im Molekül eingeführt und die sich ergebenden mutierten Moleküle werden auf Phytaseaktivität getestet, um Aminosäurereste zu identitizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch die Analyse von 3-dimensionalen Strukturen, wie durch solche Techniken wie Kernspinresonanzanalyse, Kristallographie, oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt werden (siehe z. B. de Vos et al., 1992, Science 255, 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver et al., 1992, FERS Letters 309, 59–64).
Erfindungsgemäße Polypeptide schließen auch fusionierte Polypeptide oder spaltbare Fusionspolypeptide ein, in denen ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids oder einem Fragment davon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch Fusionieren einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon), die ein anderes Polypeptid kodiert, an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (oder einen Teil davon), hergestellt. Techniken zum Herstellen von Fusionspolypeptiden sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein Ligieren der kodierenden Sequenzen, die Polypeptide kodieren, ein, so dass sie im Leserahmen sind, und so dass die Expression des fusionierten Polypeptids unter Kontrolle desselben Promotors/derselben Promotoren und Terminators ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Polypeptide mit 3,6-Phytaseaktivität, kodiert durch Nukleinsäuresequenzen, die die Fähigkeit besitzen, unter Bedingungen mittlerer Stringenz mit einer Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, welche unter denselben Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang hybridisiert (Sambrook et al., 1989, supra). Eine Hybridisierung zeigt an, dass die analoge Nukleinsäuresequenz unter Standardbedingungen an die Oligonukleotidsonde hybridisiert, die dem das Polypeptid kodierenden Teil der Nukleinsäuresequenz entspricht, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird.
Wie vorstehen offenbart kann die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäure-Teilsequenz davon verwendet werden, um eine Oligonukleotidsonde zu entwerfen, oder eine Nukleinsäure, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, wie die Nukleinsäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder eine Untersequenz davon können auch als Sonde verwendet werden, um homologe Gene aus einer beliebigen Gattung oder Art zu isolieren.
Nukleinsäurekonstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäurekonstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, funktionsfähig verbunden mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen, welche die Fähigkeit besitzen, die Expression der kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen zu steuern, die mit den Kontrollsequenzen verträglich sind.
"Nukleinsäurekonstrukt" wird hierin definiert als ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, welches aus einem natürlicherweise vorkommenden Gen isoliert wird, oder das modifiziert wurde, um Segmente von Nukleinsäure zu enthalten, die in einer Weise kombiniert und nebeneinander gestellt sind, die anderweitig nicht in der Natur vorkommen würden. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt kann synonym zum Begriff Expressionskassette sein, wenn das Nukleinsäurekonstrukt alle Kontrollsequenzen enthält, die zur Expression einer erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz nötig sind. Der Begriff" kodierende Sequenz" wie hierin verwendet ist eine Sequenz, die in mRNA transkribiert wird, und in ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle der vorstehend erwähnten Kontrollse quenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz sind allgemein durch ein Translation-Startcodon ATG am 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen einschließen, ist aber nicht beschränkt darauf
Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, kann auf eine Vielzahl von Weisen manipuliert werden, um die Expression des Polypeptids zu gewährleisten. Eine Manipulation der Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, vor ihrer Insertion in einen Vektor kann abhängig vom Expressionsvektor wünschenswert oder notwendig sein. Techniken zum Modifizieren von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Klonierungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" wird hierin definiert, alle Bestandteile einzuschließen, die nötig oder vorteilhaft für die Expression der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz sind. Jede Kontrollsequenz kann nativ oder fremd zur Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, sein. Solche Kontrollsequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, eine Leader-Sequenz, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, ein Promotor, eine Signalsequenz, und ein Transkriptionsterminator. Als Minimum schließen die Kontrollsequenzen einen Promotor und Stopp-Signale für die Transkription und Translation ein. Die Kontrollsequenzen können mit Linkern zum Zwecke des Einführens spezifischer Restriktionsstellen versehen werden, die eine Ligation der Kontrollsequenzen mit der kodierenden Region der Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, erleichtern.
Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz sein, eine Nukleinsäuresequenz, die von einer Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird. Die Promotorsequenz enthält Kontrollsequenzen für die Transkription, die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz sein, welche Transkriptionsaktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt, einschließlich mutierter, trunkierter und Hybrid-Promotoren, und kann aus jenen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide kodieren, die entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle sind.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Steuern der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, besonders in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren erhalten aus dem E. coli lac Operon, dem Agarase-Gen aus Streptomyces coelicolor (dagA), dem Levansuc rase-Gen aus Bacillus subtilis (sacB), dem Alpha-Amylase-Gen aus Bacillus licheniformis (amyL), dem Gen der maltogene Amylase aus Bacillus stearothermophilus (amyM), dem Alpha-Amylase-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), dem Penicillinase-Gen aus Bacillus licheniformis (penP), den xylA- und xylB-Genen aus Bacillus subtilis und dem prokaryotische Beta-Lactamase-Gen (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731), sowie dem tac-promoter (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21–25). Weitere Promotoren werden beschrieben in "Useful Proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; und in Sambrook et al., 1989, supra.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Steuern der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung in einer filamentösen Pilzwirtszelle sind Promotoren erhalten aus den Genen, die TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, Aspartatproteinase aus Rhizomucor miehei, neutrale Alpha-Amylase aus Aspergillus niger, säurestabile Alpha-Amylase aus Aspergillus niger, Glucoamylase aus Aspergillus niger oder Aspergillus awamori (glaA), Lipase aus Rhizomucor miehei, alkalische Protease aus Aspergillus oryzae, Triosephosphat-Isomerase aus Aspergillus oryzae, Acetamidase aus Aspergillus nidulans, trypsinartige Protease aus Fusarium oxysporum (wie in US-Patent Nr. 4,288,627 beschrieben, welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird), und mutierte, trunkierte und Hybrid-Promotoren davon, kodieren. Besonders bevorzugte Promotoren zur Verwendung in filamentösen Pilzwirtszellen sind die TAKA-Amylase, NA2-tpi (ein Hybrid der Promotoren aus den Genen, die neutrale a-Amylase aus Aspergillus niger und Triosephosphat-Isomerase aus Aspergillus oryzae kodieren), und glaA-Promotoren.
In einem Hefewirt werden verwendbare Promotoren erhalten aus dem Enolasegen (ENO-1) aus Saccharomyces cerevisiae, dem Galactokinasegen aus Saccharomyces cerevisiae (GAL1), den Genen für die Alkoholdehydrogenase/Glycerinaldehyde-3-Phosphate-dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP), und dem 3-Phosphoglyceratkinasegen aus Saccharomyces cerevisiae. Andere verwendbare Promotoren für Hefewirtszellen werden durch Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423–488 beschrieben. In einer Säugerwirtszelle schließen verwendbare Promotoren virale Promotoren wie die aus Simian-Virus 40 (SV40), aus Rous-Sarcoma-Virus (RSV), aus Adenovirus, und bovinem Papillomavirus (BPV) ein.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptions-Terminatorsequenz sein, eine Sequenz, die von einer Wirtszelle erkannt wird, um Transkription zu terminieren. Die Terminatorsequenz wird funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, verbunden. Jeder Terminator, der in der gewählten Wirtszelle funktionsfähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Terminatoren für filamentöse Pilzwirtszellen werden aus den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, die Glucoamylase aus Aspergillus niger, die Anthranilatsynthase aus Aspergillus nidulans, die Alpha-Glucosidase aus Aspergillus niger, und die trypsinartige Protease aus Fusarium oxysporum kodieren.
Bevorzugte Terminatoren für Hefewirtszellen werden aus den Genen erhalten, die die Enolase aus Saccharomyces cerevisiae, Cytochrom-C aus Saccharomyces cerevisiae (CYC1), oder Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae kodieren. Andere verwendbare Terminatoren für Hefewirtszellen werden in Romanos et al., 1992, supra beschrieben. Terminatoresequenzen für Säugerwirtszellen sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leader-Sequenz sein, eine nicht-translatierte Region einer mRNA, die für die Translation durch die Wirtszelle wichtig ist. Die Leader-Sequenz wird funktionsfähig mit dem 5'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, verbunden. Eine beliebige Leader-Sequenz, die in der gewählten Wirtszelle funktionsfähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Leader für filamentöse Pilzwirtszellen werden aus den Genen erhalten, die TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae und Triosephosphat-Isomerase aus Aspergillus oryzae kodieren.
Geeignete Leader für Hefewirtszellen werden erhalten aus dem Enolasegen aus Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), dem 3-Phosphoglyceratkinasegen aus Saccharomyces cerevisiae, dem Alpha-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae, und den Alkoholdehydrogenase/Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenasegenen (ADH2/GAP) aus Saccharomyces cerevisiae.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Polyadenylierungssequenz sein, eine Sequenz, die mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist und die, wenn sie transkribiert wird, von der Wirtszelle als Signal erkannt wird, Polyadenosinreste an die transkribierte mRNA anzuzufügen. Eine beliebige Polyadenylierungssequenz, die in der gewählten Wirtszelle funktionsfähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für filamentöse Pilzwirtszellen werden aus den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase aus Aspergillus oryzae, die Glucoamylase aus Aspergillus niger, die Anthranilatsynthase aus Aspergillus nidulans und die Alpha-Glucosidase aus Aspergillus niger kodieren.
Verwendbare Polyadenylierungssequenzen für Hefewirtszellen werden durch Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983–5990 beschrieben. Polyadenylierungssequenzen sind im Stand der Technik für Säugerwirtszellen gut bekannt.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Signalpeptid-kodierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Aminoterminus des Polypeptids verbunden ist, welche das exprimierte Polypeptid in die Sekretionswege der Zelle steuern kann. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann inhärent eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, die natürlicherweise im Translationsleserahmen mit dem Segment der kodierenden Region verbunden ist, die das sekretierte Polypeptid kodiert. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, die fremd zu dem Teil der kodierenden Sequenz ist, die das sekretierte Polypeptid kodiert. Die fremde Signalpeptid-kodierende Region kann nötig sein, wo die kodierende Sequenz normalerweise keine Signalpeptid-kodierende Region enthält. Alternativ kann die fremde Signalpeptid-kodierende Region einfach die natürliche Signalpeptid-kodierende Region ersetzen, um eine erhöhte Sekretion der Phytase bezüglich zur natürlichen Signalpeptid-kodierenden Region, die normalerweise mit der kodierenden Sequenz verbunden ist, zu erhalten. Die Signalpeptid-kodierende Region kann erhalten werden aus einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen aus einer Aspergillus-Art, einem Lipase- oder Proteinase-Gen aus einer Rhizomucor-Art, dem Gen für den Alpha-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae, einem Amylase- oder einem Protease-Gen aus einer Bacillus-Art, oder dem Prorennin-Gen aus Kälbern (Preprochymosin-Gen). Jedoch kann eine beliebige Signalpeptid-kodierende Region, die die Fähigkeit besitzt, die exprimierte Phytase in den Sekretionsweg einer gewählten Wirtszelle zu steuern, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine wirksame Signalpeptid-kodierende Region für bakterielle Wirtszellen ist die Signalpeptidkodierende Region erhalten aus dem Gen der maltogenen Amylase aus Bacillus NCIB 11837, dem Alpha-Amylase-Gen aus Bacillus stearothermophilus, dem Subtilisin-Gen aus Bacillus licheniformis, dem Beta-Lactamase-Gen aus Bacillus licheniformis, den Genen für neutrale Proteasen (nprT, nprS, nprM) aus Bacillus stearothermophilus und das PrsA-Gen aus Bacillus subtilis. Weitere Signalpeptide werden durch Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109–137 beschrieben.
Eine wirksame Signalpeptid-kodierende Region für filamentöse Pilz-Wirtszellen ist die Signalpeptid- kodierende Region erhalten aus dem TAKA-Amylasegen aus Aspergillus oryzae, dem Gen der neutralen Amylase aus Aspergillus niger, dem Aspartat-Proteinase-Gen aus Rhizomucor miehei, dem Cellulase-Gen aus Humicola lanuginosa oder dem Lipase-Gen aus Rhizomucor miehei.
