DE60033138T2

DE60033138T2 - Polypeptide mit Galaktosidaseaktivität und dafür codierende Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60033138T2
Application number: DE60033138T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Davis GOLIGHTLY; M. Randy Davis BERKA; W. Michael Davis REY
Original assignee: Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: AU3246300A; EP1157117A1; DE60033138D1; EP1157117B1; CN1344324A; ATE352626T1; WO2000050606A1; JP2002536999A; US6277612B1; US6090604A

Description

Stand der Technik
Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Galactoseoxidase-Aktivität und isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide codieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
Beschreibung des Technikstandes
Galactoseoxidase (EC 1.1.3.9) katalysiert die Oxidation von D-Galactose zu D-Galactohexodialdose und Wasserstoffperoxid in Gegenwart von molekularem Sauerstoff.
Galactoseoxidasen wurden bisher isoliert aus Polyporus circinatus (Amarai et al., 1966, Methods in Enzymology 9: 87-92; Avigad et al., 1962, Journal of Biological Chemistry 237: 2736-2743; Kosman et al., 1974, Archives of Biochemistry and Biophysics 165: 456-467), Dactylium dendroides (Tressel und Kosman, 1982, Methods in Enzymology 89: 163-171; Kellener et al., 1988, Archives of Biochemistry and Biophysics 262: 349-354); Gibberella fujikuroi (Asaka und Terada, 1982, Agricultural and Biological Chemistry 46: 333-340), Fusarium graminearum (Dias und Kemmelmeir, 1987, Rev. Microbiol., 18: 276-278).
Gene, die Galactoseoxidase codieren, wurden aus Stigmatella aurantiaca (Silakowski et al., 1998, Journal of Bacteriology 180: 1241-1247) und Dactylium dendroides (McPherson et al., 1992, Journal of Biological Chemistry 267: 8146-8152) isoliert.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von verbesserten Polypeptiden mit Galactoseoxidase-Aktivität und von Nukleinsäure, die die Polypeptide codiert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Galactoseoxidase-Aktivität, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:

(a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 85% Identität mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2 aufweist; und
(b) einem Polypeptid, das durch eine Nukleinsäure codiert ist, die unter mittel-hohen Stringenzbedingungen mit (i) den Nukleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID NR. 1, (ii) der in den Nukleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID NR. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii) von mindestens 100 Nukleotiden oder (iv) einem komplementären Strang zu (i), (ii) oder (iii) hybridisiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide codieren, und Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen einschließen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die genomische DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz einer Fusarium-venenatum-Galactoseoxidase (SEQ ID NRN. 1 bzw. 2).
2 zeigt eine Restriktionskarte von pSheB1.
3 zeigt eine Restriktionskarte von pEJG43.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Polypeptide mit Galactoseoxidase-Aktivität
Der Begriff "Galactoseoxidase-Aktivität" ist hier als eine D-Galactose:Sauerstoff-Oxidoreduktase-Aktivität definiert, die die Oxidation von D-Galactose in Gegenwart von molekularem Sauerstoff zu D-Galactohexodialdose und Wasserstoffperoxid katalysiert. Neben D-Galactose umfassen andere natürliche Substrate Dihydroxyaceton, Glycerin, Raffinose, Methyl-alpha-D-galactopyranose und Methyl-beta-D-galactopyranose, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Galactoseoxidase-Aktivität nach der von Baron et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269, 25095-25105) beschriebenen Verfahrensweise bestimmt, wobei die Galactoseoxidase-Aktivität durch Kopplung der Wasserstoffperoxid-Erzeugung aus D(+)-Galactose und O₂ durch Galactoseoxidase mit der Oxidation von 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) in Gegenwart von Meerrettichperoxidase gemessen wurde. Eine Einheit von Galactoseoxidase-Aktivität ist als 1,0 μmol Wasserstoffperoxid, der pro Minute bei 24°C, pH 7, produziert wird, definiert.
Bei einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die einen Identitätsgrad mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2 (d. h. das reife Polypeptid) von mindestens etwa 80%, noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 90%, am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 95% und sogar besonders bevorzugt von mindestens etwa 97% aufweist, die Galactoseoxidase-Aktivität aufweisen (im Folgenden "homologe Polypeptide"). Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die sich um 5 Aminosäuren, vorzugsweise um 4 Aminosäuren, stärker bevorzugt um 3 Aminosäuren, sogar noch stärker bevorzugt um 2 Aminosäuren und am stärksten bevorzugt um eine Aminosäuresequenz von den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2 unterscheidet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Identitätsgrad zischen zwei Aminosäuren unter Verwendung der Software GeneAssist^TM (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) mit einem modifizierten Smith-Waterman-Algorithmus unter Verwendung der BLOSUM-62-Matrix mit einem Schwellenwert von 70 bestimmt.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 2. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 2. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2.
Bei einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit Galactoseoxidase-Aktivität, die von Nukleinsäuresequenzen codiert werden, die unter mittel-hohen Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt hohen Stringenzbedingungen und am stärksten bevorzugt unter sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die unter den gleichen Bedingungen mit (i) den Nukleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID NR. 1, (ii) der in den Nukleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID NR. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii), oder (iv) einem komplementären Strang zu (i), (ii) oder (iii) hybridisiert (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor, New York). Die Subsequenz der SEQ ID NR. 1 kann mindestens 100 Nukleotide oder vorzugsweise mindestens 200 Nukleotide betragen. Ferner kann die Subsequenz ein Polypeptidfragment codieren, das Galactoseoxidase-Aktivität aufweist. Die Polypeptide können auch allelische Varianten oder Fragmente der Polypeptide sein, die Galactosidase-Aktivität besitzen.
Die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR. 1 oder eine Subsequenz davon, sowie die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder ein Fragment davon können zur Konstruktion einer Nukleinsäuresonde zur Identifizierung und Klonierung von DNA, die Polypeptide mit Galactoseoxidase-Aktivität codiert, aus Stämmen verschiedener Gattungen oder Arten nach aus der Technik hinreichend bekannten Verfahren verwendet werden. Insbesondere können solche Sonden zur Hybridisierung mit der genomischen DNA oder der cDNA der Gattung oder Art von Interesse und für anschließende Southern-Blot-Standardverfahren verwendet werden, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Sonden können wesentlich kürzer sein als die gesamte Sequenz, sollten allerdings mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und stärker bevorzugt mindestens 35 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können ebenfalls verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden sind typischerweise zum Nachweis des entsprechenden Gens markiert (beispielsweise mit ³²P, ³H, ³⁵S, Biotin oder Avidin). Solche Sonden sind in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
Somit kann eine genomische DNA- oder cDNA-Bibliothek, die aus solchen anderen Organismen hergestellt wurde, auf DNA gescreent werden, die mit den vorstehend beschriebenen Sonden hybridisiert und die ein Polypeptid mit Galactoseoxidase-Aktivität codiert. Genomische DNA oder andere DNA aus solchen anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder durch andere Trenntechniken abgetrennt werden. DNA aus den Bibliotheken oder die abgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder auf ein anderes geeignetes Trägermaterial übergeführt und darauf immobilisiert werden. Um einen Klon oder DNA zu identifizieren, die zu der SEQ ID NR. 1 oder zu einer Subsequenz davon homolog ist, wird das Trägermaterial bei einem Southern-Blot verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet Hybridisierung, dass die Nukleinsäuresequenz mit einer markierten Nukleinsäuresonde entsprechend der in der SEQ ID NR. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, ihrem komplementären Strang oder mit einer Subsequenz davon unter sehr niedrigen bis sehr hohen Stringenzbedingungen hybridisiert. Moleküle, mit denen die Nukleinsäuresonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der SEQ ID NR. 2 codiert, oder eine Subsequenz davon. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die SEQ ID NR. 1. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die das reife Polypeptid codierende Region mit der SEQ ID NR. 1. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die Nukleinsäuresequenz, die in dem Plasmid pEJG45 enthalten ist, welches in Escherichia coli NRRL B-300076 enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Galactoseoxidase-Aktivität codiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die das reife Polypeptid codierende Region, die in dem Plasmid pEJG45 enthalten ist, das in Escherichia coli NRRL B-30076 enthalten ist.
Für lange Sonden von mindestens 100 Nukleotiden Länge sind sehr niedrige bis sehr hohe Stringenzbedingungen definiert als Vorhybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und entweder 25% Formamid für sehr niedrige und niedrige Stringenzen, 35% Formamid für mittlere und mittel-hohe Stringenzen oder 50% Formamid für hohe und sehr hohe Stringenzen nach Southern-Blot-Standardverfahren.
Für lange Sonden von mindestens 100 Nukleotiden Länge wird das Trägermaterial am Ende dreimal jeweils 15 min unter Verwendung von 2 × SSC, 0,2% SDS, vorzugsweise bei mindestens 45°C (sehr niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 50°C (niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 55°C (mittlere Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 60°C (mittel-hohe Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 65°C (hohe Stringenz) und besonders bevorzugt bei 70°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Für kurze Sonden, die etwa 15 bis etwa 70 Nukleotide lang sind, sind die Stringenzbedingungen definiert als Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen nach Hybridisierung bei 5°C bis 10°C unterhalb der berechneten T_m unter Verwendung der Berechnung gemäß Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tri-HCl, pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 × Denhardt's Lösung, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM einbasiges Natriumphosphat, 0,1 mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml nach Southern-Blot-Standardverfahren.
Für kurze Sonden, die etwa 15 bis etwa 70 Nukleotide lang sind, wird das Trägermaterial einmal in 6 × SCC plus 0,1% SDS 15 min und jeweils zweimal 15 min unter Verwendung von 6 × SSC bei 5°C bis 10°C unterhalb der berechneten T_m gewaschen.
Bei einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Varianten des Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2, umfassend eine Substitution, Deletion und/oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren.
Die Aminosäuresequenzen der varianten Polypeptide können sich von der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder von dem reifen Polypeptid davon durch eine Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten und/oder der Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten durch verschiedene Aminosäurereste unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäureänderungen von geringfügiger Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die das Falten und/oder die Aktivität des Proteins nicht wesentlich beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid bis zu etwa 20 bis 25 Resten; oder eine kleine Extension, die die Reinigung durch Änderung der Nettoladung oder einer anderen Funktion, wie ein Polyhistidinbereich, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne, erleichtert.
Beispiele für konservative Substitutionen liegen innerhalb der Gruppe basischer Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin), saurer Aminosäuren (Glutaminsäure und Asparaginsäure), polarer Aminosäuren (Glutamin und Asparagin), hydrophober Aminosäuren (Leucin, Isoleucin und Valin), aromatischer Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Thyrosin) und kleiner Aminosäuren (Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäuresubstitutionen, die im Allgemeinen die spezifische Aktivität nicht ändern, sind aus der Technik bekannt und beispielsweise von H. Neurath und R.L. Hill, 1979 in: The Proteins, Academic Press, New York beschrieben. Die besonders häufig vorkommenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese umgekehrt.
Bei einer vierten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit immunchemischer Identität oder teilweise immunchemischer Identität mit dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder dem reifen Polypeptid davon. Die immunchemischen Eigenschaften werden durch immunologische Kreuzreaktionsidentitätstests durch das hinreichend bekannte Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsverfahren bestimmt. Insbesondere werden ein Antiserum, das polyklonale Antikörper enthält, die gegenüber Epitopen des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder des reifen Polypeptids davon immunreaktiv sind oder daran binden, durch Immunisierung von Kaninchen (oder von anderen Nagetieren) nach der von Harboe und Ingild in N.H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Hrsg., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (insbesondere Seiten 27-31) beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Ein Polypeptid mit immunchemischer Identität ist ein Polypeptid, das mit dem Antiserum auf identische Weise, wie totale Fusion von Präzipitaten, identische Präzipitatmorphologie und/oder identische elektrophoretische Mobilität, unter Verwendung einer speziellen immunchemischen Technik reagiert. Eine weitere Erklärung der immunchemischen Identität wird von Axelsen, Bock und Krøll in N.H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Hrsg., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 10, beschrieben. Ein Polypeptid mit einer partiellen immunchemischen Identität ist ein Polypeptid, das mit dem Antiserum auf teilweise identische Weise, wie partielle Fusion von Präzipitaten, teilweise identische Präzipitatmorphologie und/oder teilweise identische elektrophoretische Mobilität, unter Verwendung einer spezifischen immunchemischen Technik reagiert. Eine weitere Erklärung der partiellen immunchemischen Identität wird von Bock und Axelsen in N.H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Hrsg., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 11, beschrieben.
