ES2301177T3

ES2301177T3 - Polipeptidos con actividad fitasa y acidos nucleicos que los codifican.

Info

Publication number: ES2301177T3
Application number: ES97916892T
Authority: ES
Inventors: Randy M. Berka; Michael W. Ray; Alan V. Klotz
Original assignee: Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1996-03-18
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2017-03-18
Also published as: ATE384798T1; US6221644B1; DE69738483T2; US5866118A; DE69738483D1; JP2000507102A; AU717284B2; CN1214081A; AU2077197A; WO1997035017A1; JP4125375B2; CA2248980A1; EP0904383A1; AU2539197A; BR9708209A; WO1997035016A1; EP0904383B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS AISLADOS CON ACTIVIDAD FITASA, PROCEDENTES DE THERMOMYCES LANUGINOSUS Y A SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA LOS MISMOS. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A ESTRUCTURAS DE ACIDOS NUCLEICOS, VECTORES Y CELULAS HUESPED QUE COMPRENDEN DICHAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS, ASI COMO A METODOS DE PRODUCCION DE DICHOS POLIPEPTIDOS. TAMBIEN SE HACE REFERENCIA A PIENSOS COMPUESTOS Y A METODOS PARA REDUCIR LOS NIVELES DE FITATO.

Description

Polipéptidos con actividad fitasa y ácidos nucleicos que los codifican.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad fitasa y a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como a los métodos para producir los polipéptidos. La invención también se refiere a composiciones que comprenden los polipéptidos y a los métodos de uso de las mismas.

Descripción de las técnicas relacionadas

Las fitasas (mio-inositol hexakisfosfato fosfohidrolasas, EC 3.1.3.8) catalizan la hidrólisis del fitato (mio-inositol hexakisfosfato) a (1) mio-inositol, (2) mono-, di-, tri-, tetra- y penta-fosfatos del mismo y (3) fosfato inorgánico. De aquí en adelante, para abreviar, a los compuestos anteriores se les hará referencia a veces como IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5 y P, respectivamente. Esto significa que mediante la acción de una fitasa, IP6 es degradado en fosfato inorgánico y uno o más de los componentes IP5, IP4, IP3, IP2, IP1 y I. De forma alternativa, el mio-inositol que lleva en total n grupos fosfato fijados en las posiciones p, q, r,.. es denominado (Ins(p,q,r, ..)P_{n}).

Se conocen dos tipos diferentes de fitasas: una denominada 3-fitasa (mio-inositol hexakisfosfato 3- fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y una denominada 6-fitasa (mio-inositol hexakisfosfato 6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26). La 3-fitasa hidroliza primero el enlace estérico en la posición 3, mientras que la 6-fitasa hidroliza primero el enlace estérico en la posición 6. Los enlaces estéricos restantes del sustrato IP5 resultante (si el 1,2,4,5,6-IP5 o el 1,2,3,4,5- IP5) son posteriormente hidrolizados a diferentes niveles. También el nivel de hidrólisis de los componentes IP4, IP3, IP2 y IP1 parece ser variable, si se hidrolizan completamente.

Los microorganismos productores de fitasa incluyen bacterias tales como Bacillus subtilis (Paver y Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102-1108) y Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207-1220); levadura tal como Saccharomyces cerevisiae (Navini y Marcakis, 1984, Lebensmittei Wissenschaft und Technologie 17: 24-26; y hongos del género de Aspergillus tal como Aspergillus terreus (Yamada et al.; 1986; Agricultural Biological Chemistry 322: 1275-1282).

Se han descrito la clonación y expresión de los genes de la fitasa de Aspergillus niger var. awamori por Piddington et al. (1993, Gene 133: 55-62) y Aspergillus niger (ficuum) por van Hartingsveldt et al. (1993, Gene 127: 87-94; EP 420 358).

El ácido fítico es el almacenamiento primario a partir del fosfato en granos de cereales, leguminosas, y semillas oleaginosas, como la soja, que son los principales componentes de los piensos para animales. No obstante, la presencia de ácido fítico en los piensos para animales para animales monogástricos es indeseable debido a las fracciones de fosfato de los minerales esenciales del quelato de ácido fítico y posiblemente por las proteínas que los hacen nutricionalmente indisponibles. Además, el fósforo de fitato pasa a través del tracto gastrointestinal de los animales monogástricos y no es metabolizado. Puesto que el fósforo es un elemento esencial para el crecimiento de todos los organismos, el pienso para el ganado debe ser suplementado con fosfato inorgánico. De este modo, la técnica ha descrito el uso de las fitasas en piensos para animales monogástricos.

Además, puesto que el ácido fítico no es metabolizado por los animales monogástricos, es excretado en el abono. La cantidad de abono producido mundialmente ha aumentado significativamente como resultado de una mayor producción de ganado. La disposición de abono ha provocado un problema medioambiental en varios lugares alrededor del mundo, debido a la acumulación de fosfato particularmente en el agua. Así, la técnica también ha descrito el uso de las fitasas para reducir la cantidad de fitato en el abono.

Existe una necesidad en la técnica de fitasas nuevas con propiedades mejoradas que puedan ser producidas en cantidades comercialmente significantes.

Es un objeto de la presente invención el hecho de proporcionar una clase nueva de fitasas, es decir, 3,6-fitasas, es decir, fitasas que atacan ambos enlaces de un fosfoéster.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad 3,6-fitasa seleccionados del grupo que consiste en:

(a): un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2;

(b): un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse bajo condiciones de astringencia media con (i) la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 o (ii) su cadena complementaria;

(c): una forma alélica de (b) o (c); y

(d): un fragmento de (b), (c), o (d).

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La presente invención también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos y a los constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como a los métodos para producir los polipéptidos. La presente invención también se refiere a piensos compuestos y a métodos para reducir los niveles de fitato.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1 muestra un autorradiograma del análisis de hibridación de Southern de ADN genómico de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 con una sonda del gen de la fitasa.

Figura 2 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 (SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2, respectivamente).

Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos para las fitasas de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 y Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 (SEC ID NO:3).

Figura 4 muestra un mapa de restricción de pDM181.

Figura 5 muestra un mapa de restricción de pMWR48.

Figura 6 muestra una comparación de la termostabilidad de las fitasas de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 y de Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135.

Figura 7 muestra perfiles de actividad del pH de las fitasas de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 y de Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135.

Figura 8 muestra perfiles de temperatura-actividad de las fitasas de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 y de Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135.

Figura 9 muestra espectros de la RMN, gráficos de barras apiladas (hasta 24 h), que muestran el perfil del producto de una fitasa de Aspergillus niger (ficuum).

Figura 10 muestra espectros de la RMN, gráficos de barras apiladas (hasta 24 H), que muestran el perfil del producto de una fitasa de Thermomyces lanuginosus.

Figura 11 muestra espectros de la RMN, gráficos de barras apiladas hasta 4.5 h, que muestran el perfil del producto de una fitasa de Aspergillus niger (ficuum).

Figura 12 muestra espectros de la RMN, gráficos de barras apiladas hasta 4.5 h, mostrando el perfil del producto de una fitasa de Thermomyces lanuginosus.

Figura 13 muestra espectros de la RMN, que muestran el perfil del producto de una fitasa de Aspergillus niger (ficuum) y una fitasa de Thermomyces lanuginosus, después de veinte minutos.

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Descripción detallada de la invención Polipéptidos con actividad fitasa

En una primera forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos con actividad 3,6-fitasa. Así, los polipéptidos de este aspecto de la invención pertenecen a una clase nueva de fitasas que presentan alta afinidad inicial para la posición 6 así como a la posición 3 del ácido fítico, en otras palabras no es ni una 3-fitasa ni una 6-fitasa pero menos específica de la posición de lo que hasta ahora se había proporcionado para cualquier fitasa conocida. Preferiblemente, estos polipéptidos tienen una mayor afinidad inicial a la posición 3 que a la posición 6. Además, estos polipéptidos son obtenidos de una cepa fúngica, más preferiblemente de una cepa filamentosa fúngica. En una forma de realización más preferida, el polipéptido es obtenido de Thermomyces, más preferiblemente de Thermomyces lanuginosus, y más preferiblemente de la cepa CBS 586.94.

En una segunda forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con un grado de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2 de al menos aproximadamente un 60%, preferiblemente al menos aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, más preferiblemente al menos un 95% a, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 97%, que retiene cualitativamente la actividad fitasa de los polipéptidos (de aquí en adelante "polipéptidos homólogos"). En una forma de realización preferida, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por cinco aminoácidos, preferiblemente por cuatro aminoácidos, más preferiblemente por tres aminoácidos, incluso más preferiblemente por dos aminoácidos, y más preferiblemente por un aminoácido de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2. Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado por el método Clustal (Higgins; 1989; CABIOS 5: 151-153) con una tabla de identidad, una penalización de espacio de 10; y una penalización de longitud de espacio de 10.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos homólogos difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2 por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza inferior, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o a la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido de enlace de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de enlace.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, p. ej., por H. Neurath y R.L. Hill; 1979; En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Nal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Nal, Ala/Glu, y Asp/Gly así como los mismos a la inversa.

En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a los polipéptidos con actividad 3,6-fitasa con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2; y formas alélicas y fragmentos de los mismos que retienen actividad fitasa. Preferiblemente, un fragmento contiene al menos 400 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 425 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente al menos 475 residuos de aminoácidos.

En una tercera forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad 3,6-fitasa que son codificados por secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse bajo condiciones de astringencia alta, media, o baja con una sonda de oligonucleótidos que se hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus; 1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York), y con las formas alélicas y fragmentos de la misma. La hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos análoga hibrida a la sonda de oligonucleótidos correspondiente al polipéptido que codifica parte de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC ID NO:1; bajo condiciones de baja a alta astringencia (por ejemplo, prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE; 0,3% SDS; 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y bien 50, 35 o 25% de formamida para astringencias altas, medias y bajas, respectivamente), según procedimientos de transferencia de Southern estándares.

La secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos parcial de la misma puede ser usada para diseñar una sonda de oligonucleótidos, o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención, tal como la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO: 1. o una subsecuencia de la misma, puede ser usada para identificar y clonar polipéptidos que codifican el ADN con actividad fitasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas pueden ser usadas para la hibridación con el ADN genómico o el ADNc del género o especie de interés, conforme a los procedimientos de transferencia de Southern estándares, para identificar y aislar el gen correspondiente de las mismas. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían tener al menos 15, preferiblemente al menos 25. y más preferiblemente al menos 40 nucleótidos de longitud. Se pueden usar también sondas más largas. Se pueden usar ambas sondas de ADN y de ARN. Las sondas son normalmente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P; ^{3}H; ^{35}S, biotina, o avidina).

De esta manera, una biblioteca genómica, de ADNc o de química combinatoria obtenida a partir de estos otros organismos puede ser seleccionada para el ADN que se hibrida con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido con actividad fitasa. El ADN genómico o de otro tipo de estos otros organismos puede ser separado por electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede ser transferido a e inmovilizado en nitrocelulosa u otra materia portadora adecuada. Para identificar un clon o ADN que es homólogo a la SEC ID NO:1; se usa la materia portadora en un Southern blot donde la materia portadora es finalmente lavada tres veces durante 30 minutos cada vez usando 2XSSC; 0,2% de SDS preferiblemente a no más de 50ºC, más preferiblemente a no más de 55ºC, incluso más preferiblemente a no más de 60ºC, y más preferiblemente a no más de 65ºC. Las moléculas a las que se hibrida la sonda de oligonucleótidos bajo estas condiciones son detectadas usando una película de rayos X.

