CN1354789A - 具有胆碱氧化酶活性的多肽及编码该多肽的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有胆碱氧化酶活性的分离多肽和编码该多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含该核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞,以及生产和使用该多肽的方法。

Description

具有胆碱氧化酶活性的多肽及编码该多肽的核酸

                    发明背景

发明领域

本发明涉及具有胆碱氧化酶活性的分离多肽和编码该多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含该核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生产和使用该多肽的方法。

相关技术的描述

胆碱氧化酶(EC1.1.3.17)是能够催化由胆碱通过甜菜醛生物合成甘氨酸甜菜碱的双功能酶。该酶是含有共价结合的FAD的可溶性酶。胆碱是卵磷脂的天然水解产物。甘氨酸甜菜碱被认为在大量微生物和植物中具有渗透防护作用。除了作为渗透防护剂的生理学作用，甘氨酸甜菜碱在普通代谢中也发挥作用，由其衍生的甲基被掺入植物的生物碱、哺乳动物和微生物的甲硫氨酸、和微生物的钴胺素(维生素B₁₂)。此外，甜菜碱可以作为某些微生物的碳源和氮源。

胆碱氧化酶可以应用于临床生化，用于估计血清和羊水中含胆碱的磷脂。此外，编码胆碱氧化酶的基因可能适合用于增强感兴趣生物系统(如植物)中的渗透耐受性。

JP 54035284公开了由属于柱孢属(Cylindrocarpon)、镰孢属(Fusarium)、或赤霉属(Gibberella)的微生物制备胆碱氧化酶。

Deschnium等人(1995，植物分子生物学(Plant MolecularBiology)29：897-907)公开了由球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)克隆胆碱氧化酶基因的方法。Rozwadowski等人(1991，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)173：472-478)公开了由滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)克隆胆碱氧化酶的方法。JP5317056公开了由单孢高温放线菌(Thermoactinomyces monosporus)克隆胆碱氧化酶的方法。

本发明的目的之一是提供具有胆碱氧化酶活性的改进多肽和编码该多肽的核酸。

                      发明概述

本发明涉及具有胆碱氧化酶活性、选自下组的分离多肽：

(a)具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由在低严谨条件下与下述可杂交的核酸序列编码的多肽：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链；

(c)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的变体；

(d)(a)或(b)的等位基因变体；和

(e)具有胆碱氧化酶活性的(a)、(b)、或(d)的片段。

本发明还涉及编码所述多肽的分离核酸序列，和包含该核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生产和使用该多肽的方法。

                    图的简述

图1A和1B显示Fusarium venenatum的胆碱氧化酶的cDNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

                    发明详述具有胆碱氧化酶活性的多肽

术语“胆碱氧化酶活性”此处定义为当氧气存在时催化胆碱氧化产生甘氨酸甜菜醛和过氧化氢的胆碱：氧1-氧化还原酶。为了本发明的目的，根据Ikuta等人描述的步骤(1977，生化杂志(J.Biochem.)82：157-163)，通过测量由胆碱氧化产生的过氧化氢，测定胆碱氧化酶活性。1个单位的胆碱氧化酶活性定义为在标准条件下每分钟产生1.Oμmol过氧化氢的酶量。

在第一个实施方案中，本发明涉及具有胆碱氧化酶活性、具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少大约65％，优选至少大约70％，更优选至少大约80％，甚至更优选至少大约90％，最优选至少大约95％，甚至最优选至少大约97％，同一性的氨基酸序列的分离多肽(此后称为“同源多肽”)。在优选的实施方案中，同源多肽具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有5个氨基酸，优选4个氨基酸，更优选3个氨基酸，甚至更优选2个氨基酸，最优选1个氨基酸不同的氨基酸序列。为了本发明的目的，通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比对参数，测定两种氨基酸序列的同一性程度：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，框＝5，对角线＝5。

本发明多肽优选包含SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸或其等位基因变体；或其具有胆碱氧化酶活性的片段。在更优选的实施方案中，本发明多肽包含SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸。在另一个优选的实施方案中，本发明多肽由SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸或其等位基因变体；或其具有胆碱氧化酶活性的片段组成。在另一个优选的实施方案中，本发明多肽由SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸组成。

