CN1344324A - 具有半乳糖氧化酶活性的多肽和编码它们的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的核酸序列。本发明还涉及包含该核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及制备和使用该多肽的方法。

Description

具有半乳糖氧化酶活性的多肽和编码它们的核酸

                        发明背景

1、发明领域

本发明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分离多肽和编码这些多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及制备和使用这些多肽的方法。

2、有关技术的说明

在分子氧的存在下，半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.9)催化D一半乳糖的氧化作用，生成D-半乳-己二醛糖和过氧化氢。

半乳糖氧化酶已经从下列来源分离到：圆形多孔菌(Amarai等，1966，《酶学方法》(Methods in Enzymology)9：87-92；Avigad等，1962，《生物化学杂志》(Journal of Biological Chemistry)237：2736-2743；Kosman等，1974，《生物化学与生物物理学文献》(Archives of Biochemistry and Biophysics)165：456-467)、树状指孢(Tressel和Kosman，1982，《酶学方法》89：163-171；Kellener等，1988，《生物化学与生物物理学文献》262：349-354)、稻恶苗赤霉(Asaka和Terada，1982，《农业与生物化学》(Agricultural and Biological Chemistry)46：333-340)、禾谷镰孢(Dias和Kemmelmeir，1987，《微生物学评论》(Rev.Microbiol.)18：276-278)。

编码半乳糖氧化酶的基因已经从下列来源分离到：橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)(Silakowski等，1998，《细菌学杂志》(Journal of Bacteriology)180：1241-1247)和树状指孢(McPherson等，1992，《生物化学杂志》267：8146-8152).

本发明的目的是提供具有半乳糖氧化酶活性的改进多肽和编码这些多肽的核酸。

                发明概述

本发明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分离多肽，选自下组：

(a)具有与SEQ ID NO：2之氨基酸21至679具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)被在中等严格条件下与下列杂交的核酸序列编码的多肽：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；

(c)具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽的变体，包含一个或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入；

(d)(a)或(b)的等位基因变体；和

(e)具有半乳糖氧化酶活性的(a)、(b)或(d)的片段。

本发明还涉及编码这些多肽的分离核酸序列和包含这些核酸序列的核酸构建体、载体与宿主细胞，以及制备和使用这些多肽的方法。

附图的简要说明

图1显示Fusarium venenatum半乳糖氧化酶的基因组DNA序列和演绎氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：1和2)。

图2显示pSheB1的限制图。

图2显示pEJG43的限制图。

发明的详细说明

具有半乳糖氧化酶活性的多肽

术语“半乳糖氧化酶活性”在本文中被定义为D-半乳糖：氧6-氧化还原酶活性，它在分子氧的存在下催化D-半乳糖的氧化作用，生成D-半乳-己二醛糖和过氧化氢。除了D-半乳糖以外，其他天然底物包括但不限于二羟丙酮、甘油、棉子糖、甲基-α-D-吡喃半乳糖和甲基-β-D-吡喃半乳糖。出于本发明的目的，半乳糖氧化酶活性按照Baron等，1994，《生物化学杂志》269：25095-25105所述操作加以测定，其中半乳糖氧化酶活性是这样测量的：将通过半乳糖氧化酶的作用从D(+)-半乳糖与O2产生过氧化氢和2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)在辣根过氧化酶存在下的氧化联结在一起。一单位半乳糖氧化酶活性被定义为在24℃pH7下，每分钟产生1微摩尔过氧化氢。

在第一种实施方式中，本发明涉及具有这样一种氨基酸序列的分离多肽，所述氨基酸序列对SEQ ID NO：2之氨基酸21至679(即成熟多肽)具有至少约65％的同一性程度，优选为至少约70％，更优选为至少约80％，进而更优选为至少约90％，最优选为至少约95％，进而最优选为至少约97％，该多肽具有半乳糖氧化酶活性(以下称为“同源多肽”)。在优选的实施方式中，同源多肽具有这样一种氨基酸序列，它与SEQ ID NO：2之氨基酸21至679的区别是五个氨基酸，优选为四个氨基酸，更优选为三个氨基酸，进而更优选为两个氨基酸，最优选为一个氨基酸。出于本发明的目的，两种氨基酸序列之间的同一性程度采用GeneAssist^TM软件(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)加以测定，使用修改的Smith-Waterman算法，BLOSUM 62矩阵的阈值为70。

优选地，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位基因变体、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段。在更优选的实施方式种，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一种优选的实施方式中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2之氨基酸21至679或其等位基因变体、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段。在另一种优选的实施方式中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2之氨基酸21至679。在另一种优选的实施方式中，本发明的多肽由SEQ IDNO：2的氨基酸序列或其等位基因变体、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段组成。在另一种优选的实施方式中，本发明的多肽由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成。在另一种优选的实施方式中，本发明的多肽由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679或其等位基因变体、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段组成。在另一种优选的实施方式中，本发明的多肽由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679组成。

SEQ ID NO：2的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删去一个或更多氨基酸的多肽。优选地，片段含有至少560个氨基酸残基，更优选为至少600个氨基酸残基，最优选为至少640个氨基酸残基。

等位基因变体表示占据相同染色体基因位点的基因的任意两种或更多交替形式。等位基因变异在自然情况下是通过突变引起的，可以导致种群内的多形现象。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有变化)，或者可能编码氨基酸序列发生改变的多肽。多肽的等位基因变体是被基因的等位基因变体所编码的多肽。

在第二种实施方式中，本发明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分离多肽，是被这样的核酸序列编码的，它们在非常低严格条件下与核酸探针杂交，优选为低严格条件，更优选为中等严格条件，更优选为中-高严格条件，进而更优选为高严格条件，最优选为非常高的严格条件，该核酸探针在相同条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037，(ii)包含在SEQ ID N0：1之核苷酸61至2037中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，《分子克隆实验室指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.)。SEQ ID NO：1的子序列可以是至少100个核苷酸，或者优选为至少200个核苷酸。而且，子序列可以编码具有半乳糖氧化酶活性的多肽片段。多肽还可以是具有半乳糖氧化酶活性的多肽的等位基因变体或片段。

按照本领域的熟知方法，SEQ ID NO：1的核酸序列或其子序列以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段可以用于设计核酸探针，以鉴别和克隆来自不同属或种的菌株的具有半乳糖氧化酶活性的DNA编码多肽。确切地说，这样的探针能够用于在标准的DNA印迹操作之后，与有关属或种的基因组或cDNA杂交，目的是鉴别和分离其中相应的基因。这样的探针与完整序列相比可以是非常短的，但是在长度上应当是至少15个、优选为至少25个、更优选为至少35个核苷酸。还能够使用更长的探针。DNA和RNA探针都能使用。在检测相应的基因时，通常对探针进行标记(例如用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。本发明涵盖这样的探针。

在从这些其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库中，可以筛选出与上述探针杂交的DNA和编码具有半乳糖氧化酶活性的多肽的DNA。来自这些其他生物的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳法或其他分离工艺加以分离。来自文库的DNA或所分离的DNA可以被转移和固定在硝基纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO：1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该载体材料。出于本发明的目的，杂交表示在非常低至非常高的严格条件下，核酸序列杂交到经过标记的核酸探针上，后者相当于SEQ ID NO：1所示核酸序列、它的互补链或其子序列。利用X-射线膜检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在优选的实施方式中，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽或其子序列的核酸序列。在另一种优选的实施方式中，核酸探针是SEQID NO：1。在另一种优选的实施方式中，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一种优选的实施方式中，核酸探针是包含在质粒pEJG45中的核酸序列，该质粒是包含在大肠埃希氏杆菌NRRLB-30076中的，其中该核酸序列编码具有半乳糖氧化酶活性的多肽。在另一种优选的实施方式中，核酸探针是包含在质粒pEJG45中的成熟多肽编码区，该质粒是包含在大肠埃希氏杆菌NRRL B-30076中的。

关于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格条件被定义为在下列条件下的预杂交和杂交：在标准DNA印迹操作后，在42℃下，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切与变性的鲑鱼精液DNA中，并且非常低和低严格性为25％甲酰胺，中等和中-高严格性为35％甲酰胺，高和非常高严格性为50％甲酰胺。

关于长度为至少100个核苷酸的长探针，载体材料最后用2×SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟，温度优选为至少45℃(非常低的严格性)，更优选为至少50℃(低严格性)，更优选为至少55℃(中等严格性)，更优选为至少60℃(中-高严格性)，进而更优选为至少65℃(高严格性)，最优选为至少70℃(非常高的严格性)。

关于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格条件被定义为在下列条件下的预杂交、杂交和杂交后洗涤：在标准的DNA印迹操作之后，在低于按照Bolton和McCarthy(1962，《美国国家科学院院报》(Proceedings of the National Academy ofSciences USA)48：1390)所计算的T_m5℃至10℃的温度下，在0.9M NaCl、0.09 M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt氏溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA每ml中。

关于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，载体材料用6×SCC加0.1％SDS洗涤15分钟一次，用6×SSC洗涤两次，每次15分钟，温度为低于所计算的T_m5℃至10℃。

在第三种实施方式中，本发明涉及具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽变体，包含一个或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入。