En una forma de realización preferida, los polipéptidos aislados de la presente invención son codificados por secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse bajo condiciones de astringencia media con una sonda de oligonucleótidos que se hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria, y con las formas alélicas y fragmentos de la misma. En una forma de realización más preferida, los polipéptidos aislados de la presente invención son codificados por las secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse bajo condiciones de astringencia alta con una sonda de oligonucleótidos que se hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria, y con sus formas alélicas y fragmentos de la misma.

La presente invención también se refiere a polipéptidos con identidad inmunoquímica o identidad inmunoquímica parcial al polipéptido nativo de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94. En esta forma de realización, se utiliza un polipéptido según la presente invención para producir anticuerpos que son inmunorreactivos o que se enlazan con epítopos del polipéptido. Un polipéptido con identidad inmunoquímica al polipéptido nativo de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 significa que un antisuero que contiene anticuerpos contra el polipéptido nativo de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 reacciona con el otro polipéptido en una forma idéntica tal como fusión total de precipitados, morfología de precipitados idéntica, y/o movilidad electroforética idéntica usando una técnica inmunoquímica específica. Otra explicación de identidad inmunoquímica está descrita por Axelsen, Bock, y Krøll, en N.H. Axelsen, J. Krøll, y B. Weeks, editores, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 10. Identidad inmunoquímica parcial significa que un antisuero que contiene anticuerpos contra el polipéptido nativo de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 reacciona con el otro polipéptido en una forma parcialmente idéntica tal como fusión parcial de precipitados, morfología de precipitados parcialmente idéntica, y/o movilidad electroforética parcialmente idéntica usando una técnica específica inmunoquímica. Otra explicación de identidad inmunoquímica parcial está descrita por Bock y Axelsen, en N.H. Axelsen, J. Kroll, y B. Weeks, editores, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 11. Las propiedades inmunoquímicas son determinadas por pruebas de identidad de reacción cruzada inmunológica por el procedimiento bien conocido de doble inmunodifusión de Ouchterlony. Específicamente, se obtiene un antisuero contra el polipéptido de la invención mediante la inmunización de conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por Harboe y Ingild, en N.H. Axelsen, J. Krøll, y B. Weeks, editores, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, Capítulo 23, o Johnstone y Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente páginas 27-31).

Los polipéptidos que son codificados por las secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de hibridarse con una sonda de oligonucleótidos que se híbrida con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria y con sus formas alélicas y fragmentos de la misma, los polipéptidos homólogos y los polipéptidos con propiedades inmunológicas idénticas o parcialmente idénticas pueden ser obtenidos a partir de microorganismos de cualquier género. Preferiblemente, se obtienen a partir de una fuente bacteriana. En otra forma de realización preferida, estos polipéptidos son obtenidos a partir de una fuente fúngica. Las fuentes para este tipo de polipéptidos son cepas del género Thermomyces y especies de las mismas disponibles en depositarios públicos. Además, tales polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos de otras fuentes que comprenden microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas mencionadas arriba. Las técnicas para aislar microorganismos de sus hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. La secuencia de ácidos nucleicos puede luego ser derivada de forma similar mediante la selección de una biblioteca de ADNc de otro microorganismo, en particular un hongo, tal como una cepa de Aspergillus sp., en particular una cepa de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae, una cepa de Trichoderma sp., en particular una cepa de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride, o una cepa de Fusarium sp., en particular una cepa de Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sulphureum, o Fusarium venenatum, o una cepa de Humicola sp., o una cepa de Aureobasidium sp., Cryptococcus sp., Filibasidium sp., Magnaporthe sp., Myceliophthora sp., Neocallimastix sp., Paecilomyces sp., Piromyces sp., Talaromyces sp., Thermoascus sp., Thielavia sp., o Schizophylium sp. Una vez que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), la secuencia puede ser aislada o clonada utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al.; 1989; supra).

Los polipéptidos de la presente invención son preferiblemente obtenidos de especies de Thermomyces que comprenden, pero no se limitan a, Thermomyces ibadanensis, Thermomyces lanuginosus, Thermomyces stellatus, y Thermomyces verrucosus. Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen Gmbh (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

En una forma de realización más preferida, un polipéptido de la presente invención es obtenido a partir de Thermomyces lanuginosus, y más preferiblemente de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 o una cepa mutante de la misma, p. ej., el polipéptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2.

Un polipéptido de la presente invención puede además ser obtenido a partir de otros hongos que son sinónimos de Thermomyces como se describe por S.C. Jong, J.M. Birmingham, y G. Ma en ATCC Names of Industrial Fungi, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 1994 o M.B. Ellis en Dematiaceous Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Institute, Surrey, Inglaterra, 1971. Por ejemplo, sinónimos de Thermomyces lanuginosus incluyen Acremoniella thermophila, Humicola lanuginosa, Monotospora lanuginosa, y Sepedonium lanuginosum. La presente invención también comprende las fitasas obtenidas a partir de hongos que son teleomorfos de Thermomyces. El género Thermomyces es un elemento terrestre del grupo de los hongos hifomicetes dematiáceos. Las colonias son extendidas, algodonosas o aterciopeladas, y grises, grises verdosas, amarillentas, marrones negruzcas oscuras o negras. Los micelios son parcialmente superficiales, parcialmente inmersos. Los conidióforos son micronematosos o semi-macronematosos, mononematosos, de cadena recta o irregularmente ramificados, rectos o flexibles, incoloros o marrones, y homogéneos. Las células conidiógenas son monoblásticas, integradas y terminales o discretas, determinadas, cilíndricas o lageniformes. Las conidias son solitarias, secas, acrógenas, simples, esféricas a subesféricas o angulares y lobuladas, pálidas a marrón oscuro negruzco, homogéneas o verrugosas, y con O septos. No se conoce ningún estado fialídico.

Para objetivos de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza en este caso en relación con una fuente dada significará que el polipéptido es producido por la fuente o por una célula donde un gen de la fuente ha sido insertado.

Tal y como se define aquí, un polipéptido "aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos sin fitasa, p. ej., con al menos aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, de la forma más preferible aproximadamente un 90% de pureza, y de la forma incluso más preferible aproximadamente un 95% de pureza, según ha sido determinado por SDS-PAGE.

Los polipéptidos de la presente invención están caracterizados como teniendo una gran actividad a temperaturas elevadas. Más específicamente, estos polipéptidos tienen una actividad fitasa máxima a cerca de 65ºC y una actividad parcial incluso a 75ºC. Por el contrario, la fitasa de Aspergillus niger está esencialmente inactiva a 65ºC.

Secuencias de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido de la presente invención. En una forma de realización preferida, la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido obtenido de Thermomyces, p. ej., Thermomyces lanuginosus, y en una forma de realización más preferida, la secuencia de ácidos nucleicos es obtenida de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94, p. ej., la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1. En una forma de realización más preferida, la secuencia de ácidos nucleicos es la secuencia contenida en el plásmido pMWR46 que está contenido en Escherichia coli NRRL 21527 b. La presente invención también comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2, que difiere de la SEC ID NO:1 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de la SEC ID NO:1 que codifican un fragmento de la SEC ID NO:2 que retiene la actividad fitasa. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 1200 nucleótidos, más preferiblemente al menos 1275 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 1425 nucleótidos.

Como se ha descrito anteriormente, las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser obtenidas de microorganismos que son sinónimos o teleomorfos de Thermomyces tal y como se define por M.B. Ellis, 1971, supra o Jong et al., 1994, supra.

Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento del ADN genómico, la preparación a partir de ADNc, o una combinación de estas técnicas. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención a partir de tal ADN genómico puede ser efectuada, p. ej., usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida o la selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar los fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden usar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación a base de secuencias de ácidos nucleicos (NASBA). La secuencia de ácidos nucleicos puede ser clonada a partir de una cepa de Thermomyces productora del polipéptido, u otro organismo o uno relacionado y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de la especie de la región codificante del polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos.

El término secuencia de ácidos nucleicos "aislada" como se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., con al menos aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60%, de pureza, incluso más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, de la forma más preferible aproximadamente un 90% de pureza, y de la forma incluso más preferible aproximadamente un 95% de pureza, según ha sido determinado por electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada puede ser obtenida mediante procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos desde su ubicación natural a un sitio diferente donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, inserción del fragmento en una molécula del vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucleicos serán replicados. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de estos orígenes.

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 de al menos aproximadamente un 60%, preferiblemente al menos aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, de la forma más preferible al menos aproximadamente un 95%, y de la forma incluso más preferible al menos aproximadamente un 97%, que codifican un polipéptido activo. Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos está determinado por el método de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) con una tabla de identidad, una penalización de espacio de 10, y una penalización de longitud de espacio de 10.

La modificación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similares" al polipéptido se refiere a las formas del polipéptido sin origen natural. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna forma creada genéticamente del polipéptido aislado de su fuente nativa. Por ejemplo, puede ser interesante sintetizar variantes del polipéptido donde las variantes difieren en su actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, o similar usando, p. ej., la mutagénesis sitio dirigida. La secuencia análoga puede ser construida en base a la secuencia de ácidos nucleicos presentada como la parte codificante del polipéptido de la SEC ID NO:1, p. ej., una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos, pero que corresponde al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107.

Será evidente para los expertos en la técnica que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula y además resultan en un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos aislada de la invención, y en consecuencia preferiblemente no sometida a la sustitución, puede ser identificada según procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida o la mutagénesis de rastreo de alanina (véase, p. ej., Cunningham y Wells, 1989, Science 244:1081-1085). En esta técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas con respecto a su actividad fitasa para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción enzima-sustrato pueden también ser determinados por análisis de la estructura tridimensional según ha sido determinado por técnicas tales como el análisis de resonancia magnética nuclear, el marcado por cristalografía o por fotoafinidad (véase, p. ej., de Vos et al., 1992, Science 255, 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309, 59-6).

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles donde otro polipéptido está fusionado en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido mediante la fusión de una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidos en la técnica, e incluyen, la ligación de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que éstas estén en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del(los) mismo(s) promotor(es) y terminador.

La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad 3,6-fitasa codificada por secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de hibridarse bajo condiciones de astringencia media con una sonda de oligonucleótidos que se hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria (Sambrook et al., 1989, supra). La hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos análoga hibrida a la sonda de oligonucleótidos correspondiente a la parte codificante del polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC ID NO: 1 bajo condiciones estándares.

Como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos parcial de la misma puede ser usada para diseñar una sonda de oligonucleótidos, o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención, tal como la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma puede también ser usada como una sonda, para aislar genes homólogos de cualquier género o especie.

Constructos de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

"Constructo de ácidos nucleicos" se define aquí como una molécula de ácidos nucleicos, bien mono o bicatenaria, que está aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos que se combinan y se yuxtaponen en tal modo que de lo contrario no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos puede ser sinónimo del término casete de expresión cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. El término "secuencia codificante" tal y como se define aquí es una secuencia que está transcrita en ARNm y traducida en un polipéptido de la presente invención cuando es puesta bajo el control de las secuencias de control anteriormente mencionadas. Los bordes de la secuencia codificante son generalmente determinados por un codón ATG de iniciación de la traducción en el término 5' y un codón de detención de la traducción en el término 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no está limitada a, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes.

Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada de varias maneras para proporcionar para la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de clonación son bien conocidos en la técnica.

El término "secuencias de control" está definido aquí para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucleicos. Cada secuencia de control puede ser nativa o externa a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptidos, un promotor, una secuencia señal, y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales transcripcionales y de parada traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores para introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección, incluidos los promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, el gen de la agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de la levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de la alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de la amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de la lactamasa de Bacillus licheniformis (penP), los genes xyL4 y xylB de Bacillus subtilis, y el gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 :3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (como se describe en la patente U.S. No. 4,288,627, que está incorporada aquí por referencia), y promotores, mutantes, truncados, e híbridos de los mismos. Los promotores particularmente preferidos para el uso en células huéspedes filamentosas fúngicas son la TAKA amilasa, NA2-tpi (un híbrido de los promotores de genes que codifican la a-amilasa neutra de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y promotores de glaA.