SEQ ID NO：2的片段是在该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。该多肽优选包含至少453个氨基酸残基，更优选至少483个氨基酸残基，最优选至少513个氨基酸残基。

等位基因变体指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种变换形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并可能在种群中导致多态性。基因突变可能是沉默的(即编码的多肽没有变化)，或者可能编码氨基酸序列变化了的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

在第二个实施方案中，本发明涉及具有胆碱氧化酶活性，由在很低严谨条件下、优选低严谨条件、更优选中等严谨条件、更优选中等-高严谨条件、甚至更优选高严谨条件、最优选很高严谨条件下与核酸探针可杂交的核酸序列编码的分离多肽，该核酸探针在相同条件下与下述序列可杂交：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约)。SEQ ID NO：1的亚序列可以是至少100个核苷酸，或者优选至少200个核苷酸。此外，亚序列可以编码具有胆碱氧化酶活性的多肽片段。多肽还可以是具有胆碱氧化酶活性的多肽的等位基因变体或片段。

根据本领域众所周知的方法，SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可以用于设计鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株、具有胆碱氧化酶活性的多肽的DNA的核酸探针。具体而言，根据标准Southern印渍步骤，这些探针可以用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA的杂交，以鉴定并分离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短很多，但是应当包含至少15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸。也可以使用更长的探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常(例如用³²P、³H、³⁵S、生物素、或链霉亲和素)标记探针以检测相应基因。本发明涵盖这些探针。

由此，可以对由这样的其它有机体制备的基因组DNA或cDNA文库筛选可与上述探针杂交、编码具有胆碱氧化酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其它分离技术分离来自这样的其它有机体的基因组或其它DNA。可以转移来自文库的DNA或分离DNA，并固定在硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定克隆或与SEQID NO：1同源的DNA或其亚序列，可以将载体材料用于Southern印渍。为了本发明的目的，杂交指在很低至很高严谨条件下，与对应于SEQ IDNO：l所示核酸序列、其互补链、或其亚序列的经标记核酸探针可杂交的核酸序列。使用X线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在优选的实施方案中，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的核酸序列或其亚序列。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是SEQ IDNO：1。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是E.coliNRRL B-30066所含质粒pFD0808所含核酸序列，其中该核酸序列编码具有胆碱氧化酶活性的多肽。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是E.coli NRRLB-30066所含质粒pFD0808所含的、编码SEQ ID NO：2的多肽的核酸序列(即SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸)。

对于至少100个核苷酸的长探针，很低至很高严谨条件定义为根据常规Southern印渍步骤，于42℃在5X SSPE/0.3％ SDS/200μg/ml经剪切和变性的鲑鱼精DNA/25％(很低和低严谨度)或35％(中等和中等-高严谨度)或50％(高和很高严谨度)甲酰胺中进行预杂交和杂交。

对于至少100个核苷酸的长探针，最后将载体材料用2X SSC/0.2％SDS于至少45℃(极低严谨度)，更优选到50℃(低严谨度)，更优选55℃(中等严谨度)，更优选至少60℃(中等-高严谨度)，甚至更优选至少65℃(高严谨度)，最优选至少70℃(很高严谨度)，清洗3次，每次15分钟。

对于大约15-70个核苷酸的短探针，严谨条件定义为根据标准Southern印渍步骤，于比根据Bolton和McCarthy的算法(1962，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy of ScienceUSA)48：1390)计算所得Tm低大约5-大约10℃的温度，在0.9MNaCl/0.09M Tris-HCl pH7.6/6mM EDTA/0.5％ NP-40/1X Denhardt氏液/1mM焦磷酸钠/1mM磷酸二氢钠/0.1mM ATP/0.2mg/ml酵母RNA中，进行预杂交、杂交、和杂交后清洗。

对于大约15-70个核苷酸的短探针，于比计算所得Tm低5-10℃的温度，将载体材料用6X SCC/0.1％SDS清洗1次，再用6X SCC清洗2次，每次15分钟。