Nützliche Signalpeptide für Hefewirtszellen werden aus den Genen für den a-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae und Invertase aus Saccharomyces cerevisiae erhalten. Andere nützliche Signalpeptid-kodierenden Regionen werden durch Romanos et al., 1992, supra beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Propeptid-kodierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids gelegen ist. Das sich ergebende Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid bekannt (oder in manchen Fällen als ein Zymogen). Ein Propolypeptid ist allgemein inaktiv und kann zum reifen, aktiven Polypeptid durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids vom Propolypeptid überführt werden. Die Propeptid-kodierende Region kann aus dem Gen der alkalischen Protease (aprE) aus Bacillus subtilis, dem neutralen Protease-Gen (nprT) aus Bacillus subtilis, dem Alpha-Faktor-Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder dem Laccase-Gen aus Myceliophthora thermophila ( WO 95/33836 ) erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte können auch eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen umfassen, die einen oder mehrere Faktoren kodieren, die vorteilhaft für die Expression des Polypeptids sind, z. B. ein Aktivator (z. B. ein trans-aktivierender Faktor), ein Chaperon, und eine prozessierende Protease. Ein beliebiger Faktor, der in der gewählten Wirtszelle funktionsfähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nukleinsäuren, die einen oder mehrere dieser Faktoren kodieren, sind nicht notwendigerweise hintereinander zur Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, angeordnet.
Ein Aktivator ist ein Protein, das die Transkription einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, aktiviert (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9: 1355–1364; Jarai und Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238–244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271–297). Die Nukleinsäuresequenz, die einen Aktivator kodiert, kann aus den Genen erhalten werden, die NprA (nprA) aus Bacillus stearothermophilus, Häm-Aktivatorprotein-1 (hap1) aus Saccharomyces cerevisiae, das Galactose metabolisierende Protein 4 (gal4) aus Saccharomyces cerevisiae und Ammoniak-Regulationsprotein (areA) aus Aspergillus nidulans kodieren. Für weitere Beispiele siehe Verdier, 1990, supra und MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295–2307.
Ein Chaperon ist ein Protein, das einem anderen Polypeptid beim korrekten Falten hilft (Hart1 et al., 1994, TIBS 19: 20–25; Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124–128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179–189; Craig, 1993, Science 260: 1902–1903; Gething und Sambrook, 1992, Nature 355: 33–45; Puig und Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764–7771; Wang und Tsou, 1993, The FASER Journal 7: 1515–11157; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1: 381–384). Die Nukleinsäuresequenz, die ein Chaperon kodiert, kann aus den Genen erhalten werden, die GroE-Proteine aus Bacillus subtilis, Proteindisulfid-Isomerase aus Aspergillus oryzae, Calnexin aus Saccharomyces cerevisiae, BiP/GRP78 aus Saccharomyces cerevisiae und Hsp70 aus Saccharomyces cerevisiae kodieren. Für weitere Beispiele siehe Gething und Sambrook, 1992, supra, und Hart1 et al., 1994, supra.
Eine prozessierende Protease ist eine Protease, die ein Propeptid spaltet, um ein reifes biochemisch aktives Polypeptid hervorzubringen (Enderlin und Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67–79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434–1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075–1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839–852). Die Nukleinsäuresequenz, die eine prozessierende Protease kodiert, kann aus den Genen erhalten werden, die Dipeptidylaminopeptidase aus Saccharomyces cerevisiae, Kex2 aus Saccharomyces cerevisiae und dibasische prozessierende Endoprotease (xpro) aus Yarrowia lipolytica kodieren.
Es kann auch wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die eine Regulation der Expression des Polypeptids bezüglich des Wachstums der Wirtszelle erlauben. Beispiele für regulatorische Systeme sind solche, die zur Folge haben, dass die Expression des Gens in Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus an- oder abgestellt wird, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen würden die lac-, tac- und trp-Operatorsysteme einschließen. In Hefe kann das ADH2- System oder das GALT-System verwendet werden. In filamentösen Pilzen können der TAKA-Alpha-Amylasepromotor, der Glucoamylasepromotor aus Aspergillus niger, und der Glucoamylasepromotor aus Aspergillus oryzae als regulatorische Sequenzen verwendet werden. Andere Beispiele für regulatorische Sequenzen sind solche, die eine Genamplifikation erlauben. In eukaryotischen Systemen schließen diese das Dihydrofolat-Reductase-Gen ein, welches in Gegenwart von Methrotrexat amplifiziert wird, und Metallothionein-Gene, die mit Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen wäre die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, funktionsfähig mit der regulatorischen Sequenz verbunden.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, einen Promotor und Stoppsignale der Transkription und Translation umfassen. Die vorstehend beschriebenen verschiedenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen können zusammen verbunden werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, welcher ein oder mehrere geeignete Restriktionsschnittstellen einschließen kann, um eine Insertion oder Substitution der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, an solchen Stellen zu erlauben. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung durch Insertieren der Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäurekonstrukts, das die Sequenz umfasst, in einen geeigneten Vektor zur Expression, exprimiert werden. Beim Erschaffen des Expressionsvektors ist die kodierende Sequenz so im Vektor lokalisiert, dass die kodierende Sequenz funktionsfähig mit den geeigneten Kontrollsequenzen für die Expression und möglicherweise Sekretion verbunden ist.
Der rekombinante Expressionsvektor kann ein beliebiger Vektor (z. B. ein Plasmid oder Virus) sein, der zweckmäßigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann und die Expression der Nukleinsäuresequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors wird typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle abhängen, in die der Vektor eingeführt werden soll. Die Vektoren können lineare oder geschlossen zirkuläre Plasmide sein. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von chromosomaler Replikation ist, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor kann ein beliebiges Mittel zum Sicherstellen seiner Selbstreplikation enthalten. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom integ riert wird und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in die er integriert wurde, repliziert wird. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide sein, die zusammen die gesamte DNA enthalten, die in das Genom der Wirtszelle eingeführt werden soll, oder ein Transposon sein.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt einen oder mehrere Selektionsmarker, die eine leichte Selektion der transformierten Zellen erlauben. Ein Selektionsmarker ist ein Gen, dessen Produkt biozide oder virale Resistenz, oder Resistenz gegenüber Schwermetallen, eine Prototrophie für Auxotrophe und Ähnliches bereitstellt. Beispiele für bakterielle Selektionsmarker sind die dal-Gene aus Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, die Resistenz gegenüber Antibiotika wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz verleihen. Ein häufig verwendeter Säugermarker ist das Dihydrofolat-Reduktase-Gen. Geeignete Marker für Hefewirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 und URA3. Ein Selektionsmarker zur Verwendung in einer filamentösen Pilzwirtszelle kann ausgewählt werden aus der Gruppe einschließlich, aber nicht beschränkt auf: amdS (Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreductase), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), sC (Sulfat-Adenyltransferase), trpC (Anthranilatsynthase) und Glufosinat-Resistenzmarker sowie Äquivalente aus anderen Arten. Bevorzugt für die Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die amdS- und pyrG-Gene aus Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus. Weiterhin kann eine Selektion durch Co-Transformation erreicht werden, z. B. wie in WO 91/17243 beschrieben, wo der Selektionsmarker auf einem separaten Vektor ist.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt (ein) Element(e), das/die eine stabile Integration des Vektors in das Genom der Wirtszelle oder autonome Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig vom Genom der Zelle erlaubt/erlauben.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in das Wirtszellgenom integriert werden, wenn sie in eine Wirtszelle eingeführt werden. Für die Integration kann der Vektor auf die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid kodiert, oder auf ein beliebiges anderes Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nichthomologe Rekombination angewiesen sein. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zum Steuern der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen es dem Vektor, in das Wirtszellgenom an (eifern) genauen Ort/Orten in das Chromosom/die Chromosomen integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration an einer genauen Stelle zu erhöhen, sollten die Elemente für die Integration bevorzugt eine ausreichende Zahl an Nukleinsäuren enthalten, wie 100 bis 1.500 Basenpaare, bevorzugt 400 bis 1.500 Basenpaare, und am meisten bevorzugt 800 bis 1.500 Basenpaare, welche hoch homolog zur entsprechenden Zielsequenz sind, um die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination zu erhöhen. Die Elemente für die Integration können eine beliebige Sequenz sein, die homolog zur Zielsequenz im Genom der Wirtszelle ist. Weiterhin können die Elemente für die Integration nichtkodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen sein. Auf der anderen Seite kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch nichthomologe Rekombination integriert werden. Diese Nukleinsäuresequenzen können eine beliebige Sequenz sein, die homolog zur Zielsequenz im Genom der Wirtszelle ist, und können weiterhin nichtkodierende oder kodierende Sequenzen sein.
Für eine autonome Replikation kann der Vektor weiterhin einen Replikationsursprung umfassen, der es dem Vektor ermöglicht, autonom in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für bakterielle Replikationsursprünge sind die Replikationsursprünge der Plasmide pBR322, pUC 19, pACYC 177 und pACYC 184, die eine Replikation in E. coli erlauben, und pUB 110, pE 194, pTA1060 und pAMβ1, die eine Replikation in Bacillus erlauben. Beispiele für Replikationsursprünge zur Verwendung in einer Hefewirtszelle sind der 2-Mikron-Replikationsursprung, ARS1, ARS4, die Kombination von ARS1 und CEN3 und die Kombination von ARS4 und CEN6. Der Replikationsursprung kann einer mit einer Mutation sein, welche seine Funktion in der Wirtszelle temperatursensitiv macht (siehe z. B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Mehr als eine Kopie einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann in die Wirtszelle insertiert werden, um eine Expression der Nukleinsäuresequenz zu vervielfachen. Eine stabile Vervielfachung der Nukleinsäuresequenz kann durch Integrieren von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellgenom unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren und Selektieren auf Transformanten erhalten werden.
Die Verfahren, die verwendet werden, um die vorstehend beschriebenen Elemente zu ligieren, um die rekombinanten Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung herzustellen, sind einem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wirtszellen
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, welche vorteilhafterweise in der rekombinanten Herstellung der Polypeptide verwendet werden. Der Begriff „Wirtszelle" umfasst eine beliebige Nachkommenschaft einer Elternzelle, die nicht identisch zur Elternzelle ist, auf Grund von Mutationen, die während der Replikation auftreten.
Die Zelle wird vorzugsweise mit einem Vektor transformiert, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfasst, gefolgt durch die Integration des Vektors in das Wirtschromosom. „Transformation" bedeutet das Einführen eines Vektors umfassend eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in eine Wirtszelle, so dass der Vektor als ein chromosomaler Bestandteil oder als ein selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor beibehalten wird. Integration wird allgemein als ein Vorteil betrachtet, da es wahrscheinlicher ist, dass die Nukleinsäuresequenz stabil in der Zelle beibehalten wird. Integration des Vektors in das Wirtschromosom kann durch homologe oder nichthomologe Rekombination wie vorstehend beschrieben erfolgen.
Die Wahl einer Wirtszelle wird zu einem großen Ausmaß vom Gen, das das Polypeptid kodiert, und seiner Quelle abhängen. Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus sein, z. B. ein Prokaryot, oder ein nicht einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Eukaryot. Nützliche einzellige Zellen sind bakterielle Zellen, wie grampositive Bakterien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, eine Bacillus-Zelle, z. B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder einer Streptomyces-Zelle, z. B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien wie E. coli und Pseudomonas sp. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtzelle eine Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus stearothermophilus- oder Bacillus subtilis-Zelle. Die Transformation einer bakteriellen Wirtszelle kann z. B. durch Protoplastentransformation bewirkt werden (siehe z. B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111–115), durch Verwendung kompetenter Zel len (siehe z. B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823–829, oder Dubnau und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209–221), durch Elektroporation (siehe z. B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6: 742–751), oder durch Konjugation (siehe z. B. Koehler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771–5278).