En un huésped de levadura, los promotores útiles son obtenidos del gen de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, el gen de la galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, los genes de la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y el gen de 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488. En una célula huésped de mamífero, los promotores útiles incluyen promotores víricos tales como aquellos de Virus Símico 40 (SV40), virus del Sarcoma de Rous (RSV), adenovirus, y virus del papiloma bovino (BPV).

La secuencia de control puede también ser una secuencia del terminador de la transcripción adecuado, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador es operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención.

Los terminadores preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para células huéspedes de la levadura son obtenidos a partir de los genes que codifican la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), o la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de la levadura están descritos por Romanos et al., 1992, supra. Las secuencias del terminador son bien conocidas en la técnica para células huéspedes de mamífero.

La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Los líderes preferidos para las células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae.

Los líderes adecuados para las células huéspedes de la levadura son obtenidos a partir del gen de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, el gen de la fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y los genes de la alcohol deshidrogenasa/g liceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y que, cuando es transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, y la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Las secuencias de poliadenilación útiles para las células huéspedes de la levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990. Las secuencias de poliadenilación son bien conocidas en la técnica para las células huéspedes de mamífero.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del péptido señal, que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino del polipéptido que puede dirigir al polipéptido expresado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucleicos puede contener intrínsecamente una región codificante del péptido señal enlazada naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es externa a esta parte de la secuencia codificante que codifica el polipéptido segregado. La región codificante del péptido señal externo puede ser requerida cuando la secuencia codificante normalmente no contiene una región codificante del péptido señal. De forma alternativa, la región codificante del péptido señal externo puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para obtener una secreción mejorada de la fitasa relativa a la región codificante del péptido señal natural normalmente asociado a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal puede ser obtenida a partir de una glucoamilasa o de un gen de amilasa de una especie de Aspergillus, una lipasa o gen de proteinasa de una especie de Rhizomucor, el gen para el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, una amilasa o un gen de proteasa de una especie de Bacillus, o el gen de preproquimosina de ternera. No obstante, cualquier región codificante del péptido señal capaz de dirigir la fitasa expresada en la vía secretora de una célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Una región codificante del péptido señal eficaz para las células huéspedes bacterianas es la región codificante del péptido señal obtenida a partir del gen de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, el gen de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, el gen de la subtilisina de Bacillus licheniformis, el gen de la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, los genes de las proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, y el gen prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señales están descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137.

Una región codificante del péptido señal eficaz para células huéspedes filamentosas fúngicas es la región codificante del péptido señal obtenida del gen de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, el gen de la amilasa neutra de Aspergillus niger, el gen de la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, el gen de la celulasa de Humicola lanuginosa, o el gen de la lipasa de Rhizomucor miehei.

Los péptidos señales útiles para células huéspedes de la levadura son obtenidos a partir de los genes para el a-factor de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes del péptido señal útiles están descritas por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del propéptido, que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido está generalmente inactivo y puede ser convertido en un polipéptido maduro activo por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido puede ser obtenida a partir del gen de la proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, el gen de la proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, el gen del alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, o el gen de la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención pueden también comprender una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más factores que son ventajosos en la expresión del polipéptido, p. ej., un activador (p. ej., un factor de actuación en trans), una chaperona, y una proteasa de procesamiento. Cualquier factor que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más de estos factores no están necesariamente en serie con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido.

Un activador es una proteína que activa la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai y Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica un activador puede ser obtenida a partir de genes que codifican la NprA (nprA) de Bacillus stearothermophilus, la proteína 1 hemoactivadora (hap1) de Saccharomyces cerevisiae, la proteína 4 metabolizadora de la galactosa (gal4) de Saccharomyces cerevisiae, y la proteína reguladora de amonio de Aspergillus nidulans. Para ejemplos adicionales, véase Verdier, 1990, supra y MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307.

Una chaperona es una proteína que ayuda a otro polipéptido para un doblamiento adecuado (Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething y Sambrook, 1992, Nature 355: 33-45; Puig y Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771; Wang y Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1: 381-384). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una chaperona puede ser obtenida a partir de los genes que codifican las proteínas GroE de Bacillus subtilis, la proteína disulfuro isomerasa de Aspergillus oryzae, calnexina de Saccharomyces cerevisiae, BiP/GRP78 de Saccharomyces cerevisiae, y Hsp70 de Saccharomyces cerevisiae. Para ejemplos adicionales, véase Gething y Sambrook, 1992, supra, y Hartl et al., 1994, supra.

Una proteasa de procesamiento es una proteasa que corta un propéptido para generar un polipéptido maduro biogímicamente activo (Enderlin y Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839-852). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteasa de procesamiento puede ser obtenida de los genes que codifican la dipeptidilaminopeptidasa de Saccharomyces cerevisiae, Kex2 de Saccharomyces cerevisiae, y la endoproteasa de procesamiento dibásico (xpr6) de Yarrowia lipolytica.

Puede también ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que provocan la expresión del gen que será activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen sistemas del operador lac, tac, y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 puede ser usado. En los hongos filamentosos, el promotor de la TAKA alfa-amilasa, el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser usados como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de la metalotioneina que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido sería operativamente enlazada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor, y señales transcripcionales y de parada traduccional. Las distintas secuencias de control y de ácidos nucleicos anteriormente descritas pueden ser unidas entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido en tales sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede ser expresada insertando la secuencia de ácidos nucleicos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión, y posiblemente para la secreción.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o un virus) que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que pueden provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que tiene que ser introducido el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que haya sido integrado. El sistema del vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que tiene que ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos como por ejemplo resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Un marcador mamífero usado frecuentemente es el gen de la dihidrofolato reductasa. Marcadores adecuados para las células huéspedes de la levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Un marcador seleccionable para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica puede ser seleccionado del grupo que incluye, pero no se limita a amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato red uctasa), pyG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), y marcadores de resistencia al glufosinato, al igual que equivalentes de otras especies. Para el uso en una célula de Aspergillus son preferidos los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Además, la selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej., como se describe en WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está en un vector separado.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula.

Los vectores de la presente invención pueden ser integrados en el genoma de la célula huésped al introducirse en una célula huésped. Para la integración, el vector puede depender de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para una integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos además permiten que el vector sea integrado en el genoma de la célula huésped en un(os) lugar(es)
en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y más preferiblemente 800 a 1.500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia blanco correspondiente para incrementar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos nucleicos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga. Estas secuencias de ácidos nucleicos pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a una secuencia blanco en el genoma de la célula huésped, y, además, pueden ser secuencias no codificantes o codificantes.

Para la replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAM131 que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CENE. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que provoque que su temperatura de funcionamiento sea sensible en la célula huésped (véase, p. ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).

Más de una copia de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para amplificar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. Una amplificación estable de la secuencia de ácidos nucleicos puede ser obtenida integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped usando métodos bien conocidos en la técnica y seleccionando para transformantes.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por el experto en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

Células huéspedes

La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, que es ventajosamente usada en la producción recombinante de los polipéptidos. El término "célula huésped" comprende cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a mutaciones que tienen lugar durante la replicación.

La célula es preferiblemente transformada con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según la invención seguido de la integración del vector en el cromosoma huésped. "Transformación" significa introducir un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped de modo que el vector sea mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. La integración se considera generalmente como una ventaja ya que la secuencia de ácidos nucleicos tiene más posibilidades de ser mantenida estable en la célula. La integración del vector en el cromosoma huésped puede ocurrir por recombinación homóloga o no homóloga según se ha descrito anteriormente.

La elección de una célula huésped en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y de su fuente. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota. Las células unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megarerium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o de Bacillus subtilis. La transformación de una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplastos (véase, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), usando células competentes (véase, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823- 829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), por electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), o por conjugación (véase, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278).

La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica. Las células mamíferas útiles incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO), las células HeLa, las células de riñón de cría de hámster (BHK), las células COS, o cualquier cantidad de otras líneas celulares inmortalizadas disponibles, p. ej., de la American Type Culture Collection.

En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" según se utiliza en este caso incluye los filos de Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (según está definido por Ainsworth y Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) así como los Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra). Grupos representativos de Ascomycota incluyen, p. ej., Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus), y las levaduras reales enumeradas más abajo. Ejemplos de Basidiomycota incluyen hongos, royas, y carbones. Grupos representativos de Chytridiomycota incluyen, p. ej., Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces, y hongos acuáticos. Grupos representativos de Oomycota incluyen, p. ej., hongos acuáticos Saprolegniomycetous (moldes de agua) tales como Achlya. Ejemplos de hongos mitospóricos incluyen Aspergillus, Penicillium, Candida, y Alternaria. Grupos representativos de Zygomycota incluyen, p. ej., Rhizopus y Mucor.

En una forma de realización preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascosporogénea (Endomycetales), levadura basidiosporogénea, y levadura de los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Las levaduras ascosporogéneas se dividen en las familias Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. Esta última está compuesta de cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (p. ej., género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae, y Saccharomycoideae (p. ej., géneros Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces). Las levaduras basidiosporogéneas incluyen los géneros Leucosporidim, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y Filobasidiella. La levadura perteneciente a los Hongos Imperfectos se divide en dos familias, Sporobolomycetaceae (p. ej., géneros Sorobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (e.g., género Candida). Puesto que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura será definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980. La biología de la levadura y la manipulación de la genética de la levadura son bien conocidas en la técnica (véase, p. ej., Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., y Stopani, A.O.M., editors, 2ª Edición, 1987; The Yeasts, Rose, A.H., y Harrison, J.S., editors, 2ª edición, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., editors, 1981).

En una forma de realización más preferida, la célula huésped de la levadura es una célula de una especie de Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, o Yarrowia.

En una de las formas de realización más preferidas, la célula huésped de la levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped de la levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En una forma de realización preferida, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según está definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se hace mediante el injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo. En una forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de una especie de, pero no limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, y Trichoderma.

En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Humicola. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Mucor. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Myceliophthora. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Neurospora. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Penicillium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Thielavia. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Tolypocladium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Trichoderma.

En una de las formas de realización más preferidas, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra de las formas de realización más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusárium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sulphureum, o Fusarium venenatum. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Humicola insolens o de Humicola lanuginosa. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Mucor miehei. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Myceliophthora thermophilum. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Neurospora crassa. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Penicillium purpurogenum. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Thielavia terrestris. En otra de las formas de realización más preferidas, la célula de Trichoderma es una célula de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y en Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Un método adecuado para transformar especies de Fusarium está descrito por Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156 o en la serie divisional estadounidense No. 08/269,449. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y en Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920. Las células mamíferas pueden ser transformadas por absorción directa usando el método de precipitación de fosfato cálcico de Graham y Van der Eb (1978, Virology 52:546).

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Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una cepa de Thermomyces para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la expresión del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

En ambos métodos, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada mediante el cultivo en un frasco de agitación, fermentación a poca o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, de flujo discontinuo, o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y de carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, p. ej., referencias a bacterias y levadura; Bennett, J.W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, CA, 1991). Los medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, se recupera a partir de lisatos celulares.

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Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático, o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático puede ser usado para determinar la actividad del polipéptido. Los procedimientos para determinar la actividad fitasa son conocidos en la técnica e incluyen, p. ej., el ensayo de fosfato inorgánico liberado del ácido fítico.