在第三个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的变体。

变体多肽的氨基酸序列可以因一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、和/或取代而与SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列不同。氨基酸变化优选性质小的变化，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常为1-大约30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达大约20-25个残基的小接头肽；或者通过改变净电荷或其它功能而有助于纯化的小延伸，诸如多聚组氨酸片段、抗原性表位、或结合结构域。

保守性取代的范例是碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和甲硫氨酸)各组内的取代。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域是已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill于1979年在《蛋白质》(Academic Press，纽约)中描述过。最常见的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly以及反向替换。

在第四个实施方案中，本发明涉及与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性的分离多肽。可通过免疫学交叉反应同一性测试，由众所周知的Ouchterlony双向免疫扩散步骤，测定免疫化学特性。具体而言，根据Harboe和Ingild描述的步骤(在N.H.Axelsen、J.Krll、和B.Weeks编的《定量免疫电泳手册》(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)中，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章；或Johnstone和Thorpe，《(免疫化学实践》，BlackwellScientific Publications，1982，第27-31页)，通过免疫兔子(或其它啮齿类动物)，制备含对有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位具有免疫反应性或可与之结合的多克隆抗体的抗血清。具有免疫化学同一性的多肽是使用特异免疫化学技术，以相同方式与该抗血清反应的多肽，诸如沉淀物的完全融合、相同沉淀物形态、和/或相同电泳迁移率。免疫化学同一性的进一步解释由Axelsen、Bock、和Krll描述(在N.H.Axelsen、J.Krll、和B.Weeks编的《(定量免疫电泳手册》中，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章)。具有部分免疫化学同一性的多肽是使用特异免疫化学技术，以部分相同方式与该抗血清反应的多肽，诸如沉淀物的部分融合、沉淀物形态部分相同、和/或电泳迁移率部分相同。部分免疫化学同一性的进一步解释由Bock和Axelsen描述(在N.H.Axelsen、J.Krll、和B.Weeks编的《定量免疫电泳手册》中，BlackwellScientific Publications，1973，第11章)。

抗体还可以是单克隆抗体。可以根据E.Harlow和D.Lane(编，《抗体：实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)的方法制备并使用单克隆抗体。

本发明多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少100％的胆碱氧化酶活性。

本发明多肽可以由任何属的微生物获得。为了本发明的目的，术语“由……获得”如此处与指定来源一起使用时，指由核酸序列编码的多肽由该来源或插入了来自该来源的核酸序列的细胞产生。在优选的实施方案中，多肽分泌到细胞外。

本发明多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，如嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus alkslophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环形芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)多肽；或者链霉菌属(Streptomyces)多肽，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)多肽；或者革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)多肽。

本发明多肽可以是真菌多肽，更优选酵母多肽，诸如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia属多肽；或者更优选丝状真菌多肽，诸如顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix属、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces属、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、或木霉属(Trichoderma)多肽。

在优选的实施方案中，多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyecs diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces Kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。

在另一个优选的实施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另一个优选的实施方案中，多肽是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、或Fusarium venenatum多肽。

在更优选的实施方案中，所述Fusarium venenatum细胞是最初作为禾谷镰孢ATCC 20334保藏、最近由Yoder和Christianson(1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics and Biology)23：62-80)以及O’Donnell等人(1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics andBiology)23：57-67)重新分类为Fusarium venenatum的Fusariumvenenatum A3/5；以及Fusarium venenatum的分类学同等物，不论这些物种现在的名称如何。在另一个优选的实施方案中，Fusariumvenenatum细胞是Fusarium venenatum A3/5或Fusarium yenenatumATCC 20334的形态学突变体，公开于WO 97/26330。

可以理解，本发明涵盖上述物种的完全和不完全状态，和其它分类学同等物，如无性型，而不论这些物种现在的名称如何。本领域技术人员将容易的领会适当同等物的具体内容。例如，D.L.Hawksworth、P.M.Kirk、B.C.Sutton、和D.N.Pegler(编)在《真菌的Ainsworth和Bisby氏字典》中(1995，第8版，CAB International，UniversityPress，剑桥，英国，第173-174页)定义了镰孢的分类学同等物。

这些物种的菌株可以在大量的培养物收藏中心公开获得，诸如美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、和北方地区研究中心(NRRL)的农业研究机构专利培养物收藏中心(NRRL)。