Die Wirtszelle kann ein Eukaryot sein, wie eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, oder eine Pilzzelle. Verwendbare Säugerzellen schließen Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (chinese hamster ovary cells, CHO), HeLa-Zellen, Nierenzellen eines Babyhamsters (baby hamster kidney cells, BHK), COS-Zellen oder eine beliebige Anzahl anderer immortalisierter Zelllinien ein, die z. B. von der American Type Culture Collection erhältlich sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. „Pilze" wie hierin verwendet schließen die Phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert durch Hawksworth et al., in Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Ausg., 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) sowie die Oomycota (wie zitiert in Hawksworth et al., 1995, supra, Seite 171) und alle mitosporischen Pilze ein (Hawksworth et al., 1995, supra). Beispielhafte Gruppen von Ascomycota schließen z. B. ein: Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus) und die nachstehend aufgelisteten echten Hefen. Beispiele für Basidiomycota schließen Pilze, Rostpilze und Brande ein. Beispielhafte Gruppen von Chytridiomycota schließen z. B. Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces und Wasserpilze ein. Typische Gruppen von Oomycota schließen z. B. saprolegniomycetenartige Wasserpilze (Wasserschimmel) wie Achlya ein. Beispiele für mitosporische Pilze schließen Aspergillus, Penicillium, Candida und Alternaria ein. Beispielhafte Gruppen von Zygomycota schließen z. B. Rhizopus und Mucor ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzwirtszelle eine Hefezelle. „Hefe" wie hierin verwendet, schließt ascosporogene Hefe (Endomycetales), basidiosporogene Hefe, und Hefe, die zu den unvollkommenen Pilzen (Fungi Imperfecti, Blastomycetes, imperfekte Hefen) gehört. Die ascosporogenen Hefen werden in Familien der Spermophthoraceae und Saccharomycetaceae. Die Letztere beinhaltet vier Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae (z. B. Gattung Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae (z. B. die Gattungen Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces). Die basidiosporogenen Hefen schließen die Gattungen Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella ein. Hefen, die zu den Fungi imperfecti gehören, werden in zwei Familien eingeteilt, Sporobolomyceta ceae (z. B. die Gattungen Sorobolomyces und Bullera) und Cryptococcaceae (z. B. die Gattung Candida). Da die Klassifizierung von Hefe sich in der Zukunft ändern kann, soll Hefe zum Zwecke dieser Erfindung definiert werden wie beschrieben in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. und Davenport, R. R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). Die Biologie von Hefe und die Manipulation von Hefegenetik sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B. J. und Stopani, A. O. M., Hrsg., 2. Ausg., 1987; The Yeasts, Rose, A. H. und Harrison, J. S., Hrsg., 2. Ausg., 1987; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., Hrsg., 1981).
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Zelle einer Art von Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, oder Yarrowia.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Zelle von Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Kluyveromyces lactis-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Auführungsform ist die Hefewirtszelle eine Yarrowia lipolytica-Zelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzwirtszelle eine filamentöse Pilzzelle. "Filamentöse Pilze" schließen alle filamentösen Formen der Unterabteilung Eumycota und Oomycota (wie definiert durch Hawksworth et al., 1995, supra) ein. Die filamentösen Pilze sind charakterisiert durch eine Myzelwand, die aus Chitin, Zellulose, Glucan, Chitosan, Mannan, und anderen komplexen Polysacchariden besteht. Vegetatives Wachstum findet durch Elongation der Hyphen statt, und der Kohlenstoff-Katabolismus ist obligat aerob. Im Gegensatz dazu findet vegetatives Wachstum durch Hefen wie Saccharomyces cerevisiae durch Knospung aus einem einzelligen Thallus statt, und der Kohlenstoff-Katabolismus kann fermentativ sein. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Zelle einer Art von, aber nicht beschränkt auf, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, und Trichoderma.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Aspergillus-Zelle. In einer anderen weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirts zelle eine Acremonium-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Fusarium-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Humicola-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Mucor-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Myceliophthora-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Neurospora-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Penicillium-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Thielavia-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Tolypocladium-Zelle. In einer anderen noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Trichoderma-Zelle.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Aspergillus awamori-, Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus niger- oder Aspergillus oryzae-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium graminearum-, Fusarium oxysporum-, Fusarium sambucinum-, Fusarium sulphureum-, oder Fusarium venenatum-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Humicola insolens- oder Humicola lanuginosa-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Mucor miehei-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Myce/iophthora thermophilum-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Neurospora crassa-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Penicillium purpurogenum-Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Thielavia terrestris-Zelle. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Trichoderma-Zelle eine Trichoderma harzianum-, Trichoderma koningii-, Trichoderma longibrachiatum-, Trichoderma reesei- oder Trichoderma viride-Zelle.
Pilzzellen können transformiert werden durch ein Verfahren, das Protoplastenbildung, Transformation der Protoplasten, und Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Weise einschließt. Geeignete Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen werden beschrieben in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474. Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Fusarium-Arten wird beschrieben durch Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 oder in dem Mitglied der Patentfamilie U.S. Ser.-Nr. 08/269,449 . Hefe kann transformiert werden unter Verwendung der Verfahren beschrieben durch Becker and Guarente, in Abelson, J. N. und Simon, M. I., Herausgeber, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Band 194, S. 182–187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Säugerzellen können durch direkte Aufnahme unter Verwendung des Kalziumphosphat-Präzipitations-Verfahrens von Graham and Van der Eb (1978, Virology 52: 546) transformiert werden.
Herstellungsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfassend (a) Kultivieren eines Thermomyces-Stamms um einen Überstand herzustellen, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die der Expression des Polypeptids förderlich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
In beiden Verfahren werden die Zellen in einem Nährmedium kultiviert, das geeignet zur Herstellung des Polypeptids ist, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Z. B. kann die Zelle durch SchüttelKolben-Kultivierung, Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierlicher, Batch-, Fed-Batch- oder Festphasen-Fermentationen) in Labor- oder Industriefermentatoren, durchgeführt in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die es erlauben, dass das Polypeptid exprimiert und/oder isoliert wird, kultiviert werden. Das Kultivieren findet unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren in einem geeigneten Nährmedium statt, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst (siehe z. B. Referenzen für Bakterien und Hefe; Bennett, J. W. und LaSure, L., Herausgeber, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Geeignete Medien sind von kommerziellen Herstellern erhältlich, oder können gemäß veröffentlichter Zusammensetzungen zubereitet werden (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection). Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sekretiert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid nicht sekretiert wird, wird es aus Zelllysaten gewonnen.
Die Polypeptide können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren nachgewiesen werden, die spezifisch für die Polypeptide sind. Diese Nachweisverfahren können eine Verwendung von spezifischen Antikörpern, eine Bildung eines Enzymprodukts, oder ein Verschwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Z. B. kann ein Enzym-Assay verwendet werden, um die Aktivität des Polypeptids zu bestimmen. Verfahren zum Bestimmen von Phytaseaktivität sind im Stand der Technik bekannt und schließen z. B. den Assay des anorganischen Phosphats, das aus Phytinsäure freigesetzt wird, ein.
Das sich ergebende Polypeptid kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. z. B. kann das Polypeptid aus dem Nährmedium durch gebräuchliche Verfahren gewonnen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknen, Evaporation oder Fällen. Das gewonnene Polypeptid kann dann weiter durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren gereinigt werden, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnlichem.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahrensweisen gereinigt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch, Affinität, hydrophobische, Chromatofokussierung, und Größenausschluss), elektrophoretische Verfahren (z. B. präparative isoelektrische Fokussierung (IEF), unterschiedliche Löslichkeit (z. B. Ammoniumsulfatfällung) oder Extraktion (z. B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Herausgeber, VCH Publishers, New York, 1989).
Polypeptidzusammensetzungen
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptidzusammensetzungen, die mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid angereichert sind. Im vorliegenden Kontext soll der Begriff "angereichert" bedeuten, dass die 3,6-Phytaseaktivität der Polypeptidzusammensetzung erhöht wurde, z. B. mit einem Anreicherungsfaktor von 1,1, zweckmäßigerweise auf Grund einer Zufügung eines erfindungsgemäßen Polypeptids.
Die Polypeptidzusammensetzung kann eine sein, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid als hauptsächlichen enzymatischen Bestandteil enthält, z. B. eine einkomponentige Polypeptidzusammensetzung. Alternativ kann die Zusammensetzung mehrere enzymatische Aktivitäten umfassen, wie eine Aminopeptidase, eine Amylase, eine Carbohydrase, eine Carboxypeptidase, eine Katalase, eine Cellulase, eine Chitinase, eine Cutinase, eine Cyclodextrin-Glykosyltransferase, eine Desoxyribonuclease, eine Esterase, eine Alpha-Galaktosidase, eine Beta-Galaktosidase, eine Glukoamylase, eine Alpha-Glukosidase, eine Beta-Glukosidase, eine Haloperoxidase, eine Invertase, eine Laccase, eine Lipase, eine Mannosidase, eine Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, eine Peroxidase, eine Phytase, eine Polyphenoloxidase, ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease oder eine Xylanase. Das/die zusätzliche(n) Enzym(e) kann/können mit Hilfe eines Mikroorganismus herstellbar sein, der zur Gattung Aspergillus gehört, bevorzugt Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, oder Aspergillus oryzae, oder Trichoderma, Humicola, bevorzugt Humicola insolens, oder Fusarium, bevorzugt Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium granlinearum, Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sulphureum, oder Fusarium venenatum.
Die Polypeptidzusammensetzungen können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren zubereitet werden und können in Form einer Flüssigkeit oder einer trockenen Zusammensetzung sein. Das Polypeptid, das in der Zusammensetzung eingeschlossen sein soll, kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren stabilisiert werden.
Nachstehend werden Beispiele für bevorzugte Verwendungen der erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzungen angeführt. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzung und andere Bedingungen, unter denen die Zusammensetzung verwendet wird, können auf der Basis von im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Verwendungen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch allgemein die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids zum Katalysieren der Freisetzung von anorganischem Phosphat aus Phytat oder Phytinsäure.
Genauer können die Polypeptide in Nahrungsmitteln für Menschen oder Tierfutterzusammensetzungen oder als Zusatzstoffe für solche Zubereitungen verwendet werden, wobei die Phytase die Verdaulichkeit verbessert, Wachstum fördert und die Ausnutzung von Nahrungs- oder Futtermitteln oder ihre Umwandlungseffizienz verbessert.
Eine "Futtermittelzusammensetzung" und eine "Nahrungsmittelzusammensetzung" bedeuten jeweils eine beliebige natürliche oder künstliche Ernährung, Mahlzeit oder ähnliches oder Bestandteile solcher Mahlzeiten, von denen beabsichtigt ist oder die geeignet sind, gegessen zu werden, aufgenommen zu werden, verdaut zu werden, durch ein Tier beziehungsweise einen Menschen.
Ein "Nahrungsmittel- oder Futtermittelzusatzstoff" ist eine im Wesentlichen reine Verbindung oder eine Zusammensetzung mit mehreren Bestandteilen, von der beabsichtigt ist oder die geeignet ist, zu Nahrungs- oder Futtermittel zugefügt zu werden. Sie umfasst gewöhnlich eine oder mehrere Verbindungen, wie Vitamine, Mineralstoffe oder Futtermittel-verbessernde Enzyme und geeignete Träger und/oder Trägerstoffe, und wird gewöhnlich in einer Form bereitgestellt, die geeignet ist, zu Tierfuttermitteln hinzugefügt zu werden.
Die Erfindung betrifft auch Futter- und Nahrungsmittelzusammensetzungen und -zusatzstoffe, die hierfür ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfassen.
Eine wirksame Menge des Polypeptids in Futter- oder Nahrungsmitteln ist von etwa 10–20.000; bevorzugt von etwa 10 bis 15.000, weiter bevorzugt von etwa 10 bis 10.000, insbesondere von etwa 100 bis 5.000, besonders von etwa 100 bis etwa 2.000 U/kg Futter- oder Nahrungsmittel.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Verringern von Phytatspiegeln in Tierdung, umfassend das Füttern eines Tieres mit einem Futtermittel, das eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids umfasst.
Auch vom Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids während der Zubereitung von Nahrungs- oder Futtermittelzubereitungen oder -zusatzstoffen, d. h. das Polypeptid übt seine Phytaseaktivität nur während des Herstellungsprozesses aus, und ist nicht im endgültigen Nahrungs- oder Futtermittelprodukt aktiv. Dieser Aspekt ist z. B. zum Backen relevant.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Polypeptide in Verfahren zum Verflüssigen von Stärke, umfassend (a) Behandeln der Stärke mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 vor dem oder gleichzeitig zum Verflüssigen; (b) Zufügen einer α-Amylase zur Stärke; und (c) Umsetzen der Stärke von Schritt (b) für eine Zeit und bei einer Temperatur, die wirksam sind, um die Stärke zu verflüssigen. In diesem Verfahren katalysiert das Polypeptid die Hydrolyse von Phytat, welches mit der Stärke assoziiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgene Pflanzen und Pflanzenteile wie Pflanzensamen und Pflanzenzellen, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurden, die das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, um dieses Enzym zu exprimieren oder herzustellen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und Verwendungen solcher Pflanzen und Pflanzenteile, besonders als Futter- und Nahrungsmittel, oder Zusätze dafür.