El resultante polipéptido puede ser recuperado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. El polipéptido recuperado puede luego ser purificado adicionalmente por una variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej., cromatografía de intercambio jónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, o similar.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (p. ej., de intercambio fónico, de afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfoque, y por exclusión de tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Composiciones polipeptídicas

En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a composiciones polipeptídicas que son enriquecidas con un polipéptido de la presente invención. En el contexto presente, el término "enriquecido" se destina a indicar que la actividad 3,6-fitasa de la composición polipeptídica ha sido aumentada, p. ej., con un factor de enriquecimiento de 1.1, convenientemente debido a la adición de un polipéptido de la invención.

La composición polipeptídica puede ser una que comprenda un polipéptido de la invención como el componente más importante enzimático, p. ej., una composición polipeptídica monocomponente. De forma alternativa, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, una amilasa, una carbohidrasa, una carboxipeptidasa, una catalasa, una celulasa, una quitinasa, una cutinasa, una ciclodextrina glicosiltransferasa, una desoxiribonucleasa, una esterasa, una alfa-galactosidasa, una beta-galactosidasa, una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una beta-glucosidasa, una haloperoxidasa, una invertasa, una lacasa, una lipasa, una manosidasa, una oxidasa, una enzima pectinolitica, una peroxidasa, una fitasa, una polifenoloxidasa, una enzima proteolitica, una ribonucleasa, o una xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) pueden ser producibles mediante un microorganismo del género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae, o Trichoderma, Humicola, preferiblemente Humicola insolens, o Fusarium, preferiblemente Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense. Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sulphureum, o Fusarium venenatum.

Las composiciones polipeptídicas pueden ser preparadas conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. El polipéptido que debe ser incluido en la composición puede ser estabilizado de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Se proporcionan ejemplos más abajo de usos preferidos de las composiciones polipeptídicas de la invención. La dosificación de la composición polipeptidica de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición puede ser determinada en base a métodos conocidos en la técnica.

Usos

La presente invención también está relacionada generalmente con el uso del polipéptido de la presente invención para catalizar la liberación de fosfato inorgánico a partir de fitato o ácido fítico.

Más específicamente, los polipéptidos pueden ser usados en composiciones alimentarias para humanos o en composiciones de piensos para animales o como aditivos para este tipo de preparaciones, donde la fitasa mejora la digestibilidad, promueve el crecimiento, y mejora la utilización de los alimentos y de los piensos o su eficiencia de conversión.

Una "composición de piensos" y una "composición alimentaria", respectivamente, significa cualquier dieta natural o artificial, comida o similar o componentes de comidas de este tipo destinados o adecuados para ser comidos, ingeridos, digeridos, por un animal y un ser humano, respectivamente.

Un "aditivo para alimentos o piensos" es un compuesto esencialmente puro o una composición multicomponente destinada a o adecuada para ser añadida a alimentos o piensos. Normalmente comprende uno o más compuestos tales como vitaminas, minerales o enzimas mejoradoras de los piensos y portadores y/o excipientes adecuados, y está normalmente proporcionado en una forma que es adecuada para ser añadido a los piensos.

La invención también se refiere a composiciones y aditivos para alimentos y piensos que en consecuencia comprenden un polipéptido de la invención.

Una cantidad eficaz del polipéptido en alimentos o piensos es de aproximadamente 10-20.000, preferiblemente de aproximadamente 10 a 15.000, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 10.000, en particular de aproximadamente 100 a 5.000, especialmente de aproximadamente de 100 a aproximadamente 2.000 U/kg de pienso o alimento.

La invención también se refiere a un método para reducir los niveles de fitato en el abono animal, comprendiendo la alimentación de un animal con un alimento que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención.

También dentro del campo de la invención se incluye el uso de un polipéptido de la invención durante la preparación de preparaciones o aditivos alimentarios o para piensos, es decir, el polipéptido ejerce su actividad fitasa sólo durante la producción y no está activo en el producto final de los alimentos o piensos. Este aspecto es relevante por ejemplo en la panificación.

La presente invención también se refiere al uso de los polipéptidos en métodos para licuar un almidón, comprendiendo (a) tratamiento del almidón con un polipéptido según la reivindicación 1 antes o simultáneamente con licuefactante; (b) adición de una \alpha-amilasa al almidón; y (c) reacción del almidón de la fase (b) durante un tiempo y a una temperatura eficaz para licuar el almidón. En este proceso, el polipéptido cataliza la hidrólisis del fitato asociado con el almidón.

La presente invención también se refiere a unas plantas transgénicas y partes de la planta tales como semillas vegetales, y células vegetales, que han sido transformadas con una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la invención para expresar o producir esta enzima. La presente invención también se refiere a composiciones y usos de plantas de este tipo y partes de la planta, especialmente como piensos y alimentos o aditivos en consecuencia.

Las plantas transgénicas pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas, para abreviar una dicot o una monocot. Las plantas de interés primario son aquellas que son componentes alimenticios o de piensos potenciales y que comprenden ácido fitico. Un nivel de ácido fitico normal de los componentes alimenticios es 0,1-100 g/kg, o más normalmente 0,5-50 g/kg, de la forma más normal 0,5-20 g/kg. Ejemplos de plantas monocot son hierbas, tales como poa pratense (pasto azul, Poa), pasto de forraje tal como festuca, lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, p. ej. trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (mazorca).

Ejemplos de plantas dicot son legumbres, tales como altramuces, guisantes, judías y semilla de soja, y crucíferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de aceite colza y el organismo modelo muy relacionado Arabidopsis thaliana.

Tales plantas transgénicas, partes de la planta y células vegetales son capaces de degradar su propio ácido fítico, y por consiguiente la necesidad de añadir tales enzimas a los alimentos o piensos comprendiendo estas plantas es reducida. Preferiblemente, las plantas y partes de la planta, p. ej. las semillas, son trituradas o molidas, y posiblemente también puestas a remojo antes de ser añadidas a los alimentos o piensos o antes del uso, p. ej. ingesta, de la misma, con el propósito de adaptar la velocidad de la degradación enzimática al uso real.

Si se desea, el polipéptido producido por la planta puede también ser recuperado de la planta. En ciertos casos, la recuperación de la planta debe ser preferida con el propósito de asegurar una formulación estable al calor en un proceso potencial de granulación posterior.

Ejemplos de partes de la planta son el tallo, callo, hojas, raíz, frutas, semillas, tubérculos etc. pero también cualquier tejido vegetal está incluido en esta definición.

La presente invención también se refiere a la progenie de estas plantas, partes de la planta y células vegetales.

Un experto en la técnica sabrá cómo construir un constructo de expresión de ADN para su inserción en la planta en cuestión, teniendo en cuenta, entre otras cosas, si la enzima debería ser excretada de forma tejido específica. Para esta evaluación es relevante la estabilidad (estabilidad de pH, degradabilidad por proteasas endógenas etc.) de la fitasa en los compartimientos de expresión de la planta. El experto también podrá seleccionar secuencias reguladoras apropiadas tales como las secuencias del promotor y del terminador, y secuencias señal o de tránsito si fueran necesarias (Tague et al., 1988, Plant Phys. 86:506).

Las plantas, partes de la planta y células vegetales pueden ser transformadas con este constructo de ADN usando cualquier método conocido. Un ejemplo de este método es la transformación por un vector vírico o bacteriano tal como especies bacterianas del género Agrobacterium creadas genéticamente para comprender el gen que codifica la fitasa de la invención. Además, los métodos para introducir directamente la ADN fitasa en la célula vegetal o tejido vegetal son conocidos en la técnica, p. ej., microinyección y electroporación (Gasser et al., Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Techn. 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Después de la transformación, los transformantes son seleccionados usando cualquier método conocido por el experto, tras lo cual son regenerados en plantas enteras.

Estas plantas, partes de la planta y células vegetales al igual que su descendiente luego llevan el ADN codificante de la fitasa como una parte de su equipamiento genético.

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicots transgénicas (para revisión véase Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38). Debido a las limitaciones de rango del huésped generalmente no es posible transformar monocots con la ayuda de A. tumefaciens. Aquí, se deben emplear otros métodos. El método de elección para generar monocots transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de oro microscópico o de tungsteno revestidas con el ADN transformante) de callos embrionarios o de embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674).

También son métodos preferidos otros sistemas para el suministro del ADN libre en estas plantas, que incluyen vectores víricos (Joshi & Joshi, 1991. FEBS Lett. 281: 1-8), la transformación de protoplastos por medio de polietilenglicol o electroporación (para revisión véase Potyrkus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225), la microinyección de ADN en protoplastos de mesofilo (Crossway et al., 1986. Mol. Gen. Genet. 202: 79-85), y la macroinyección de ADN en brotes florales jóvenes de plantas de cereales (de la Pena et al., 1987, Nature 325: 274-276).

En general, el ADNc o gen que codifica la fitasa de la invención es colocado en un casete de expresión (p. ej., Pietrzak et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 5857-5868) que consiste en un promotor activo adecuado en la planta blanco y un terminador adecuado (terminación de la transcripción). Este casete (que por supuesto incluye un marcador de selección adecuado, véase más abajo) será transformado en la planta como tal en el caso de monocots por medio del bombardeo de partículas. En el caso de dicots el casete de expresión es colocado primero en un vector adecuado suministrando los bordes del T-ADN y un marcador de la selección adecuado que a su vez son transformados en Agrobacterium tumefaciens. Las dicots serán transformadas por medio del Agrobacterium que alberga el casete de expresión y el marcador de selección flanqueado por T-ADN según los protocolos estándares (p. ej. Akama et al., 1992, Plant Cell Reports 12: 7-11). La transferencia de T-ADN de Agrobacterium a la célula vegetal ha sido revisada recientemente (Zupan & Zambryski, 1995, Plant Physiol. 107: 1041-1047). Los vectores para la transformación vegetal por medio de Agrobacterium están comercialmente disponibles o pueden ser obtenidos de muchos laboratorios que construyen este tipo vectores (p. ej., Deblaere et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 4777-4788; para revisión véase Klee et al., 1987, Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 467-486).

Promotores vegetales disponibles: dependiendo del proceso bajo manipulación, se podrá requerir la expresión órgano y/o célula específica así como el control desarrollable y medioambiental apropiado. Por ejemplo, es deseable expresar una ADNc fitasa en endosperma de maíz etc. El promotor usado más frecuentemente ha sido el promotor 35S- CaMV constitutivo (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). La expresión será más o menos igual en la planta entera. Este promotor ha sido usado exitosamente para crear genéticamente plantas resistentes a los herbicidas y patógenos (para revisión véase Stitt & Sonnewald, 1995, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 341-368). Promotores órgano específicos han sido proporcionados para almacenar tejidos sumidero tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), y para tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878).

La presente invención también se refiere al uso de una fitasa de la invención durante la preparación de preparaciones o aditivos alimentarios o de piensos, es decir la fitasa ejerce su actividad fitasa durante sólo la producción y no está activa en el producto final del alimento o pienso. Esta forma de realización se aplica a la fabricación y cocción de la masa.

La presente invención está posteriormente descrita por los ejemplos siguientes, los cuales no deberían ser interpretados como limitadores del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Extracción de ADN genómico de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94

Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 fue hecha crecer en 25 ml de un medio con el 0,5% de extracto de levadura-2% de glucosa (YEG) durante 24 horas a 32ºC y 250 rpm. Los micelios fueron luego recogidos por filtración a través de Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) y lavados una vez con 25 ml de un tampón 10 mM Tris-1 mM EDTA (TE). El exceso de tampón fue drenado de los micelios que fueron posteriormente congelados en nitrógeno líquido. Los micelios congelados fueron molidos hasta un polvo fino en un molinillo de café eléctrico, y el polvo fue añadido a 20 ml de tampón TE y 5 ml de dodecilsulfato de sodio al 20% p/v (SDS) en un tubo centrífugo de plástico desechable. La mezcla fue suavemente invertida varias veces para asegurar la mezcla, y extraída dos veces con un volumen igual de fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1 v/v/v). Acetato sódico (solución 3 M) fue añadido para dar una concentración final de 0,3 M y los ácidos nucleicos fueron precipitados con 2,5 volúmenes de etanol helado. El tubo fue centrifugado a 15.000 x g durante 30 minutos y el granulado se dejó secar al aire durante 30 minutos antes de la resuspensión en 0,5 ml de tampón TE. Se añadió ribonucleasa A sin ADNsa a una concentración de 100 \mug/ml y la mezcla fue incubada a 37ºC durante 30 min. Luego se añadió proteinasa K (200 \mug/ml) y la mezcla fue incubada durante una hora adicional a 37ºC. Finalmente, la mezcla fue extraída dos veces con fenol:cloroformo: isoamil alcohol (25:24:1 v/v/v) antes de precipitar el ADN con acetato sódico y etanol. El granulado de ADN fue secado al vacío, resuspendido en tampón TE, y almacenado a 4ºC.