Der Antikörper kann auch ein monoklonaler Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können z. B. nach dem Verfahren von E. Harlow und D. Lane, Hrsg., 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden und verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide besitzen mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 60%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, sogar noch stärker bevorzugt mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 100% der Galactoseoxidase-Aktivität des reifen Polypeptids der SEQ ID NR. 2.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid. kann aus Mikroorganismen einer beliebigen Gattung erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "erhalten aus", wie hier verwendet, in Verwendung mit einer gegebenen Quelle, bedeuten, dass das von der Nukleinsäuresequenz codierte Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle produziert wird, in die die Nukleinsäuresequeuz aus der Quelle inseriert wurde. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid extrazellulär sezerniert.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ein Pilzpolypeptid und stärker bevorzugt ein Hefepolypeptid, wie Candida-, Kluyveromyces-, Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- oder ein Yarrowia-Polypeptid; oder stärker bevorzugt ein filamentöses Pilzpolypeptid, wie ein Acremonium-, Aspergillus-, Aureobasidium-, Cryptococcus-, Filibasidium-, Fusarium-, Humicola-, Magnaporthe-, Mucor-, Myceliophthora-, Neocallimastix-, Neurospora-, Paecilomyces-, Penicillium-, Piromyces-, Schizophyllum-, Talaromyces-, Thermoascus-, Thielavia-, Tolypocladium- oder Trichoderma-Polypeptid, sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-, Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces norbensis- oder Saccharomyces oviformis-Polypeptid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Aspergillus aculeatus-, Aspergillus awamori-, Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-, Aspergillus niger-, Aspergillus oryzae-, Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-, Fusarium graminum-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-, Fusarium sarcochroum-, Fusarium sporotrichioides-, Fusarium sulphureum-, Fusarium torulosum-, Fusariumtrichothecioides-, Fusarium venenatum-, Humicola insolens-, Humicola lanuginosa-, Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora crassa-, Penicillium purpurogenum-, Trichoderma harzianum-, Trichoderma koningii-, Trichoderma longibrachiatum-, Trichoderma reesei- oder Trichoderma viride-Polypeptid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-, Fusarium graminum-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-, Fusarium sarcochroum-, Fusarium sporotrichioides-, Fusarium sulphureum-, Fusarium torulosum-, Fusarium trichothecioides- oder Fusarium venenatum-Polypeptid.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Fusarium venenatum-Zelle Fusarium venenatum A3/5, die als Fusarium graminearum ATCC 20334 ursprünglich hinterlegt und neuerdings von Yoder und Christianson, 1998 (Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 und O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67) als Fusarium venenatum reklassifiziert wurde, sowie taxonomische Äquivalente von Fusarium venenatum, ohne Rücksicht auf den Arten-Namen, unter dem sie derzeit bekannt sind. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fusarium venenatum-Zelle eine morphologische Mutante von Fusarium venenatum A3/5 oder Fusarium venenatum ATCC 20334, wie in WO 97/26330 offenbart.
Es ist selbstverständlich, dass die Erfindung für die zuvor erwähnten Arten sowohl die perfekten als auch imperfekten Zustände und weitere taxonomische Äquivalente, z. B. Anamorphe, mit einschließt, ohne Rücksicht auf den Arten-Namen, unter dem sie bekannt sind. Die Fachleute erkennen unschwer die Identität entsprechender Äquivalente. Beispielsweise sind taxonomische Äquivalente von Fusarium von D.L. Hawksworth, P.M. Kirk, B.C. Sutton und D.N. Pegler (Hrsg.), 1995, In Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi, 8. Ausg., CAB International, University Press, Cambridge, England, Seiten 173-174, definiert.
Stämme dieser Arten sind der Öffentlichkeit unschwer in einer Anzahl von Kultursammlungen zugänglich, wie American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
Außerdem können solche Polypeptide aus anderen Quellen, einschließlich Mikroorganismen, die aus der Natur isoliert werden (z. B. Boden, Kompost, Wasser etc.), unter Verwendung der oben erwähnten Sonden identifiziert und erhalten werden. Techniken zur Isolierung von Mikroorganismen aus natürlichen Lebensräumen sind aus der Technik bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann sodann durch Screening auf Ähnlichkeiten einer genomischen oder cDNA-Bibliothek von einem anderen Mikroorganismus abgeleitet werden. Nachdem eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, mit der (den) Sonde(n) nachgewiesen wurde, kann die Sequenz unter Verwendung von Techniken, die den Fachleuten bekannt sind (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, supra), isoliert oder kloniert werden.
Wie hier verwendet, ist ein "isoliertes" Polypeptid ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei ist von anderen Nicht-Galactoseoxidasepolypeptiden, z. B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und am stärksten bevorzugt sogar etwa 95% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
Die erfindungsgemäßen, von Nukleinsäuresequenzen codierten Polypeptide umfassen auch fusionierte Polypeptide oder spaltbare Fusionspolypeptide, in die ein anderes Polypeptid am N- oder am C-Terminus des Polypeptids fusioniert wird, oder ein Fragment davon. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch Fusionieren einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon), die ein anderes Polypeptid codiert, mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz (oder mit einem Teil davon) hergestellt. Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind aus der Technik bekannt und umfassen die Ligation der codierenden Sequenzen, die das Polypeptid codieren, so dass sie sich im Raster befinden und die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle des (der) gleichen Promotor(en) und des gleichen Terminators steht.
Nukleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz in der SEQ ID NR. 1 ausgeführt. Bei einer weiteren, stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die im Plasmid pEJG45 enthaltene Sequenz, welche in Escherichia coli NRRL B-30076 enthalten ist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die das reife Polypeptid codierende Region der SEQ ID NR. 1. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die das reife Polypeptid codierende Region, die in Plasmid pEJG45 enthalten ist, welches in Escherichia coli NRRL B-30076 enthalten ist. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder das reife Polypeptid davon codieren, die sich aufgrund der Degenerität des genetischen Codes von der SEQ ID NR. 1 unterscheiden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Subsequenzen der SEQ ID NR. 1, die Fragmente der SEQ ID NR. 2 codieren, die Galaktoseoxidase-Aktivität aufweisen.
Eine Subsequenz der SEQ ID NR. 1 ist eine Nukleinsäuresequenz, die durch die SEQ ID NR. 1 mit umfasst ist, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere Nukleotide vom 5'- und/oder 3'-Ende deletiert worden sind. Vorzugsweise enthält eine Subsequenz mindestens 1680 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 1800 Nukleotide und besonders bevorzugt mindestens 1920 Nukleotide.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch mutante Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eine Mutation in der das reife Polypeptid codierenden Sequenz der SEQ ID NR. 1 umfassen, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, welches aus den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2 besteht.
Die zur Isolierung und Klonierung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, eingesetzten Techniken sind aus der Technik bekannt und umfassen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine Kombination davon. Das Klonieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aus einer solchen genomischen DNA kann z. B. unter Verwendung der hinreichend bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) oder durch Antikörperscreening von Expressionsbibliotheken zum Nachweis klonierter DNA-Fragmente, denen Strukturmerkmale gemeinsam sind, durchgeführt werden. Siehe z. B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, wie Ligasekettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA), können verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann aus einem Stamm von Fusarium oder einem anderen oder verwandten Organismus kloniert werden, und somit kann sie beispielsweise eine allelische oder eine Artenvariante der Polypeptid-codierenden Region der Nukleinsäuresequenz sein.
Der Begriff "isolierte Nukleinsäuresequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuresequenzen, z. B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt mindestens etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 80% rein und besonders bevorzugt mindestens etwa 90% rein, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz durch Standardklonierungsverfahren erhalten werden, die in der Gentechnik zur Relokation der Nukleinsäuresequenz von ihrer natürlichen Lokation an eine unterschiedliche Stelle, wo sie reproduziert wird, eingesetzt werden. Die Klonierungsverfahren können Exzision und Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments, das die Nukleinsäuresequenz einschließt, die das Polypeptid codiert, sowie Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und Einschleusen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrere Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden, umfassen. Die Nukleinsäuresequenz kann genomischen Ursprungs sein, aus cDNA, RNA stammen, semisynthetischen Ursprungs, synthetischen Ursprungs sein oder aus beliebigen Kombinationen davon stammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die einen Homologiegrad zu der das reife Polypeptid codierenden Sequenz der SEQ ID NR. 1 (d. h. Nukleotide 61 bis 2037) von mindestens 65%, vorzugsweise etwa 70%, vorzugsweise etwa 80%, stärker bevorzugt etwa 90%, noch stärker bevorzugt etwa 95% und besonders bevorzugt von etwa 97% Homologie aufweisen, die ein aktives Polypeptid codieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Homologiegrad zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen durch das Wilbur-Lipman-Verfahren (Wilbur und Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) unter Verwendung der LASERGENE^TM MEGALIGN^TM Software (DYNASTAR, Inc. Madison, WI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden multiplen Alignment-Parametern bestimmt: gap penalty 10 und gap length penalty 10. Die paarweisen Alignment-Parameter waren ktuple = 3, gap penalty = 3 ist und windows = 20.
Die Modifikation einer Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann zur Synthese von Polypeptiden notwendig sein, die im Wesentlichen dem Polypeptid entsprechen. Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich" zu dem Polypeptid bezieht sich auf nicht-natürlich vorkommende Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich in einer konstruierten Weise von dem Polypeptid, das aus seiner nativen Quelle isoliert wurde, unterscheiden, z. B. Varianten, die sich in der spezifischen Aktivität, der Wärmestabilität, dem pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden. Die variante Sequenz kann auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenz, die als der Polypeptid-codierende Teil der SEQ ID NR. 1 präsentiert wird, z. B. eine Subsequenz davon, und/oder durch Einbringen von Nukleotid-Substitutionen, die keine andere Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von der Nukleinsäuresequenz codiert wird, entstehen lassen, die allerdings der Kodon-Verwendung des Wirtsorganismus, der zur Produktion des Enzyms beabsichtigt ist, entsprechen, oder durch Einbringen von Nukleotid-Substitutionen, die eine unterschiedliche Aminosäuresequenz entstehen lassen können, konstruiert werden. Für eine allgemeine Beschreibung der Nukleotid-Substitution, siehe z. B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Den Fachleuten ist klar, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, vorgenommen werden können und dennoch zu einem aktiven Polypeptid führen. Aminosäurereste, die für die Aktivität des Polypeptids essentiell sind, das von der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenz codiert wird, und die darum vorzugsweise keiner Substitution unterzogen werden, können nach aus den Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe z. B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Bei letzterer Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest im Molekül eingebracht, und die resultierenden mutanten Moleküle werden auf Galactoseoxidase-Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen von Substrat-Enzym-Wechselwirkung können ebenfalls durch Analyse der dreidimensionalen Struktur, wie durch solche Techniken, wie kernmagnetische Resonanzanalyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe beispielsweise de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992; Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64), bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, welche unter sehr niedrigen Stringenzbedingungen, vorzugsweise niedrigen Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt mittleren Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt mittel-hohen Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt hohen Stringenzbedingungen und besonders bevorzugt sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die unter den gleichen Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR. 1 oder ihrem komplementären Strang hybridisiert; oder allele Varianten und Subsequenzen davon (Sambrook, et al., 1989, supra), wie hier definiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die hergestellt werden durch (a) Hybridisierung einer DNA unter sehr niedrigen, niedrigen, mittleren, mittel-hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit (i) Nukleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID NR. 1, (ii) der cDNA-Sequenz, die in den Nukleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID NR. 1 enthalten ist, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii) oder (iv) einem komplementären Strang von (i), (ii) oder (iii) und (b) Isolieren der Nukleinsäuresequenz. Die Subsequenz ist vorzugsweise eine Sequenz von mindestens 100 Nukleotiden wie eine Sequenz, die ein Polypeptidfragment codiert, das Galactoseoxidase-Aktivität besitzt.