此外，这些多肽可以使用上述探针由其它来源鉴定并获得，包括由自然界(如土壤、堆肥、水、等等)分离的微生物。用于由天然栖息地分离微生物的技术在本领域是众所周知的。然后可以通过对其它微生物的基因组或cDNA文库相似筛选获得核酸序列。一旦用探针检测到了编码多肽的核酸序列，可以通过本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆序列(参阅Sambrook等人，1989，见上文)。

如此处定义的，“分离”多肽是基本上不含其它非胆碱氧化酶多肽的多肽，如通过SDS-PAGE测定至少大约20％纯，优选至少大约40％纯，更优选大约60％纯，甚至更优选大约80％纯，最优选大约90％纯，甚至最优选大约95％纯。

由本发明核酸序列编码的多肽还包括在多肽或其片段的N末端或C末端融合了另一种多肽的融合多肽或可切割融合多肽。融合多肽通过将编码另一种多肽的核酸序列或其部分与本发明的核酸序列或其部分融合而产生。产生融合多肽的技术在本领域是已知的，包括连接编码各多肽的编码序列，使得它们位于同一读码框且融合多肽的表达受同一启动子和终止子的控制。核酸序列

本发明还涉及编码本发明多肽的分离核酸序列。在优选的实施方案中，核酸序列是SEQ ID NO：1所示序列。在另一个优选的实施方案中，核酸序列是E.coli NRRL B-30066所含质粒pFD0808中所含序列。在另一个优选的实施方案中，核酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一个更优选的实施方案中，核酸序列是E.coliNRRL B-30066所含质粒pFD0808中所含成熟多肽编码区。本发明还涵盖编码具有SEQID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽、因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：1不同的核酸序列。本发明还涉及编码具有胆碱氧化酶活性的SEQ ID NO：2的片段的SEQ ID NO：1亚序列。

SEQ ID NO：1的亚序列是SEQ ID NO：1涵盖，由5’和/或3’末端缺失了一个或多个核苷酸的核酸序列。优选的亚序列包含至少1359个核苷酸，更优选至少1449个核苷酸，最优选至少1559个核苷酸。

本发明还涉及在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一处突变的突变型核酸序列，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术在本领域是已知的，并包括由基因组DNA的分离方法、由cDNA的制备方法、及其组合。可以使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆DNA片段，从而由这些基因组DNA克隆本发明核酸序列。参阅Innis等人，1990，《PCR方法和应用指南》(PCR：A Guideto Methods and Application)，Academic Press，纽约。可以使用其它核酸扩增步骤，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核酸序列的扩增(NASBA)。核酸序列可以由镰孢属的菌株或者其它或相关有机体克隆，因此可以是核酸序列多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

如此处所用，术语“分离核酸序列”指基本不含其它核酸序列的核酸序列，如通过琼脂糖电泳测定至少大约20％纯，优选至少大约40％纯，更优选至少大约60％纯，甚至更优选至少大约80％纯，最优选至少大约90％纯。例如，可以通过基因工程中使用的常规克隆步骤获得分离核酸序列，并将核酸序列由其天然位置重新安置在可将其复制的不同位点。克隆步骤可能涉及切割并分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将片段插入载体分子，并将重组载体掺入将复制多个拷贝或克隆的核酸序列的宿主细胞。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源、或其任意组合。

本发明还涉及编码活性多肽、与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区(SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸)具有至少大约65％、优选大约70％、优选大约80％、更优选大约90％、甚至更优选大约95％、最优选大约97％同源性的核酸序列。为了本发明的目的，通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy of Science USA)80：726-730)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比对参数，测定两种核酸序列之间的同源性程度：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3，框＝20。

对编码本发明多肽的核酸序列的修饰对于合成与本发明多肽基本相似的多肽可能是必需的。术语与多肽“基本相似”指非天然产生的多肽形式。这些多肽可能因工程方法而与由其天然来源分离的多肽不同，如比活性、热稳定性、最佳pH、等等不同的变体。变体序列可以根据SEQ ID NO：1的多肽编码部分(如其亚序列)的核酸序列，和/或通过导入仍产生相同氨基酸序列、但符合意欲用于生产酶的宿主有机体的密码子使用率的核苷酸取代，或通过导入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代而构建。关于核苷酸取代的一般性描述参阅Ford等人，1991，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107。