多肽变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：2之氨基酸序列或其成熟多肽的区别可以是一个或更多氨基酸残基的插入或缺失和/或一个或更多氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。优选地，氨基酸的变化是次要性质，也就是不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常为一个至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延长，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；小的连接肽，至多为约20-25个残基；或小的延长，有利于通过改变净电荷或另一种功能而纯化，例如多组氨酸通路、抗原表位或结合域。

保守性取代的实例发生在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，例如描述在H.Neurath和R.L.Hill，1979，《蛋白质》(The Proteins)，Academic Press，New York中。最常见的置换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及相反的这些。

在第四种实施方式中，本发明涉及与具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性的分离多肽。免疫化学性质是按照熟知的Ouchterlony双向免疫扩散操作，通过免疫交叉反应同一性试验加以测定的。具体来说，按照Harboe和Ingild，In N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks，编辑，《定量免疫电泳指南》(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章、或Johnstone和Thorpe，《免疫化学实践》(Immunochemistry in Practice)，Blackwell ScientificPublications，1982(更具体为27-31页)所述，通过免疫兔子(或其他啮齿动物)制备含有多克隆抗体的抗血清，这些抗体是免疫反应性的或者与具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位结合。具有免疫化学同一性的多肽是以完全相同的方式与抗血清反应的多肽，例如使用特定的免疫化学工艺所得到的沉淀的全部融合、完全相同的沉淀形态和/或完全相同的电泳移动性。免疫化学同一性的进一步解释参见Axelsen，Bock和Kroll，In N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks，编辑，《定量免疫电泳指南》，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章。具有部分免疫化学同一性的多肽是以部分相同的方式与抗血清反应的多肽，例如利用特定的免疫化学工艺所得到的沉淀的部分融合、部分相同的沉淀形态和/或部分相同的电泳移动性。部分免疫化学同一性的进一步解释参见Bock和Axelsen，In N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks，编辑，《定量免疫电泳指南》，Blackwell ScientificPublications，1973，第11章。

抗体也可以是单克隆抗体。单克隆抗体例如可以按照E.Harlow和D.Lane，编辑，1988，《抗体实验室指南》(Antibodies，ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.的方法加以制备和使用。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2之成熟多肽的半乳糖氧化酶活性的至少20％，优选为至少40％，更优选为至少60％，进而更优选为至少80％，进而更优选为至少90％，最优选为至少100％。

本发明的多肽可以从任意属的微生物获得。出于本发明的目的，本文所用的与给定来源有关的术语“从……获得”应当表示被核酸序列编码的多肽是由该来源产生的，或者是由这样一种细胞产生的，其中已经插入来自该来源的核酸序列。在优选的实施方式中，多肽是细胞外分泌的。

本发明的多肽可以是真菌多肽，更优选为酵母多肽，例如假丝酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属或Yarrowia多肽；或者更优选为丝状真菌多肽，例如支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、Filibasidium，镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe、白霉属、毁丝霉属、Neocallimastix、链孢霉属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、踝节菌属、热子囊菌属、草根霉属、Tolypocladium或木霉属多肽。在优选的实施方式中，多肽是卡尔斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维氏糖酵母、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母多肽。

在另一种优选的实施方式中，多肽是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、杆孢状镰孢、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola  insolens、Humicola  lanuginosa、米赫毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙链孢霉、产紫青霉、Trichoderma harzianum、康宁氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉多肽。

在另一种优选的实施方式中，多肽是杆孢状镰孢、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum多肽。

在更优选的实施方式中，Fusarium venenatum细胞是Fusariumvenenatum A3/5，最初作为禾谷镰孢ATCC 20334而保藏的，最近Yoder和Christianson，1998，《真菌遗传学与生物学》(FungalGenetics and Biology)23：62-80和O’Donnell等，1998，《真菌遗传学与生物学》23：57-67将其重新分类为Fusariumvenenatum；以及Fusarium venenatum的分类学等价物，与它们目前已知的种名无关。在另一种优选的实施方式中，Fusariumvenenatum细胞是Fusarium venenatum A3/5或  Fusariumvenenatum ATCC 20334的形态突变体，参见WO 97/26330。

关于上述种类不言而喻的是，本发明涵盖完整与不完整的状态，和其他分类学等同物，例如无性型，与它们已知的种名无关。本领域技术人员将易于认识到适当等同物的同一性。例如，镰孢属的分类学等同物是由D.L.Hawksworth，P.M.Kirk，B.C.Sutton和D.N.Pegler(编辑)，1995，《Ainsworth与Bisby氏真菌辞典》(Ainsworth&Bisby’s Dictionary of the Fungi)，第八版，CAB International，University Press，Cambridge，England，pp.173-174所定义的。

这些种类的菌株在大量培养物保藏中心是易为公众获得的，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Col1ection(ATCC))、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection、Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，这些多肽可以利用上述探针从其他来源鉴别和获得，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物。从自然栖息地分离微生物的工艺是本领域熟知的。然后通过类似的筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库，可以衍生核酸序列。一旦已用探针检测到编码多肽的核酸序列，即可以利用本领域普通技术人员已知的工艺分离或克隆序列(例如参见Sambrook等，1989，出处同上)。

正如本文所定义的，“分离”多肽是基本上不含其他非半乳糖氧化酶多肽的多肽，根据SDS-PAGE测定，纯度例如为至少约20％，优选为至少约40％，更优选为约60％，进而更优选为约80％，最优选为约90％，进而最优选为约95％。

被本发明核酸序列编码的多肽还包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中在该多肽或其片段的N-端或C-端融合了另一种多肽。融合多肽是这样制备的，将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合到本发明的核酸序列(或其部分)上。制备融合多肽的工艺是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列，以便它们在框架内，并且融合多肽的表达受相同启动子和终止子的控制。

核酸序列

本发明还涉及编码本发明多肽的分离核酸序列。在优选的实施方式中，核酸序列列在SEQ ID NO：1中。在另一种更优选的实施方式中，核酸序列是包含在质粒pEJG45中的序列，该质粒是包含在大肠埃希氏杆菌NRRL B-30076中的。在另一种优选的实施方式中，核酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一种更优选的实施方式中，核酸序列是包含在质粒pEJG45中的成熟多肽编码区，该质粒是包含在大肠埃希氏杆菌NRRL B-30076中的。本发明还涵盖这样的核酸序列，它们编码具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遗传密码的简并而不同于SEQ ID NO：1。本发明还涉及SEQ ID NO：l的子序列，它们编码具有半乳糖氧化酶活性的SEQ IDNO：2片段。

SEQ ID NO：1的子序列是由SEQ ID NO：1所涵盖的核酸序列，但是已从5，和/或3，末端删去一个或更多核苷酸。优选地，子序列含有至少1680个核苷酸，更优选为至少1800个核苷酸，最优选为至少1920个核苷酸。

本发明还涉及突变的核酸序列，在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中该突变的核酸序列编码由SEQ IDNO：2之氨基酸21至679组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的工艺是本领域已知的，包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。从基因组DNA克隆本发明核酸序列例如可以这样进行，利用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选，以检测具有共有结构特征的所克隆的DNA片段。例如参见Innis等，1990，《PCR：方法与应用指导》(PCR：A Guide to Methods and Application)，  Academic Press，NewYork。还可以使用其他核酸扩增操作，例如连接酶链反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。核酸序列可以从镰孢属或另一种菌株或有关生物克隆，因此例如可以是核酸序列的多肽编码区的等位基因变体或变种。

本文所用的术语“分离核酸序列”指的是基本上不含其他核酸序列的核酸序列，根据琼脂糖电泳测定，纯度例如至少为约20％，优选为至少约40％，更优选为至少约60％，进而更优选为至少约80％，最优选为至少约90％。例如，分离核酸序列可以通过用在遗传工程中的标准克隆操作获得，使核酸序列从其天然位置重新定位到不同的位点，在那里它将被复制。克隆操作可以涉及包含编码多肽的核酸序列的所需核酸片段的切除和分离、片段向载体分子中的插入和重组载体向宿主细胞中的掺入，在那里核酸序列的多个副本或克隆将被复制。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或其任意组合。

本发明还涉及这样的核酸序列，它们与SEQ ID N0：1的成熟多肽编码区(即核苷酸61至2037)具有至少约65％的同源程度，优选为约70％，优选为约80％，更优选为约90％，进而更优选为约95％，最优选为约97％的同源性，这些序列编码活性多肽。出于本发明的目的，两种核酸序列之间的同源程度是这样测定的：按照Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，《美国国家科学院院报》80：726-730)，使用带有同一性表格和下列多重排列参数的LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)：缺口罚为10，缺口长度罚为10。成对排列参数为Ktuple＝3，缺口罚＝3，窗口＝20。

编码本发明多肽的核酸序列的修饰对基本上相似于该多肽的多肽合成来说可能是必要的。术语“基本上相似”于该多肽指的是多肽的非天然存在形式。这些多肽可以在有些设计方式上不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、pH最优值等方面不同的变体。变体的序列可以这样构建，在如SEQ ID NO：1之多肽编码部分所示核酸序列的基础上，例如其子序列，和/或通过引入核苷酸取代，这些取代不会产生被核酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列，但是相当于意欲制备酶的宿主生物的密码子用途，或者通过引入产生不同氨基酸序列的核苷酸取代。关于核苷酸取代的一般说明，例如参见Ford等，1991，《蛋白质表达与纯化》(ProteinExpression and Purification)2：95-107。