Verfahren zur Herstellung von mutanten Nukleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung einer mutanten Nukleinsäuresequenz, umfassend das Einführen mindestens einer Mutation in die das reife Polypeptid codierende Sequenz der SEQ ID NR. 1, oder in eine Subsequenz davon, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2 besteht, oder ein Fragment davon, das Galactoseoxidase-Aktivität besitzt.
Das Einführen einer Mutation in die Nukleinsäuresequenz, um ein Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid auszutauschen, kann durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von einem der aus der Technik bekannten Verfahren erreicht werden. Besonders geeignet ist das Verfahren, das einen superhelikalen, doppelsträngigen DNA-Vektor in einem Insert von Interesse und zwei synthetische Primer, die die gewünschte Mutation enthalten, verwendet. Die Oligonukleotidprimer, die jeweils komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen des Vektors sind, dehnen sich während des Temperatur-Cyclings mittels Pfu-DNA-Polymerase aus. Beim Einführen der Primer wird ein mutiertes Plasmid, das versetzte Strangbrüche (nicks) enthält, erzeugt. Nach dem Temperatur-Cycling wird das Produkt mit DpnI behandelt, das auf methylierte und hemimethylierte DNA spezifisch ist, um das parentale DNA-Templat zu verdauen und um Mutations-enthaltende synthetisierte DNA zu selektionieren. Andere aus der Technik bekannte Verfahren können ebenfalls verwendet werden.
Nukleinsäurekonstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, die mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen operabel verknüpft ist, die die Expression der codierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen steuert, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind. Die Expression umfasst selbstverständlich jeden Schritt, der an der Herstellung des Polypeptids beteiligt ist, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Transkription, posttranskriptionale Modifikation, Translation, posttranslationale Modifikation und Sekretion.
"Nukleinsäurekonstrukt" ist hier definiert als ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, das aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wird, oder das modifiziert wurde, um Segmente von Nukleinsäure zu enthalten, die, auf eine Weise, die ansonsten nicht in der Natur vorkommen würde, kombiniert und neben einander gestellt wurden. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt ist synonym mit dem Begriff Expressionskassette, wenn das Nukleinsäurekonstrukt sämtliche Kontrollsequenzen enthält, die zur Expression einer erfindungsgemäßen codierenden Sequenz erforderlich sind. Der Begriff "codierende Sequenz" ist hier als Nukleinsäuresequenz definiert, die direkt die Aminosäuresequenz ihres Proteinprodukts festlegt. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind im Allgemeinen durch eine Ribosomen-Bindungsstellen (Prokaryoten) oder durch das ATG-Startkodon (Eukaryoten), das unmittelbar stromaufwärts von dem offenen Leseraster am 5'-Ende der mRNA lokalisiert ist, und durch eine Transkriptions-Terminatorsequenz, die unmittelbar stromabwärts des offenen Leserasters am 3'-Ende der mRNA lokalisiert ist, bestimmt. Eine codierende Sequenz kann DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann auf eine Vielzahl von Wegen manipuliert werden, um Expression des Polypeptids bereitzustellen. Die Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann wünschenswert oder notwendig sein, je nach Expressionsvektor. Die Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von DNA-Rekombinantionsverfahren sind aus der Technik hinreichend bekannt.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" ist hier so definiert, dass sämtliche Komponenten eingeschlossen sind, die zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids notwendig oder von Vorteil sind. Jede Kontrollsequenz kann nativ oder fremd für die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, sein. Solche Kontrollsequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Leadersequenz, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz einen Promotor, eine Signalpeptidsequenz und einen Transkriptionsterminator. Minimal umfassen die Kontrollsequenzen einen Promotor und ein transkriptionales und translationales Stoppsignal. Die Kontrollsequenzen können mit Linkern für den Zweck des Einbringens spezieller Restriktionsschnittstellen vorgesehen sein, was die Ligation der Kontrollsequenzen mit der codierenden Region der Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, erleichtert. Der Begriff "operabel verknüpft", ist hier als Konfiguration definiert, in der eine Kontrollsequenz entsprechend an einer Stelle relativ zu der codierenden Sequenz der DNA-Sequenz so angeordnet ist, dass die Kontrollsequenz die Expression eines Polypeptids steuert.
Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz, eine Nukleinsäuresequenz, die von einer Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird, sein. Die Promotorsequenz enthält transkriptionale Kontrollsequenzen, die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz sein, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, einschließlich von Mutanten, Rumpf- und Hybridpromotoren, und kann aus Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide, die zu der Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind, codieren.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren, die erhalten werden aus dem E.-coli-lac-Operon, dem Streptomyces coelicolor-Agarasegen (dagA), dem Bacillus subtilis-Levansaccharosegen (sacB), dem Bacillus licheniformis-alpha-Amylasegen (amyL), dem Bacillus stearothermophilus-maltogenen Amylasegen (amyM), dem Bacillus amyloliquefaciens-alpha-Amylasegen (amyQ), dem Bacillus licheniformis-Penicillinasegen (penP), den Bacillus subtilis-zylA- und XylB-Genen und dem prokaryotischen beta-Lactamasegen (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), sowie der tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Weitere Promotoren sind in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94, und in Sambrook et al., 1989, supra, beschrieben.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte in einer filamentösen Pilz-Wirtszelle sind Promotoren, die erhalten werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Asparaginsäure-Proteinase, Aspergillus niger-neutrale alpha-Amylase, Aspergillus niger-säurestabile alpha-Amylase, Aspergillus niger- oder Aspergillus awamori-Glucoamylase (glaA), Rhizomucor miehei-Lipase, Apergillus oryzae-alkalische Protease, Aspergillus oryzae-Triosephosphatisomerase, Aspergillus nidulans-Acetamidase und Fusarium oxysporum-Trypsin-artige Protease (WO 96/00787), sowie der NA2-tpi-Promotor (ein Hybrid der Promotoren aus den Genen für Aspergillus niger-neutrale alpha-Amylase und Aspergillus oryzae-Triosephosphatisomerase) und mutante, rumpfförmige und Hybrid-Promotoren davon.
In einem Hefewirt werden geeignete Promotoren aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae-Galactokinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae-Alkoholdehydrogenaseglyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (ADH2/GAP) und Saccharomyces cerevisiae-3-Phosphoglyceratkinase erhalten. Weitere geeignete Promotoren für Hefe-Wirtszellen sind bei Romanos et al. 1992, Yeast 8: 423-488 beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz, eine von einer Wirtszelle zur Terminierung der Transkription erkannte Sequenz sein. Die Terminatorsequenz ist mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jeder Terminator, der in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Terminatoren für filamentöse Pilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Aspergillus niger-Glucoamylase, Aspergillus nidulans-Anthranilatsynthase, Aspergillus niger-alpha-Glucosidase und Fusarium oxysporum-Trypsin-artige Protease erhalten.
Bevorzugte Terminatoren für Hefe-Wirtszellen werden aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase, Saccharomyces cerevisiae-Cytrochrom C (CYC1) und Saccharomyces cerevisiae-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase erhalten. Weitere geeignete Terminatoren für Hefe-Wirtszellen werden von Romanos et al, 1992, supra, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz, eine nicht-translatierte Region einer mRNA, die zur Translation durch die Wirtszelle von Bedeutung ist, sein. Die Leadersequenz ist mit dem 5'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jede Leadersequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Leader für filamentöse Pilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus-oryzae-TAKA-Amylase und Aspergillus-nidulans-Triosephosphatisomerase erhalten.
Geeignete Leader für Hefe-Wirtszellen werden aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae-3-Phosphoglyceratkinase, Saccharomyces cerevisiae-Alpha-Faktor und Saccharomyces cerevisiae-Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (ADH2/GAP) erhalten.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Polyadenylierungssequenz, eine mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz operabel verknüpfte Sequenz und die, wenn transkribiert, von der Wirtszelle als Signal zur Addition von Polyadenosinresten an transkribierte mRNA erkannt wird, sein. Jede Polyadenylierungssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für filamentöse Pilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Aspergillus niger-Glucoamylase, Aspergillus nidulans-Anthranilatsynthase, Fusarium oxysporum-Trypsin-ähnliche Protease und Aspergillus niger-Alpha-Glucosidase erhalten.
Geeignete Polyadenylierungssequenzen für Hefe-Wirtszellen werden von Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990, erhalten.
Die Kontrollsequenz kann auch ein Signalpeptid sein, das eine Region codiert, die eine Aminosäuresequenz codiert, die mit dem Aminoterminus eines Polypeptids verknüpft ist und die das codierte Polypeptid auf den sekretorischen Weg der Zelle lenkt. Das 5'-Ende der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann von Natur aus ein Signalpeptid enthalten, das die Region codiert, die natürlicherweise im Translationsleseraster mit dem Segment der codierenden Region verknüpft ist, die das sezernierte Polypeptid codiert. Alternativ kann das 5'-Ende der codierenden Sequenz eine Signalpeptid-codierende Region enthalten, die für die codierende Sequenz fremd ist. Die fremde Signalpeptid-codierende Region kann erforderlich sein, wo die codierende Sequenz von Natur aus keine Signalpeptid-codierende Region enthält. Alternativ kann die fremde Signalpeptid-codierende Region einfach die natürliche Signalpeptid-codierende Region ersetzen, um die Sekretion des Polypeptids zu verstärken. Bei der vorliegenden Erfindung kann allerdings jede Signalpeptid-codierende Region, die das exprimierte Polypeptid auf den sekretorischen Pfad einer Wirtszelle der Wahl steuert, verwendet werden.
Wirksame Signalpeptid-codierende Regionen für bakterielle Wirtszellen sind die Signalpeptid-codierenden Regionen, die aus den Genen für Bacillus NCIB 11837-maltogene Amylase, Bacillus stearothermophilus-alpha-Amylase, Bacillus licheniformis-Subtilisin, Bacillus licheniformis-beta-Lactamase, Bacillus stearothermophilus-neutrale Proteasen (nprT, nprS, nprM) und Bacillus-subtilis-prsA erhalten werden. Weitere Signalpeptide werden von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137, beschrieben.
Wirksame Signalpeptid-codierende Regionen für filamentöse Pilz-Wirtszellen sind die Signalpeptid-codierenden Regionen, die aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Aspergillus niger-neutrale Amylase, Aspergillus niger-Glucoamylase, Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase, Humicola insolens-Zellulase und Humicola lanuginosa-Lipase erhalten werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Signalpeptid-codierende Region die Nukleotide 1 bis 60 der SEQ ID NR. 1, die die Aminosäuren 1 bis 20 der SEQ ID NR. 2 codieren.
Geeignete Signalpeptide für Hefe-Wirtszellen werden aus den Genen für den Saccharomyces cerevisiae-Alpha-Faktor und die Saccharomyces cerevisiae-Invertase erhalten. Weitere geeignete Signalpeptid-codierende Regionen werden von Romanos et al., 1992, supra, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Propeptid-codierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz codiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids positioniert ist. Das resultierende Polypeptid ist als Proenzym und Propolypeptid (oder als ein Zymogen in einigen Fällen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann durch katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids von dem Propolypeptid in ein reifes aktives Polypeptid umgewandelt werden. Die Propeptid-codierende Region kann aus den Genen für Bacillus subtilis-alkalische Protease (aprE), Bacillus subtilis-neutrale Protease (nprT), Saccharomyces cerevisiae-Alpha-Faktor, Rhizomucor miehei-Asparaginsäure-Proteinase und Myceliophthora thermophila-Laccase (WO 95/33836) erhalten werden.
Wo sowohl Signalpeptid- als auch Propeptid-Regionen am Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden sind, ist die Propeptid-Region zu dem Aminoterminus eines Polypeptids am Nächsten positioniert, und die Signalpeptid-Region ist am Nächsten zu dem Aminoterminus der Propeptid-Region positioniert.