对于本领域技术人员是显而易见的，这些取代可以位于对分子功能重要的区域之外，而仍产生活性多肽。可以根据本领域已知的步骤，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参阅Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)，鉴定对由本发明的分离核酸序列编码的多肽活性重要、并因此优选不进行取代的氨基酸残基。在后一种技术中，在分子中每个带正电的残基处导入突变，并对产生的突变型分子测试胆碱氧化酶活性，以鉴定对分子活性重要的氨基酸残基。还可以通过由诸如核磁共振分析、晶体学、或光亲和标记(参阅de Vos等人，1992，科学(Science)255：306-312；Smith等人，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS通讯(FEBS Letters)309：59-64)等技术进行的三维结构分析测定底物-酶相互作用的位点。

本发明还涉及编码本发明多肽、在很低严谨条件下、优选低严谨条件、更优选中等严谨条件、更优选中等-高严谨条件、甚至更优选高严谨条件，最优选很高严谨条件下与下述与核酸探针可杂交的分离核酸序列，该核酸探针在相同条件下与SEQ ID NO：1的核酸序列或其互补链可杂交；或此处定义的其等位基因变体和亚序列(Sambrook等人，1989，见上文)。

本发明还涉及通过(a)在很低、低、中等、中等-高、高、或很高严谨条件下，将DNA与下述序列杂交：(i) SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链；和(b)分离核酸序列，由此产生的分离核酸序列。亚序列优选至少100个核苷酸的序列，诸如编码具有胆碱氧化酶活性的多肽片段的序列。产生突变型核酸序列的方法

本发明进一步涉及产生突变型核酸序列的方法，包括在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其亚序列中导入至少一个突变，其中突变型核酸序列编码具有胆碱氧化酶活性、由SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸组成的多肽或其片段。

可以使用本领域的已知方法，通过定点诱变，将突变导入核酸序列，从而用一种核苷酸替换另一种核苷酸。特别有用的是利用包含感兴趣插入片段的超螺旋双链DNA载体和含期望突变的两种合成引物的方法。与载体的相对链互补的寡核苷酸引物在温度循环过程中借助PfuDNA聚合酶而延伸。掺入引物后，产生了包含交错缺刻的突变质粒。温度循环之后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物以消化亲本DNA模板，并选择包含突变的合成DNA。还可使用本领域已知的其它方法。核酸构建物

本发明还涉及包含与一种或多种在相容条件下指导编码序列在合适表达宿主细胞中表达的控制序列可操作连接的本发明核酸序列的核酸构建物。表达应理解为包括涉及产生多肽的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

“核酸构建物”此处定义为由天然产生的基因分离的、或经修饰包含以自然界中不存在的方式组合和并列的核酸片段的单链或双链核酸分子。当核酸构建物包含本发明编码序列表达需要的所有控制序列时，术语“核酸构建物”与术语“表达盒”同义。术语“编码序列”此处定义为直接指示其蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列。基因组编码序列的边界通常由正好位于mRNA开放阅读框架5’末端上游的核糖体结合位点(原核生物)或ATG起始密码子(真核生物)和正好位于mRNA开放阅读框架3’末端下游的转录终止子序列确定。编码序列可以包括(但不限于)DNA、cDNA、和重组核酸序列。

可以以多种方法操作编码本发明多肽的分离核酸序列，以提供多肽的表达。在插入载体前对核酸序列的操作可能是希望的或必需的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰核酸序列的技术在本领域是众所周知的。

术语“控制序列”此处定义为包括对本发明多肽的表达必需或有利的所有成分。每一种控制序列对编码多肽的核酸序列可以是天然的或外来的。这些控制序列包括(但不限于)前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最低限度控制序列包括启动子，和转录和翻译终止信号。为了导入有助于将控制序列与编码多肽的核酸序列编码区连接的特异限制性位点，可以与接头一起提供控制序列。术语“可操作连接”此处定义为其中控制序列被正确置于相对于DNA序列编码序列的位置使得控制序列指导多肽表达的这样一种构象。