对本领域技术人员来说将是显而易见的是这些取代可以在对分子功能起决定性作用的区域之外进行，仍然会产生活性多肽。被本发明分离核酸序列编码的多肽的活性所必需的氨基酸残基——因此优选地不进行取代——可以按照本领域已知的操作加以鉴别，例如定向诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和Wells，1989，《科学》(Science)244：1081-1085)。在后者工艺中，在分子中每个带正电的残基上引入突变，试验所得突变分子的半乳糖氧化酶活性，以鉴别对分子活性起决定性作用的氨基酸残基。通过核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等工艺所测定的三维结构分析，还能够测定底物-酶相互作用的位点(例如参见de Vos等，1992，《科学》255：306-312；Smith等，1992，《分子生物学杂志》(Journalof Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLetters 309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离核酸序列，它们在非常低的严格条件下与核酸探针杂交，优选为低严格条件，更优选为中等严格条件，更优选为中-高严格条件，进而更优选为高严格条件，最优选为非常高的严格条件，该核酸探针在相同条件下与SEQ ID NO：1的核酸序列或其互补链、或其等位基因变体与子序列杂交(Sambrook等，1989，出处同上)，如本文所定义。

本发明还涉及通过下列步骤制备的分离核酸序列：(a)在非常低、低、中等、中-高、高或非常高的严格条件下，杂交DNA与(i)SEQID NO：1之核苷酸61至2037、(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037中的cDNA序列、(iii)(i)或(ii)的子序列、或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；和(b)分离核酸序列。子序列优选为至少100个核苷酸的序列，例如编码具有半乳糖氧化酶活性的多肽片段的序列。

制备突变的核酸序列的方法

本发明进一步涉及制备突变的核酸序列的方法，包括向SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列或其子序列引入至少一个突变，其中该突变的核酸序列编码由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679或其片段组成的、具有半乳糖氧化酶活性的多肽。

利用本领域已知的任意方法，可以通过定向诱变来实现向核酸序列引入突变以置换一个核苷酸为另一个核苷酸。特别有用的是这样的操作，利用超螺旋的双链DNA载体，其中具有有关的插入片段和两个含有所需突变的合成引物。分别与载体的对立链互补的低聚核苷酸引物在温度循环期间借助Pfu DNA聚合酶而延长。引物一经掺入，即生成含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后，将产物用DpnI处理，后者对甲基化与半甲基化的DNA是特异性的，以消化母体DNA模板和选择含有突变的合成DNA。还可以使用本领域已知的其他操作。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明核酸序列的核酸构建体，它们在操作上可连接到一个或更多控制序列上，该控制序列指向在适合的宿主细胞中编码序列在与控制序列相容的条件下的表达。表达将被理解为包括任何涉及多肽产生的步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

“核酸构建体”在本文中被定义为这样一种单链或双链的核酸分子，它是从天然存在的基因中分离的，或者经过修饰含有以自然界不会存在的方式联合和并置的核酸区段。当核酸构建体含有本发明编码序列的表达所需全部控制序列时，术语核酸构建体与术语表达弹夹是同义的。术语“编码序列”在本文中被定义为这样一种核酸序列，它直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般是由恰好位于mRNA 5’末端可读框架上游的核糖体结合位点(原核生物)或ATG起始密码子(真核生物)和恰好位于mRNA 3’末端可读框架下游的转录终止子序列确定的。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重组的核酸序列。

编码本发明多肽的分离核酸序列可以以各种方式进行处理，以供多肽的表达。核酸序列在其插入载体之前的处理可以是可取的或必要的，因表达载体而异。利用重组DNA法修饰核酸序列的工艺是本领域熟知的。

术语“控制序列”在本文中被定义为包括全部对本发明多肽的表达来说是必要或有利的组分。每种控制序列都可以是编码多肽的核酸序列天生的或外来的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列最起码包括启动子和转录与翻泽终止信号。控制序列可以具有接头，目的是引入特殊的限制位点，有利于控制序列与编码多肽的核酸序列编码区连接。术语“在操作上可连接”在本文中被定义为这样一种构型，其中相对DNA序列的编码序列而言，控制序列被适当放置在这样一个位置，使控制序列指向多肽的表达。

控制序列可以是适当的启动子序列，这是被宿主细胞识别的核酸序列，用于核酸序列的表达。启动子序列含有转录的控制序列，介导多肽的表达。启动子序列可以是任意在所选的宿主细胞内显示转录活性的核酸序列，包括突变、截短和杂种启动子，可以从编码细胞外或细胞内多肽的基因获得，这些多肽与宿主细胞是同源的或异源的。

适合于指向本发明核酸构建体——尤其在细菌宿主细胞中——转录的启动子实例是从下列来源获得的启动子：大肠埃希氏杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖生成酶基因(sacB)、地衣型芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、液化淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣型芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA与xylB基因和原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，《美国国家科学院院报》75：3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等，1983，《美国国家科学院院报》80：21-25)。其他启动子描述在“来自重组细菌的有用蛋白质”(Useful proteins fromrecombinant bacteria)，《科学美国人》(Scientific American)，1980，242：74-94和Sambrook等，1989，出处同上。

适合于指向本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的启动子实例是从下列来源获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)的基因以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶与米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子杂种)和其突变、截短与杂种启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子是从啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒糖酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得的。关于酵母宿主细胞，其他有用的启动子描述在Romanos等，1992，《酵母》(Yeast)8：423-488中。

控制序列还可以是适合的转录终止子序列，这是被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列在操作上可连接到编码多肽的核酸序列3’末端。任何在所选的宿主细胞中起作用的终止子都可以用在本发明中。

关于丝状真菌宿主细胞，优选的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。

关于酵母宿主细胞，优选的终止子是从啤酒糖酵母烯醇化酶、啤酒糖酵母细胞色素C(CYC1)和啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得的。关于酵母宿主细胞，其他有用的终止子描述在Romanos等，1992，出处同上。

控制序列还可以是适合的前导序列，这是mRNA的非翻译区，对宿主细胞翻译来说是重要的。前导序列在操作上可连接到编码多肽的核酸序列5’末端。任何在所选的宿主细胞中起作用的前导序列都可以用在本发明中。

关于丝状真菌宿主细胞，优选的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得的。

适合于酵母宿主细胞的前导序列是从啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒糖酵母α-因子和啤酒糖酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得的。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，该序列在操作上可连接到核酸序列的3’末端，在转录时，被宿主细胞识别为向所转录的mRNA加入多腺苷残基的信号。任何在所选的宿主细胞中起作用的多腺苷酸化序列都可以用在本发明中。

关于丝状真菌宿主细胞，优选的多腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因获得的。

关于酵母宿主细胞，有用的多腺苷酸化序列描述在Guo和Sherman，1995，《分子细胞生物学》(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990中。

控制序列还可以是信号肽编码区，它编码与多肽氨基末端连接的氨基酸序列，使所编码的多肽指向细胞分泌途径。核酸序列的编码序列5’端可以固有地含有这样一种信号肽编码区，它在翻译阅读框架中与编码所分泌的多肽的编码区区段是天然连接的。或者，编码序列5’端可以含有对编码序列来说是外来的信号肽编码区。当编码序列天然不含有信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。或者，外来的信号肽编码区可以简单地替代天然的信号肽编码区，目的是增强多肽的分泌。不过，任何使所表达的多肽指向所选的宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用在本发明中。

关于细菌宿主细胞，有效的信号肽编码区是从下列来源获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB11837麦芽淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣型芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣型芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因。其他信号肽描述在Simonen和Palva，1993，《微生物学评论》57：109-137中。

关于丝状真菌宿主细胞，有效的信号肽编码区是从下列来源获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因。

在优选的实施方式中，信号肽编码区是编码SEQ ID NO：2之氨基酸1至20的SEQ ID NO：1之核苷酸1至60。

关于酵母宿主细胞，有用的信号肽是从啤酒糖酵母5-因子和啤酒糖酵母转化酶的基因获得的。其他有用的信号肽编码区描述在Romanos等，1992，出处同上。

控制序列还可以是前肽编码区，它编码定位在多肽氨基末端上的氨基酸序列。所得多肽已知是酶前体或前多肽(或者在有些情况下是酶原)。前多肽一般是无活性的，能够通过前肽的催化性或自动催化性裂解而从前多肽转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母5-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthora thermophila漆酶的基因(WO 95/33836)获得。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端上时，前肽区定位在多肽氨基末端旁边，信号肽区定位在前肽区氨基末端旁边。

还有可能加入调节序列，允许多肽表达相对于宿主细胞生长的调节。调节系统的实例是导致基因表达响应于化学或物理刺激而开或关的那些，包括调节化合物的存在。原核生物系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。其他调节序列的实例是允许基因扩增的那些。在真核生物系统中，这些包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和与重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核酸序列将在操作上与调节序列连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，其包含本发明的核酸序列、启动子和转录与翻译终止信号。可以将上述各种核酸与控制序列连接在一起，形成重组表达载体，它可以包括一个或更多适宜的限制位点，允许编码多肽的核酸序列在这样的位点上插入或取代。或者，本发明的核酸序列可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入到适当的表达载体中而进行表达。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，以便编码序列在操作上可与适当的表达控制序列连接。