Es kann auch wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, durch die sich die Expression des Polypeptids relativ zu dem Wachstum der Wirtszelle regulieren lässt. Beispiele für regulatorische Systeme sind diejenigen, die die Expression des auf die Reaktion eines chemischen oder physikalischen Stimulans ein- oder auszuschaltenden Gens herbeiführen, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen umfassen die lac-, tac- und trp-Operatorsysteme. In Hefe kann das ADH2-System oder das GAL1-System verwendet werden. In filamentösen Pilzen können der TAKA-alpha-Amylase-Promotor, der Aspergillus niger-Glucoamylase-Promotor und der Aspergillus oryzae-Glucoamylase-Promotor als regulatorische Sequenzen verwendet werden. Weitere Beispiele für regulatorische Sequenzen sind diejenigen, die die Gen-Amplifikation ermöglichen. In eukaryotischen Systemen umfassen diese das Dihydrofolatreduktasegen, das in Gegenwart von Methotrexat amplifiziert wird, und die Metallothioneingene, die mit Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen wäre die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, mit der regulatorischen Sequenz operabel verknüpft.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale umfassen. Die verschiedenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen, die vorstehend beschrieben sind, können miteinander verknüpft werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine oder mehrere zweckmäßige Restriktionsschnittstellen einschließen kann, um die Insertion oder Substitution der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, an solchen Stellen zu ermöglichen. Alternativ kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz durch Insertion der Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäurekonstrukts, das die Sequenz einschließt, in einen entsprechenden Vektor zur Expression exprimiert werden. Durch Erzeugung des Expressionsvektors wird die codierende Sequenz in dem Vektor so angeordnet, dass die codierende Sequenz mit den entsprechenden Kontrollsequenzen für die Expression operabel verknüpft ist.
Der rekombinante Expressionsvektor kann jeder Vektor (z. B. ein Plasmid oder Virus) sein, der zweckmäßigerweise DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen werden und die Expression der Nukleinsäuresequenz herbeiführen kann. Die Wahl des Vektors hängt typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle ab, in die der Vektor eingeführt werden soll. Die Vektoren können lineare oder geschlossene zirkuläre Plasmide sein.
Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor kann ein beliebiges Mittel zur Sicherstellung der Selbstreplikation enthalten. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der beim Einführen in die Wirtszelle in das Genom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in die er integriert wurde, repliziert wird. Außerdem kann ein einzelner Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die Gesamt-DNA, die in das Genom der Wirtszelle einzuführen ist, enthalten, oder ein Transposon verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die die leichte Selektion transformierter Zellen erlauben. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt Biozid- oder Virus-Resistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie gegenüber Auxotrophen und dergleichen bereitstellt. Beispiele für bakterielle selektierbare Marker sind die dal-Gene aus Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, die Antibiotikum-Resistenz verleihen, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz. Geeignete Marker für Hefe-Wirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 und URA3. Selektierbare Marker zur Verwendung in einer filamentösen Pilz-Wirtszelle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, amdS (Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hygB (Hygromycinphosphatransferase), niaD (Nitratreduktase), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase), trpC (Anthranilatsynthase) sowie Äquivalente davon. Bevorzugt zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die amdS- und pyrG-Gene von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und das bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten vorzugsweise ein Element (Elemente), die die stabile Integration des Vektors in das Genom der Wirtszelle oder die autonome Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig von dem Genom ermöglichen.
Zur Integration in das Wirtszellengenom kann der Vektor auf die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder jedes andere Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht-homologe Rekombination beruhen. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zur Steuerung der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen es dem Vektor, in das Wirtszellengenom an einer exakten Lokation (exakten Lokationen) in dem Chromosom(en) integriert zu werden. Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Integration an einer exakten Lokation sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäuren, wie 100 bis 1500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1500 Basenpaare und besonders bevorzugt 800 bis 1500 Basenpaare enthalten, die mit der entsprechenden Zielsequenz stark homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu verstärken. Die Integrationselemente können eine beliebige Sequenz sein, die zu der Zielsequenz in dem Genom der Wirtszelle homolog ist. Außerdem können die Integrationselemente nicht- codierende oder codierende Nukleinsäuresequenzen sein. Andererseits kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch nicht homologe Rekombination integriert werden.
Zur autonomen Replikation kann der Vektor weiterhin einen Replikationsursprung einschließen, der es dem Vektor ermöglicht, sich autonom in der in Frage kommenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für bakterielle Replikationsursprünge sind Replikationsursprünge der Plasmide pBR233, pUC19, pACYC177 und pACYC184, die die Replikation in E. coli ermöglichen und pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1, die die Replikation in Bacillus ermöglichen. Beispiele für Replikationsursprünge zur Verwendung in einer Hefe-Wirtszelle sind der 2-Mikron-Replikationsursprung ARS1, ARS4, die Kombination von ARS1 und CEN3 und die Kombination von ARS4 und CEN6. Der Replikationsursprung kann ein Ursprung mit einer Mutation sein, die seine Funktionsweise in der Wirtszelle temperaturempfindlich macht (siehe z. B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Mehr als eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kann in die Wirtszelle inseriert werden, um die Produktion des Genprodukts zu erhöhen. Eine Zunahme in der Kopienanzahl der Nukleinsäuresequenz kann durch Integrieren mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellengenom oder durch Einschließen eines amplifizierbaren selektierbaren Markergens mit der Nukleinsäuresequenz erhalten werden, wobei die Zellen, die amplifizierte Kopien des selektierbaren Markergens und dadurch zusätzliche Kopien der Nukleinsäuresequenz enthalten, durch die Kultivierung der Zellen in Gegenwart eines geeigneten selektierbaren Mittels selektioniert werden können.
Die zur Ligation der vorstehend beschriebenen Elemente verwendeten Verfahren, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren zu konstruieren, sind einem Fachmann hinreichend bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, die zweckmäßigerweise bei der rekombinanten Herstellung der Polypeptide verwendet wird. Ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz einschließt, wird in eine Wirtszelle eingebracht, so dass der Vektor als chromosomale Integrante oder als selbst-replizierender extrachromosomaler Vektor, wie zuvor beschrieben, gehalten wird. Der Begriff "Wirtszelle" umfasst jeden Abkömmling einer Elternzelle, der aufgrund von Mutationen, die während der Replikation auftreten, nicht mit der Elternzelle identisch ist. Die Wahl einer Wirtszelle hängt von einem großen Ausmaß von dem Gen, das das Polypeptid codiert, und seiner Quelle ab.
Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Prokaryot, oder ein nicht-einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Eukaryot, sein.
Geeignete einzellige Zellen sind Bakterienzellen, wie grampositive Bakterien, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, eine Bacillus-Zelle, z. B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder eine Streptomyces-Zelle, z. B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien wie E. coli und Pseudomonas sp. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtszelle eine Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus stearothermophilus- oder Bacillus subtilis-Zelle. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Bacillus-Zelle ein alkaliphiler Bacillus.
Das Einführen eines Vektors in eine bakterielle Wirtszelle kann beispielsweise durch Protoplastentransformation (siehe z. B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), unter Verwendung kompetenter Zellen (siehe z. B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 oder Dubnau und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), Elektroporation (siehe z. B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) oder Konjugation (siehe z. B. Kochler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) durchgeführt werden.
Die Wirtszelle kann ein Eukaryot sein, wie eine Säuger, Insekten-, Pflanzen- oder Pilzzelle.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. "Pilze"; wie hier verwendet, umfassen die Phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert von Hawksworth et al., in Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Ausg., 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) sowie die Oomycota (wie zitiert bei Hawksworth et al., 1995, supra, Seite 171) und alle mitosporischen Fungi (Hawksworth et al., 1995, supra).
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pilz-Wirtszelle eine Hefezelle. "Hefe", wie hier verwendet, umfasst ascosporogene Hefe (Endomycetales), basidiosporogene Hefe und Hefe, die zu den Fungi imperfecti (Blastomyceten) gehört. Da die Klassifizierung von Hefe sich in Zukunft ändern kann, soll für die Zwecke dieser Erfindung Hefe so definiert sein, wie in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., und Davenport, R.R. Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) beschrieben.
Bei einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Candida-, Hansenula-, Kluyveromyces-, Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- oder Yarrowia-Zelle.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-, Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces morbensis- oder Saccharomyces oviformis-Zelle. Bei einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Yarrowia lipolytica-Zelle.
Bei einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pilz-Wirtszelle eine filamentöse Pilzzelle. "Filamentöse Pilze" umfassen sämtliche filamentösen Formen der Unterabteilung Eumycota oder Oomycota (wie definiert von Hawksworth et al., 1995, supra). Die filamentösen Pilze sind gekennzeichnet durch eine Mycelwand, die aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden besteht. Das vegetative Wachstum erfolgt durch Hyphenverlängerung, und der Kohlenstoffkatabolismus ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum durch Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, durch Knospung eines einzelligen Thallus, und der Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ sein.
Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Zelle einer Art von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Aspergillus awamori-, Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-, Aspergillus niger- oder Aspergillus oryzae-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-, Fusarium graminum-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-, Fusarium sarcochroum-, Fusarium sporotrichioides-, Fusarium sulphureum-, Fusarium torulosum-, Fusarium trichothecioides- oder Fusarium venenatum-Zelle. Bei einer noch besonders bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Elternzelle eine Fusarium venenatum-(Nirenberg sp. nov.)-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Humicola insolens-, Humicola lanuginosa-, Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora crassa-, Penicillium purpurogenum-, Thielavia terrestris-, Trichoderma harzianum-, Trichoderma koningii-, Trichoderma longibrachiatum-, Trichoderma reesei- oder Trichoderma viride-Zelle.
Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das Protoplastenbildung, Transformation der Protoplasten und Regeneration der Zellwand auf eine an sich bekannte Weise umfasst. Geeignete Verfahrensweisen zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474 beschrieben. Geeignete Verfahren zur Transformation von Fusarium-Arten werden von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, und WO 96/00787 beschrieben. Hefe kann unter Verwendung der von Becker und Guarente in Abelson, J.N. und Simon, M.I., Hrsg., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Bd. 194, Seiten 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920, beschriebenen Verfahren transformiert werden.
Herstellungsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Stammes, dessen Wildtyp-Form fähig ist, das Polypeptid sowie einen Überstand, der das Polypeptid umfasst, herzustellen; und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides. Vorzugsweise ist der Stamm eine Fusarium-Art, und stärker bevorzugt Fusarium venenataum.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptides geeignet sind; und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptids geeignet sind, wobei die Wirtszelle eine mutante Nukleinsäuresequenz mit mindestens einer Mutation in der das reife Polypeptid codierenden Region der SEQ ID NR. 1 umfasst, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID NR. 2 besteht, und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides.
Bei den erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden die Zellen in einem Nährmedium kultiviert, das zur Herstellung des Polypeptids unter Verwendung von aus der Technik bekannten Verfahren geeignet ist. Beispielsweise kann die Zelle durch Schüttelkolbenkultivierung, Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierliche, "batch", "fed-batch" oder Festzustand-Fermentationen) in Labor- oder Industriefermentern, durchgeführt in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die die Expression und/oder Isolierung des Polypeptids erlauben, kultiviert werden. Die Kultivierung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und ein organisches Salz umfasst, unter Verwendung von aus der Technik bekannten Verfahrensweisen. Geeignete Medien stehen von kommerziellen Lieferfirmen zur Verfügung oder können nach veröffentlichten Zusammensetzungen (z. B. in den Katalogen der American Type Culture Collection) herstellt werden. Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid nicht sezerniert wird, kann es aus Zelllysaten gewonnen werden.
Die Polypeptide können unter Verwendung von aus der Technik bekannten Verfahren, die für die Polypeptide spezifisch sind, nachgewiesen werden. Diese Nachweisverfahren können die Verwendung spezifischer Antikörper, Bildung eines Enzymprodukts oder Verschwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Beispielsweise kann ein Enzymtest zur Bestimmung der Aktivität des Polypeptids, wie hier beschrieben, verwendet werden.