Ejemplo 2 Análisis de hibridación de ADN genómico

La muestra de ADN celular total preparada como se describe en el Ejemplo 1 fue analizada por hibridación de Southern (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Aproximadamente 5 \mug de la muestra de ADN fueron digeridos con BamHI o PstI y fraccionados por tamaños en gel de agarosa al 1%. El gel fue fotografiado bajo una luz UV de poca longitud de onda y puesto a remojo durante 15 minutos en 0,5 M de NaOH-1,5 M de NaCl seguido de 15 minutos en 1 M de Tris-HCl pH 8-1,5 M de NaCl. El ADN del gel fue transferido a una membrana de hibridación Nytran^{TM} (Schleicher & Schuell, Keene, NH) por transferencia capilar en 20 X SSPE (3 M de cloruro de sodio - 0,2 M de fosfato dibásico de sodio- 0,02 M de EDTA) según Davis et al. (1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). La membrana fue horneada durante 2 horas a 80ºC al vacío y fue puesta a remojo durante 2 horas en el siguiente tampón de hibridación a 45ºC con agitación suave: 5 X SSPE, 25% de formamida (v/v), 0,3% de SDS, y 200 \mug/ml de ADN de testículos de salmón desnaturalizado y fragmentado. Un fragmento de sonda específica de fitasa (aproximadamente 1,6 kb) fue radiomarcado por la técnica de nick translation, o traslado de mellas, (Maniatis et al., 1982, supra) con \alpha[^{32}P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) y añadido al tampón de hibridación a una actividad de aproximadamente 1 x 10^{6} cpm por ml de tampón. La mezcla fue incubada con la membrana durante toda la noche a 45ºC al baño maría con agitación. Después de la incubación, la membrana fue lavada una vez en 1.0 X SSPE con SDS al 0,1% a 45ºC seguido de dos lavados en 1.0 X SSPE (sin SDS) a la misma temperatura. La membrana fue secada en una toalla de papel durante 15 minutos, luego envuelta en Saran-Wrap^{TM} y expuesta a una película de rayos X durante toda la noche a -70ºC con filtros intensificadores (Kodak, Rochester, NY).

La transferencia de Southern indica que la sonda puede ser usada como sonda para identificar y clonar el gen de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 como se muestra en la Figura 1.

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Ejemplo 3 Bibliotecas de ADN e identificación de clones de fitasa

Se construyeron bibliotecas de ADN genómico usando el vector de clonación bacteriófago \lambdaZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) con células Y1090ZL de E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD) como huésped para colocar en placas y purificar el bacteriófago recombinante y DH10Bzip de E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD) para la escisión de clones de pZL1-fitasa individuales. El ADN celular total fue parcialmente digerido con Tsp5091 y dividido por tamaños en geles de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN que varían en la gama de tamaño de 3-7 kb fueron cortados y eluidos del gel usando reactivos de Prep-a-Gene (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Los fragmentos de ADN eluidos fueron ligados con los brazos del vector \lambdaZipLox defosforilados y cortados con EcoRI (Life Technologies, Gaithersburg, MD), y las mezclas de ligación fueron envasadas usando extractos de envasado comercial (Stratagene, La Jolla, CA). Las bibliotecas de ADN envasadas fueron colocadas en placas y amplificadas en células Y1090ZL de E. coli (Life Technologies Gaitersburg, MD). Aproximadamente 30.000 placas de la biblioteca fueron seleccionadas por hibridación de las placas con la sonda de fitasa radiomarcada descrita en el Ejemplo 2. Un clon positivo que hibrida fuertemente a la sonda fue seleccionado y purificado dos veces en células Y1090ZL de E. coli. El clon de fitasa fue posteriormente cortado del vector XZipLox como clones de fitasa de pZL1 (D'Alessio et al., 1992, Focus® 14: 76) produciendo DH5\alpha (pMWR46) de E. coli.

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Ejemplo 4 Secuenciación del ADN del gen de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94

El mapeo de restricción del clon de pZL1-fitasa de DH5\alpha (pMWR46) de E. coli descrito en el Ejemplo 3 fue realizado usando métodos estándares (Maniatis et al., 1982, supra). La secuenciación del ADN de los clones de fitasa fue realizada con un secuenciador de ADN automatizado modelo 373A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando la técnica de paseo de cebadores con la química del terminador por colorante (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47-60). Además de los cebadores lac-directo y lac-inverso, los cebadores de secuenciación de oligonucleótidos específicos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN/ARN modelo 394 de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 5 Propiedades del gen de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94

Secuenciación del ADN de una parte de un gen de la fitasa clonado de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 (E. coli DH5\alpha - pMWR46) demostró un marco de lectura abierto (SEC ID NO:1) (Figura 2) con homología al gen de la fitasa de Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 (Figura 3).

Las posiciones de intrones y exones dentro del gen de fitasa Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 fueron asignados en base a alineamientos de la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de aminoácidos deducida del producto genético de la fitasa de Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 correspondiente. En base a esta comparación, el gen de fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 está compuesto de 2 exones (47 y 1377 pares de bases) que están interrumpidos por 1 intrón pequeño (56 pares de bases). El tamaño y composición del intrón es consecuente con aquellos de otros genes fúngicos (Gurr et al., 1987, En Kinghorn, J.R. (ed.), Gene Structure in Eukaryotic Microbes, pp. 93-139, IRL Press, Oxford) en en los que todos contienen secuencias de aceptores y donadores de empalme de consenso así como la secuencia de lazo de consenso (PuCTPuAC) cerca del extremo 3' de cada secuencia intermedia.

La secuencia de aminoácidos deducida del producto genético de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 está mostrada en la figura 2 (SEC ID NO:2). En base a las reglas de von Heijne (1984, Journal of Molecular Biology 173: 243-251), los primeros 22 aminoácidos del producto genético de Thermomyces lanuginosus pueden comprender un péptido señal secretor que dirige el polipéptido naciente en el retículo endoplásmico. La fitasa madura es una proteína acídica (punto isoeléctrico predicho = 5.4) compuesta por 452 aminoácidos (PM = 51 kDa). La secuencia de aminoácidos deducida contiene el motivo de centro activo RHGXRXP (SEC ID NO:2) que es compartido por otras fitasas fúngicas conocidas (Ullah y Dischinger, 1993 Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 754-759).

La secuencia de aminoácidos deducida de la fitasa madura de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 comparte aproximadamente un 47,5% de identidad con la fitasa de Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 como se muestra en la Figura 3 (SEC ID NO:3).

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Ejemplo 6 Estudios de hibridación cruzada usando ADN genómico de otros hongos

El gen de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 fue usado como una sonda en experimentos de hibridación de Southern con muestras de ADN genómico de una variedad de géneros fúngicos. Los Southern blots fueron evaluados bajo condiciones de astringencia baja (25% de formamida, 5 X SSPE, 0,3% de SDS a 42ºC) y astringencia media (35% de formamida, 5 X SSPE, 0,3% de SDS a 42ºC). Las muestras de ADN genómico fueron aisladas de las especies siguientes usando el protocolo perfilado en el Ejemplo 1: Corynascus thermophilus (ATCC 22066), Fusarium graminearum (ATCC 20334), Humicola grisea var.thermoidea (ATCC 16453), Neurospora crassa (FGSC 987), Botrytis cinerea (ATCC 11542), Curvularia verruculosa (CBS 147.63), Rhizoctonia solani (IMI 358730) Trichoderma harzianum (CBS 819.68), Absidia sporophora-variabilis (ATCC 36019), Myceliophthora thermophila (CBS 117.65), y Penicillium diversum (CBS 320.48). Cada muestra de ADN (aprox. 5 \mug) fue digerida con BamHl antes de la electroforesis en un gel de agarosa al 1%. El ADN fue transferido a una membrana de nilón Zeta-Probe (BioRad Laboratories, Hercules, CA) y evaluado con una sonda de ADN con traslado de mellas comprendiendo el gen phy1. Las manchas fueron lavadas con 2 X SSPE \pm 0,1% de SDS a 42ºC.

El gen de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 realizó la hibridación cruzada con secuencias genéticas probables de la fitasa en varias otras especies fúngicas (tabla 1). Bajo condiciones de astringencia baja aparecieron señales de hibridación fuertes en ADNs de Corynascus thermophilus, Fusarium graminearum, Humicola grisea var. thermoidea, Neurospora crassa y, por supuesto, Thermomyces lanuginosus. Las señales más débiles fueron detectadas en Botrytis cinerea, Curvularia verruculosa, Rhizoctonia solani, y Trichoderma harzianum. No se detectó ninguna hibridación en Absidia sporophora-variabilis Myceliophthora thermophila, o Penicillium diversum. Usando astringencia media, señales de hibridación fuertes fueron visibles con sólo Corynascus thermophilus, Fusarium graminearum, y Thermomyces lanuginosus. Una hibridación débil fue observada con ADNs de Humicola grisea var. thermoidea y Neurospora crassa. Estos datos indican que el gen de la fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 puede ser usado como una sonda para clonar genes de la fitasa de otros hongos filamentosos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Hibridación de muestras de ADN genómico de varios hongos evaluados con el gen de la fitasa clonado de Thermomyces lanuginosus. A +++ indica una señal de hibridación positiva fuerte, + indica una señal débil, y, - indica hibridación no detectable

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Ejemplo 7 Construcción del vector pMWR48 de expresión de fitasa

Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados más abajo fueron diseñados para amplificar por PCR la secuencia codificante del gen de fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 del plásmido pMWR46 (DH5\alpha-pMWR46 de E. coli) para la subclonación y expresión en un huésped de Fusarium. Cebador directo: 5'-ATTTAAATGG
CGGGGATAGGTTTGG-3' (SEC ID NO:4) cebador inverso: 5'-CTTAATTAATCAAAAGCAGCGATCCC-3' (SEC ID NO:5) El cebador sentido fue diseñado para el primer ATC dentro del marco de lectura y se extiende 14 pares de bases en sentido descendente. El cebador antisentido fue diseñado para una región de 14 pares de bases en dirección ascendente del codón de detención traduccional y se extiende a través del codón de parada.

Para facilitar la subclonación del fragmento del gen en un vector de expresión designado pDM181 (figura 4), los sitios de restricción enzimática SwaI y PacI fueron introducidos en el extremo 5' y 3' del gen de la fitasa, respectivamente. El vector pDM181 contenía el promotor y terminador de la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787) como secuencias reguladoras. El plásmido también contenía el gen bar como un marcador seleccionable para transformaciones fúngicas (de Block et al., 1987, EMBO Journal 6:2513-2518).