重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA操作并且能够引起核酸序列表达的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常将取决于载体与所要引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或封闭循环的质粒。

载体可以是自发复制的载体，即以非染色体性实体存在的载体，它的复制与染色体复制无关，例如质粒、非染色体性元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任意确保自我复制的手段。或者，载体可以在引入到宿主细胞中时，整合到基因组内，与已被整合的染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或者两个或更多载体或质粒，它们一起含有所要引入到宿主细胞基因组中的全体DNA、或转座子。

本发明的载体优选地含有一个或更多可选择的标记物，易于选择转化细胞。可选择的标记物是这样一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒耐受性、对重金属的耐受性、对营养缺陷型的原养型等。细菌可选择的标记物实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的da1基因，或者赋予抗生素耐受性的标记物，例如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素耐受性。适合于酵母宿主细胞的标记物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用在丝状真菌宿主细胞中的可选择标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)及其等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS与pyrG基因和吸水链霉菌的bar基因。

本发明的载体优选地含有允许载体稳定整合到宿主细胞基因组中或者允许载体在细胞中独立于基因组的自发复制的元件。

关于向宿主细胞基因组中的整合，载体可以依赖于编码多肽的核酸序列或任何其他适合于载体通过同源或非同源重组稳定整合到基因组中的载体元件。或者，载体可以含有其他指向通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的核酸序列。其他核酸序列使载体能够整合到宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加整合到精确位置的可能性，整合元件应当优选地含有足够数量的核酸，例如100至1500个碱基对，优选为400至1500个碱基对，最优选为800至1500个碱基对，它们与对应的靶序列是高度同源的，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

关于自发复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述宿主细胞中自发复制的复制起始点。细菌的复制起始点实例是允许在大肠埃希氏杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184和允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起始点。用在酵母宿主细胞中的复制起始点实例是复制的2微米起始点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合和ARS4与CEN6的组合。复制起始点可以是具有这样一种突变者，使其在宿主细胞中的功能是温度敏感性的(例如参见Ehrlich，1978，《美国国家科学院院报》75：1433)。

向宿主细胞中可以插入一个以上本发明核酸序列的副本，以增加基因产物的产生。核酸序列副本数量的增加可以这样实现，向宿主细胞基因组中整合至少一种另外的序列副本，或者包括带有核酸序列的、可扩增的可选择的标记基因，其中通过在适当选择剂的存在下培养细胞，能够选择含有可选择标记基因的扩增副本以及核酸序列的其他副本。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的操作是本领域技术人员熟知的(例如参见Sambrook等，1989，出处同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，包含本发明的核酸序列，它们有利地用于多肽的重组制备。向宿主细胞中引入包含本发明核酸序列的载体，以便使载体保持染色体完整或者如前所述作为自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖母体细胞的任何因发生在复制期间的突变而不等同于母体细胞的后代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞的微生物，例如原核生物，或非单细胞的微生物，例如真核生物。

有用的单细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，或链霉菌属细胞，例如变青链霉菌或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠埃希氏杆菌和假单胞菌。在优选的实施方式中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一种优选的实施方式中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性芽孢杆菌。

向细菌宿主细胞引入载体例如可以这样进行，通过原生质体转化(例如参见Chang和Cohen，1979，《分子遗传学与普通遗传学》(Molecular General Genetics)168：111-115)、利用活性细胞(例如参见Young和Spizizin，1961，《细菌学杂志》81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，《分子生物学杂志》56：209-221)、电穿孔(例如参见Shigekawa和Dower，1988，《生物工艺》(Biotechniques)6：742-751)或接合(例如参见Koehler和Thorne，1987，《细菌学杂志》169：5771-5278)。

宿主细胞可以是真核生物、例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌的细胞。

在优选的实施方式中，宿主细胞是真菌细胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌纲、担子菌纲、壶菌纲和接合菌纲(如Hawksworth等定义，《Ainsworth与Bisby氏真菌辞典》，第8版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK)以及卵菌亚纲(如Hawksworth等所引用，1995，出处同上，171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，出处同上)。

在更优选的实施方式中，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(酵母目)、产担子孢子酵母和属于不完全菌纲(芽生菌目)的酵母。由于将来酵母的分类可能发生改变，出于本发明的目的，酵母应当根据《酵母的生物学与活性》(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所述加以定义。

在进而更优选的实施方式中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊氏酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属或Yarrowia细胞。

在最优选的实施方式中，酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维氏糖酵母、Saccharomyces norbensis或卵形糖酵母细胞。在另一种最优选的实施方式中，酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母细胞。在另一种最优选的实施方式中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一种更优选的实施方式中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌和卵菌亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等所定义，1995，出处同上)。丝状真菌的特征在于菌丝壁由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂的多糖组成。植物性生长是通过菌丝伸长进行的，碳的分解代谢必须是需氧的。相形之下，啤酒糖酵母等酵母的植物性生长是通过单细胞叶状体的芽生进行的，碳的分解代谢可以是发酵的。

在进而更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是下列种类的细胞，但不限于支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、白霉属、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、草根霉属、Tolypocladium或木霉属。

在最优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum、(Nirenborg sop.nov.)细胞。在另一个更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙链孢霉、产紫青霉、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康宁氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以按本身已知的方式转化，其过程涉及原生质体生成、原生质体的转化和细胞壁的再生。适合于曲霉属宿主细胞转化的操作描述在EP 238 023和Yelton等，1984，《美国国家科学院院报》81：1470-1474中。适合于转化镰孢属的方法描述在Malardier等，1989，《基因》(Gene)78：147-156和WO 96/00787中。酵母可以用下述方法转化：Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编辑，酵母遗传学与分子生物学指导(Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology)，《酶学方法》，194卷，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，《细菌学杂志》153：163；和Hinnen等，1978，《美国国家科学院院报》75：1920。

制备方法

本发明还涉及制备本发明多肽的方法，包括(a)培养这样一种菌株，它的野生型能够产生多肽，制得包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。优选地，该菌株是镰孢属，更优选为Fusarium venenatum。

本发明还涉及制备本发明多肽的方法，包括(a)在有助于多肽产生的条件下培养宿主细胞；和(b)回收多肽。

本发明还涉及制备本发明多肽的方法，包括(a)在有助于多肽产生的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含突变的核酸序列，该序列在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区具有至少一种突变，其中该突变的核酸序列编码由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679组成的多肽；和(b)回收多肽。

在本发明的制备方法中，利用本领域已知的方法，在适合于多肽产生的营养培养液中培养细胞。例如，细胞可以这样培养，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)，在实验室或工业发酵罐内、在适合的培养液中进行，在允许多肽表达和/或分离的条件下进行。利用本领域已知的操作，在包含碳与氮源和无机盐的适合的培养液中进行培养。适合的培养液可从供应商处获得，或者可以按照已公开的组成制备(例如美国典型培养物保藏中心目录)。如果多肽被分泌到营养培养液中，可以直接从培养液中回收多肽。如果没有分泌多肽，则可以从细胞溶胞产物中回收之。

多肽可以利用对多肽来说是特异性的本领域已知方法加以检测。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的生成或酶底物的消失。例如，如本文所述，酶测定法可以用于测定多肽的活性。

所得多肽可以通过本领域已知的方法加以回收。例如，多肽可以通过常规操作从营养培养液中回收，这些操作包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过本领域已知的各种操作加以纯化，这些操作包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲合、疏水性、色谱聚焦和体积排阻)、电泳操作(例如制备型等电位聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(例如参见《蛋白质纯化》(Protein Purification)J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCHPublishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，它们已经用本发明的编码具有半乳糖氧化酶活性的多肽的核酸序列转化，以便以可回收的量表达和产生多肽。多肽可以从植物或植物部分中回收。或者，含有重组多肽的植物或植物部分本身可以用于提高食品或饲料的质量，例如提高营养价值、可口性和流变性质，或者破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物。单子叶植物的实例是禾草，例如草地早熟禾(早熟禾，早熟禾属)，饲用牧草，例如羊茅属、黑麦草属，温带草，例如剪股颖属，和谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻米、高梁和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草，豆类，例如白羽扇豆，马铃薯，甜菜，豌豆，蚕豆和大豆，和十字花科植物(芸苔科)，例如花椰菜、芸苔籽，和密切相关的典型生物拟南芥。

植物部分的实例是茎、愈合组织、叶、根、果实、种子和块茎。特殊的植物组织也被认为是植物部分，例如叶绿体、质外体、线粒体、空泡、过氧物酶体和细胞质。此外，任何植物细胞都被认为是植物部分，无论组织起源如何。

还包括在本发明范围内的是这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以按照本领域已知的方法加以构建。简言之，植物或植物细胞是这样构建的，将一种或更多编码本发明多肽的表达构建体掺入到植物宿主基因组中，使所得经过修饰的植物或植物细胞繁殖成为转基因的植物或植物细胞。