Das resultierende Polypeptid kann durch aus der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise kann das Polypeptid aus dem Nährmedium durch herkömmliche Verfahrensweisen gewonnen werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung, Eindampfen oder Präzipitation.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch eine Vielzahl von aus der Technik bekannten Verfahrensweisen aufgereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Chromatographie (z. B. Ionenaustauscher-, Affinitäts-, hydrophobe Chromatographie, Chromatofokussierung und Größenausschlusschromatographie), elektrophoretische Verfahrensweise (z. B. präparative isoelektrische Fokussierung), differentielle Löslichkeit (z. B. Ammoniumsulfat-Fällung), SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z. B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989).
Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine transgene Pflanze, ein Pflanzenteil oder eine Pflanzenzelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz transformiert wurde, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Galactoseoxidase-Aktivität codiert, so dass das Polypeptid in gewinnbaren Mengen exprimiert und produziert wird. Das Polypeptid kann aus der Pflanze oder dem Pflanzenteil gewonnen werden. Alternativ kann die Pflanze oder der Pflanzenteil, welcher das rekombinante Polypeptid enthält, als solcher zur Verbesserung der Qualität eines Lebensmittels oder eines Nahrungsmittels verwendet werden, z. B. Verbesserung des Nährwertes, Schmackhaftigkeit und rheologische Eigenschaften oder zur Zerstörung eines antinutritiven Faktors verwendet werden.
Die transgene Pflanze kann dicotyledon (eine Dicotyledone) oder monocotyledon (eine Monocotyledone) sein. Beispiele für monokotyledone Pflanzen sind Gräser, wie Wiesengras (Blaugras, Poa), Futtergras, wie Festuca, Lolium, Gras aus gemäßigten Zonen, wie Agrostis und Cerealien, z. B. Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Reis, Hirse und Mais (Korn).
Beispiele für dicotyle Pflanzen sind Tabak, Gemüse, wie Lupinen, Kartoffel, Zuckerrübe, Erbse, Bohne und Sojabohne und Kreuzblütler (Familie Brassicaceae), wie Blumenkohl, Raps und der eng verwandte Modellorganismus Arabidopsis thaliana.
Beispiele für Pflanzenteile sind Stamm, Kallus, Blätter, Wurzel, Früchte, Samen und Wurzelknollen.
Auch spezielle Pflanzengewebe, wie Chloroplast, Apoplast, Mitochondrien, Vakuole, Peroxisomen und Zytoplasma, werden als ein Pflanzenteil betrachtet. Außerdem wird jede Pflanzenzelle, gleich welchen Gewebsursprungs, als Pflanzenteil betrachtet.
Auch eingeschlossen im Umfang der Erfindung sind die Abkömmlinge von solchen Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenzellen.
Die transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann nach aus der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden. Kurz gesagt, wird die Pflanze oder Pflanzenzellen durch Einbringen von einem oder mehreren Expressionskonstrukten, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, in das pflanzliche Wirtsgenom und Propagation der resultierenden modifizierten Pflanze oder Pflanzenzelle zu einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle konstruiert.
Zweckmäßigerweise ist das Expressionskonstrukt ein Nukleinsäurekonstrukt, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, das operabel mit entsprechenden regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die zur Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze oder dem Pflanzenteil der Wahl erforderlich sind. Außerdem kann das Expressionskonstrukt einen selektierbaren Marker, der zur Identifizierung von Wirtszellen geeignet ist, in die das Expressionskonstrukt integriert worden ist, und DNA-Sequenzen, die zum Einführen des Konstrukts in die fragliche Pflanze (letztere hängt von dem zu verwendenden DNA-Einführungsverfahren ab) notwendig sind, umfassen.
Die Wahl der regulatorischen Sequenzen, wie Promotor- und Terminatorsequenzen und gegebenenfalls Signal- oder Transitsequenzen, wird beispielsweise auf der Grundlage davon bestimmt, wann, wo und wie es gewünscht ist, dass das Polypeptid exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression des Gens, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, konstitutiv oder induzierbar sein oder kann entwicklungsbedingt, stadium- oder gewebespezifisch sein, und das Genprodukt kann auf ein spezielles Gewebe oder einen speziellen Pflanzenteil ausgerichtet sein, wie Samen oder Blätter. Regulatorische Sequenzen sind beispielsweise von Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506 beschrieben.
Zur konstitutiven Expression kann der 35S-CaMV-Promotor verwendet werden (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). Organspezifische Promotoren können beispielsweise ein Promotor aus Speichergeweben, wie Samen, Kartoffelknollen und Früchte (Edwards & Coruzii, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) oder aus metabolischen Speichergeweben, wie Meristemen (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), ein Samen-spezifischer Promotor, wie der Glutelin-, Prolamin-, Globulin- oder Albumin-Promotor aus Reis (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), ein Vicia faba-Promotor aus dem Legumin B4 und das unbekannte Samenproteingen aus Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), ein Promotor aus einem Samenölkörperprotein (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), der Speicherprotein-napA-Promotor aus Brassica napus oder jeder andere Samen-spezifische Promotor, der aus der Technik bekannt ist, z. B. wie in WO 91/14772 beschrieben, sein. Außerdem kann der Promotor ein Blatt-spezifischer Promotor sein, wie der rbcs-Promotor aus Reis oder Tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), der Chlorellavirus-Adeninmethyltranferase-Gen-Promotor (Mitra und Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) oder der aldP-Gen-Promotor aus Reis (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) oder ein Wunden-induzierbarer Promotor, wie der Kartoffel-Pin2-Promotor (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588) sein.
Ein Promotor-Enhancer-Element kann ebenfalls zum Erreichen einer höheren Expression des Enzyms in der Pflanze verwendet werden. Beispielsweise kann das Promotor-Enhancer-Element ein Intron sein, das zwischen dem Promotor und der Nukleotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, angeordnet ist. Beispielsweise offenbaren Xu et al, 1993, supra, die Verwendung des ersten Introns des Reis-Actin-1-Gens zur Verstärkung der Expression.
Das selektierbare Markergen und beliebige andere Teile des Expressionskonstrukts können aus denjenigen gewählt werden, die in der Technik zur Verfügung stehen.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird in das Pflanzengenom nach herkömmlichen, aus der Technik bekannten Verfahren, einschließlich Agrobacterium-vermittelte Transformation, Virus-vermittelte Transformation, Mikroinjektion, Teilchenbombardement, biolistische Transformation und Elektroporation (Grasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274) eingebaut.
Derzeit ist der Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentransfer das Verfahren der Wahl zur Erzeugung von transgenen Dicotyledonen (zur Übersicht siehe Hooykas und Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). Er kann allerdings auch zur Transformation von Monocotyledonen eingesetzt werden, obwohl andere Transformationsverfahren im Allgemeinen für diese Pflanzen bevorzugt sind.
Derzeit ist das Verfahren der Wahl zur Erzeugung von transgenen Monocotyledonen das Teilchen-Bombardement (mikroskopische Gold- oder Wolfram-Teilchen, die mit der transformierenden DNA beschichtet sind) von embryonalen Kalli oder sich entwickelnden Embryonen (Christou, 1992; Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Ein alternatives Verfahren zur Transformation von Monocotyledonen beruht auf der Protoplastentransformation, wie von Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428, beschrieben.
Nach der Transformation werden die Transformanten mit dem darin eingebauten Expressionskonstrukt selektioniert und nach aus der Technik hinreichend bekannten Verfahren zu ganzen Pflanzen regeneriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle, die eine Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Galactoseoxidase-Aktivität codiert, unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids geeignet sind; und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides.
Entfernung oder Reduktion von Galactoseoxidase-Aktivität
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer mutanten Zelle einer Elternzelle, die das Aufbrechen oder Deletieren einer Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder einer Kontrollsequenz davon umfasst, was zu der mutanten Zelle führt, die bei einem Kultivieren unter den gleichen Bedingungen weniger des Polypeptids produziert als die Elternzelle.
Die Konstruktion von Stämmen, die reduzierte Galactoseoxidase-Aktivität aufweisen, kann zweckmäßigerweise durch Modifikation oder Inaktivierung einer Nukleinsäuresequenz, die zur Expression des Polypeptids mit Galactoseoxidase-Aktivität in der Zelle notwendig ist, erreicht werden. Die zu modifizierende oder zu inaktivierende Nukleinsäuresequenz kann beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz sein, die das Polypeptid oder einen Teil davon codiert, der essentiell ist, um Galactoseoxidase-Aktivität aufzuweisen, oder die Nukleinsäuresequenz kann eine regulatorische Funktion besitzen, die für die Expression des Polypeptids aus der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz erforderlich ist. Ein Beispiel für eine solche regulatorische oder Kontrollsequenz kann eine Promotorsequenz oder ein funktioneller Teil davon sein, d. h. ein Teil, der ausreicht, um die Expression des Polypetids zu beeinflussen. Weitere Kontrollsequenzen für eine mögliche Modifikation sind vorstehend beschrieben.
Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durchgeführt werden, indem mit der Zelle eine Mutagenese durchgeführt wird und indem auf Zellen selektioniert oder gescreent wird, in denen die Galactoseoxidase-produzierende Fähigkeit reduziert worden ist. Die Mutagenese, die spezifisch oder regellos sein kann, kann beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittels, durch die Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids oder durch Unterziehen der DNA-Sequenz einer PCR-generierten Mutagenese durchgeführt werden. Außerdem kann die Mutagenese durch die Verwendung einer beliebigen Kombination dieser Mutagenisierungsmittel durchgeführt werden.
Beispiele für ein physikalisches oder chemisches Mutagenisierungsmittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, umfassen Ultraviolett-(UV)-Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotid-Analoge.
Wenn solche Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in Gegenwart des mutagenisierenden Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen und Selektionieren auf Zellen, die reduzierte Galactoseoxidase-Aktivität oder -produktion aufweisen, durchgeführt.
Die Modifikation oder Inaktivierung der Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids kann durch Einbringen, Substitution oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden in der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder eines regulatorischen Elements, das für die Transkription oder Translation davon erforderlich ist, erreicht werden. Beispielsweise können Nukleotide inseriert oder entfernt werden, so dass sich der Einbau eines Stoppkodons, die Entfernung des Startkodons oder eine Änderung des offenen Leserasters ergibt. Eine solche Modifikation oder Inaktivierung kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch PCR-generierte Mutagenese nach aus der Technik bekannten Verfahren erreicht werden. Obwohl im Prinzip die Modifikation in vivo durchgeführt werden kann, d. h. direkt auf der Zelle, die die zu modifizierende Nukleinsäuresequenz exprimiert, ist es bevorzugt, dass die Modifikation in vitro, wie nachstehend beispielhaft ausgeführt, durchgeführt wird.
Ein Beispiel eines zweckmäßigen Weges zur Beseitigung oder Reduktion der Produktion durch eine Wirtszelle besteht im Gen-Ersatz oder in der Gen-Unterbrechung. Bei dem Genunterbrechungsverfahren wird eine Nukleinsäuresequenz, entsprechend dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse, in vitro mutagenisiert, um eine fehlerhafte Nukleinsäuresequenz herzustellen, die anschließend in die Wirtszelle transformiert wird, um ein defektes Gen zu produzieren. Durch homologe Rekombination ersetzt die defekte Nukleinsäuresequenz das endogene Gen oder das Genfragment. Es kann gewünscht sein, dass das defekte Gen oder Genfragment auch einen Marker codiert, der zur Selektion von Transformanten verwendet werden kann, in denen das Gen, das das Polypeptid codiert, modifiziert oder zerstört worden ist.