Die transgenen Pflanzen können zweikeimblättrig oder einkeimblättrig sein, abgekürzt eine Dikotyledone oder eine Monokotyledone. Von hauptsächlichem Interesse sind solche Pflanzen, die potenzielle Nahrungs- oder Futtermittelbestandteile sind, und die Phytinsäure umfassen. Ein normaler Phytinsäurespiegel von Futtermittelbestandteilen ist 0,1–100 g/kg, oder üblicher 0,5–50 g/kg, am üblichsten 0,5–20 g/kg. Beispiele für monokotyledone Pflanzen sind Gräser, wie Rispengras (Blue Grass, Poa), Futtergräser wie Schwingel (Festuca), Lolch (Lolium), Straußgras, wie Agrostis, und Getreide, z. B. Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Reis, Hirse und Mais (Mais).
Beispiele für dikotyledone Pflanzen sind Hülsenfrüchte wie Lupinen, Erbse, Bohne und Sojabohne und Kreuzblütler (Familie Brassicaceae) wie Blumenkohl, Ölsamen-Raps und der nahe Verwandte Modellorganismus Arabidopsis thaliana.
Solche transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen besitzen die Fähigkeit, ihre eigene Phytinsäure abzubauen, und daher ist der Bedarf des Zusatzes solcher Enzyme zu Nahrungs- oder Futtermitteln, die solche Pflanzen umfassen, verringert. Vorzugsweise werden die Pflanzen und Pflanzenteile, z. B. die Samen, zerrieben oder gemahlen, und möglicherweise auch eingeweicht, bevor sie zum Nahrungs- oder Futtermittel zugefügt werden, oder vor der Verwendung, z. B. deren Aufnahme, im Hinblick auf eine Anpassung der Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus an die konkrete Verwendung.
Wenn gewünscht, kann das durch eine Pflanze hergestellte Polypeptid auch aus der Pflanze gewonnen werden. In bestimmten Fällen ist die Gewinnung aus der Pflanze im Hinblick auf das Sicherstellen einer hitzestabilen Formulierung in einem möglicherweise folgenden Pelletierungsverfahren bevorzugt.
Beispiele für Pflanzenteile sind Stängel, Kallus, Blätter, Wurzel, Früchte, Samen, Knollen, etc. Aber jedes beliebige Pflanzengewebe ist in dieser Definition eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Nachkommenschaft solcher Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen.
Ein Fachmann wird wissen, wie ein DNA-Expressionskonstrukt zur Insertion in die fragliche Pflanze hergestellt werden kann, wobei beachtet wird, ob das Enzym auf eine gewebespezifische Art ausgeschieden werden soll. Von Relevanz für diese Abschätzung ist die Stabilität (pH-Stabilität, Abbaubarkeit durch endogene Proteasen, etc.) der Phytase in den Expressionskompartimenten der Pflanze. Er wird auch die Fähigkeit besitzen, geeignete regulatorische Sequenzen auszuwählen, wie Promotor- und Terminatorsequenzen, und wenn nötig Signal- oder Transitsequenzen (Tague et al., 1988, Plant Phys. 86: 506).
Die Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen können mit diesem DNA-Konstrukt unter Verwendung jedes bekannten Verfahrens transformiert werden. Ein Beispiel für ein solches Verfahren ist die Transformation durch einen viralen oder bakteriellen Vektor wie Bakterienarten der Gattung Agrobacterium, die genetisch manipuliert wurden, das Gen zu umfassen, das die erfindungsgemäße Phytase kodiert. Zusätzlich sind Verfahren im Stand der Technik bekannt, um die Phytase-DNA direkt in die Pflanzenzelle oder das Pflanzengewebe einzuführen, z. B. Mikroinjektion und Elektroporation (Gasser et al., Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Techn. 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
Nach der Transformation werden die Transformanten unter Verwendung eines beliebigen dem Fachmann bekannten Verfahrens gescreent, und in Folge darauf werden sie zu ganzen Pflanzen regeneriert.
Diese Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen sowie ihre Nachkommenschaft tragen dann die Phytase-kodierende DNA als ein Teil ihrer genetischen Ausstattung.
Agrobacierium tumefaciens-vermittelter Gentransfer ist das Verfahren der Wahl, um transgene Dikotyledonen hervorzubringen (für eine Übersicht siehe Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15–38). Auf Grund der Beschränkungen des Bereichs an Wirten ist es allgemein nicht möglich, Monokotyledonen mit Hilfe von A. tumefaciens zu transformieren. Hier müssen andere Verfahren verwendet werden. Das Verfahren der Wahl, um transgene Monokotyledonen hervorzubringen, ist ein Partikelbeschuss (mikroskopische Gold- oder Wolframpartikel, beschichtet mit der transformierenden DNA) von embryonischen Kalli oder sich entwickelnden Embryos (Christou, 1992, Plant J. 2: 275–281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158–162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667–674).
Auch andere Systeme zur Einführung freier DNA in diese Pflanzen, einschließlich viraler Vektoren (Joshi & Joshi, 1991. FERS Lett. 281: 1–8), Protoplastentransformation mit Polyethylenglycol oder Elektroporation (für eine Übersicht siehe Potyrkus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205–225), Mikroinjektion von DNA in Mesophyll-Protoplasten (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 79–85) und Makroinjektion von DNA in junge Blütensprosse von Getreidepflanzen (de la Pena et al., 1987, Nature 325: 274–276), sind bevorzugte Verfahren.
Allgemein wird die cDNA oder das Gen, welche(s) die erfindungsgemäße Phytase kodiert, in eine Expressionskassette gesetzt (z. B. Pietrzak et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 5857–5868), die aus einem geeigneten Promotor, der in der Zielpflanze aktiv ist, und einem geeigneten Terminator besteht (Termination der Transkription). Diese Kassette (die natürlich einen geeigneten Selektionsmarker einschließt, siehe nachstehend) wird als solche in die Pflanze transformiert werden, im Fall von Monokotyledonen via Partikelbeschuss. Im Fall von Dikotyledonen wird die Expressionskassette erst in einen geeigneten Vektor gesetzt, der T-DNA-Grenzen und einen geeigneten Selektionsmarker liefert, welche danach in Agrobacierium tumefaciens transformiert werden. Dikotyledonen werden unter Verwendung von Standardprotokollen durch das Agrobacterium transformiert, welches die Expressionskassette und Selektionsmarker, flankiert durch T-DNA, beherbergt (z. B. Akama et al., 1992, Plant Cell Reports 12: 7–11). Der Transfer von T-DNA von Agrobacterium zur Pflanzenzelle wurde kürzlich in einem Übersichtsartikel dargestellt (Zupan & Zambryski, 1995, Plant Physiol. 107: 1041–1047). Vektoren für die Pflanzentransformation über Agrobacterium sind kommerziell erhältlich oder können von vielen Laboratorien erhalten werden, die solche Vektoren herstellen (z. B. Deblaere et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 4777–4788; für eine Übersicht siehe Klee et al., 1987, Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 467–486).
Erhältliche Pflanzenpromotoren: Abhängig vom Vorgang, der manipuliert werden soll, können eine organ- und/oder zellspezifische Expression sowie eine geeignete Entwicklungs- und Umgebungskontrolle nötig sein. Z. B. ist es wünschenswert, eine Phytase-cDNA in Mais-Endosperm, etc. zu exprimieren. Der am häufigsten verwendete Promotor war der konstitutive 35S-CaMV-Promotor (Franck et al., 1980, Cell 21: 285–294). Die Expression wird über die gesamte Pflanze hinweg mehr oder weniger gleichartig sein. Dieser Promotor wurde erfolgreich verwendet, um Herbizid- und Pathogen-resistente Pflanzen zu erschaffen (für eine Übersicht siehe Stitt & Sonnewald, 1995, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 341–368). Organspezifische Promotoren wurden berichtet für "sink"-Speichergewebe wie Samen, Kartoffelknollen, und Früchte (Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275–303), und für metabolische "sink"-Gewebe wie Meristeme (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863–878).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Phytase während der Zubereitung von Nahrungs- oder Futtermittelzubereitungen oder -zusatzstoffen, d. h. die Phytase bewirkt ihre Phytaseaktivität nur während des Herstellungsverfahrens und ist nicht im letztendlichen Nahrungs- oder Futtermittelprodukt aktiv. Diese Ausführungsform betrifft auch das Herstellen und Backen von Teig.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, von denen nicht angenommen werden soll, dass sie den Schutzbereich der Erfindung beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Genomische DNA-Extraktion aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94.
Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 wurde in 25 ml 0,5% Hefeextrakt-2% Glukosemedium (YEG) 24 Stunden lang bei 32°C und 250 Upm wachsen gelassen. Myzelien wurden dann durch Filtration durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, Calif.) gesammelt und einmal mit 25 ml 10 mM Tris-1 mM EDTA-Puffer (TE) gewaschen. Überschüssiger Puffer wurde von den Myzelien ablaufen gelassen, welche anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Die gefrorenen Myzelien wurden in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen Pulver vermahlen, und das Pulver wurde zu 20 ml TE-Puffer und 5 ml 20% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (SDS) in einem Einweg-Plastikzentrifugenröhrchen zugefügt. Die Mischung wurde vorsichtig mehrere Male umgedreht, um eine Mischung zu erreichen, und 2 Mal mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 Vol./Vol./Vol.) extrahiert. Natriumacetat (3 M-Lösung) wurde zugefügt, um eine Endkonzentration von 0,3 M zu ergeben, und die Nukleinsäuren wurden mit 2,5 Volumen eisgekühltem Ethanol gefällt. Das Röhrchen wurde bei 15.000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet wurde an der Luft 30 Minuten lang trocknen gelassen, bevor es in 0,5 ml TE-Puffer resuspendiert wurde. DNase-freie Ribonuclease A wurde bis zu einer Konzentration von 100 μg/ml zugefügt, und die Mischung wurde bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Proteinase K (200 μg/ml) wurde dann hinzugefügt, und die Mischung wurde eine zusätzliche Stunde bei 37°C inkubiert. Schließlich wurde die Mischung 2 Mal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 Vol./Vol./Vol.) extrahiert, bevor die DNA mit Natriumacetat und Ethanol gefällt wurde. Das DNA-Pellet wurde unter Vakuum getrocknet, in TE-Puffer resuspendiert und bei 4°C gelagert.
Beispiel 2: Hybridisierungsanalyse von genomischer DNA
Die Probe mit gesamter zellulärer DNA, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde durch Southern-Hybridisierung analysiert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Etwa 5 μg der DNA-Probe wurden mit BamHI oder PstI verdaut und nach Größe auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Das Gel wurde unter kurzwelligem UV-Licht fotografiert, und 15 Minuten lang in 0,5 M NaOH-1,5 M NaCl eingeweicht, gefolgt durch 15 Minuten in 1 M Tris-HCl (pH 8) -1,5 M NaCl. Die DNA im Gel wurde auf eine Nytran^TM-Hybridisierungsmembran transferiert (Schleicher & Schuell, Keene, NH) durch Kapillar-Blotten in 20 × SSPE (3 M Natriumchlorid-0,2 M dibasisches Natirumphosphat-0,02 M Di-Natrium-EDTA) gemäß Davis et al. (1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Die Membran wurde 2 Stunden lang bei 80°C unter Vakuum gebacken und wurde 2 Stunden im folgenden Hybridisierungspuffer bei 45°C unter leichtem Schütteln eingeweicht: 5 × SSPE, 25% Formamid (Vol./Vol.), 0,3% SDS, und 200 μg/ml denaturierter und gescherter Lachs-Testes-DNA. Ein phytasespezifisches Sondenfragment (etwa 1,6 kb) wurde durch Nick-Translation (Maniatis et al., 1982, supra) mit α[³²P]dCTP radiomarkiert (Amersham, Arlington Heights, IL) und zum Hybridisierungspuffer mit einer Aktivität von etwa 1 × 10⁶ cpm pro ml Puffer zugefügt. Die Mischung wurde mit der Membran über Nacht bei 45°C in einem Schüttel-Wasserbad inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Membran einmal in 1,0 × SSPE mit 0,1% SDS bei 45°C gewaschen, gefolgt von 2 Wäschen in 1,0 × SSPE (kein SDS) bei der selben Temperatur. Die Membran wurde auf einem Papiertuch 15 Minuten lang getrocknet, dann in Saran-Wrap^TM eingewickelt, und damit ein Röntgenfilm über Nacht bei –70°C mit Verstärkerschirmen belichtet (Kodak, Rochester, NV).