控制序列可以是恰当的启动子序列，即由用于表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选定的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短的、和杂合的启动子，而且可以由编码对于宿主细胞是同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于特别是在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建物转录的合适启动子的范例是由大肠杆菌的lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因(amyl)、嗜热脂肪芽孢杆菌的生麦芽糖淀粉酶基因(maltogenicamylase gene，amyM)、解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌的青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌的xylA和xylB基因、和原核生物的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy ofScience USA)75：3727-3731)获得的启动子，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院进展(Proceedings of the NationalAcademy of Science USA)80：21-25)。“来自重组细菌的有用蛋白质”(科学美国人(Scientific American)242：74-94，1980)和Sambrook等人(1989，见上文)描述了其它启动子。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建物转录的合适启动子的范例是由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉的中性α-淀粉酶基因、黑曲霉的酸稳定性α-淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)、米赫根毛霉的脂肪酶基因、米曲霉的碱性蛋白酶基因、米曲霉的磷酸丙糖异构酶基因、构巢曲霉的乙酰胺酶基因、尖镰孢的类胰蛋白酶蛋白酶基因(WO 96/00787)获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(黑曲霉的中性α-淀粉酶基因和米曲霉的磷酸丙糖异构酶基因启动子的杂合体)，和它们突变的、截短的、和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子由酿酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母的半乳糖激酶(GAL1)基因、酿酒酵母的乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因、和酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因获得。Romanos等人(1992，酵母(Yeast)8：423-488)描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子。

控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作连接。在选定的宿主细胞中发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)、构巢曲霉的邻氨基苯甲酸合成酶基因、黑曲霉的α-糖苷酶基因、和尖镰孢的类胰蛋白酶蛋白酶基因获得。

用于酵母宿主细胞的优选终止子由酿酒酵母的烯醇化酶基因、酿酒酵母的细胞色素C(CYC1)基因、和酿酒酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因获得。Romanos等人(1992，见上文)描述了用于酵母宿主细胞的其它有用终止子。

控制序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞进行的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’末端可操作连接。在选定的宿主细胞中发挥功能的任何前导序列都可以用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列由米曲霉的TAKA淀粉酶基因和构巢曲霉的磷酸丙糖异构酶基因获得。

用于酵母宿主细胞的合适前导序列由酿酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母的α-因子基因、和酿酒酵母的乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因获得。

控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列，即与核酸序列的3’末端可操作连接、当转录时由宿主细胞识别作为向转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的信号的序列。在选定的宿主细胞中发挥作用的任何多聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。

用于宿主真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因、构巢曲霉的邻氨基苯甲酸合成酶基因、尖镰孢的类胰蛋白酶蛋白酶基因、和黑曲霉的α-糖苷酶基因获得。

Guo和Sherman(1995，分子细胞生物学(Molecular CellularBiology)15：5983-5990)描述了用于酵母宿主细胞的有用多聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列并引导编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核酸序列的编码序列的5’末端可能包含与编码分泌多肽的编码区在翻译读码框中天然连接的信号肽编码区。或者，编码序列的5’末端可能包含对编码序列来说是外源的信号肽编码区。当编码序列天然不含信号肽编码区时可能需要外源信号肽编码区。或者，为了增强多肽的分泌，可以仅仅用外源信号肽编码区取代天然信号肽编码区。然而，引导表达的多肽进入选定宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区都可以用于本发明。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是由芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌的prsA基因获得的信号肽编码区。Simonen和Palva(1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)57：109-137)描述了其它信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、黑曲霉的中性淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola insolens的纤维素酶基因、和Humicola lanuginosa的脂肪酶基因获得的信号肽编码区。

用于酵母宿主细胞的有用信号肽由酿酒酵母的α-因子基因和酿酒酵母的转化酶基因获得。Romanos等人(1992，见上文)描述了其它有用的信号肽编码区。

控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽称为前酶或前多肽(或某些情况中称酶原)。前多肽通常是无活性的，而且可以由前多肽通过前肽的催化或自催化切割转变成成熟的有活性多肽。前肽编码区可以由枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶基因(nprT)、酿酒酵母的α-因子基因、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因、和嗜热毁丝霉的漆酶基因(WO 95/33836)获得。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区紧靠多肽的氨基末端，而信号肽区紧靠前肽区的氨基末端。