Cien picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción de PCR que contenía 52 ng de pEJG13, 1X tampón Pwo (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 1 mM de cada DATP, dTTP, dGTP, y dCTP, y 2,5 unidades de PwoI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94ºC durante 2 minutos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 9 ciclos cada uno a 94ºC durante 15 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 15 ciclos cada uno a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto más 20 segundos para cada ciclo adicional; un ciclo a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 7 minutos; y un ciclo de remojo a 4ºC. El fragmento de ADN amplificado de 2866 pares de bases fue purificado por electroforesis en gel y cortado con las endonucleasas de restricción SwaI y PacI (usando condiciones especificadas por el fabricante). El fragmento cortado fue clonado en pDM181 (Figura 4) que había sido cortado previamente con SwaI y PacI dando como resultado el plásmido de expresión pMWR48 (Figura 5) en el que la transcripción del gen de la fitasa estaba bajo el control del promotor de proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. El plásmido pMWR48 fue transformado en células DH5a de E. coli. El transformante de E. coli conteniendo el plásmido pMWR48 fue aislado y el ADN del plásmido fue preparado según los procedimientos descritos por Sambrook et al., 1989, supra.

Ejemplo 8 Transformación de Fusarium CCl-3 y análisis de los transformantes

La cepa CCI-3 de Fusarium, un mutante morfológico altamente ramificado de la cepa A3/5 de Fusarium (ATCC 20334) (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555-562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284-1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555-562), fue hecha crecer en un medio líquido que contenía sales de Vogel, (Vogel, 1964, Am. Nature 98: 435-446), 25 mM de NaNO_{3}, y 1,5% de glucosa durante 4 días a 28ºC y 150 rpm. Las conidias fueron purificadas por filtración a través de 4 capas de estopilla y finalmente a través de una capa de Miracloth. Las suspensiones conidiales fueron concentradas por centrifugación. Cinquenta ml de medio YPG compuesto del 1% de extracto de levadura, 2% de bactopeptona, y 2% de glucosa fueron inoculados con aproximadamente 10^{8} conidias, e incubados durante 14 horas a 24ºC y 150 rpm. Las hifas resultantes fueron retenidas en un filtro estéril de 0,4 \muM y lavadas sucesivamente con agua destilada estéril y 1,0 M de MgSO_{4}. Las hifas fueron resuspendidas en 10 ml de solución NOVOZYM 234^{TM} (2-10 mg/ml en 1,0 M de MgSO_{4}) y digeridas durante 15-30 minutos a 34ºC con agitación a 80 rpm. El material hifal no asimilado fue eliminado de la suspensión resultante de protoplasto por filtración sucesiva a través de 4 capas de estopilla y a través de Miracloth. Veinte ml de sorbitol 1 M fueron combinados con la solución de protoplastos. Después de la mezcla, los protoplastos fueron comprimidos por centrifugado y lavados sucesivamente por resuspensión y centrifugado en 20 ml de sorbitol 1 M y en 20 ml de STC (0,8 M de sorbitol, 0,05 M de Tris pH 8.0, 0,05 M de CaCl_{2}). Los protoplastos lavados fueron resuspendidos en 4 partes de STC y 1 parte de SPTC (0,8 M de sorbitol, 40% de PEG 4000, 0,05 M de Tris pH 8.0, 0,05 M de CaCl_{2}) a una concentración de 5 x 10^{7}/ml. Cien \mul de suspensión de protoplastos fueron añadidos a 5 \mug de pMWR48 en tubos de polipropileno (17 x 100 mm), fueron mezclados e incubados en hielo durante 30 minutos. Un ml de SPTC fue mezclado suavemente en la suspensión de protoplastos y la incubación fue continuada a la temperatura ambiente durante 20 minutos. 12,5 ml de solución fundida (enfriada a 40ºC) que consistía en 1X sales de Vogel, 25 mM de NaNO_{3}, 0.8 M de sacarosa y 1% de agarosa de fusión baja (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) fueron mezclados con los protoplastos y luego colocados en placas sobre una placa de Petri vacía de 100 mm. La incubación fue continuada a la temperatura ambiente durante 10 a 14 días. Tras la incubación a la temperatura ambiente durante 24 horas, 12,5 ml del medio idéntico más 10 mg de basta (Hoechst Schering, Rodovre, Dinamarca) por ml fueron cubiertos sobre la placa de Petri. Basta fue extraído dos veces con fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1), y una vez con cloroformo:isoamil alcohol (24:1) antes del uso. Después de dos semanas, 17 transformantes aparecieron. Un fragmento micelial del borde de cada transformante fue transferido a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contenía un medio Vogel/BASTA. El medio contenía 25 g de sacarosa, 25 g de agar Noble, 20 ml de 50X sales de Vogel (Vogel, 1964, supra), 25 mM de NaNO_{3} y 10 g de basta por litro. La placa fue sellada en una bolsa de plástico para mantener la humedad y se incubó aproximadamente una semana a la temperatura ambiente.

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Ejemplo 9 Expresión del gen de fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94

Un fragmento micelial de cada uno de los 17 transformantes CCl-3 de Fusarium descritos en el Ejemplo 8 fueron inoculados en 20 ml de medio M400Da que contenía 50 g de maltodextrina, 2,0 g de MgSO_{4} -7H_{2}O, 2,0 g de KH_{2}PO_{4}, 4,0 g del ácido cítrico, 8,0 g de extracto de levadura, 2,0 g de úrea, y 0,5 ml de solución de metales traza por litro y se incubó durante 7 días a 30ºC y 150 rpm. El medio fue ajustado a pH 6.0 con 5 N de NaOH. La solución de metales traza contenía 14,3 g de ZnSO_{4} -7H_{2}O, 2,5 g de CuSO_{4} -5H_{2}O, 0,5 g de NiCl_{2}-6H_{2}O, 13,8 g de FeSO_{4}-7H_{2}O, 8,5 g de MnSO_{4}-H_{2}O, y 3,0 g de ácido cítrico por litro. El huésped no transformado fue también realizado como un control. Un ml de sobrenadante del cultivo fue cosechado a los 4, 5, y 7 días y almacenado a 4ºC. La actividad fitasa fue determinada como se describe más abajo.

Una muestra fue diluida en 0,2 M de tampón citrato pH 5.5 y 1 ml de la muestra diluida fue añadida a cada uno de dos tubos de ensayo. Dos mililitros de ácido tricloroacético (ATC) al 15% fueron añadidos a un tubo, mientras que el otro tubo fue preincubado a 40ºC durante 5 min. Un mililitro de solución de sustrato de fitato al 1% en 0,2 M de tampón citrato pH 5.5 fue posteriormente añadido a ambos tubos. Las muestras carentes de ATC fueron incubadas a 40ºC durante 30 minutos. Al final del periodo de incubación, 2 ml de ATC fueron añadidos y las muestras fueron dejadas refrescar. Un volumen de 100 microlitros de cada muestra fue luego diluido hasta 1 ml en agua y preincubado a 50ºC durante 5 minutos. Un mililitro de un reactivo que contenía 1:2:1:1 de 6 N de ácido sulfúrico:agua:2.5% amonio molibdato:10% ácido ascórbico fue añadida a cada muestra y las muestras fueron incubadas durante otros 15 minutos para desarrollar el color. El color resultante fue medido a 690 nm en unos lector de microplacas Thermomax de Molecular Devices (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Esporas de transformantes primarios productoras de la actividad fitasa máxima fueron generadas inoculando 20 ml de un medio que contenía por litro 12,1 g de NaNO_{3}, 50 g de ácido succínico, y 20 ml de 50X sales de Vogel (ajustadas a pH 6.0) con micelios e incubándolo a 30ºC con agitación durante 2-3 días. Las únicas esporas fueron aisladas extendiendo 150 ml de cultivo de esporas en placas micromanipuladoras que contenían 1X sales de Vogel, 25 mM de NaNO_{3}, 2,5% de sacarosa, 2% de agar Noble y 5 mg/ml de BASTA y usando un micromanipulator para transferir las esporas individuales a una región limpia de la placa. Después de 3 días de crecimiento a la temperatura ambiente, las esporas germinadas fueron transferidas a placas de Vogel individuales que contenían 5 mg/ml de BASTA.

Los sobrenadantes del cultivo de catorce de los diez transformantes primarios de pMWR48 fueron positivos al evaluarse su actividad fitasa. Dos transformantes primarios llamados transformante #3 y #5 fueron seleccionados para el aislamiento de esporas individuales en base a la actividad fitasa. Nueve aislados de esporas individuales fueron obtenidos. Frascos de agitación que contenían 25 ml de medio M400Da más 5 mg/ml de BASTA fueron inoculados por duplicado con trozos miceliales de cada aislado de esporas individuales y se incubaron a 30ºC. Partes alícuotas de un ml de los medios de cultivo fueron cosechadas a los cuatro, cinco, y siete días postinoculación y se evaluó su actividad fitasa. Los resultados de los ensayos de fitasa demostraron que ambos transformantes primarios produjeron actividad.

Ejemplo 10 Producción de fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 recombinante

El transformante primario #5 de Fusarium descrito en el Ejemplo 9 fue cultivado en dos fermentadores de 2 litros durante 7 días a 30ºC en un medio a pH 6.25 compuesto de 20 g de soja, 20 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura, 2 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de ácido cítrico, 3 g de K_{2}SO_{4}, 2 g de CaCl_{2}-2H_{2}O, y 0,5 ml de solución de metales traza por litro y se le suministró un medio compuesto de 300 g de glucosa, 20 g de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, y 1 g de ácido cítrico por litro. Un 2,5% de inóculo fue usado para las fermentaciones. El inóculo fue un cultivo de frasco de agitación de 48-72 horas compuesto de 62,5 g de Nutriosa, 2 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 10 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de K_{2}SO_{4}, 2 g de ácido cítrico, 10 g de extracto de levadura, 2 g de úrea, 0,5 g de CaCl_{2}, y 0,5 ml de solución de metales traza pH 6.0 por litro.

El caldo de cultivo entero fue filtrado usando una capa doble de Miracloth fijada en la parte superior de un vaso de precipitación de 4 litros con bandas de caucho. El filtrado fue recuperado y luego congelado a -20ºC.

Ejemplo 11 Purificación de fitasa de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 recombinante

El caldo congelado libre de células (1700 ml) descrito en el ejemplo 9 fue descongelado, aclarado por centrifugado a 10.000 x g, y concentrado a un volumen de 350 ml con una unidad de filtración de fibras huecas de Amicon equipada con un filtro Amicon S1Y10 (Amicon, Beverly, MA). La muestra fue ajustada a pH 7, diluida hasta una conductividad de 2 mS, y cargada a la temperatura ambiente en una columna Big Beads de Q-Sepharose de Pharmacia con un volumen de lecho de 75 ml (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) preequilibrada con 20 mM de tampón Tris-Cl de pH 7. La columna fue eluida a un nivel de flujo de 5 ml por minuto usando el tampón de equilibrio hasta que el efluente A_{280} disminuyó hasta la base de referencia. La columna fue luego eluida con un gradiente de 600 ml de NaCl 0-0,6 M en el mismo tampón a un nivel de flujo de 5 ml por minuto. La actividad enzimática de la fitasa fue determinada midiendo el índice de hidrólisis de 10 mM de fosfato de p-nitrofenilo en 405 nm de tampón de 0,2 M de citrato sódico pH 5.5 y 30ºC en un volumen de reacción de 200 \mul usando un lector de microplacas Thermomax de Molecular Devices. La actividad enzimática unida se eluyó en fracciones correspondientes a aprox. 0,2 M de NaCl.