Der Southern-Blot zeigt, dass die Sonde als Sonde verwendet werden kann, um das Phytase-Gen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 wie in 1 gezeigt zu identifizieren und zu klonieren.
Beispiel 3: DNA-Bibliotheken und Identifizierung von Phytaseklonen
Genomische DNA-Bibliotheken wurden hergestellt unter Verwendung des Bakteriophagen-Klonierungsvektors λZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) mit E. coli Y1090ZL-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) als ein Wirt zum Ausplattieren und Reinigen von rekombinanten Bakteriophagen und E. coli DH10Bzip (Life Technologies, Gaithersburg, MD) zum Ausschneiden der individuellen pZL1-Phytaseklonen. Gesamte zelluläre DNA wurde teilweise mit Tsp509I verdaut und nach der Größe auf 1%-igen Agarosegelen aufgetrennt. DNA-Fragmente, die im Größenbereich 3–7 kb wanderten, wurden ausgeschnitten und aus dem Gel unter Verwendung von Prep-a-Gene-Reagenzien eluiert (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Die eluierten DNA-Fragmente wurden mit den EcoRI-geschnittenen und dephosphorylierten λZipLox-Vektorarmen ligiert (Life Technologies, Gaithersburg, MD), und die Ligationsmischungen wurden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Verpackungsextrakten (Stratagene, La Jolla, CA) verpackt. Die verpackten DNA-Bibliotheken wurden ausplattiert und in E. coli Y1090ZL-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) vervielfältigt. Etwa 30.000 Plaques aus der Bibliothek wurden durch Plaque-Hybridisierung mit der in Beispiel 2 beschriebenen radiomarkierten Phytasesonde gescreent. Ein positiver Klon, der stark mit der Sonde hybridisiert, wurde gepickt und zweimal in E. coli Y1090ZL-Zellen gereinigt. Der Phytaseklon wurde anschließend aus dem λZipLox-Vektor als pZL1-Phytaseklone ausgeschnitten (D'Alessio et al., 1992, Focus^® 14: 76), was E. coli DH5α (pMWR46) hervorbrachte.
Beispiel 4: DNA-Sequenzierung des Phytase-Gens aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94
Eine Restriktionskartierung des pZL1-Phytaseklons E. coli DH5α (pMWR46), der in Beispiel 3 beschrieben wird, wurde unter Verwendung von Standardverfahren erstellt (Maniatis et al., 1982, supra). Die DNA-Sequenzierung der Phytaseklone wurde mit einem automatischen DNA-Sequenziergerät Applied Biosystems Model 373A durchgeführt (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Verwendung der „primer walking"-Technik mit Farbstoff-Terminator-Chemie (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47–60). Zusätzlich zu den lacforward- und lac-reverse-Primern wurden spezielle Oligonukleotid-Sequenzierungsprimer auf einem Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA-Synthesizer gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
Beispiel 5: Eigenschaften des Phytase-Gens aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94
Die DNA-Sequenzierung eines Teils eines klonierten Phytase-Gens aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 (E. coli DH5α – pMWR46) zeigte einen offenen Leserahmen (SEQ ID NO: 1) (2) mit einer Homologie zum Phytasegen aus Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 (3).
Die Positionen von Introns und Exons innerhalb des Phytase-Gens aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 wurden auf Grundlage von Alignments der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des entsprechenden Phytase-Genprodukts aus Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 zugeordnet. Auf der Grundlage dieses Vergleichs besteht das Phytase-Gen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 aus zwei Exons (47 und 1377 bp), die durch ein kleines Intron (56 bp) unterbrochen sind. Die Größe und die Zusammensetzung des Introns stimmt mit denen anderer Pilzgene insofern überein (Gurr et al., 1987, In Kinghorn, J. R. (Hrsg.), Gene Structure in Eukaryotic Microbes, Seiten 93–139, IRL Press, Oxford), dass sie alle Consensus-Splice-Donor- und -Akzeptor-Sequenzen, sowie die Consensus-Lariat-Sequenz (PuCTPuAC) in Nähe des 3'-Endes jeder dazwischen liegenden Sequenz enthalten.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Produkts des Gens aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 wird in 2 gezeigt (SEQ ID NO: 2). Auf Grundlage der Regeln von von Heijne (1984, Journal of Molecular Biology 173: 243–251) umfassen die ersten 22 Aminosäuren des Produkts des Thermomyces lanuginosus-Gens wahrscheinlich ein sekretorisches Signalpeptid, welches das entstehende Polypeptid in das endoplasmatische Retikulum steuert. Die reife Phytase ist ein saures Protein (vorhergesagter isoelektrischer Punkt = 5,4), bestehend aus 452 Amino säuren (MW = 51 kDa). Die abgeleitete Aminosäuresequenz enthält das Motiv RHGXRXP des aktiven Zentrums (SEQ ID NO: 2), welches anderen bekannten Pilzphytasen gemein ist (Ullah und Dischinger, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 754–759).
Die abgeleitete Aminosäuresequenz der reifen Phytase aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 besitzt etwa 47,5% Identität mit der Phytase aus Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 wie in 3 (SEQ ID NO: 3) gezeigt.
Beispiel 6: Kreuzhybridisierungsstudien unter Verwendung von genomischer DNA aus anderen Pilzen
Das klonierte Phytase-Gen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 wurde als Sonde in Southern-Hybridisierungsexperimenten mit genomischen DNA-Proben aus einer Vielzahl von Pilzgattungen verwendet. Die Southern-Blots wurden mit Sonden unter Bedingungen geringer Stringenz (25% Formamid, 5 × SSPE, 0,3% SDS bei 42°C) und mittlerer Stringenz (35% Formamid, 5 × SSPE, 0,3% SDS bei 42°C) versehen. Genomische DNA-Proben wurden aus den folgenden Arten unter Verwendung des in Beispiel 1 dargestellten Protokolls isoliert: Corynascus thermophilus (ATCC 22066), Fusarium graminearum (ATCC 20334), Humicola grisea var. thermoidea (ATCC 16453), Neurospora crassa (FGSC 987), Botrytis cinerea (ATCC 11542), Curvularia verruculosa (CBS 147.63), Rhizocionia solani (IMI 358730), Trichoderma harzianum (CBS 819.68), Absidia sporophora-variabilis (ATCC 36019), Myceliophthora thermophila (CBS 117.65), und Penicillium diversum (CBS 320.48). Jede DNA-Probe (ca. 5 μg) wurde mit BamHI vor einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel verdaut. Die DNA wurde auf Zeta-Probe-Nylon-Membran (BioRad Laboratories, Hercules, CA) geblottet und mit einer Nicktranslatierten DNA-Sonde, die das phyI-Gen umfasst, versehen. Die Blots wurden mit 2 × SSPE ± 0,1% SDS bei 42°C gewaschen.

Das Phytase-Gen aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 kreuzhybridiserte mit möglichen Phytase-Gensequenzen in mehreren anderen Pilzarten (Tabelle 1). Unter Bedingungen geringer Stringenz erschienen starke Hybridisierungssignale in DNAs aus Corynascus thermophilus, Fusarium graminearum, Humicola grisea var. thermoidea, Neurospora crassa und natürlich Thermomyces lanuginosus. Schwächere Signale wurden in Botrytis cinerea, Curvularia verruculosa, Rhizoctonia solani und Trichoderma harzianum nachgewiesen. Keine Hybridisierung wurde in Absidia sporophora-variabilis, Myceliophthora thermophila oder Penicillium diversum nachge wiesen. Unter Verwendung mittlerer Stringenz waren starke Hybridisierungssignale nur sichtbar bei Corynascus thermophilus, Fusarium graminearum und Thermomyces lanuginosus. Schwache Hybridisierung wurde mit DNAs aus Humicola grisea var. thermoidea und Neurospora crassa beobachtet. Diese Daten zeigen, dass das Thermomyces-lanuginosus-CBS-586.94-Phytase-Gen als eine Sonde verwendet werden kann, um Phytase-Gene aus anderen filamentösen Pilzen zu klonieren. Tabelle 1. Hybridisierung von genomischen DNA-Proben aus verschiedenen Pilzen, mit dem klonierten Phytase-Gen aus Thermomyces languginosus als Sonde.

Genomische DNA-Quelle	Geringe Stringenz	Hohe Stringenz
Absidia sporophora-variabilis	-	-
Botrytis cinerea	+	-
Corynascus thermophilus	+++	+++
Curvularia verruculosa	+	-
Fusarium graminearum	+++	+++
Humicola grisea var. thermoidea	+++	+
Myceliophthora thermophila	-	-
Neurospora crassa	+++	+
Penicillium diversum	-	-
Rhizoctonia solani	+	-
Thermomyces lanuginosus	+++	+++
Trichoderma harzianum	+	-

Ein +++ bezeichnete ein stark positives Hybridisierungssignal, + bezeichnet ein schwaches Signal, und - bezeichnet keine nachweisbare Hybridisierung.

Beispiel 7: Herstellung des Phytase-Expressionsvektors pMWR48
Zwei nachstehend gezeigte synthetische Oligonukleotidprimer wurden entworfen, um die das Phytase-Gen aus Thermomyces languginosus CBS 586.94 kodierende Sequenz aus dem Plasmid pMWR46 (E. coli DH5α-pMWR46) durch PCR für das Subklonieren und die Expression in einem Fusarium-Wirt zu vervielfältigen.

Forward-Primer: 5'-ATTTAAATGGCGGGGATAGGTTTGG-3' (SEQ ID NO: 4)
Reverse-Primer: 5'-CTTAATTAATCAAAAGCAGCGATCCC-3' (SEQ ID NO: 5)

Der Sense-Primer wurde zum ersten ATG im Leserahmen entworfen, und erstreckt sich 14 bp stromabwärts. Der Antisense-Primer wurde für eine Region 14 bp stromaufwärts des Translations-Stoppcodons entworfen, und erstreckt sich durch das Stoppcodon.
Um das Subklonieren des Genfragments in einen Expressionsvektor, bezeichnet als pDM181 (4) zu erleichtern, wurden SwaI und PacI Restriktionsenzymschnittstellen jeweils am 5'- und 3'-Ende des Phytase-Gens eingeführt. Der Vektor pDM181 enthielt den trypsinartigen Proteasepromotor und Terminator aus Fusarium oxysporum ( WO 96/00787 ) als regulatorische Sequenzen. Das Plasmid enthielt auch das bar-Gen als einen Selektionsmarker für Transformationen in Pilzen (de Block et al., 1987, EMBO Journal 6: 2513–2518).
Einhundert Picomol von jedem der vorstehend genannten Primer wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, die 52 ng pEJG13, einen 1 × Pwo-Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 1 mM von jeweils dATP, dTTP, dGTP und dCTP, und 2,5 Einheiten PwoI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) enthielt. Die Amplifizierungsbedingungen waren ein Zyklus bei 94°C 2 Minuten lang, 50°C 30 Sekunden lang, und 72°C 1 Minute lang; 9 Zyklen jeweils bei 94°C 15 Sekunden lang, 50°C 30 Sekunden lang, und 72°C 1 Minute lang; 15 Zyklen jeweils bei 94°C 15 Sekunden lang, 55°C 30 Sekunden lang, und 72°C 1 Minute lang, plus 20 Sekunden für jeden zusätzlichen Zyklus; ein Zyklus bei 94°C 15 Sekunden lang, 55°C 30 Sekunden lang, und 72°C 7 Minuten lang; und ein Haltezyklus bei 4°C. Das amplifizierte 2866 bp große DNA-Fragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und mit den Restriktions-Endonukleasen SwaI und PacI geschnitten (unter Verwendung von Bedingungen, die vom Hersteller angegeben waren). Das geschnittene Fragment wurde in pDM181 (4) kloniert, das vorher mit SwaI und PacI geschnitten wurde, was das Expressionsplasmid pMWR48 (5) zum Ergebnis hatte, in welchem die Transkription des Phytase-Gens unter Kontrolle des trypsinartigen Proteasepromotors aus Fusarium oxysporum war. Das Plasmid pMWR48 wurde in E. coli DH5α-Zellen transformiert. Der E. coli-Transformant, der das pMWR48-Plasmid enthielt, wurde isoliert, und Plasmid-DNA wurde gemäß den in Sambrook et al., 1989, supra beschriebenen Verfahren hergestellt.