Alternativ kann die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz durch die entwickelten Antisense-Techniken unter Verwendung einer Nukleotidsequenz, die zu der Polypeptid-codierenden Sequenz komplementär ist, durchgeführt werden. Insbesondere kann die Produktion des Polypeptids durch eine Zelle durch Einbringen einer Polypeptidsequenz herabgesetzt oder ausgeschaltet werden, die zu der Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die das Polypeptid codiert, das in der Zelle transkribiert werden kann und zur Hybridisierung mit der Polypeptid-mRNA, die in der Zelle produziert wird, in der Lage ist. Unter Bedingungen, durch die sich die komplementäre Antisense-Nukleotidsequenz mit der Polypeptid-mRNA hybridisieren lässt, wird somit die Menge an translatiertem Polypeptid herabgesetzt oder unterdrückt.
Es ist bevorzugt, dass die durch die erfindungsgemäßen Verfahren zu modifizierende Zelle mikrobiellen Ursprungs ist, beispielsweise ein Pilzstamm, der zur Produktion von gewünschten Proteinprodukten, die entweder homolog oder heterolog gegenüber der Zelle sind, geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine mutante Zelle einer Elternzelle, die eine Unterbrechung oder Deletion einer Nukleinsäuresequenz einschließt, die das Polypeptid oder eine Kontrollsequenz davon codiert, was zu der mutanten Zelle führt, die weniger des Polypeptids produziert als die Elternzelle.
Die so erzeugten Polypeptid-defizienten mutanten Zellen sind besonders als Wirtszellen zur Expression von homologen und/oder heterologen Polypeptiden geeignet. Darum betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin Verfahren zur Herstellung eines homologen oder heterologen Polypeptids, umfassend (a) das Kultivieren der mutanten Zelle unter Bedingungen, die zur Herstellung des Polypeptids geeignet sind, und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides. Der Begriff "heterologe Polypeptide" ist hier definiert als Polypeptide, die für die Wirtszelle nicht nativ sind, als ein natives Protein, in dem Modifikationen vorgenommen wurden, um die native Sequenz zu ändern, oder als ein natives Protein, dessen Expression als Ergebnis einer Manipulation der Wirtszelle durch rekombinante DNA-Techniken quantitativ verändert wurde.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinprodukts, das im Wesentlichen frei von Galactoseoxidase-Aktivität ist, durch Fermentation einer Zelle, die sowohl ein erfindungsgemäßes Polypeptid als auch das Proteinprodukt von Interesse produziert, durch Zugabe einer wirksamen Menge eines Mittels, das zur Hemmung der Galactoseoxidase-Aktivität in der Lage ist, zu der Fermentationslösung vor, während oder nachdem die Fermentation abgeschlossen wurde, zur Wiedergewinnung des Produkts von Interesse aus der Fermentationslösung und gegebenenfalls zur Durchführung einer weiteren Aufreinigung mit dem wiedergewonnenen Produkt.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinprodukts, das im Wesentlichen frei von Galactoseoxidase-Aktivität ist, durch Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Produkts erlauben, zur Durchführung einer kombinierten pH- und Temperaturbehandlung mit der resultierenden Kulturlösung, so dass die Galactoseoxidase-Aktivität im Wesentlichen herabgesetzt wird, und Wiedergewinnen des Produkts aus der Kulturlösung. Alternativ kann die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung an einer Enzympräparation, die aus der Kulturlösung gewonnen wurde, durchgeführt werden. Die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung kann gegebenenfalls in Kombination mit einer Behandlung mit einem Galactoseoxidase-Inhibitor verwendet werden.
Nach diesem Aspekt der Erfindung ist es möglich, mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 85%, noch stärker bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 99% der Galactoseoxidase-Aktivität zu entfernen. Durch Verwendung dieses Verfahrens kann eine vollständige Entfernung der Galactoseoxidase-Aktivität erhalten werden.
Die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung wird vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 6,5-7 und einer Temperatur im Bereich von 40-70°C ausreichend lange durchgeführt, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, wobei typischerweise 30-60 Minuten ausreichen.
Die zur Kultivierung und Reinigung des Produkts von Interesse verwendeten Verfahren können durch aus der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen Galactoseoxidase-freien Produkts ist bei der Herstellung von eukaryotischen Polypeptiden, insbesondere Pilzproteinen, wie Enzymen, von besonderem Interesse. Das Enzym kann ausgewählt werden aus z. B. einem amylolytischen Enzym, lipolytischen Enzym, proteolytischen Enzym, cellulytischen Enzym, aus Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand-Abbau-Enzym. Beispiele für solche Enzyme umfassen eine Aminopeptidase, Amylase, Amyloglucosidase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalyse, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Desoxyribonuklease, Esterase, Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, Glucoseoxidase, Glucosidase, Haloperoxidase, Hemicellulase, Invertase, Isomerase, Laccase, Ligase, Lipase, Lyase, Mannosidase, Oxidase, pectinolytische Enzyme, Peroxidase, Phytase, Phenoloxidase, Polyphenoloxidase, proteolytische Enzyme, Ribonuklease, Transferase, Transglutaminase oder Xylanase. Die Galactoseoxidase-defizienten Zellen können auch zur Expression heterologer Proteine von pharmazeutischem Interesse, wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen, verwendet werden.
Selbstverständlich umfasst der Begriff "eukaryotische Polypeptide" nicht nur native Polypeptide, sondern auch diejenigen Polypeptide, z. B. Enzyme, die durch Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Additionen oder andere solche Modifikationen modifiziert worden sind, um die Aktivität, Thermostabilität, pH-Toleranz und dergleichen zu verstärken.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Proteinprodukt, das im Wesentlichen von Galactoseoxidase-Aktivität frei ist, welches durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellt wird.
Anwendungen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Polypeptide mit Galactoseoxidase-Aktivität.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können zur quantitativen Bestimmung von Galactose unter Anwendung des von Buglova, 1983, Mikrobiol. Zh. 45: 70-77, beschriebenen Verfahrens verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht als Einschränkung für den Umfang der Erfindung ausgelegt werden sollten.
Beispiele
Die als Puffer und Substrate verwendeten Chemikalien waren handelsübliche Produkte mit mindestens Reinheitsgrad.
Medien und Lösungen
COVE-Spurenmetalllösung bestand pro Liter aus 0,04 g NaB₄O₇·10H₂O, 0,4 g von CuSO₄·5H₂O, 1,2 g FeSO₄·7H₂O, 0,7 g MnSO₄·H₂O, 0,8 g Na₂MoO₂·H₂O und 10 g von ZnSO₄·7H₂O.
50 × COVE-Salzlösung bestand pro Liter aus 26 g KCl, 26 g MgSO₄7H₂O, 76 g KH₂PO₄ und 50 ml COVE-Spurenmetallen.
COVE-Medium bestand pro Liter aus 342,3 g Saccharose, 20 ml 50 × COVE-Salzlösung, 10 ml 1 M Acetamid, 10 ml 1,5 M CsCl₂ und 25 g Noble-Agar.
50 × Vogels-Medium bestand pro Liter aus 150 g Natriumcitrat, 250 g KH₂PO₄, 10 g MgSO₄·7H₂O, 10 g CaCl₂·2H₂O, 2,5 ml Biotin-Stammlösung und 5,0 ml AMG-Spurenmetalllösung.
COVE-Top-Agarose bestand pro Liter aus 20 ml 50 × COVE-Salzen, 0,8 M Saccharose, 1,5 M Cäsiumchlorid, 1,0 M Acetamid und 10 g niedrigschmelzende Agarose, pH eingestellt auf 6,0.
RA-Sporulationsmedium bestand pro Liter aus 50 g Succinsäure, 12,1 g NaNO₃, 1 g Glucose, 20 ml 50 × Vogels-Medium und 0,5 ml einer 10 mg/ml NaMoO₄-Stammlösung, pH 6,0.
YEPG-Medium bestand pro Liter aus 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glucose.
STC bestand aus 0,8 M Sorbit, 25 mM Tris pH 8, 25 mM CaCl₂.
SPTC bestand aus 40% PEG 4000, 0,8 M Sorbit, 25 mM Tris pH 8, 25 mM CaCl₂.
M400Da-Medium bestand pro Liter aus 50 g Maltodextrin, 2 g MgSO₄7H₂O, 2 g KH₂PO₄, 4 g Citronensäure, 8 g Hefeextrakt, 2 g Harnstoff und 1 ml COVE-Spurenmetalllösung.
Beispiel 1: Isolierung von Fusarium venenatum-Mycelien
Fusarium venenatum-CC1-3, eine morphologische Mutante des Fusarium-Stamms ATCC 20334 (Wiebe et al., 1991, Mycol. Research 95: 1284-1288) wurde in einem 2-1- Labormaßstab-Fermenter unter Verwendung eines "fed-batch"-Fermentationsschemas mit NUTRIOSE^TM (Roquette Freres, S.A., Beinheim, Frankreich) als Kohlenstoffquelle und mit Hefeextrakt gezüchtet. Ammoniumphosphat wurde in der Nährlösung bereitgestellt. Der pH-Wert wurde bei 6 bis 6,5 gehalten, und die Temperatur wurde mit positiv gelösten Sauerstoff bei 30°C gehalten.
Mycel-Proben wurden 2, 4, 6 und 8 Tage nach der Beimpfung geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Proben wurden bei –80°C gelagert, bis sie zur RNA-Extraktion aufgebrochen wurden.
Beispiel 2: cDNA-Bibliothek-Konstruktion
Gesamtzellen-RNA wurde aus den in Beispiel 1 beschriebenen Mycel-Proben nach dem Verfahren von Timberlake und Barnard (1981, Cell 26: 29-37) extrahiert, und die RNA-Proben wurden durch Norther-Hybridisierung nach Blotten von 1% Formaldehyd-Agarosegelen (Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York) analysiert. Polyadenylierte mRNA-Fraktionen wurden aus Gesamt-RNA mit einem mRNA-Separator-Kit^TM (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von ungefähr 5 μg Poly(A)+ mRNA nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (1983, Gene 25: 263-269), außer dass ein NotI-(dT)18-Primer (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) zur Initiation der ersten Strangsynthese verwendet wurde, synthetisiert. Die cDNA wurde mit Mungobohnennuklease (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) behandelt, und die Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) abgestumpft.
Die cDNA wurde mit NotI verdaut, durch Agarosegelelektrophorese (ca. 0,7-4,5 kb) größenselektioniert und mit pZErO-2.1 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ligiert, welcher mit NotI plus EcoRV gespalten und mit Kälberdarm-Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) dephosphoryliert wurde. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation kompetenter E.-coli-TOP10-Zellen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) verwendet. Die Transformanten wurden auf 2YT-Agarplatten selektioniert (Miller 1992, A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York), die Kanamycin in einer Endkonzentration von 50 μg/ml enthielten.
Zwei unabhängige direktionale cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des Plasmidklonierungsvektors pZErO-2.1 konstruiert. Bibliothek A wurde unter Verwendung von mRNA aus Mycelien hergestellt, die nach vier Tagen geerntet wurden, und Bibliothek B wurde mit mRNA vom Zeitpunkt des sechsten Tages konstruiert. Keine der beiden cDNA-Bibliotheken wurde amplifiziert, um einen repräsentativen "Schnappschuss" des Genexpressionsprofils in den Zellen zu überprüfen. Stattdessen wurden die Bibliotheken ausplattiert, titriert, und unabhängige Klone von jeder wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert.
Bibliothek A (4-Tage-Zellen) bestand aus etwa 7,5 × 10⁴ unabhängigen Klonen, und Bibliothek B (6-Tage-Zellen) bestand aus grob 1,2 × 10⁵ Klonen. Miniprep-DNA wurde aus 40 Kolonien in jeder Bibliothek isoliert und auf die Gegenwart und Größe von cDNA-Inserts überprüft. Bei dieser Analyse enthielten 39 von 40 Kolonien (97,5%) aus Bibliothek A Inserts mit Größen im Bereich von 600 bis 2200 Bp (Durchschnitt = 1050 Bp). Gleichermaßen wiesen 39 von 40 Kolonien (97,5%), die aus Bibliothek B ausgewählt wurden, Inserts mit Größen im Bereich von 800 bis 3600 Bp auf (Durchschnitt = 1380 Bp).