Las fracciones activas fueron agrupadas y concentradas por ultrafiltración con una membrana Amicon PM-10 (Amicon, Beverly, MA) hasta un volumen de 25 ml, diluidas hasta una conductividad de 0,9 mS, y cargadas a 4 ml por minuto en una columna 10/16 MonoQ HR de Pharmacia (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) preequilibrada en un tampón MOPS 20 mM pH 7. La columna fue eluida con 80 ml del tampón de equilibrio y luego con un gradiente de 400 ml de NaCl 0-0,5 M en el mismo tampón. La actividad enzimática fue detectada en fracciones usando el ensayo de p-nitrofenil fosfato anteriormente descrito. Las fracciones activas fueron también analizadas con un gel de SDS-poliacrilamida con un gradiente del 10-27% de Novex según las instrucciones del fabricante (Novex, San Diego, CA) y las fracciones fueron agrupadas para ser sustancialmente purificadas si la electroforesis lo juzgara necesario.

Las fracciones agrupadas fueron concentradas con una membrana Amicon PM-10 por ultrafiltración e intercambiadas en un tampón MES 20 mM pH 5.5. La conductividad de la muestra fue 1,1 mS. Un tercio de esta muestra fue cargado a 1 ml por minuto sobre una columna Mono S HR 5/5 de Pharmacia (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) preequilibrada con un tampón MES 20 mM pH 5.5. La columna fue eluida con 5 ml del tampón de equilibrio y luego con un gradiente lineal de 25 ml de cloruro sódico 0-0.6 M en el mismo tampón. Las fracciones activas fueron agrupadas después del análisis electroforético para eliminar aquellas que contenían contaminantes de metales traza.

La fitasa purificada de Thermomyces lanuginosus CBS 586,94 recombinante resultó homogénea por el análisis de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida con un único componente que tenía un peso molecular de aproximadamente 60.000 daltons.

Ejemplo 12 Caracterización fisicoquímica de la fitasa purificada de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 recombinante

Todas las caracterizaciones fueron realizadas con la fitasa purificada de Thermomyces lanuginosus CBS 586.94 recombinante descrita en el Ejemplo 11. Las comparaciones fueron también hechas donde se observaron con una fitasa estándar de Aspergillus niger (ficuum) obtenida de Novo Nordisk NS, Bagsvmrd. Dinamarca.

Punto isoeléctrico. El punto isoeléctrico (pi) de la fitasa de Thermomyces fue determinado para la fitasa de Aspergillus niger. El isoelectroenfoque (IEF) fue realizado con un gel con IEF pH 3-7 de Novex (Novex, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. IEF estándares de Pharmacia (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y de BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA) fueron usados para calibrar el gel.

El IEF demostró que la fitasa de Thermomyces contenía componentes múltiples con pls en la gama de 4.7 a 5.2, mientras que se observó que la fitasa de Aspergillus niger tenía un pl de 4.8-5.0.

Análisis de la secuencia amino terminal. La fitasa purificada de Thermomyces recombinante fue sometida a un análisis de secuencias de proteínas amino terminales en un secuenciador modelo 476A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante con suministro de TFA de fase líquida y HPLC en línea para la separación del PTH- aminoácido. Las muestras fueron transferidas a un filtro de fibra de vidrio con TFA recubierto de Biobrene^{TM} (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) y secuenciadas directamente.

El análisis de la secuencia amino terminal de la fitasa purificada reveló tres componentes. El componente mayor (aprox. 60%) es H_{2}N-His-Pro-Asn-Val-Asp-Ile-Ala-Arg-His-Trp-Gly-Gln-Tyr-Ser-Pro-Phe-Phe-Ser-Leu-Ala (SEC ID NO:2) que correspondía a un sitio de seccionamiento kex2 en la posición 34 en el producto primario de la traducción. Dos secuencias menores, (aprox. 30%) H_{2}N-Gly-Glu-Asp-Glu-Pro-Phe-Val-Arg-Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg-Val-Val-Pro-Leu-His-Gly (SEC ID NO:2) y (aprox.10%) H,N-Ser-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Glu-Asp-Glu-Pro-Phe-Val-Arg-Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg (SEC ID NO:2) correspondía a sitios de seccionamiento interno cerca del extremo COOH terminal de la proteína en las posiciones 428 y 435 en el producto primario de la traducción.

Estudios de cinética enzimática. Estudios de cinética enzimática fueron realizados en la fitasa de Thermomyces y la fitasa de Aspergillus niger. Los estudios fueron realizados por ensayo de fosfato inorgánico liberado del ácido fítico del maíz (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO). Se realizaron reacciones enzimáticas estándares durante 30 minutos a 37ºC y pH 5.5 en ácido fítico al 0,5% p/p. La reacción fue detenida por la adición de un volumen igual de ácido tricloroacético al 15% p/p. Tras el enfriamiento, 100 \mul de la mezcla resultante fueron diluidos en 1,0 ml de agua destilada de vidrio. La muestra fue incubada a 50ºC durante 5 minutos. Se añadió reactivo colorante (1,0 ml) y la incubación a 50ºC fue continuada durante 15 minutos. La absorbencia de una alícuota de 200 \mul fue medida a 690 nm con un lector de microplacas Thermomax de Molecular Devices. El reactivo colorante está compuesto de 6 N de ácido sulfúrico: agua: 2,5% (p/v) heptamolibdato de amonio tetrahidrato: 10% ascorbato (acuoso) en una proporción de 1:2:1:1 y preparado al instante en una base diaria. La cuantificación se basó en una curva estándar generada con un fosfato de sodio monobásico estándar de 10 mM. Una unidad (U) está definida como un pmol de fosfato inorgánico liberado por minuto a 37ºC y pH 5.5.

Las mediciones cinéticas del estado estacionario fueron hechas por titulación del sustrato. Las concentraciones de fitato fueron 2,16, 1,08, 0,541, 0,216, 0,108, y 0,0758 mM para la determinación de K_{m}. Las concentraciones de fitato de 1,08: 0,541: 0,216 y 0,108 mM en presencia o ausencia de 1 mM de fosfato monobásico de sodio fueron usadas para el propósito de evaluar la inhibición del producto.

Las mediciones cinéticas de régimen estacionario demostraron que la fitasa de Thermomyces tiene una K_{m} aparente, de aproximadamente 110 \muM con respecto al fitato mientras que la fitasa de Aspergillus niger tiene una K_{m} aparente de 200 \muM. Hubo una indicación débil de inhibición del exceso de sustrato en la concentración de sustrato 2,16 mM, quizás congruente con el informe bibliográfico de inhibición superior a 2 mM para la fitasa de Aspergillus (Ullah, 1988, Preparative Biochemistry 18: 443-458). Las mediciones cinéticas de estado estacionario con 1 mM de fosfato presente no pudieron revelar ningún tipo de inhibición con este producto. Se estimó que la K_{i} para el fosfato debe exceder 3 mM para no ser detectable en nuestros experimentos. Por el contrario, Ullah (Ullah, 1988, supra) ha declarado que el fosfato es un inhibidor competitivo de la fitasa de Aspergillus con una K_{i} de 1.9 mM.

Medición de la termostabilidad. La termostabilidad de la fitasa de Thermomyces fue comparada con la fitasa de Aspergillus niger. Las muestras de la fitasa de Thermomyces y la fitasa de Aspergillus niger fueron disueltas en 100 U por ml en un tampón 0,2 M de citrato sódico pH 5.5. Las partes alícuotas (100 pl) de cada solución enzimática fueron incubadas durante 20 minutos al baño maría a las temperaturas siguientes: 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70 y 75ºC. Después de los tratamientos de temperatura, las muestras fueron almacenadas a 0ºC hasta que se realizaron los ensayos de actividad. Cada muestra fue diluida 1:80 en un tampón 0,2 M de citrato sódico pH 5.5 conteniendo 0,01% p/p de Tween 20 y el ensayo de actividad estándar anteriormente descrito fue realizado.

La comparación de los perfiles de termostabilidad enzimática (Figura 6) sugirió que las diferencias de estabilidad entre las dos enzimas son pequeñas. No obstante, la enzima tampoco es completamente inactivada por una incubación a alta temperatura y el perfil de actividad residual es consecuente con la desnaturalización térmica parcialmente reversible (Ullah y Mullaney, 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 227: 311-317).

Medición de la actividad y del pH. El perfil de la actividad y del pH de la fitasa de Thermomyces fue comparado con el de la fitasa de Aspergillus niger. Para lograr una gama amortiguadora entre pH 2-7, se empleó un tampón de glicina-acetato-citrato 0,125 M de tres componentes. Los componentes del tampón fueron combinados a concentraciones finales de 42 mM por componente y ácido fítico fue añadido como un sólido al 1% p/p. Esta mezcla fue ajustada a pH 7 con HCl concentrado y una alícuota de 10 ml fue eliminada. Esto fue realizado para cada incremento de pH de 0.5 hasta pH 2.

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Las soluciones stock enzimáticas de 20 U por ml fueron preparadas en un tampón MES de 20 mM pH 5.5. El sustrato (850 microlitros) en un tampón a un pH dado fue combinado con 100 microlitros de agua y 50 microlitros de solución stock enzimática y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Posteriormente la reacción enzimática fue detenida con 1 ml de ATC al 15% y cuantificada por el método estándar.

La comparación del perfil de la actividad y del pH de la fitasa de Thermomyces y de Aspergillus indica una similitud sustancial entre las dos enzimas en el perfil de pH (figura 7). No obstante, la fitasa de Thermomyces está también activa a pH neutro mientras que la enzima de Aspergillus no lo está. Informes anteriores en la bibliografía (véase, por ejemplo, Sandberg, et al., 1996, J. Nutr. 126: 476 480) sugieren que la fitasa de Aspergillus posee dos pH óptimos. Es más posible que estos informes estén basados en un material impuro conteniendo trazas de la fosfatasa ácida de Aspergillus que es bien conocida en la bibliografía (Zyla, 1993, World J. Microbiol. Biotechnol. 9: 117-119).

Medición de la actividad-temperatura. El perfil de actividad-temperatura de la fitasa de Thermomyces fue comparada con la fitasa de Aspergillus niger. Soluciones stock enzimáticas de 12,5 U por ml fueron preparadas en 0,2 M de tampón citrato sódico pH 5.5. 250 microlitros de sustrato de ácido fítico al 1% fueron añadidos a un tubo de Eppendorf de 1,7 ml seguido de 240 microlitros de 0,2 M de tampón citrato sódico pH 5.5. Esta solución fue removida y colocada al baño maría a la temperatura designada. Después de un equilibrio de 20 minutos al baño maría, el tubo de Eppendorf fue removido y se añadieron 10 microlitros de solución de fitasa. La muestra fue removida e incubada al baño maría durante 30 minutos adicionales. Después de 30 minutos al baño maría, la reacción fue detenida con 1 ml de ATC al 15% y cuantificada por el método de ensayo anteriormente descrito.

La medición de la actividad enzimática como función de la temperatura reveló una diferencia significante entre las dos enzimas (figura 8). La fitasa de Thermomyces presenta actividad enzimática máxima a cerca de 65ºC y tiene actividad parcial incluso a 75ºC mientras que la fitasa de Aspergillus niger está esencialmente inactiva a 65ºC.

Hidrólisis del fitato. Se realizó una comparación de la capacidad de las fitasas de Thermomyces y de Aspergillus niger para hidrolizar el ácido fítico. Cada fitasa (0,5 U de actividad enzimática por ml) fue incubada con bien el 0,5% o el 0,1% de ácido fítico a pH 5.5 y 37ºC durante 10 horas. Los resultados revelaron que las fitasas de Aspergillus niger y de Thermomyces liberaron cantidades idénticas (70%) del fósforo total teóricamente disponible después de 10 horas con concentraciones del 0,5% o del 0,1% de ácido fítico.

Ejemplo 13 Perfil del producto con resolución temporal de la hidrólisis del ácido fítico catalizada por fitasa mediante espectros- copia ^{1}H RMN

Se investigó la hidrólisis del ácido fítico catalizada por fitasa de Thermomyces y por una fitasa de Aspergillus niger comercial (fitasa Novo®) (27 mM de fitato, 1 FYT/ml, pH 5.5, y 27ºC) mediante ^{1}H RMN perfilando la mezcla del producto en el transcurso de 24 horas.