Beispiel 8: Transformation von Fusarium CC1-3 und Analyse von Transformanten
Der Fusarium-Stamm CC1-3, eine hoch verzweigte morphologische Mutante des Fusarium-Stamms A3/5 (ATCC 20334) (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555–562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284–1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555–562), wurde in einem Flüssigmedium wachsen gelassen, welches Vogel-Salze enthielt (Vogel, 1964, Am. Nature 98: 435–446), 25 mM NaNO₃, und 1,5% Glukose 4 Tage lang bei 28°C und 150 Upm. Konidien wurden durch Filtration durch 4 Schichten von Seihtuch, und schließlich durch eine Schicht Miracloth gereinigt. Konidiensuspensionen wurden durch Zentrifugation konzentriert. Fünfzig ml YPG-Medium, bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, und 2% Glukose wurden mit etwa 10⁸ Konidien angeimpft und 14 Stunden lang bei 24°C und 150 Upm inkubiert. Die entstehenden Hyphen wurden auf einem sterilen 0,4 μm Filter eingefangen, und nacheinander mit sterilem destilliertem Wasser und 1,0 M MgSO₄ gewaschen. Die Hyphen wurden in 10 ml NOVOZYM-234^TM-Lösung resuspendiert (2–10 mg/ml in 1,0 M MgSO₄) und 15–30 Minuten lang bei 34°C unter Rühren bei 80 Upm verdaut. Unverdautes Hyphenmaterial wurde aus der resultierenden Protoplastensuspension durch schrittweise Filtration durch 4 Lagen Seihtuch und durch Miracloth entfernt. Zwanzig ml 1 M Sorbitol wurden mit der Protoplastenlösung vereinigt. Nach dem Vermischen wurden die Protoplasten durch Zentrifugation pelletiert und nacheinander durch Resuspension in Zentrifugation in 20 ml einen 1 M Sorbitol und in 20 ml STC (0,8 M Sorbitol, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaCl₂) gewaschen. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 4 Teilen STC und 1 Teil SPTC (0,8 M Sorbitol, 40% PEG 4000, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,5 M CaCl₂) bei einer Konzentration von 5 × 10⁷/ml gewaschen. Einhundert μl Protoplastensuspension wurde zu 5 μg pMWR48 in Polypropylenröhrchen zugefügt (17 × 100 mm), gemischt und auf Eis 30 Minuten lang inkubiert. Ein ml SPTC wurde vorsichtig in die Protoplastensuspension gemischt, und die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten lang fortgeführt. 12,5 ml geschmolzene Lösung (abgekühlt auf 40°C) bestehend aus IX Vogel-Salze, 25 mM NaNO₃, 0,8 M Saccharose und 1% niedrig schmelzende Agarose (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) wurden mit den Protoplasten gemischt und dann auf eine leere 100 mm Petrischale ausplattiert. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 10 bis 14 Tage lang fortgesetzt. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 24 Stunden wurden 12,5 ml des identischen Mediums plus 10 mg basta (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) pro ml auf die Petrischale überschichtet. Basta wurde zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) vor der Verwendung extrahiert. Nach zwei Wochen erschienen 17 Transformanten. Ein Myzelfragment vom Rand jedes Transformanten wurde in einzelne Löcher einer 24-Loch-Platte, die Vogel/BASTA-Medium enthielt, überführt.
Das Medium enthielt 25 g Saccharose, 25 g Noble-Agar, 20 ml 50 × Vogel-Salze (Vogel, 1964, supra), 25 mM NaNO₃ und 10 g basta pro Liter. Die Platte wurde in einer Plastiktüte versiegelt, um die Feuchtigkeit beizubehalten, und etwa eine Woche bei Raumtemperatur inkubiert.
Beispiel 9: Expression des Phytase-Gens aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94
Ein Myzelfragment von jedem der 17 Fusarium-CC1-3-Transformanten, die in Beispiel 8 beschrieben werden, wurde in 20 ml M400Da-Medium angeimpft, welches 50 g Maltodextrin, 2,0 g MgSO₄-7H₂O, 2,0 g KH₂PO₄, 4,0 g Zitronensäure, 8,0 g Hefeextrakt, 2,0 g Harnstoff, und 0,5 ml Spurenmetalllösung pro Liter enthielt, und wurde 7 Tage lang bei 30°C und 150 Upm inkubiert. Das Medium wurde auf pH 6,0 mit 5 N NaOH eingestellt. Die Spurenmetalllösung enthielt 14,3 g ZnSO₄-7H₂O, 2,5 g CuSO₄-5H₂O, 0,5 g NiCl₂-6H₂O, 13,8 g FeSO₄-7H₂O, 8,5 g MnSO₄-H₂O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter. Der nicht transformierte Wirt wurde auch als Kontrolle mitlaufen gelassen. Ein ml Kulturüberstand wurde bei 4, 5 und 7 Tagen geerntet und bei 4°C gelagert. Phytaseaktivität wurde wie nachstehend beschrieben bestimmt.
Eine Probe wurde in 0,2 M Zitratpuffer pH 5,5 verdünnt, und 1 ml der verdünnten Probe wurde zu jeder von zwei Teströhrchen zugefügt. Zwei Milliliter 15% Trichloressigsäure (TCA) wurden zu einem Röhrchen zugefügt, während das andere Röhrchen bei 40°C 5 Minuten lang vorinkubiert wurde. Ein Milliliter einer 1% Phytatsubstratlösung in 0,2 M Zitratpuffer pH 5,5 wurden anschließend zu beiden Röhrchen zugefügt. Die Proben ohne TCA wurden bei 40°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden 2 ml TCA zugefügt, und die Proben wurden abkühlen gelassen. Ein Volumen von 100 Mikroliter jeder Probe wurden dann auf 1 ml in Wasser verdünnt, und bei 50°C 5 Minuten lang vorinkubiert. Ein Milliliter eines Reagenz enthaltend 1:2:1:1 6 N Schwefelsäure:Wasser:2,5% Ammoniummolybdat:10% Ascorbinsäure wurde zu jeder Probe zugefügt, und die Proben wurden weitere 15 Minuten lang zur Farbentwicklung inkubiert. Die sich ergebende Farbe wurde bei 690 nm auf einem Molecular Devices Thermomax Mikroplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen.
Sporen der ursprünglichen Transformanten, die die höchste Phytaseaktivität verursachten, wurden durch Animpfen mit Myzelien von 20 ml eines Mediums, das pro Liter 12,1 g NaNO₃, 50 g Bernsteinsäure und 20 ml 50 × Vogel-Salze (eingestellt auf pH 6,0) enthielt, und durch Inkubieren unter Schütteln bei 30°C 2–3 Tage lang erzeugt. Einzelne Sporen wurden durch Verteilen von 150 ml Sporenkultur auf Mikromanipulatorplatten, die 1 × Vogel-Salze, 25 mM NaNO₃, 2,5% Saccharose, 2% Noble-Agar und 5 mg/ml BASTA enthielten, und unter Verwendung eines Mikromanipulators, um einzelne Sporen auf eine klare Region der Platte zu überführen, isoliert. Nach 3 Tagen Wachstum bei Raumtemperatur wurden die gekeimten Sporen auf einzelne Vogel-Platten, die 5 mg/ml BASTA enthielten, übertragen.
Kulturüberstände von vierzehn der siebzehn ursprünglichen Transformanten von pMWR48 waren positiv, wenn sie auf Phytaseaktivität getestet wurden. Zwei ursprüngliche Transformanten, die als Transformant #3 und #5 bezeichnet wurden, wurden für Einzelsporenisolierung auf Grund von Phytaseaktivität ausgewählt. Neun Einzelsporenisolate wurden erhalten. Schüttelkolben, die 25 ml M400Da-Medium plus 5 mg/ml BASTA enthielten, wurden in zweifacher Ausführung mit Myzelstücken aus jedem Einzelsporenisolat angeimpft, und bei 30°C inkubiert. Ein ml-Aliquots der Kulturmedien wurden vier, fünf und sieben Tage nach Animpfung geerntet, und auf Phytaseaktivität getestet. Die Ergebnisse der Phytaseassays zeigten, dass beide ursprünglichen Transformanten Aktivität erzeugten.
Beispiel 10: Herstellung von rekombinanter Phytase aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94
Der ursprüngliche Fusarium-Transformant #5, der in Beispiel 9 beschrieben wird, wurde in zwei 2-Liter-Fermentoren 7 Tage lang bei 30°C in einem Medium bei pH 6,25 kultiviert, bestehend aus 20 g Soja, 20 g Glukose, 10 g Hefeextrakt, 2 g MgSO₄-7H₂O, 2 g KH₂PO₄, 2 g Zitronensaure, 3 g K₂SO₄, 2 g CaCl₂-2H₂O, und 0,5 ml Spurenmetalllösung pro Liter, und wurde gefüttert mit einem Medium, das aus 300 g Glukose, 20 g (NH₄)₂HPO₄, und 1 g Zitronensäure pro Liter bestand. Ein 2,5%-iges Inokulum wurde für Fermentationen verwendet. Das Inokulum war eine 48–72 Stunden-Schüttelkolbenkultur bestehend aus 62,5 g Nutriose, 2 g MgSO₄-7H₂O, 10 g KH₂PO₄, 2 g K₂SO₄, 2 g Zitronensäure, 10 g Hefeextrakt, 2 g Harnstoff, 0,5 g CaCl₂, und 0,5 ml Spurenmetalllösung pH 6,0 pro Liter.
Die gesamte Kulturbrühe wurde unter Verwendung einer doppelten Schicht von Miracloth, mit Gummibändern am oberen Ende eines 4-Liter-Becherglases befestigt, filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und dann bei –20°C eingefroren.
Beispiel 11: Reinigung von rekombinanter Phytase aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94
Die in Beispiel 9 beschriebene gefrorene zellfreie Brühe (1700 ml) wurde aufgetaut, durch Zentrifugation bei 10.000 × g geklärt, und auf ein Volumen von 350 ml mit einer Amicon Hohlfaserfiltrationseinheit, ausgestattet mit einem Amicon S1Y10-Filter (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Die Probe wurde auf pH 7 titriert, auf eine Leitfähigkeit von 2 mS verdünnt, und bei Raumtemperatur auf eine Pharmacia Q-Sepharose Big Beads Säule mit einem Bettvolumen von 75 ml (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) geladen, welche mit 20 mM Tris-Cl Puffer pH 7 voräquilibriert war. Die Säule wurde bei einer Flussrate von 5 ml pro Minute unter Verwendung des Äquilibrierungspuffers eluiert, bis der A₂₈₀ des Ausflusses fast bis auf die Basislinie abgefallen war. Die Säule wurde dann mit einem 600 ml-Gradienten von 0–0,6 M NaCl im gleichen Puffer bei einer Flussrate von 5 ml pro Minute eluiert. Die Phytaseenzymaktivität wurde durch Messen der Hydrolyserate von 10 mM p-Nitrophenylphosphat in 0,2 M Natriumzitratpuffer pH 5,5 bei 405 nm und 30°C in einem 200 μl Reaktionsvolumen unter Verwendung eines Molecular Devices Thermomax Mikroplatten-Lesegeräts bestimmt. Die gebundene Enzymaktivität eluierte in Fraktionen, die ca. 0,2 M NaCl entsprachen.
Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und durch Ultrafiltration mit einer Amicon PM-10-Membran (Amicon, Beverly, MA) auf ein Volumen von 25 ml konzentriert, auf eine Leitfähigkeit von 0,9 mS verdünnt, und mit 4 ml pro Minute auf eine Pharmacia-MonoQ-HR-10/16-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) geladen, die in 20 mM MOPS Puffer pH 7 voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 80 ml des Äquilibrierungspuffers eluiert, und dann mit einem 400 ml Gradienten von 0–0,5 M NaCl im selben Puffer eluiert. Enzymaktivität wurde in den Fraktionen unter Verwendung des p-Nitrophenylphosphatassays, der vorstehend beschrieben wurde, nachgewiesen. Die aktiven Fraktionen wurden auch mit einem Novex 10–27% Gradienten-SDS-Polyacrylamidgel gemäß den Vorschriften des Herstellers (Novex, San Diego, CA) analysiert, und die Fraktionen wurden vereinigt, wenn sie durch Elektrophorese als im Wesentlichen gereinigt beurteilt wurden.