表达构建体适宜为核酸构建体，它包含编码本发明多肽的核酸序列，在操作上可与适当的核酸序列在所选的植物或植物部分中表达所需的调节序列连接。此外，表达构建体可以包含可选择的标记物，用于鉴别已经整合表达构建体的宿主细胞和构建体引入到所述植物中所必要的DNA序列(后者取决于所使用的DNA引入方法)。

在需要多肽何时、何处和如何表达的基础上，决定调节序列的选择，例如启动子与终止子序列和可选的信号或转运序列。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或可诱导的，或者可以是发展的、阶段或组织特异性的，基因产物可以定向于特殊的组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列例如描述在Tague等，1988，《植物生理学》(Plant Physiology)86：506中。

关于组成型表达，可以使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980，《细胞》(Cell)21：285-294)。器官特异性启动子例如可以是来自贮藏组织、例如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)或来自代谢组织、例如分生组织的启动子(Ito等，1994，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)24：863-878)，种子特异性启动子，例如来自稻米的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白(Wu等，1998，《植物与细胞生理学》(Plant and Cell Physiology)39：885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等，1998，《植物生理学杂志》(Journal of Plant Physiology)152：708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等，1998，《植物与细胞生理学》39：935-941)，来自蔓菁的贮藏蛋白napA，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如描述在WO 91/14772中。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自稻米或马铃薯的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，《植物生理学》102：991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，《植物分子生物学》26：85-93)或来自稻米的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，《分子遗传学与普通遗传学》248：668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，《植物分子生物学》22：573-588)。

还可以使用启动子增强元件，以实现酶在植物中的更高表达。例如，启动子增强元件可以是内含子，它被放置在启动子与编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如，Xu等，1993，出处同上公开了稻米肌动蛋白1基因的第一种内含子用于增强表达。

可选择的标记基因和表达构建体的任何其他部分可以从本领域可得到的那些中选择。

按照本领域已知的常规工艺将核酸构建体掺入到植物基因组中，包括土壤杆菌属介导的转化、病毒介导的转化、微量注射、粒子轰击、生物分解转化和电穿孔(Gasser等，1990，《科学》244：1293；Potrykus，1990，《生物技术》(BioTechnology)8：535；Shimamoto等，1989，《自然》(Nature)338：274).

目前，根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于生成转基因双子叶植物的所选方法(关于评论，参见Hooykas和Schilperoort，1992，《植物分子生物学》19：15-38)。不过，还能够用于转化单子叶植物，尽管其他转化方法一般也是这些植物所优选的。目前，用于生成转基因单子叶植物的所选方法是embryonic calli或正在发育的胚胎的粒子轰击(细微的金或钨粒子涂以转化DNA)(Christou，1992，《植物杂志》(Plant Journal)2：275-281；Shimamoto，1994，《生物技术流行观点》(Current Opinion Biotechnology)5：158-162；Vasil等，1992，《生物技术》10：667-674)。单子叶植物转化的另一种方法是基于原生质体转化的，如Omirulleh等，1993，《植物分子生物学》21：415-428所述。

转化之后，按照本领域熟知的方法选择其中掺入表达构建体的转化体，再生为全植物。

本发明还涉及制备本发明多肽的方法，包括(a)在有助于多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，其中包含编码本发明的具有半乳糖氧化酶活性的多肽的核酸序列；和(b)回收多肽。

半乳糖氧化酶活性的除去或减少

本发明还涉及制备母体细胞的突变细胞的方法，该方法包括破裂或删去编码多肽的核酸序列或其控制序列，导致当在相同条件下培养时，突变细胞比母体细胞产生更少的多肽。

半乳糖氧化酶活性减少的菌株的构建可以适宜这样实现，修饰或灭活对具有半乳糖氧化酶活性的多肽在细胞中的表达来说必要的核酸序列。所要修饰或灭活的核酸序列例如可以是编码对表达半乳糖氧化酶活性来说必要的多肽或其部分的核酸序列，或者是可以具有多肽从核酸序列的编码序列表达所需的调节功能的核酸序列。这样一种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响多肽表达的部分。关于可能的修饰，其他控制序列如上所述。

核酸序列的修饰或灭活可以这样进行，使细胞受到诱变作用，选择或筛选其中半乳糖氧化酶产生能力已经减少的细胞。诱变可以是特异性的或随机的，例如可以这样进行，利用适合的物理或化学诱变剂，利用适合的低聚核苷酸，或者使DNA序列受到PCR生成的诱变作用。此外，可以利用这些诱变剂的任意组合进行诱变。

适合于该目的的物理或化学诱变剂实例包括紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这样的试剂时，诱变通常这样进行，在适合条件下、在诱变剂的存在下培养细胞，使其发生诱变，选择表现出减少的半乳糖氧化酶活性或产生的细胞。

本发明多肽产生的修饰或灭活可以这样实现，引入、取代或除去编码多肽的核酸序列或其转录或翻译所需的调节元件中的一个或更多核苷酸。例如，可以插入或除去核苷酸，以导致终止密码子的引入、起始密码子的除去或可读框架的改变。这些修饰或灭活可以这样实现，按照本领域已知的方法进行指向位点的诱变或PCR生成的诱变。尽管在原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达所要修饰的核酸序列的细胞上进行，不过优选的是修饰是在体外进行的，如下例示。

消除或减少宿主细胞产生的常规方法实例是通过基因替代或基因间断。在基因间断方法中，体外诱变相当于有关内源性基因或基因片段的核酸序列，产生有缺陷的核酸序列，后者然后转化到宿主细胞中，产生有缺陷的基因。通过同源重组，有缺陷的核酸序列替代内源性基因或基因片段。也可能可取的是，有缺陷的基因或基因片段也编码标记物，后者可以用于选择其中编码多肽的基因已被修饰或破坏的转化体。

或者，核酸序列的修饰或灭活可以采用与多肽编码序列互补的核苷酸序列的既定反义工艺进行。更具体地说，通过引入与编码多肽的核酸序列互补的核苷酸序列，该多肽可以在细胞内转录，并且能够与细胞内产生的多肽mRNA杂交，可以减少或消除由细胞产生的多肽。在允许互补反义核苷酸序列与多肽mRNA杂交的条件下，减少或消除了所翻译的多肽的量。

优选的是，根据本发明的方法所要修饰的细胞是微生物起源的细胞，例如适合于产生所需蛋白质产物的真菌菌株，与细胞是同源的或异源的均可。

本发明进一步涉及母体细胞的突变细胞，包含编码多肽的核酸序列或其控制序列的破裂或缺失，导致突变细胞产生比母体细胞更少的多肽。

如此创建的多肽缺陷型突变细胞特别可用作宿主细胞，用于同源和/或异源多肽的表达。因此，本发明进一步涉及制备同源或异源多肽的方法，包括(a)在有助于多肽产生的条件下培养突变细胞；和(b)回收多肽。术语“同源多肽”在本文中被定义为不是宿主细胞天生的多肽、其中已经经过修饰而改变天生序列的天生蛋白质或作为重组DNA工艺处理宿主细胞的结果其表达被定量改变的天生蛋白质。

本发明在进一步的方面涉及制备基本上没有半乳糖氧化酶活性的蛋白质产物的方法，该方法是发酵产生本发明多肽以及有关蛋白质产物的细胞，发酵的方法是在发酵之前、发酵期间或发酵已经完成之后向发酵肉汤中加入有效量的能够抑制半乳糖氧化酶活性的试剂，从发酵肉汤中回收有关蛋白质产物，可选地对回收产物进行进一步的纯化。

本发明在进一步的方面涉及制备基本上没有半乳糖氧化酶活性的蛋白质产物的方法，该方法是在允许产物表达的条件下培养细胞，对所得培养肉汤进行联合的pH与温度处理，以便从实质上减少半乳糖氧化酶活性，从培养肉汤中回收产物。或者，可以对从培养肉汤中回收的酶制剂进行联合的pH与温度处理。联合的pH与温度处理可以可选地用在与半乳糖氧化酶抑制剂的组合处理中。

按照发明的这个方面，有可能除去至少60％、优选为至少75％、更优选为至少85％、进而更优选为至少95％、最优选为至少99％的半乳糖氧化酶活性。利用这种方法可以完全除去半乳糖氧化酶活性。

联合的pH与温度处理优选地是这样进行的，在6.5-7的pH下，在40-70℃的温度下，处理足够的时间阶段以达到所需效果，通常，30至60分钟足矣。

用于培养和纯化有关产物的方法可以是本领域已知的方法。

用于制备基本上不含半乳糖氧化酶的产物的本发明方法在真核生物多肽的制备中是特别有意义的，特别是真菌蛋白，例如酶。酶例如可以选自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、碳水化物酶、羧基肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质素酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、盐过氧化酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶糖分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。半乳糖氧化酶缺陷型细胞也可以用于表达药物意义上的异种蛋白，例如激素、生长因子、受体等。

不言而喻的是术语“真核生物多肽”不仅包括天生的多肽，而且包括这样的多肽，例如酶，它们已经经过氨基酸取代、删去或加成的修饰，或者其他修饰，以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。