A continuación (Ins(p,q,R,..)Pn indica mio-inositol que lleva en total n grupos de fosfato fijados en las posiciones p, q, r,..

La técnica proporciona información específica sobre los puntos iniciales de incursión por la enzima en ácido fítico, así como información sobre la identidad del producto final. Por otro lado, los modelos en desarrollo de los valores máximos que reflejan la composición de las mezclas del producto intermedio, proporcionan una medida cualitativa, una impresión dactilar, adecuada para la identificación de similitudes y de diferencias entre enzimas individuales.

Los espectros de la RMN fueron registrados a 300ºK (27ºC) en un instrumento Bruker DRX400 equipado con una cabeza de sonda inversa selectiva de 5 mm. Dieciséis exploraciones precedidas por 4 exploraciones simuladas fueron acumuladas usando una anchura de barrido de 2003 Hz (5 ppm) cubierto por puntos de datos de 8 K. La atenuación de la resonancia de HOD residual fue conseguida por un periodo de presaturación de 3 segundos. Los espectros fueron referenciados hasta la señal de HOD (\delta4.70).

Muestras de ácido fítico para los análisis de RMN fueron preparadas como sigue: ácido fítico (100 mg, sal de dipotasio de ácido fítico, Sigma P-5681) fue disuelto en agua desionizada (4,0 ml) y el pH fue ajustado a 5.5 por adición de NaOH acuoso (4 N). Se añadió agua desionizada (ad 5 ml) y partes de 1 ml, cada una correspondiendo a 20 mg de ácido fítico, fueron transferidas a frascos de tapón de rosca y el solvente fue evaporado (centrifugadora de vacío). Las muestras secas fueron disueltas en óxido de deuterio (2 ml, Merck 99,5% D) y nuevamente evaporado a sequedad (almacenado a -18ºC hasta el uso).

Para el análisis de la RMN, una muestra de ácido fítico de 20 mg fue disuelta en óxido de deuterio (1,0 ml, Merck 99,95% D). La solución fue transferida a un tubo de RMN y el espectro ^{1}H RMN fue registrado. Se añadió la solución enzimática (1 FTU, disuelta en/diluida, según lo apropiado, con óxido de deuterio) seguido de una mezcla profunda (1 minuto). Los espectros ^{1}H RMN fueron registrados inmediatamente después de la adición de la enzima (t=0), luego después de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 150, 165, 180, 195, 210 minutos (= 3.5 horas), 4,5, 5,5, 6,5, 7,5, 8,5, 9,5, 11,5, 13,5, 15,5, 17,5, 19,5, 21,5, y 23,5 horas. Se midió el pH en el tubo de la RMN. Espectros adicionales fueron adquiridos después de 48 y 120 horas (5 días), donde una parte de sustrato (6 mg de ácido fítico) fue añadida a una sonda si la enzima retuvo su actividad catalítica.

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Mediante el análisis de la RMN de 2D de las mezclas de fosfato de inositol obtenidas por digestión parcial del ácido fítico, junto con datos de la RMN publicados (Scholz, P.; Bergmann, G., y Mayr, G.W.: Methods in Inositide Research (Ed. Irvine, R.F.), pp. 65-82, Raven Press, Ltd., Nueva York (1990)), señales de ^{1}H RMN características atribuibles a Ins(1,2,3,4,5,6) P_{6} (PA), Ins(1,2,4,5,6)P_{5}, Ins(1,2,3,4,5)P_{5}, Ins(1,2,5,6)P_{4}, Ins(1,2,6)P_{3}, Ins(1,2)P_{2}, y Ins(2)P, fueron identificadas y permitieron una cuantificación relativa de estas especies durante el transcurso de la reacción.

Gráficos apilados de perfiles del producto para la fitasa de Aspergillus y la fitasa de Thermomyces que cubre 24 horas de tiempo de reacción están presentados en las Figuras 9 y 10, respectivamente.

La señal a \delta3,25(t) representa H-5 en Ins(1,2)P_{2} mientras que la señal a 83,18(t) representa H-5 en Ins(2)P. Ins(1,2)P_{2} comienza a acumularse después de aproximadamente 4 horas de tiempo de reacción con la fitasa de Aspergillus y después de aproximadamente 2 horas de tiempo de reacción con la fitasa de Thermomyces. Ins(2)P es observada después de aproximadamente 10 horas de reacción con la fitasa de Aspergillus y después de aproximadamente 5 horas de reacción con la fitasa de Thermomyces. Después de 24 horas de reacción, la cantidad o nivel de Ins(1,2)P_{2} es muy baja para ambas fitasas, mientras que la cantidad de Ins(2)P es máxima para ambas fitasas después de 24 horas.

Por consiguiente, los perfiles observados después de 24 horas de tiempo de reacción demuestran que ambas fitasas degradan PA en Ins(2)P. La especie completamente defosforilada, el inositol (SNI), no fue observada en modo alguno.

Para ambas enzimas la mezcla reactiva a 24 h comprendió además de Ins(2)P cantidades inferiores de Ins(1,2)P_{2}. Los tiempos de reacción prolongados (varios días) resultaron en la desaparición del Ins(1,2)P_{2} residual, pero la especie completamente defosforilada, el inositol (SNI), no fue observada en modo alguno. La observación no se explica por la inhibición/desnaturalización irreversible de la enzima, puesto que las enzimas retuvieron sus actividades catalíticas durante períodos prolongados, según fue demostrado por su capacidad para digerir partes frescas de ácido fítico añadido a los tubos de la RMN después de mantenerlos 5 días a la temperatura ambiente.

Las Figuras 11 y 12 representan con más detalle los perfiles en desarrollo durante las 4,5 horas iniciales. La Figura 13 muestra que H-3 en Ins(1,2,4,5,6)P_{5} (designado A) muestra una señal a \delta 3,66(dd), H-6 en Ins(1,2,3,4,5)P_{5} (B) una señal a \delta 3,87(t) y H- 3 en Ins(1,2,5,6)P_{4} (C) una señal a \delta 3,56(dd). El compuesto A corresponde a fosfato que ha sido hidrolizado en la posición 3, B en la posición 6 y C en la posición 3 y 4.

La Figura 11 muestra que el compuesto A es el producto primario mayor (t=5 min) que utiliza la fitasa de Aspergillus, mientras que en el compuesto B no aparece. En el compuesto C aparece después de 20-25 minutos.

En cambio, la Figura 12 (la fitasa de Thermomyces) muestra que el compuesto A así como el compuesto B son producidos muy temprano, es decir, dentro de los primeros 15 minutos, probablemente más compuesto A que B.

Las señales a \delta 4,82(dt, H-2), 4,38 (q, H-4/H-6), 4,13(q, H-5) y 4,11(dt,H1/H3) son atribuibles al sustrato, el ácido fítico. Las Figuras 11 y 12 muestran que estos valores máximos disminuyen mucho más rápido (es decir, dentro de una hora) con la fitasa de Thermomyces que con la fitasa de Aspergillus.

Depósito de materias biológicas

La cepa siguiente ha sido depositada según el tratado de Budapest en la colección de cultivos en materia de patentes del servicio de investigación agrícola (NRRL), Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA.

Cepa	Número de acceso	Fecha de depósito
DH5\alpha E. coli (pMWR46)	NRRL B-21527	23 de Febrero de 1996

La cepa ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente a una determinada por el Comisiario de Patentes y Marcas para tener derecho a ellas bajo 37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. El depósito representa un cultivo substancialmente puro de cada cepa depositada. El depósito está disponible según está requerido por las leyes de patente extranjeras en países donde se depositan los equivalentes de la solicitud en cuestión, o su progenie. No obstante, debe ser entendido que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la invención en cuestión en derogación de los derechos resultantes de las patentes concedidos por acción gubernamental.

La invención descrita y reivindicada aquí no debe ser limitada en su alcance por las formas de realización específicas aquí descritas, puesto que estas formas de realización están previstas como ilustraciones de diferentes aspectos de la invención. No se prevé que alguna forma de realización equivalente esté incluida dentro del campo de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí se volverán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. También se prevé que tales modificaciones estén también dentro del campo de las reivindicaciones anexas.

Varias referencias están citadas en la presente, las descripciones estando incorporadas por referencia en su totalidad.

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Patentes citadas en la descripción

\bullet EP 420358 A [0005]

\bullet US 4288627 A [0046]

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\bullet WO 9117243 A [0069]

\bullet EP 238023 A [0086]

\bullet US 08269449 B [0086]

\bullet WO 9600787 A [0135]

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\bulletNAVINI; MARCAKIS. Lebensmittei Wissenschaft and Technologie, 1984, vol. 17, 24-26 [0004]

\bulletYAMADA et al. Agricultural Biological Chemistry, 1986, vol. 322, 1275-1282 [0004]

\bulletPIDDINGTON et al. Gene, 1993, vol. 133, 55-62 [0005]

\bulletHARTINGSVELDT et al. Gene, 1993, vol. 127, 87-94 [0005]

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\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Berka, Randy M.

\hskip3.9cm

Ray, Michael W.

\hskip3.9cm

Klotz, Alan V.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: polipéptidos con actividad de fitasa y ácidos nucleicos que los codifican

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Novo Nordisk of North America, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 405 Lexington Avenue, Suite 6400

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: E.E.U.U.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 10174-6401

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: FastSEQ para Windows versión 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: pendiente de asignación

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 18-MAR-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Lambiris, Elias J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33,728

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 4758.214-WO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 212 867 0123

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 212 867 0298

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2200 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:1:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 475 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:2:

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 467 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTAAATGG CGGGGATAGG TTTGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAATTAAT CAAAAGCAGC GATCCC

\hfill

26

Claims

1. Polipéptido aislado con actividad 3,6-fitasa, seleccionada del grupo que consiste en:

(a): un polipéptido con una secuencia de aminoácidos con al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2;

(b): un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse bajo condiciones de astringencia alta, definidas como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 50% de formamida, con la parte codificante del polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1;

(c): una forma alélica de (a) o (b); y

(d): un fragmento de (a), (b), o (c).

\vskip1.000000\baselineskip

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene una preferencia para la posición 3 del ácido fítico.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que es obtenible a partir de una cepa de Thermomyces o un sinónimo o teleomorfo de la misma.

4. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

5. Secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 4, que es capaz de hibridarse bajo condiciones de astringencia alta con la parte codificante del polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO:1; o una forma alélica o fragmento de la misma.

6. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 4-5 operativamente enlazada a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

7. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6, un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional.

8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6 conteniendo segmentos de ácidos nucleicos que se combinan y yuxtaponen de tal modo que de lo contrario no existirían en la naturaleza.

9. Método para la producción del polipéptido según la reivindicación 3 comprendiendo (a) el cultivo de una cepa de Thermomyces para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) la recuperación del poli-
péptido.

10. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la expresión del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

11. Composición alimentaria o para piensos que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y uno o más aditivos o componentes alimentarios o para piensos.

12. Método para reducir los niveles de fitato en el abono animal comprendiendo el suministro a un animal de una cantidad eficaz de una composición alimentaria o para piensos según la reivindicación 11.

13. Método para licuar un almidón, comprendiendo

(a): el tratamiento del almidón con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 antes de o simultáneamente con la licuación; y

(b): la adición de una \alpha-amilasa al almidón; y

(c): la reacción del almidón de la fase (b) durante un tiempo y a una temperatura eficaz para licuar el almidón.

\newpage

14. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3

(i): para liberar fosfato inorgánico a partir del ácido fítico;

(ii): durante la preparación de preparaciones o aditivos alimentarios o de piensos; y/o

(iii): para mejorar la utilización de los alimentos o piensos.