Die vereinigten Fraktionen wurden mit einer Amicon PM-10-Membran durch Ultrafiltration konzentriert, und in 20 mM MES Puffer pH 5,5 ausgetauscht. Die Probenleitfähigkeit war 1,1 mS. Ein Drittel dieser Probe wurde mit 1 ml pro Minute auf eine Pharmacia Mono S HR 5/5-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) geladen, welche mit 20 mM MES-Puffer pH 5,5 voräquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 5 ml des Äquilibrierungspuffers eluiert, und dann mit 25 ml eines linearen Gradienten von 0–0,6 M Natriumchlorid im gleichen Puffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden nach der elektrophoretischen Analyse vereinigt, um die zu entfernen, welche Spuren von Verunreinigungen enthielten.
Die gereinigte rekombinante Phytase aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 erschien in der Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als homogen mit einem einzigen Bestandteil, der ein Molekulargewicht von etwa 60.000 Dalton hatte.
Beispiel 12: Physikochemische Charakterisierung der gereinigten rekombinanten Phytase aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94
Alle Charakterisierungen wurden mit der in Beispiel 11 beschriebenen gereinigten rekombinanten Phytase aus Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 durchgeführt. Wenn angemerkt, wurden auch Vergleiche mit einem Standard einer Aspergillus niger (ficuum)-Phytase, die von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhalten wurde, gemacht.
Isoelektrischer Punkt. Der isoelektrische Punkt (pI) der Thermomyces-Phytase wurde zu dem der Aspergillus niger-Phytase bestimmt. Isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde mit einem Novex pH 3–7 IEF-Gel (Novex, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. IEF-Standards sowohl von Pharmacia (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA) wurden verwendet, um das Gel zu kalibrieren.
IEF zeigte, dass die Thermomyces-Phytase mehrere Bestandteile mit pIs im Bereich von 4,7 bis 5,2 enthielt, wohingegen bei der Aspergillus niger-Phytase beobachtet wurde, dass sie einen pI von 4,8–5,0 besaß.
Aminoterminale Sequenzanalyse. Die gereinigte Rekombinante Thermomyces-Phytase wurde einer aminoterminalen Proteinsequenzanalyse mit einem Applied Biosystems Model 476A-Sequenziergerät (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unterzogen, gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Flüssigphasen-TFA-Zuführung und angeschlossener HPLC für die Auftrennung der PTH-Aminosäuren. Die Proben wurden auf einen mit Biobrene^TM beschichteten TFA-Glasfaserfilter aufgetupft (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) und direkt sequenziert.
Die aminoterminale Sequenzanalyse der gereinigten Phytase zeigte drei Bestandteile auf. Der Hauptbestandteil (ca. 60%) ist H₂N-His-Pro-Asn-Val-Asp-Ile-Ala-Arg-His-Trp-Gly-Gln-Tyr-Ser-Pro-Phe-Phe-Ser-Leu-Ala (SEQ ID NO: 2) was einer kex2-Spaltungsstelle an Position 34 im ursprünglichen Translationsprodukt entsprach. Zwei Nebensequenzen (ca. 30%) H₂N-Gly-Glu-Asp-Glu-Pro-Phe-Val-Arg-Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg-Val-Val-Pro-Leu-His-Gly (SEQ ID NO: 2) und (ca. 10%) H₂N-Ser-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Glu-Asp-Glu-Pro-Phe-Val-Arg-Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg (SEQ ID NO: 2) entsprachen internen Spaltungsstellen nahe dem COOH-Terminus des Proteins an den Positionen 428 und 435 im ursprünglichen Translationsprodukt.
Enzymkinetikstudien. Enzymkinetikstudien wurden mit der Thermomyces-Phytase und der Aspergillus niger-Phytase durchgeführt. Die Studien wurden mit einem Assay von anorganischem Phosphat, das aus Phytinsäure aus Mais freigesetzt wird, durchgeführt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Standardenzymreaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37°C und pH 5,5 in 0,5% Gew./Gew. Phytinsäure ausgeführt. Die Reaktion wurde durch Zufügen eines gleichen Volumens 15% Gew./Gew. Trichloressigsäure gequencht. Nach dem Abkühlen wurden 100 μl der sich ergebenden Mischung in 1,0 ml von im Glas destilliertem Wasser verdünnt. Die Probe wurde bei 50°C 5 Minuten lang inkubiert. Ein Farbreagenz (1,0 ml) wurde zugefügt, und die Inkubation bei 50°C wurde 15 Minuten lang fortgesetzt. Das Absorptionsvermögen eines 200 μl-Aliquots wurde bei 690 nm mit einem Molecular Devices Thermomax Mikroplatten Lesegerat gemessen. Das Farbreagenz besteht aus 6 N Schwefelsäure:Wasser:2,5% (Gew./Vol.) Ammoniumheptamolybdat-Tetrahydrat:10% Ascorbat (wässrig) in einem Verhältnis von 1:2:1:1, und wurde täglich frisch zubereitet. Die Quantifizierung beruhte auf einer Standardkurve, die mit einem 10 mM monobasischen Natriumphosphat-Standard erzeugt wurde. Eine Einheit (U) wird definiert als ein μMol anorganisches Phosphat, freigesetzt pro Minute bei 37°C und pH 5,5.
Steady-state-Kinetikmessungen wurden durch Substrattitration gemacht. Phytatkonzentrationen waren 2,16, 1,08, 0,541, 0,216, 0,108 und 0,0758 mM für den Zweck der K_m-Bestimmung. Phytatkonzentrationen von 1,08, 0,541, 0,216 und 0,108 mM in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 mM monobasischem Natriumphosphat wurden für die Auswertung der Produktinhibition verwendet.
Steady-state-Kinetikmessungen zeigten, dass die Thermomyces-Phytase einen scheinbaren Km von etwa 110 μM bezüglich Phytat besitzt, während die Aspergillus niger-Phytase einen scheinbaren K_m von 200 μM besitzt. Bei der Substratkonzentration von 2,16 mM gab es eine schwache Andeutung einer Inhibition durch überschüssiges Substrat, vielleicht in Übereinstimmung mit einer in der Literatur berichteten Inhibition über 2 mM bei der Aspergillus-Phytase (Ullah, 1988, Preparative Biochemistry 18: 443–458). Steady-state-Kinetikmessungen mit 1 mM vorhandenem Phosphat zeigten keine Inhibition mit diesem Produkt. Es wurde geschätzt, dass der K_i für Phosphat 3 mM übersteigen muss, um in unseren Experimenten nicht nachweisbar zu sein. Im Gegensatz dazu berichtete Ullah (Ullah, 1988 supra), dass Phosphat ein kompetitiver Inhibitor der Aspergillus-Phytase mit einem K_i von 1,9 mM ist.
Thermostabilitätsmessungen. Die Thermostabilität der Thermomyces-Phytase wurde mit der Aspergillus niger-Phytase verglichen. Proben der Thermomyes-Phytase und der Aspergillus niger-Phytase wurden zu 100 U pro ml in 0,2 M Natriumzitratpuffer pH 5,5 gelöst. Aliquots (100 μl) jeder Enzymlösung wurden 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei den folgenden Temperaturen inkubiert: 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70 und 75°C. Nach den Temperaturbehandlungen wurden die Proben bei 0°C gelagert, bis Aktivitätsassays durchgeführt wurden. Jede Probe wurde 1:80 in 0,2 M Natriumzitratpuffer pH 5,5 verdünnt, der 0,01% Gew./Gew. Tween 20 enthielt, und der vorstehend beschriebene Standard-Aktivitätsassay wurde durchgeführt.
Ein Vergleich der Enzym-Thermostabilitätsprofile (6) deutete an, dass Stabilitätsunterschiede zwischen den zwei Enzymen klein sind. Jedoch ist kein Enzym bei einer Inkubation bei hoher Temperatur voll inaktiviert, und das Profil von Restaktivität ist in Übereinstimmung mit einer teilweise reversiblen thermischen Denaturierung (Ullah und Mullaney, 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 227: 311–317).
pH-Aktivitätsmessung. Das pH-Aktivitätsprofil der Thermomyes-Phytase wurde mit der Aspergillus niger-Phytase verglichen. Um einen Pufferbereich zwischen pH 2–7 zu erreichen, wurde ein dreikomponentiger 0,125 M Glycin-Acetat-Citratpufffer benutzt. Die Pufferbestandteile wurden bei Endkonzentrationen von 42 mM pro Bestandteil kombiniert, und Phytinsäure wurde als Feststoff auf 1% Gew./Gew. zugefügt. Diese Mischung wurde auf pH 7 mit konzentrierter HCl eingestellt, und ein 10 ml Aliquot wurde entnommen. Dies wurde für jeden 0,5 pH-Schritt danach gemacht, bis zu pH 2.
Enzymstammlösungen von 20 U pro ml wurden in 20 mM MES-Puffer pH 5,5 zubereitet. Substrat (850 Mikroliter) in Puffer bei einem gegebenen pH wurde mit 100 Mikroliter Wasser und 50 Mikroliter Enzymstammlösung kombiniert, und 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. An schließend wurde die Enzymreaktion mit 1 ml 15% TCA gequencht, und mit dem Standardverfahren quantifiziert.
Der Vergleich der pH-Aktivitätsprofile von Thermomyces- und Aspergillus-Phytase zeigte eine wesentliche Ähnlichkeit zwischen den zwei Enzymen im pH-Profil (7). Jedoch ist die Thermomyces-Phytase auch bei neutralem pH aktiv, während das Aspergillus-Enzym es nicht ist. Frühere Berichte in der Literatur (siehe z. B. Sandberg, et al., 1996, J. Nutr. 126: 476–480) schlagen vor, dass die Aspergillus-Phytase zwei pH-Optima besitzt. Es ist wahrscheinlicher, dass diesen Berichten unreines Material zu Grunde liegt, welches Spuren der sauren Phosphatase aus Aspergillus enthält, welche in der Literatur gut bekannt ist (Zyla, 1993, World J. Microbiol. Biotechnol. 9: 117–119).
Temperaturaktivitätsmessung. Das Temperaturaktivitätsprofil der Thermomyces-Phytase wurde mit dem der Aspergillus niger-Phytase verglichen. Enzymstammlösungen von 12,5 U pro ml wurden in 0,2 M Natriumzitratpuffer pH 5,5 zubereitet. 250 Mikroliter von 1% Phytinsäuresubstrat wurden zu einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen zugefügt, gefolgt von 240 Mikrolitern 0,2 M Natriumzitratpuffer pH 5,5. Diese Lösung wurde gevortext und in ein Wasserbad mit der angegebenen Temperatur gestellt. Nach einer 20-minütigen Äquilibrierung im Wasserbad wurde das Eppendorf-Röhrchen gevortext und 10 ml Phytaselösung zugegeben. Die Probe wurde gevortext und im Wasserbad weitere 30 Minuten lang inkubiert. Nach 30 Minuten im Wasserbad wurde die Reaktion mit 1 ml 15% TCA gequencht und mit dem vorstehend beschriebenen Assayverfahren quantifiziert.
Die Messung der Enzymaktivität als eine Funktion der Temperatur zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den zwei Enzymen (8). Thermomyces-Phytase zeigt maximale Enzymaktivität nahe 65°C und besitzt Teilaktivität selbst bei 75°C, während die Aspergillus niger-Phytase im Wesentlichen bei 65°C inaktiv ist.
Phytathydrolyse. Ein Vergleich der Fähigkeit von Thermomyces- und Aspergillus niger-Phytasen, Phytinsäure zu hydrolysieren, wurde durchgeführt. Jede Phytase (0,5 U Enzymaktivität pro ml) wurde mit entweder 0,5% oder 0,1% Phytinsäure bei pH 5,5 und 37°C 10 Stunden lang inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aspergillus niger- und Thermomyces-Phytasen identische Mengen (70%) des gesamten theoretisch verfügbaren Phosphors nach 10 Stunden unter entweder 0,5% oder 0,1% Phytinsäurekonzentrationen freisetzten.
Beispiel 13: Zeitaufgelöste Produkt-Profilerstellung von phytasekatalysierter Hydrolyse von Phytinsäure durch ¹H-NMR-Spektroskopie
Die Hydrolyse von Phytinsäure, katalysiert durch Thermomyces-Phytase und durch eine käuflich erhältliche Aspergillus niger-Phytase (Phytase Novo^®) wurde untersucht (27 mM Phytat, 1 FYT/ml, pH 5,5 und 27°C) durch ¹H-NMR-Profilerstellung von der Produktmischung im Verlauf von 24 Stunden.