Beispiel 3: Templat-Herstellung und Nukleotidsequenzierung
Aus jeder in Beispiel 2 beschriebenen cDNA-Bibliothek wurden 1192 transformante Kolonien direkt aus den Transformationsplatten auf 96-Well-Mikrotiterplatten, die 200 μl 2YT Nährlösung (Miller, 1992, supra) mit 50 μg/ml Kanamycin enthielten, entnommen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Nach Inkubation wurden jeder Mulde 100 μl steriles 50% Glycerin zugesetzt. Die Transformanten wurden in sekundären tiefen 96-Well-Mikrokulturplatten (Advance Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD), die 1 m Magnificent Broth^TM (MacConnell Research, San Diego, CA), angereichert mit 50 μg Kanamycin pro ml in jeder Vertiefung, enthielten, repliziert. Die primären Mikrotiterplatten wurden tiefgefroren bei –80°C aufbewahrt. Die zweiten tiefen Platten wurden bei 37°C über Nacht unter kräftigem Schütteln (300 U/min) auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Um ein Verschütten und eine Kreuzverunreinigung zu vermeiden und um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen, wurde jede sekundäre Kulturplatte mit einem Polypropylenkissen (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) und einem Mikrotiter-Schalendeckel aus Kunststoff abgedeckt.
Die DNA wurde aus jeder Mulde unter Verwendung des 96-Well-Miniprep-Kit-Protokolls von Advance Genetic Technologies Corporation (Gaithersburg, MD), wie modifiziert nach Utterback et al. (1995, Genome Sci., Technol. 1: 1-8), isoliert. Eine DNA-Sequenzierung in einem Durchgang erfolgte mit einem Perkin-Elmer Applied Biosystem Model 377 Sequenzierer XL (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Verwendung der Farbstoff-Terminationschemie (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60) und des reversen lac-Sequenzierungsprimers.
Beispiel 4: Analyse der DNA-Sequenzdaten
Die Nukleotidsequenzdaten wurden genau auf ihre Qualität untersucht, und Proben, die unkorrekte Abstands- oder zweideutige Niveaus über 2% ergaben, wurden verworfen oder noch einmal durchgeführt. Die Vektorsequenzen wurden mit Unterstützung der FACTURA^TM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) entfernt. Zusätzlich wurden die Sequenzen am Ende von jeder Probe, wenn die Anzahl von zweideutigen Basenzellen zunahm, abgebrochen. Sämtliche Sequenzen wurden miteinander verglichen, um die Multiplizität unter Verwendung der AutoAssembler^TM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) zu bestimmen. Als Letztes wurden sämtliche Sequenzen in drei Rastern translatiert und gegen eine nicht-redundante Datenbasis (NRDB) unter Verwendung der GeneAssist^TM-Software mit einem modifizierten Smith-Waterman-Algorithmus unter Verwendung der BLOSUM-62-Matrix mit einem Schwellenwert von 70 durchsucht. Die NRDB war aus Genpept, Swiss-Prot und PIR-Datenbasen zusammengefügt.
Beispiel 5: Identifizierung von partiellem Galactoseoxidase-cDNA-Klon
Ein putativer Galactoseoxidase-Klon wurde durch partielles Sequenzieren von willkürlichen cDNA-Klonen unter Verwendung eines Applied Biosystem Model 377 XL Automated DNA Sequenzers nach den Anweisungen des Herstellers identifiziert und durch Vergleich der hergeleiteten Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz von Dactylium dendroides-Galactoseoxidase (EMBL M86819), wie in Beispiel 4 beschrieben, identifiziert. Von dem Klon wurde angenommen, dass er ein Teilfragment ist, auf der Grundlage seines Alignments gegenüber der Dactulium dendroides-Galactoseoxidase-Aminosäuresequenz. Dieser Klon wurde als E. coli FD0728 (pFD0728) bezeichnet. Das Teilfragment wurde als Sonde zum Screening einer Fusarium venenatum-Genombibliothek eingesetzt.
Beispiel 6: Fusarium-venenatum-Genom-DNA-Extraktion
Fusarium venenatum-CC1-3 wurde 24 Stunden bei 28°C und 150 U/min in 25 ml YEG-Medium, bestehend pro Liter aus 5 g Hefeextrakt und 20 g Glucose, wachsengelassen. Die Mycelien wurden anschließend durch Filtration über Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) gesammelt und einmal mit 25 ml 10 mM Tris-1 mM EDTA-(TE)-Puffer gewaschen. Überschüssiger Puffer wurde aus den Mycelien ablaufengelassen, die anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Die eingefrorenen Mycelien wurden in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen Pulver gemahlen, und das Pulver wurde zu 20 ml TE-Puffer und 5 ml 20% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (SDS) in einem Einmalzentrifugenröhrchen aus Kunststoff zugesetzt. Das Gemisch wurde vorsichtig mehrmals umgedreht, um ein Mischen sicherzustellen und zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 Vol./Vol./Vol.) extrahiert. Natriumacetat (3 M Lösung) wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,3 M zu ergeben, und die Nukleinsäuren wurden mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol präzipiziert. Das Röhrchen wurde bei 15000 × g 30 min zentrifugiert, und das Pellet wurde vor der Resuspension in 0,5 ml TE-Puffer an der Luft 30 min trocknen gelassen. DNase-freie Ribonuklease A wurde bis auf eine Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde Proteinase K (200 μg/ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Schließlich wurde das Gemisch zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 Vol./Vol./Vol.) vor der Präzipitation der DNA mit Natriumacetat und Ethanol nach Standardverfahren extrahiert. Das DNA-Pellet wurde unter Vakuum getrocknet, in TE-Puffer resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 7: Genomische DNA-Bibliothek-Konstruktion und Screening
Genomische Bibliotheken von Fusarium venenatum wurden in λZipLox nach den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies, Gaithersburg, MD) konstruiert. Fusarium venenatum-genomische DNA wurde teilweise mit Tsp509I verdaut und auf 1% Agarosegelen größenfraktioniert. Die DNA-Fragmente, die im Größenbereich von 3-7 kb wanderten, wurden ausgeschnitten und aus den Agarose-Gelscheiben unter Verwendung von Prep-a-Gene-Reagenzien (BioRad, Hercules, CA) eluiert. Die eluierten DNA-Fragmente wurden mit EcoRI-gespaltenen und dephosphorylierten λZipLox-Vektorarmen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ligiert, und die Ligationsgemische wurden unter Verwendung von handelsüblichen Verpackungs-Extrakten (Stratagene, La Jolla, CA) verpackt. Die verpackten DNA-Bibliotheken wurden ausgestrichen und in E. coli Y1090ZL-Zellen amplifiziert.
Ungefähr 40000 Plaques aus der Bibliothek wurden durch Plaque-Hybridisierung (Davis et al, 1980, supra) mit dem radioaktiv markierten Sondenfragment des Fusarium venenatum-Galactoseoxidase-Gens unter Verwendung hoher Stringenzbedingungen bei 45°C (hohe Stringenz = 50% Formamid, 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA) gescreent. Plaques, die Hybridisierungssignale ergaben, wurden einmal in E. coli Y1090ZL-Zellen gereinigt, und die einzelnen Klone wurden anschließend aus dem λZipLox-Vektor als pZLI-Derivate (D'Alessio et al., 1992, Focus^® 14: 7) ausgeschnitten.
Sechs Plaques wurden identifiziert, die stark mit der Fusarium venenatum-Galactoseoxidase-Gensonde hybridisierten, und jeder der potenziellen Klone wurde anschließend aus dem λZipLox-Vektor als pZLI-Derivat (D'Alessio et al., 1992, supra) ausgeschnitten. Plasmid-DNA wurde aus den Klonen mittels Passage durch E. coli DN10B-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Plasmide wurden mit EcoR und NotI verdaut, um zu bestimmen, ob die Klone identisch waren. Die Größen der klonierten Inserts wurden durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Nach dem Verdau umfasste das größte Insert ein DNA-Fragment von ungefähr 4,3 kb. Dieser Klon wurde als E. coli DH10B-pEJG45 bezeichnet, der zur Sequenzanalyse gewählt wurde.
Beispiel 8: Nukleotidsequenzierung und Charakterisierung des Fusarium venenatum-genomischen Galactoseoxidase-Klons
Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem Applied Biosystems Model 377 XL automatisierten DNA-Sequenzierer unter Verwendung des Dye-Terminator-Verfahrens durchgeführt. Zusammenhängende Sequenzen wurden unter Verwendung einer Transposon-Insertionsstrategie (Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) erzeugt. Der genomische Galactoseoxidase-Klon aus E. coli DH10B-pEJG45, beschrieben in Beispiel 7, wurde bis zu einer durchschnittlichen Redundanz von 5,5 sequenziert.
Der Galactoseoxidase-Klon besaß ein offenes Leseraster von 2037 Bp, welches ein Polypeptid von 679 Aminosäuren codierte. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 2) sind in 1 gezeigt. Unter Verwendung des SignalP-Programms (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) wurde ein Signalpeptid von 20 Resten, entsprechend den Nukleotiden 1 bis 60, vorhergesagt.
Ein Vergleichs-Alignment von Galactoseoxidasesequenzen wurde unter Verwendung der GeneAssist^TM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) mit einem modifizierten Smith-Waterman-Algorithmus unter Verwendung der BLOSUM-62-Matrix mit einem Schwellenwert von 70 vorgenommen.
Das Vergleichs-Alignment zeigte, dass der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Fusarium venenatum-Galactoseoxidase mit dem Galactoseoxidaseprotein aus Dactylium dendroides Identitätsregionen von 61,48% gemeinsam waren (EMBL M86819).
Beispiel 9: Konstruktion des Plasmid pSheB1
Der Fusarium venenatum-Expressionsvektor pSheB1 (2) wurde durch Modifikation von pDM181 (WO 98/20136) erzeugt. Die Modifikationen umfassten (a) Entfernung von zwei NcoI-Schnittstellen innerhalb der pDM181-Sequenz und (b) Restauration des natürlichen Translationsstarts des Fusarium oxysporum-Trypsinpromotors (Rekonstruktion einer NcoI-Schnittstelle am ATG-Startkodon).
Das Entfernen von zwei NcoI-Schnittstellen innerhalb der pDM181-Sequenz wurde unter Verwendung des ortsgerichteten Mutagenese-Kits QuikChange^TM (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) nach den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Paaren von Mutagenese-Primern vorgenommen:
5'-dCAGTGAATTGGCCTCGATGGCCGCGGCCGCGAATT-3' plus (SEQ ID NR. 3)
5'-dAATTCGCGGCCGCGGCCATCGAGGCCAATTCACTG-3' (SEQ ID NR. 4)
5'-dCACGAAGGAAAGACGATGGCTTTCACGGTGTCTG-3' plus (SEQ ID NR. 5)
5'-dCAGACACCGTGAAAGCCATCGTCTTTCCTTCGTG-3' (SEQ ID NR. 6)
Die Restauration des natürlichen Translationsstarts des Fusarium oxysporum-Trypsinpromotors wurde auch unter Verwendung des ortsgerichteten Mutagenese-Kits QuikChange^TM von Stratagene in Verbindung mit dem folgenden Paar von Mutagenese-Primern erreicht:
5'-dCTATCTCTTCACCATGGTACCTTAATTAAATACCTTGTTGGAAGCG-3' plus (SEQ ID NR. 7)
5'-dCGCTTCCAACAAGGTATTTAATTAAGGTACCATGGTGAAGAGATAG-3' (SEQ ID NR. 8)
Sämtliche ortsgerichteten Änderungen wurden durch DNA-Sequenzanalyse der entsprechenden Vektorregionen bestätigt.
Beispiel 10: Konstruktion von Expressionsvektor pEJG43
Der Galactoseoxidase-Expressionsvektor pEJG43 wurde wie folgt konstruiert. Die Galactoseoxidase-codierende Region wurde aus dem genomischen Klon pEJG45 unter Verwendung des folgenden Paars von Primern: 5'-AAATCTTTCTACACCTTGGCC-3' (vorwärts) (SEQ ID NR: 9) und 5'-GGGGTTAATTAATCAAACTGTCACCTTAATCG-3' (rückwärts) (SEQ ID NR: 10) amplifiziert. Der reverse Primer führte nach dem Stoppkodon eine PacI-Schnittstelle ein.
Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt die folgenden Komponenten: 0,5 μg genomischer Klon pEJG45, 50 pmol des Vorwärtsprimers, 50 pmol des Rückwärtsprimers, jeweils 250 μm von dATP, DCTP, dGTP und dTTP, 1 × Pwo-DNA-Polymerasepuffer und 2,5 Einheiten Pwo-DNA-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem Thermal-Cycler, Perkin-Elmer Modell 480, inkubiert, der auf einen Zyklus bei 95°C für 2 min; 10 Zyklen jeweils bei 94°C für 45 s, 55°C für 45 s und 72°C für 2 min; 17 Zyklen jeweils bei 94°C für 45 s, 55°C für 45 s und 72°C für 2 min mit einer Verlängerung von 20 s pro Zyklus; 1 Zyklus bei 72°C für 10 min und einen Einweichzyklus bei 45°C programmiert war. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 1-%-Agarosegel (Eastman Kodak, Rochester, NY) isoliert, wobei eine 2-kb-Produktbande aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung von Qiaex II (Qiagen, Chatsworth, CA) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt wurde.
Das amplifizierte Galactoseoxidase-Segment wurde mit PacI verdaut, mit Qiaquik (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt und mit dem Vektor pSHeB1 ligiert, der zuvor mit NcoI gespalten, mit Klenow behandelt und mit PacI gespalten wurde. Das resultierende Expressionsplasmid wurde als pEJG43 (3) bezeichnet.
Beispiel 11: Expression von Galactoseoxidase-Gen in Fusarium venenatum
Sporen von Fusarium venenatum (CC1-3 (LYMCI) wurden durch Beimpfen eines Kolbens, der 500 ml RA-Sporulationsmedium enthielt, mit 10 Kolonien aus einer 1×-Vogel-Mediumplatten (2,5% Noble-Agar), angereichert mit 2,5% Glucose und 2,5 mM Natriumnitrat, und durch Inkubieren bei 28°C 150 U/min für 2 bis 3 Tage erzeugt. Die Sporen wurden über Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) geerntet und 20 min bei 7000 U/min in einer Sorvall RC-5 B Zentrifuge (E.I. DuPont De Nemours und Co., Wilmington, DE) geerntet. Die pelletisierten Sporen wurden zweimal mit sterilem destillierten Wasser gewaschen, in einem kleinen Volumen Wasser resuspendiert und sodann unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt.
Die Protoplasten wurden durch Beimpfen von 100 ml YEPG-Medium mit 4 × 10⁷ Sporen von Fusarium venenatum-CC1-3 und 16 h Inkubieren bei 24°C und 150 U/min hergestellt. Die Kultur wurde 7 min bei 3500 U/min in einer Sorvall RT 6000D (E.I. DuPont De Nemours und Co., Wilmington, DE) zentrifugiert. Die Pellets wurde zweimal mit 30 ml 1 M MgSO₄ gewaschen und in 15 ml 5 mg/ml NOVOZYME 234^TM (Charge PPM 4356, Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) in 1 M MgSO₄ resuspendiert. Die Kulturen wurden bei 24°C und 150 U/min inkubiert, bis sich Protoplasten bildeten. Dem Protoplastenverdau wurde ein Volumen von 35 ml 2 M Sorbit zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 2500 U/min 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert, zweimal mit STC gewaschen und bei 2000 U/min 10 min zur Pelletisierung der Protoplasten zentrifugiert. Die Protoplasten wurden mit einem Hämozytometer gezählt und in einer 8:2:0,1-Lösung von STC:SPTC:DMSO bis auf eine Endkonzentration von 1,25 × 10⁷ Protoplasten/ml resuspendiert. Die Protoplasten wurden nach Einfrieren mit kontrollierter Geschwindigkeit in einem Nalgene Cryo 1°C Gefriercontainer (VWR Scientific, Inc., San Francisco, CA) bei –80°C gelagert.
Die eingefrorenen Protoplasten von Fusarium venenatum-CC1-3 wurden auf Eis aufgetaut. 5 μg von pEJG43, beschrieben in Beispiel 10, und 5 μl Heparin (5 mg pro ml STC) wurden einem sterilen 50-ml-Polypropylenröhrchen zugesetzt. 100 μl Protoplasten wurden zugesetzt, leicht vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. 1 ml SPTC wurde zugesetzt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 25 ml 40°C COVE-Top-Agarose wurde das Gemisch auf eine leere Platte mit 150 mm Durchmesser gegossen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden zusätzliche 25 ml 40°C COVE-Top- Agarose, die 10 mg BASTA^TM pro ml enthielt, auf die Platte aufgegossen und bei Raumtemperatur für bis zu 14 Tage inkubiert. Der Wirkstoff in dem Herbizid BASTA^TM ist Phosphinothricin. BASTA^TM wurde von AgrEvo (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) erhalten und wurde vor der Verwendung zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.
43 Transformanten wurden direkt aus den Selektionsplatten (COVE-Unterlage mit einer COVE-BASTA^TM-Auflage) ausgewählt und in 125-ml-Schüttelkolben überimpft, die 25 ml M400Da-Medium, angereichert mit 1 mM CaCl₂ und 100 μg/ml Ampicillin (zur Verhinderung bakterieller Verunreinigung), enthielten, und 7 Tage bei 28°C 200 U/min auf einem Plattformschüttler inkubiert. Der untransformierte Empfängerstamm war ebenfalls als eine negative Kontrolle eingeschlossen.
Von den Kolben wurden nach 2, 3, 4 und 7 Tagen Proben genommen und auf Galactoseoxidase-Aktivität getestet. Die Testlösung enthielt 0,1 M Galactose, 17 μg Meerrettichperoxidase pro ml, 1 mM ABTS, 74 mM Natriumphosphat pH 7 und Galactoseoxidase in einer Menge, die zur Erzeugung von 0,03-3 Absorptionsänderungseinheiten bei 405 nm und 24°C, wie gemessen entweder in einer Küvette mit 1 cm Weglänge mit einem Shimadzu UV160U Spektralphotometer oder in einer 96-Well-Platte mit einem Molecular Devices Thermomax Microplate Reader, ausreichte.
Die Ergebnisse des Galactoseoxidase-Aktivitätstests zeigten, dass die Transformanten nachweisbare Galactoseoxidase produzierten.
Hinterlegung von biologischen Materialien
Das folgende biologische Material wurde unter den Regeln des Budapester Vertrags mit der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604 hinterlegt, und es wurde ihm die folgende Zugangsnummer gegeben:
Der Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die gewährleisten, dass der Zugang zur Kultur während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung einer Person verfügbar ist, die von dem Commissioner of Patents and Trademarks als dafür autorisiert gemäß 37 C.F.R. § 1.14 und 35 U.S.C. § 122 bestimmt wird. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur des hinterlegten Stammes dar. Die Hinterlegung steht zur Verfügung, wie es durch ausländische Patentgesetze in Ländern, bei denen Gegenstücke des angemeldeten Gegenstandes oder seiner Abkömmlinge eingereicht sind, erfordert ist. Jedoch sollte verstanden werden, dass die Möglichkeit einer Hinterlegung keine Lizenz zur Ausübung des Gegenstands der Erfindung unter teilweiser Aufhebung der durch behördliche Wirkung gewährten Patentrechte darstellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid mit Galactoseoxidase-Aktivität, das ist: (a) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80% Identität mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 aufweist, oder (b) ein Polypeptid, das durch eine Nucleinsäure-Sequenz kodiert ist, die unter mittleren-hohen Stringenzbedingungen mit (i) den Nucleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID Nr. 1, (ii) der in den Nucleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID Nr. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii) von mindestens 100 Nucleotiden oder (iv) einem komplementären Strang zu (i), (ii) oder (iii) hybridisiert.
Polypeptid von Anspruch 1, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mindestens 80% Identität mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 2, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mindestens 90% Identität mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 3, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mindestens 95% Identität mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 4, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mindestens 97% Identität mit den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2.
Polypeptid nach Anspruch 1, bestehend aus der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2.
Polypeptid nach Anspruch 1, das aus den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 1, das durch eine Nucleinsäure-Sequenz kodiert ist, die unter mittleren-hohen Stringenzbedingungen mit (i) den Nucleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID Nr. 1, (ii) der in den Nucleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID Nr. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii) von mindestens 100 Nucleotiden oder (iv) einem komplementären Strang zu (i), (ii) oder (iii) hybridisiert.
Polypeptid nach Anspruch 9, das durch eine Nucleinsäure-Sequenz kodiert ist, die unter mittleren-hohen Stringenzbedingungen mit (i) den Nucleotiden 2342 bis 4318 der SEQ ID Nr. 1, (ii) der in den Nucleotiden 2342 bis 4318 der SEQ ID Nr. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz oder (iii) einem komplementären Strang zu (i) oder (ii) hybridisiert.
Polypeptid nach Anspruch 1, das durch eine Nucleinsäure-Sequenz kodiert ist, die unter mittleren-hohen Stringenzbedingungen mit (i) den Nucleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID Nr. 1, (ii) der in den Nucleotiden 61 bis 2037 der SEQ ID Nr. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz, (iii) einer Subsequenz von (i) oder (ii) von mindestens 100 Nucleotiden oder (iv) einem komplementären Strang von (i), (ii) oder (iii) hybridisiert.
Polypeptid nach Anspruch 11, das durch eine Nucleinsäure-Sequenz kodiert ist, die unter hohen Stringenzbedingungen mit (i) den Nucleotiden 2342 bis 4318 der SEQ ID Nr. 1, (ii) der in den Nucleotiden 2342 bis 4318 der SEQ ID Nr. 1 enthaltenen cDNA-Sequenz oder (iii) einem komplementären Strang zu (i) oder (ii) hybridisiert.
Polypeptid nach Anspruch 1, das durch die Nucleinsäure-Sequenz kodiert ist, die im Plasmid pEJG45 NRRL enthalten ist, das in E. coli NRRL B-30076 enthalten ist.
Nucleinsäure-Sequenz, die eine Nucleinsäure-Sequenz umfasst, die die Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäure-Konstrukt, das die Nucleinsäure-Sequenz von Anspruch 14 umfasst, die operativ mit einer oder mehreren Kontroll-Sequenzen verbunden ist, die die Produktion des Polypeptides in einem geeigneten Expressionswirt steuert.
Rekombinanter Expressions-Vektor, der das Nucleinsäure-Konstrukt von Anspruch 15 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die das Nucleinsäure-Konstrukt von Anspruch 15 umfasst.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend (a) das Kultivieren eines Stammes, um einen Überstand herzustellen, der das Polypeptid umfasst, und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend (a) das Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Nucleinsäure-Konstrukt umfasst, die eine Nucleinsäure-Sequenz umfasst, die das Polypeptid kodiert, unter Bedingungen die für die Herstellung des Polypeptides geeignet sind und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides mit Galactoseoxidase-Aktivität, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptides förderlich sind, wobei die Wirtszelle eine mutante Nucleinsäuresequenz mit mindestens einer Mutation in der das reife Polypeptid kodierenden Sequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst, wobei die mutante Nucleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, die aus den Aminosäuren 21 bis 679 der SEQ ID Nr. 2 besteht, und (b) Wiedergewinnen des Polypeptides.
Nucleinsäure-Konstrukt, das ein Gen umfasst, das ein Protein kodiert, das operativ an eine Nucleinsäuresequenz gebunden ist, die ein Signalpeptid kodiert, das aus den Nucleotiden 1 bis 60 der SEQ ID. Nr. 1 besteht, wobei das Gen für die Nucleinsäuresequenz fremd ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nucleinsäure-Konstrukt von Anspruch 21.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nucleinsäure-Konstrukt von Anspruch 21.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend (a) das Kultivieren der rekombinanten Wirtszelle von Anspruch 23 unter Bedingungen, die für die Herstellung des Proteins geeignet sind, und (b) Wiedergewinnen des Proteins.