本发明在进一步的方面涉及基本上没有半乳糖氧化酶活性的蛋白质产物，它是用本发明的方法制备的。

用途

本发明还涉及使用具有半乳糖氧化酶活性的多肽的方法。

本发明的多肽可以用于半乳糖的定量测定，采用Buglova，1983，Mikrobiol.Zh.45：70-77所述方法。

本发明的多肽还可以用于产生过氧化氢。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，它包含编码在操作上可连接到核酸序列上的蛋白质的基因，该核酸序列由SEQ ID NO：1之核苷酸1至60组成，后者编码由SEQ ID NO：2之氨基酸1至20组成的信号肽，其中该基因对该核酸序列来说是外来的。

本发明还涉及包含这样一种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及制备蛋白质的方法，包括(a)在适合于蛋白质产生的条件下培养这样一种重组宿主细胞；和(b)回收蛋白质。

核酸序列在操作上可以与其他控制序列连接到外来基因上。这些其他控制序列是如上所述的。

蛋白质对宿主细胞来说可以是天生的或异种的。术语“蛋白质”在本文中不表示具体长度的编码产物，因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”也涵盖两种或更多结合形成编码产物的多肽。“蛋白质”还包括杂种多肽，它包含从至少两个不同的蛋白质获得的部分或完全多肽序列的组合，其中一个或以上蛋白质对宿主细胞来说可以是异源的或天生的。蛋白质进一步包括天然存在的上述蛋白质与杂种蛋白质的等位与工程变体。

优选地，蛋白质是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分或报告基因。在更优选的实施方式中，蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在进而更优选的实施方式中，蛋白质是氨基肽酶、淀粉酶、碳水化物酶、羧基肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质素酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶糖分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以从任何原核生物、真核生物或其他来源获得。出于本发明的目的，本文所用的与给定来源有关的术语“从……获得”应当表示蛋白质是由该来源产生的，或者是由其中已经插入来自该来源的基因的细胞产生的。

本发明通过下列实施例加以进一步描述，它们不应被解释为限制发明的范围。

                     实施例

作为缓冲剂和底物使用的化学品是至少为试剂级的商业产品。

培养液和溶液

每升COVE痕量金属溶液的组成为0.04g NaB₄O₇·10H₂O、0.4gCuSO₄·5H₂O、1.2g FeSO₄·7H₂O、0.7gMnSO₄·H₂O、0.8g Na₂MoO₂·2H₂O和10g ZnSO₄·7H₂O。

每升50X COVE盐溶液的组成为26g KCl、26g MgSO₄·7H₂O、76gKH₂PO₄和50ml COVE痕量金属。

每升COVE培养液的组成为342.3g蔗糖、20ml 50X COVE盐溶液、10mi 1M乙酰胺、10ml 1.5M CsCl₂和25g Noble琼脂。

每升50X Vogels培养液的组成为150g柠檬酸钠、250g KH₂PO₄、10g MgSO₄·7H₂O、10g CaCl₂·2H₂O、2.5ml生物素储备溶液和5.0mlAMG痕量金属溶液。

每升COVE顶层琼脂糖的组成为20ml 50X COVE盐、0.8M蔗糖、1.5M氯化铯、1.0M乙酰胺和10g低熔点琼脂糖，pH调为6.0。

每升RA孢子形成培养液的组成为50g琥珀酸、12.1g NaNO₃、1g葡萄糖、20ml 50X Vogels和0.5ml 10mg/ml NaMoO₄储备溶液，pH调为6.0。

每升YEPG培养液的组成为10g酵母浸膏、20g胨和20g葡萄糖。

STC的组成为0.8M山梨糖醇、25mM Tris pH 8、25mM CaCl₂。

SPTC的组成为40％PEG 4000、0.8M山梨糖醇、25mM Tris pH8、25mM CaCl₂。

每升M400Da培养液的组成为50g麦芽糖糊精、2g MgSO₄7H₂O、2g KH₂PO₄、4g柠檬酸、8g酵母浸膏、2g尿素和1ml COVE痕量金属溶液。

实施例1：Fusarium venenatum菌丝的分离

Fusarium venenatum CCl-3是镰孢属菌株ATCC 20334的形态突变体(Wiebe等，1991，《真菌学研究》(Mycol.Research)95：1284-1288)，使其在两升实验室规模发酵罐中生长，采用补料分批发酵流程，使用NUTRIOSE^TM(Roquette Freres，S.A.，Beinheim，France)作为碳源和酵母浸膏。在饲料中提供磷酸铵。pH保持在6至6.5，温度保持在30℃，含有阳性(positive)溶解氧。

在接种后2、4、6和8天收获菌丝样本，在液氮中快速冷冻。将样本贮藏在-80℃下，直到将它们破裂用于RNA提取。

实施例2：cDNA文库的构建

按照Timberlake和Barnard的方法(1981，《细胞》26：29-37)，从实施例1所述菌丝样本中提取全细胞RNA，从1％甲醛-琼脂糖凝胶得到印迹，用RNA杂交分析RNA样本(Davis等，1986，《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier《科学》Publishing Co.，Inc.，N.Y.)。按照厂商的教导，用mRNASeparator Kit^TM(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，Caiif.)从全RNA中分离多腺苷酸化的mRNA部分。按照Gubler和Hoffman的方法(1983，《基因》25：263-269)，利用大约5μg poly(A)+mRNA合成双链cDNA，但是使用NotI-(dT)18引物(PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，N.J.)引发第一条链的合成。将cDNA用绿豆核酸酶(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，Ind.)处理，末端用T4 DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，Mass.)钝化。

将cDNA用NotI消化，用琼脂糖凝胶电泳选择大小(约0.7-4.5kb)，与pZErO-2.1(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)连接，后者已经用NotI加EcoRV裂解，用小牛肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，IN)脱磷酸化。连接混合物用于转化活性大肠埃希氏杆菌TOP10细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。在2YT琼脂平板上选择转化体(Miller，1992，《细菌遗传学速成》(A Short Course inBacterial Genetics).《大肠埃希氏杆菌与有关细菌的实验室指南和手册》(A Laboratory Manual and Handbook for Escherichiacoli and Related Bacteria)，Cold Spting Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)，平板含有最终浓度为50μg/ml的卡那霉素。

利用质粒克隆载体pZErO-2.1构建两种独立的方向性cDNA文库。利用来自第四天收获的菌丝的mRNA制备文库A，利用来自第六天的mRNA构建文库B。两种cDNA文库都不扩增，目的是检查细胞内基因表达概况的代表性“瞬间图象”。反而将文库平板接种、滴定，通过DNA测序分析彼此独立的克隆。

文库A(4天细胞)由约7.5×10⁴个独立的克隆组成，文库B(6天细胞)由约1.2×10⁵个克隆组成。从每个文库的四十个菌落中分离小量制备的DNA，检查cDNA插入片段的存在和大小。在本项分析中，来自文库A的40个菌落中有39个(97.5％)含有插入片段，大小为600bp至2200bp(平均＝1050bp)。类似地，取自文库B的40个菌落中有39个(97.5％)具有插入片段，大小为800bp至3600bp(平均＝1380bp)。

实施例3：模板制备和核苷酸测序

从每个实施例2所述cDNA文库中，直接将转化平板中的1192个转化体菌落拾取到96孔微量滴定皿中，后者含有200μl 2YT肉汤(Miller，1992，出处同上)和50μg/ml卡那霉素。将平板在37℃下培养过夜，无需摇动。培养后，向每孔中加入100μl无菌的50％甘油。将转化体复制到次级深皿96孔微量培养平板(AdvancedGenetic Technologies Corporation，Gaithersburg，Md.)中，后者含有1ml Magnificent Broth^TM(MacConnell Research，SanDiego，CA)，在每孔每ml中补充有50μg卡那霉素。将初级微量滴定平板冷冻贮藏在-80℃下。将次级深皿平板在37℃下培养过夜，并在旋转摇动器上剧烈搅拌(300rpm)。为了防止溢出和交叉污染，也为了充分换气，将每个次级培养平板盖上聚丙烯垫(AdvancedGenetic Technologies Corporation，Gaithersburg，Md.)和塑料微量滴定皿盖。

利用经过Utterback等(1995，《基因组科学技术》(Genome Sci.Technol.)1：1-8)改进的、Advanced Genetic Technologies公司(Gaithersburg，Md.)的96孔小量制备试剂盒方案从每孔中分离DNA。利用染料-终止子化学(Giesecke等，1992，《病毒学方法杂志》(Journal of Virology Methods)38：47-60)和逆转lac排序引物，用Perkin-Elmer Applied Btosystems 377型测序仪XL(Perkin-Elmer Appl ied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行单程DNA测序。

实施例4：DNA序列数据的分析

仔细检查核苷酸序列数据的质量，将给出不正确间距的样本或不定性水平超过2％的样本放弃掉或者重新进行。借助FACTURA^TM软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif.)除去载体序列。另外，当不确定的碱基访问数增加时，在每个样本末端截短序列。利用AutoAssembler^TM软件(Perkin-Elmer AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，Calif.)彼此比较所有序列，以测定多重性。最后，使用阈值为70的BLOSUM 62矩阵，采用改进的Smith-Waterman算法，利用GeneAssist^TM软件(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif.)在三个框架内翻泽所有序列，检索非多余性数据库(NRDB)。NRDB是从Genpept，Swiss-Prot和PIR数据库集合的。