Im Folgenden bezeichnet (Ins(p, q, r, ...)P_n myo-inositol, das insgesamt n Phosphatgruppen verbunden mit den Positionen p, q, r, ... trägt.
Die Technik stellt spezifische Informationen über die anfänglichen Angriffspunkte des Enzyms auf Phytinsäure bereit, sowie Information über die Identität des Endprodukts. Auf der anderen Seite stellen die sich entwickelnden Muster von Peaks, die die Zusammensetzung der intermediären Produktmischungen widerspiegeln, einen qualitativen Messwert bereit, einen Fingerabdruck, geeignet zur Identifizierung von Ähnlichkeiten und Unterschieden zwischen individuellen Enzymen.
NMR-Spektren wurden bei 300°K (27°C) mit einem Bruker DR × 400 Instrument, ausgestattet mit einem 5 mm selektiven inversen Probenkopf, aufgenommen. Sechzehn Aufnahmen, vorangegangen durch 4 Testaufnahmen, wurden unter Verwendung einer spektralen Breite von 2003 Hz (5 ppm) gesammelt, abgedeckt durch 8 K Datenpunkte. Die Unterdrückung der verbleibenden HOD-Resonanz wurde durch eine 3 Sekunden lange Vorsättigungszeit erreicht. Das HOD-Signal wurde als Referenz für die Spektren benutzt (δ 4,70).
Phytinsäureproben für die NMR-Analyse wurden wie folgt zubereitet: Phytinsäure (100 mg, Phytinsäuredikaliumsalz, Sigma P-5681) wurde in deionisiertem Wasser gelöst (4,0 ml) und der pH auf 5,5 durch Zugabe von wässriger NaOH (4 N) eingestellt. Deionisiertes Wasser wurde zugefügt (bis auf 5 ml) und 1 ml-Portionen, von denen jede 20 mg Phytinsäure entsprach, wurden in Schraubverschlussröhrchen überführt, und das Lösungsmittel evaporiert (Vakuumzentrifuge). Die trockenen Proben wurden in Deuteriumoxid gelöst (2 ml, Merck 99,5% D), und wiederum bis zur Trockenheit evaporiert (gelagert bei –18°C bis zur Verwendung).
Für die NMR-Analyse wurde eine 20 mg Phytinsäureprobe in Deuteriumoxid gelöst (1,0 ml, Merck 99,95% D). Die Lösung wurde in ein NMR-Röhrchen überführt, und das ¹H-NMR-Spektrum aufgenommen. Eine Enzymlösung (1 FTU, gelöst in/verdünnt, wie benötigt, mit Deuteriumoxid) wurde zugefügt, gefolgt durch gründliches Mischen (1 Minute). ¹H-NMR-Spektren wurden sofort nach Hinzufügen des Enzyms (t = 0) aufgenommen, dann nach 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 195, 210 Minuten (= 3,5 Stunden), 4,5, 5,5 6,5, 7,5, 8,5, 9,5, 11,5, 13,5, 15,5, 17,5, 19,5, 21,5, und 23,5 Stunden. Der pH im NMR-Röhrchen wurde gemessen. Zusätzliche Spektren wurden nach 48 und 120 Stunden (5 Tage) aufgenommen, wobei ein Teil des Substrats (6 mg Phytinsäure) zu einer Probe zugefügt wurde, wenn das Enzym seine katalytische Aktivität behielt.
Durch 2D-NMR-Analyse von Inositolphosphatmischungen, erhalten durch teilweisen Verdau von Phytinsäure, in Verbindung mit veröffentlichten NMR-Daten (Scholz, P.; Bergmann, G., und Mayr, G. W.: Methods in Inositide Research (Hrsg. Irvine, R. F.), Seiten 65–82, Raven Press, Ltd., New York (1990)), wurden charakteristische ¹H-NMR-Signale, die Ins(1, 2, 3, 4, 5, 6)P₆ (PA), Ins(1, 2, 4, 5, 6)P₅, Ins(1, 2, 3, 4, 5)P₅, Ins(1, 2, 5, 6)P₄, Ins(1, 2, 6,)P₃, Ins(1, 2)P₂, und Ins(2)P zugeschrieben werden konnten, identifiziert und erlaubten eine relative Quantifizierung dieser Spezies während des Verlaufs der Reaktion.
Übereinander gestellte Diagramme der Produktprofile der Aspergillus-Phytase und der Thermomyces-Phytase, die 24 Stunden Reaktionszeit abdecken, werden jeweils in den 9 und 10 gezeigt.
Das Signal bei δ 3,25(t) stellt das H-5 in Ins(1, 2)P₂ dar, wohingegen das Signal bei δ 3,18(t) das H-5 in Ins(2)P darstellt. Ins(1, 2)P₂ beginnt, sich nach etwa 4 Stunden Reaktionszeit mit der Aspergillus-Phytase und nach etwa 2 Stunden Reaktionszeit mit der Thermomyces-Phytase anzusammeln. Ins(2)P wird nach etwa 10 Stunden Reaktion mit der Aspergillus-Phytase und nach etwa 5 Stunden Reaktion mit der Thermomyces-Phytase beobachtet. Nach 24 Stunden Reaktion ist die Menge oder der Spiegel an Ins(1, 2)P₂ bei beiden Phytasen sehr gering, wohingegen die Menge von Ins(2)P bei beiden Phytasen nach 24 Stunden maximal ist.
In Übereinstimmung damit zeigen die Profile, die nach 24 Stunden Reaktionszeit beobachtet wurden, dass beide Phytasen PA zu Ins(2)P abbauen. Die voll desphosphorylierte Spezies, Inositol (Ins), wurde gar nicht beobachtet.
Bei beiden Enzymen umfasste die Reaktionsmischung bei 24 Stunden zusätzlich zu Ins(2)P geringe Mengen an Ins(1, 2)P₂. Verlängerte Reaktionszeiten (mehrere Tage) hatten das Verschwinden des Rest Ins(1, 2)P₂ zum Ergebnis, jedoch wurde die voll desphosphorylierte Spezies, Inositol (Ins), gar nicht beobachtet. Die Beobachtung kann nicht durch eine irreversible Inhibition/Denaturierung des Enzyms erklärt werden, da die Enzyme ihre katalytischen Aktivitäten über lang andauernde Zeiträume beibehielten, gezeigt durch ihre Fähigkeit, frische Mengen Phytinsäure, die zu dem NMR-Röhrchen zugefügt wurden, zu verdauen, nachdem sie 5 Tage bei Raumtemperatur gehalten worden waren.
11 und 12 zeigen im genaueren Detail die Profile, die sich während der anfänglichen 4,5 Stunden entwickeln. 13 zeigt, dass das H-3 in Ins(1, 2, 4, 5, 6)P₅ (bezeichnet als A) ein Signal bei δ 3,66(dd), das H-6 in Ins(1, 2, 3, 4, 5)P₅ (B) ein Signal bei δ 3,87(t), und das H-3 in Ins(1, 2, 5, 6)P₄ (C) ein Signal bei δ 3,56(dd) zeigt. Die Verbindung A entspricht einem Phosphat in Position 3, welches hydrolysiert wurde, B in Position 6, und C in Position 3 und 4.
11 zeigt, dass Verbindung A das hauptsächliche Primärprodukt (t = 5 Minuten) unter Verwendung der Aspergillus-Phytase ist, wohingegen Verbindung B nicht erscheint. Verbindung C erscheint nach 20–25 Minuten.
Auf der anderen Seite zeigt 12 (die Thermomyces-Phytase), dass Verbindung A sowie Verbindung B sehr früh hergestellt werden, d. h. innerhalb der ersten 15 Minuten, vermutlich mehr von Verbindung A als von B.
Die Signale bei δ 4,82(dt, H-2), 4,38 (q, H-4/H-6), 4,13(q, H-5) und 4,11(dt, H1/H3) können dem Substrat Phytinsäure zugeschrieben werden. 11 und 12 zeigen, dass diese Peaks sehr viel schneller (d. h. innerhalb einer Stunde) bei der Thermomyces-Phytase als bei der Aspergillus-Phytase abnehmen.
Hinterlegung von biologischem Material
Der folgende Stamm wurde gemäß des Budapester Vertrags in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt.

Stamm Zugangsnummer Hinterlegungsdatum

E. coli DH5α (pMWR46) NRRL B-21527 23. Februar 1996
Der Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die sicherstellen, dass ein Zugang zur Kultur während der Laufzeit dieser Patentanmeldung einer Person zugänglich sein wird, die durch den Commissioner of Patents and Trademarks als dazu berechtigt bestimmt wurde gemäß 37 C. F. R. § 1.14 und 35 U. S. C. § 122. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur jedes hinterlegten Stamms dar. Die Hinterlegung ist, wie durch ausländische Patentgesetze verlangt, in Ländern erhältlich, in denen Entsprechungen zur vorliegenden Anmeldung, oder Mitgliedern ihrer Patentfamilie, eingereicht sind. Jedoch sollte verstanden werden, dass die Erhältlichkeit einer Hinterlegung keine Lizenz bedeutet, die betroffene Erfindung unter Beeinträchtigung von Patentrechten, die durch Regierungshandlungen erteilt wurden, auszuführen.
Die hierin beschriebene beanspruchte Erfindung ist in ihrem Schutzbereich nicht durch die speziellen hierin offenbarten Ausführungsformen beschränkt, da diese Ausführungsformen nur als Erläuterungen mehrerer Aspekte der Erfindung gedacht sind. Jegliche äquivalente Ausführungsformen sollen innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung sein. Tatsächlich werden verschieden Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu denen die hierin gezeigt und beschrieben werden, dem Fachmann auf dem Gebiet aus der vorangehenden Beschreibung offensichtlich werden. Solche Modifikationen sollen auch innerhalb des Schutzbereichs der angehängten Ansprüche fallen.
Verschiedene Referenzen werden hierin zitiert, deren Offenbarungen durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid mit 3,6-Phytaseaktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% Identität mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 besitzt; (b) einem Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter Bedingungen hoher Stringenz, definiert als Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und 50% Formamid, mit dem das Polypeptid kodierenden Teil der Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist; (c) einer allelischen Form von (a) oder (b); und (d) einem Fragment von (a), (b) oder (c).
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Präferenz für die 3'-Position von Phytinsäure hat.
Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1–2, welches aus einem Stamm von Thermomyces, oder einem Synonym oder Teleomorph davon, erhältlich ist.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4, die die Fähigkeit besitzt, unter Bedingungen hoher Stringenz mit dem das Polypeptid kodierenden Teil der Nukleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist; oder einer allelischen Form oder einem Fragment davon zu hybridisieren.
Nukleinsäurekonstrukt, umfassend die Nukleinsäuresequenz eines beliebigen der Ansprüche 4–5, funktionsfähig verbunden mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen, welche die Fähigkeit besitzen, die Expression des Polypeptids in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6, einen Promotor, und Stoppsignale der Transkription und Translation.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6, das Abschnitte von Nukleinsäure enthält, welche auf eine Weise kombiniert und nebeneinander gestellt sind, die sonst nicht in der Natur existieren würde.
Verfahren zum Herstellen des Polypeptids nach Anspruch 3, umfassend (a) Kultivieren eines Thermomyces-Stamms, um einen Überstand herzustellen, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zum Herstellen des Polypeptids eines beliebigen der Ansprüche 1–3, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, unter Bedingungen, die der Expression des Polypeptids förderlich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Futter- oder Nahrungsmittelzusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1–3 und einen oder mehrere Futter- oder Nahrungsmittelzusatzstoffe oder -bestandteile.
Verfahren zum Verringern von Phytatspiegeln in Tierdung, umfassend das Füttern eines Tieres mit einer wirksamen Menge einer Futter- oder Nahrungsmittelzusammensetzung nach Anspruch 11.
Verfahren zum Verflüssigen von Stärke, umfassend (a) Behandeln der Stärke mit einem Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1–3 vor dem oder gleichzeitig zum Verflüssigen; und (b) Zufügen einer α-Amylase zur Stärke; und (c) Umsetzen der Stärke von Schritt (b) für eine Zeit und bei einer Temperatur, die wirksam sind, um die Stärke zu verflüssigen.
Verwendung eines Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1–3 (i) zum Freisetzen von anorganischem Phosphat aus Phytinsäure; (ii) während der Herstellung von Nahrungs- oder Futtermittelzubereitungen oder -zusatzstoffen und/oder (iii) zum Verbessern der Verwertbarkeit von Nahrungs- oder Futtermitteln.