实施例5：部分半乳糖氧化酶cDNA克隆的鉴定

公认的半乳糖氧化酶克隆是这样鉴定的，按照厂商的教导，利用Applied Biosystems 377XL型自动DNA序列分析仪进行随机cDNA克隆的部分测序，如实施例4所述，将所演绎的氨基酸序列与树状指孢半乳糖氧化酶(EMBL M86819)的氨基酸序列进行比较。在其按树状指孢半乳糖氧化酶的氨基酸序列排列的基础上假定克隆是部分的片段。这种克隆称为大肠埃希氏杆菌FD0728(pFD0728)。使用部分片段作为探针，筛选Fusarium venenatum基因组文库。

实施例6：Fusarium venenatum基因组DNA提取

在28℃和150rpm下，使Fusarium venenatum CCl-3在25ml YEG培养液中生长24小时，每升培养液的组成为5g酵母浸膏和20g葡萄糖。然后通过Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)过滤收集菌丝，用25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)缓冲液洗涤一次。排出菌丝中的过量缓冲液，随后冷冻在液氮中。在电动咖啡研磨机中将冷冻后的菌丝研磨成微细粉末，在一次性塑料离心试管内将粉末加入到20ml TE缓冲液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)中。将混合物小心地颠倒数次以确保混合，用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取两次。加入乙酸钠(3M溶液)，得到最终体积为0.3M，用2.5体积的冰冷乙醇使核酸沉淀出来。将试管在15，000Xg下离心30分钟，使颗粒状物风干30分钟，然后重新悬浮在0.5ml TE缓冲液中。加入不含DNA酶的核糖核酸酶A至浓度为100μg/ml，在37℃下培养30分钟。然后加入蛋白酶K(200ug/ml)，混合物在37℃下额外培养一小时。最后，将混合物用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取两次，然后按照标准操作用乙酸钠和乙醇沉淀出DNA。将DNA颗粒状物在真空下干燥，重新悬浮在TE缓冲液中，贮藏在4℃下。

实施例7：基因组DNA文库的构建和筛选

按照厂商的教导(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)，在λZipLox中构建Fusarium venenatum的基因组文库。将Fusariumvenenatum基因组DNA用Tsp509I部分消化，在1％琼脂糖凝胶上进行大小分级。切除在3-7kb大小范围内移行的DNA片段，利用Prep-a-Gene试剂(BioRad，Hercules，Calif.)从琼脂糖凝胶切片中洗脱。将洗脱后的DNA片段与EcoRI-裂解和脱磷酸的λZipLox载体臂(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)连接起来，利用市售包装提取物(Stratagene，La Jolla，Calif.)包装连接混合物。在大肠埃希氏杆菌Y1090ZL细胞内平板接种和扩增包装后的DNA文库。

在45℃高严格条件下(高严格性＝50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切与变性的鲑鱼精液DNA)，利用Fusariumvenenatum半乳糖氧化酶基因的放射性标记探针片段，通过噬斑杂交(Davis等，1980，出处同上)从文库中筛选大约40，000个噬斑。将给出杂交信号的噬斑在大肠埃希氏杆菌Y1090ZL细胞中纯化一次，随后从λZipLox载体中切除单个克隆，作为pZLl-衍生物(D’Alessio等，1992，Focus.RTM.14∶7)。

鉴定出有六个噬斑与Fusarium venenatum半乳糖氧化酶基因探针强烈地杂交，随后从λZipLox载体中切除每个潜在的克隆，作为pZL1-衍生物(D’Alessio等，1992，出处同上)。按照厂商的教导，使克隆通过大肠埃希氏杆菌DH10B细胞(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)，分离质粒DNA。将质粒用EcoRI和NotI消化，以确定克隆是否等同。通过琼脂糖凝胶电泳测定所克隆的插入片段的大小。通过消化，最大的插入片段包含大约4.3kb的DNA片段。这种克隆称为大肠埃希氏杆菌DH10B-pEJG45，选择它用于序列分析。

实施例8：Fusarium venenatum基因组半乳糖氧化酶克隆的核苷酸测序和特征鉴定

利用染料-终止子化学，用Applied Biosystems 377XL型自动DNA序列分析仪进行DNA测序。利用转位子插入策略生成邻近的序列(Primer Island Transposition Kit，Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，Calif.)。对实施例7所述来自大肠埃希氏杆菌DH10B-pEJG45的半乳糖氧化酶基因组克隆进行测序，平均冗余度为5.5。

半乳糖氧化酶克隆具有编码679个氨基酸的多肽的2037bp可读框架。核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和所演绎的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)如图1所示。利用SignalP程序(Nielsen等，1997，《蛋白质工程》(Protein Engineering)10：1-6)，预测20个残基的信号肽相当于核苷酸1至60。

使用阈值为70的BLOSUM 62矩阵，采用改进的Smith-Waterman算法，利用GeneAssist^TM软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif.)进行半乳糖氧化酶序列的对比排列。

对比排列显示，Fusarium venenatum半乳糖氧化酶的演绎氨基酸序列与来自树状指孢(EMBL M86819)的半乳糖氧化酶蛋白共享61.48％的同一性区域。

实施例9：质粒pSheB1的构建

通过pDM181(WO 98/20136)的修饰生成Fusarium venenatum表达载体pSheB1(图2)。修饰包括(a)除去pDM181序列内的两个NcoI位点，和(b)恢复尖孢镰孢胰蛋白酶启动子的天然翻译开始(在ATG起始密码子上重建NcoI位点)。

按照厂商的教导，利用QuikChange^TM指向位点的诱变试剂盒(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，Calif.)与下对诱变引物除去pDM181序列内的两个NcoI位点：5’-dCAGTGAATTGGCCTCGATGGCCGCGGCCGCGAATT-3’加(SEQ ID NO：3)5’-dAATTCGCGGCCGCGGCCATCGAGGCCAATTCACTG-3’(SEQ ID NO：4)5’-dCACGAAGGAAAGACGATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’加(SEQ ID NO：5)5’-dCAGACACCGTGAAAGCCATCGTCTTTCCTTCGTG-3’  (SEQ ID NO：6)

恢复尖孢镰孢胰蛋白酶启动子的天然翻译开始也是利用Stratagene QuikChange^TM指向位点的诱变试剂盒结合下对诱变引物来完成的：5’-dCTATCTCTTCACCATGGTACCTTAATTAAATACCTTGTTGGAAGCG-3’  加(SEQ ID NO：7)5’-dCGCTTCCAACAAGGTATTTAATTAAGGTACCATGGTGAAGAGATAG-3’(SEQID NO：8)

所有指向位点的变化都得到适当载体区域的DNA序列分析的确认。

实施例10：表达载体pEJG43的构建

如下构建半乳糖氧化酶表达载体pEJG43。利用下对引物从基因组克隆pEJG45扩增半乳糖氧化酶编码区：5’-AAATCTTTCTACACCTTGGCC-3’(正向)(SEQ ID NO：9)和5’-GGGGTTAATTAATCAAACTGTCACCTTAATCG-3’(反向)(SEQ IDNO：10)。将反向引物引入终止密码子后的PacI位点。

扩增反应物(50μl)含有下列组分：0.5μg基因组克隆pEJG45、50pmol正向引物、50pmol反向引物、各为250μM的dATP、dCTP、dGTP与dTTP、1X Pwo DNA聚合酶缓冲液和2.5单位Pwo DNA聚合酶。在Perkin-Elmer 480型热循环装置内，将反应物按下列程序培养：95℃2分钟为1个循环；94℃45秒钟、55℃45秒钟和72℃2分钟为10个循环；94℃45秒钟、55℃45秒钟和72℃2分钟为17个循环，每个循环延长20秒钟；72℃10分钟为1个循环；和一个4℃浸泡循环。在1％琼脂糖凝胶(Eastman Kodak，Rochester，N.Y.)上分离反应产物，从凝胶中切除2kb产物带，按照厂商的教导，利用Qiaex II(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化。

将扩增后的半乳糖氧化酶区段用PacI消化，用Qiaquik(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化，连接到以前已经用NcoI裂解的载体pSheB1上，用Klenow处理，用PacI裂解。所得表达质粒称为pEJ643(图3)。

实施例11：半乳糖氧化酶基因在Fusarium venenatum中的表达

Fusarium venenatum CC1-3(MLY-3)的孢子是这样生成的：在烧瓶内含有500ml RA孢子形成培养液，带有来自1X Vogels培养液平板(2.5％Noble琼脂)的10个塞子，补充有2.5％葡萄糖和2.5mM硝酸钠，在28℃、150rpm下培养2至3天。通过Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)收获孢子，在Sorvall RC-5B离心器(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，DE)中、在7000rpm下离心20分钟。将沉淀的孢子用无菌蒸馏水洗涤两次，重新悬浮在少量水中，然后利用血细胞计数器计数。

原生质体是这样制备的，将l00ml YEPG培养液与4×10⁷个Fusarium venenatum CC1-3孢子在24℃、150rpm下培养16小时。在Sorvall RT 6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，Del.)中，将培养物在3500rpm下离心7分钟。将沉淀用30ml 1M MgSO₄洗涤两次，重新悬浮在15ml 5mg/ml NOVOZYME234^TM(批号PPM 4356，Novo Nordisk A/S，Bagsvxrd，Denmark)的lM MgSO₄溶液中。将培养物在24℃和150rpm下培养，直到生成原生质体。向原生质体消化物中加入体积为35ml的2M山梨糖醇，混合物在2500rpm下离心10分钟。重新悬浮沉淀，用STC洗涤两次，在2000rpm下离心10分钟，使原生质体形成沉淀。用血细胞计数器计数原生质体，重新悬浮在8∶2∶0.1的STC：SPTC：DMSO溶液中，最终浓度为1.25×10⁷个原生质体/ml。在Nalgene Cryo 1℃冷冻容器(VWR Scientific，Inc.，San Francisco，Calif.)中进行控速冷冻后，将原生质体贮藏在-80℃下。

将冷冻后的Fusarium venenatum CCl-3原生质体在冰上融化。向50ml无菌聚丙烯试管中加入5μg实施例10所述pEJG43和5μl肝素(5mg/ml的STC溶液)。加入100μl原生质体，小心地混合，在冰上培养30分钟。加入1ml SPTC，在室温下培养20分钟。加入25ml 40℃COVE顶层琼脂糖后，将混合物倒在空的直径150mm的平板上，在室温下培养过夜。然后在平板顶部倒上含有10mg BASTA^TM/ml的额外25ml 40℃COVE顶层琼脂糖，在室温下培养至多14天。除草剂BASTA^TM中的活性成分是膦丝菌素。BASTA^TM是从AgrEvo(HoechstSchering，Rodovre，Denmark)得到的，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取两次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)提取一次备用。

直接从选择平板拾取43个转化体(下面为COVE，上面为COVE-BASTA^TM)，在125ml摇瓶内含有25ml M400Da培养液，补充有1mM CaCl₂和100μg/ml氨苄西林(防止细菌污染)，在平台摇动器上、在28℃200rpm下培养7天。还包括未转化的受体菌株作为阴性对照。

在2、3、4和7天时取样，测定半乳糖氧化酶活性。测定溶液含有0.1M半乳糖、17μg辣根过氧化酶/ml、1mM ABTS、74mM磷酸钠pH 7和半乳糖氧化酶，其含量足以在405nm和24℃下产生0.03-3个单位的吸光度变化，这是在1-cm径长比色杯中、用ShimadzuUV160U分光光度计测量的，或者是在96孔平板中、用MolecularDevices Thermomax微量滴定板读数器测量的。

半乳糖氧化酶活性测定的结果显示，转化体产生可检测的半乳糖氧化酶。

               生物材料的保藏

下列生物材料已经按照《布达佩斯条约》条款保藏在农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center)，1815University Street，Peoria，Illinois.，61604中，给出下列入藏号：保藏物                           入藏号            保藏日期大肠埃希氏杆菌DH10B(pETB45)    NRRL B-30076    1998年10月27日

菌株已经保藏在这样的条件下，以保证按照37 C.F.R..sctn.§1.14和35 U.S.C..§122，受专利与商标局长官指定的人员在本专利申请悬而未决期间可以获得培养物。保藏物代表所保藏菌株基本上纯的培养物。根据外国专利法的需要，在本申请的相应的或其后续申请所提交的国家也可以获得保藏物。不过应当这样理解，保藏物的可利用性并不构成在由政府行为授予的专利权废除的情况下实施本发明的许可。

本文所述和要求保护的发明并不限于本文所公开的具体实施方式的范围，因为这些实施方式仅供阐述发明的若干方面。任何等同的实施方式都有意落在本发明的范围内。的确，通过上述说明，除了本文这些明示和描述的内容，发明的各种变例对本领域技术人员来说将是显而易见的。这些变例也有意落在所附权利要求的范围内。万一发生抵触，包括定义的公开内容将受到节制。

各种参考文献引用在这里，其全文结合在此作为参考。

Claims (39)

1、具有半乳糖氧化酶活性的分离多肽，选自下组：

(a)具有与SEQ ID NO：2之氨基酸21至679具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)被在中等严格条件下与下列杂交的核酸序列编码的多肽：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；

(c)具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽变体，包含一个或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入；

(d)(a)或(b)的等位基因变体；和

(e)具有半乳糖氧化酶活性的(a)、(b)或(d)的片段。

2、权利要求1的多肽，具有这样一个氨基酸序列，它与SEQ IDNO：2之氨基酸21至679具有至少65％的同一性。

3、权利要求2的多肽，具有这样一个氨基酸序列，它与SEQ IDNO：2之氨基酸21至679具有至少70％的同一性。

4、权利要求3的多肽，具有这样一个氨基酸序列，它与SEQ IDNO：2之氨基酸21至679具有至少80％的同一性。

5、权利要求4的多肽，具有这样一个氨基酸序列，它与SEQ IDNO：2之氨基酸21至679具有至少90％的同一性。

6、权利要求4的多肽，具有这样一个氨基酸序列，它与SEQ IDNO：2之氨基酸21至679具有至少95％的同一性。

7、权利要求1的多肽，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

8、权利要求1的多肽，由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段组成。

9、权利要求8的多肽，由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

10、权利要求9的多肽，由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679组成。

11、权利要求1的多肽，它被在中等严格条件下与下列杂交的核酸序列所编码：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。

12、权利要求11的多肽，它被在中等严格条件下与下列杂交的核酸序列所编码：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318；(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链。

13、权利要求1的多肽，它被在高严格条件下与下列杂交的核酸序列所编码：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。

14、权利要求13的多肽，它被在高严格条件下与下列杂交的核酸序列所编码：(i)SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318；(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链。

15、权利要求1的多肽，其中该多肽是具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的多肽变体，包含一个或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入。

16、权利要求1的多肽，它被包含在质粒pEJG45 NRRL中的核酸序列所编码，该质粒是包含在大肠埃希氏杆菌NRRL B-30076。

17、权利要求1-16任一项的多肽，它具有至少20％的SEQ ID NO：2的半乳糖氧化酶活性。

18、具有与权利要求1-17任一项的多肽相同半乳糖氧化酶活性的多肽。

19、分离的核酸序列，包含编码权利要求1-18任一项的多肽的核酸序列。

20、分离的核酸序列，包含在SEQ ID NO：1之成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的核酸序列，其中该突变的核酸序列编码由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679组成的多肽。

21、分离的核酸序列，是如下制备的：(a)在中等严格条件下，杂交DNA与(i)SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318、(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列、(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)序列、或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；和(b)分离该核酸序列。

22、权利要求21的分离的核酸序列，是如下制备的：(a)在高严格条件下，杂交DNA与(i)SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318、(ii)包含在SEQ ID NO：1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)序列、或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；和(b)分离该核酸序列。

23、核酸构建体，包含权利要求19的核酸序列，在操作上可连接到一个或更多控制序列上，该控制序列指向多肽在适合的表达宿主中的产生。

24、包含权利要求23的核酸构建体的重组表达载体。

25、包含权利要求23的核酸构建体的重组宿主细胞。

26、制备突变核酸序列的方法，包括(a)向SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列引入至少一个突变，其中该突变的核酸序列编码由SEQID NO：2之氨基酸21至679组成的多肽；和(b)回收该突变的核酸序列。

27、由权利要求26的方法制备的突变核酸序列。

28、制备多肽的方法，包括(a)培养包含权利要求27的编码该多肽的突变核酸序列的菌株，制得包含该多肽的上清液；和(b)回收该多肽。

29、制备权利要求1-18任一项的多肽的方法，包括(a)培养菌株，制得包含该多肽的上清液；和(b)回收该多肽。

30、制备权利要求1-18任一项的多肽的方法，包括(a)在适合于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，该构建体包含编码该多肽的核酸序列；和(b)回收该多肽。

31、制备多肽的方法，包括(a)在有助于该多肽产生的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的突变核酸序列，其中该突变的核酸序列编码由SEQ ID NO：2之氨基酸21至679组成的多肽；和(b)回收该多肽。

32、制备细胞突变体的方法，该方法包括破裂或删去编码权利要求1-18任一项的多肽的核酸序列或其控制序列，导致突变体产生比细胞更少的多肽。

33、由权利要求32的方法制备的突变体。

34、权利要求33的突变体，进一步包含编码异源蛋白质的核酸序列。

35、制备异源多肽的方法，包括(a)在有助于该多肽产生的条件下培养权利要求34的突变体；和(b)回收该多肽。

36、核酸构建体，包含编码这样一种蛋白质的基因，它在操作上可连接到编码由SEQ ID NO：1之核苷酸1至60组成的信号肽的核酸序列上，其中该基因对该核酸序列来说是外来的。

37、包含权利要求36的核酸构建体的重组表达载体。

38、包含权利要求36的核酸构建体的重组宿主细胞。

39、制备蛋白质的方法，包括(a)在适合于该蛋白质产生的条件下培养权利要求38的重组宿主细胞；和(b)回收该蛋白质。

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