可能还需要添加能够相对于宿主细胞的生长调控多肽表达的调控序列。调控系统的范例是应答化学或物理刺激(包括存在调控化合物)导致基因表达开放或关闭的调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉的葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉的葡糖淀粉酶启动子作为调控序列。调控序列的其它范例是能够用于扩增基因的调控序列。在真核系统中，这些包括当氨甲喋呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因和当重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核酸序列应与调控序列可操作连接。

本发明还涉及用于改变编码本发明多肽的内源基因表达的核酸构建物。该构建物可以包含改变内源基因表达必需的最小数目成分。在一个实施方案中，该核酸构建物优选包含(a)靶向序列、(b)调控序列、(c)外显子、和(d)剪接供体位点。将核酸构建物导入细胞后，构建物通过同源重组插入细胞基因组中的内源基因位点。靶向序列指导元件(a)-(d)整合到内源基因中，使得元件(b)-(d)与内源基因可操作连接。在另一个实施方案中，核酸构建物包含(a)靶向序列、(b)调控序列、(c)外显子、(d)剪接供体位点、(e)内含子、和(f)剪接受体位点，其中靶向序列指导元件(a)-(f)的整合，使得元件(b)-(f)与内源基因可操作连接。然而，构建物可以包含其它成分，诸如选择标记。

在这两个实施方案中，这些成分的导入产生了内源基因表达改变了的新的转录单位。在本质上，新的转录单位是通过靶向构建物导入的序列和内源基因的融合产物。在内源基因改变了的一个实施方案中，基因被激活。在该实施方案中，使用同源重组，通过插入将引起基因以高于相应亲本细胞的水平表达的调控序列，从而取代、破坏、或灭活与亲本细胞内源基因正常相连的调控序列。使用本领域众所周知的方法(参阅美国专利号5,641,670)，通过在构建物中包含可扩增的选择标记，可以进一步扩增激活的基因。在内源基因改变了的另一个实施方案中，基因表达被降低了。

靶向序列可以位于内源基因内、直接与基因相邻、位于上游基因内、或位于内源基因上游且相距一定距离。可以使用一种或多种靶向序列。例如，环形质粒或DNA片段优选采用单个靶向序列，而线性质粒或DNA片段优选采用两个靶向序列。

构建物的调控序列可以包含一种或多种启动子、增强子、支架附着区或基质结合位点、负调控元件、转录结合位点、或这些序列的组合。

构建物还包含内源基因的一个或多个外显子。外显子定义为拷贝成RNA、并存在于成熟mRNA分子中的DNA序列，因此外显子序列与内源基因的编码区处于同一读码框。外显子可以任选的包含编码一个或多个氨基酸和/或部分编码氨基酸的DNA。或者，外显子包含对应于5’非翻译区的DNA。当外源外显子编码一个或多个氨基酸和/或部分氨基酸时，核酸构建物被设计成在转录和剪接后，读码框与内源基因编码区处于同一读码框，因此由第二个外显子衍生的mRNA部分的正确读码框没有改变。

构建物的剪接供体位点指导一个外显子与另一个外显子的剪接。通常，第一个外显子位于第二个外显子的5’，且位于第一个外显子3’侧翼且有交叠的剪接供体位点识别位于第二个外显子5’侧翼的剪接受体位点。剪接受体位点和剪接供体位点一样，是指导一个外显子与另一个外显子发生剪接的序列。剪接系统利用剪接受体位点与剪接供体位点联合作用以除去内含子。表达载体

本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和控制序列连接在一起，以产生重组表达载体，该载体可以包含一个或多个方便的限制性位点，使得能够在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者可以通过将本发明核酸序列或包含该核酸序列的核酸构建物插入用于表达的适当载体而表达本发明核酸序列。在产生表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作连接。

重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA步骤并能够表达核酸序列的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与将要导入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，如质粒、染色体外元件、微小染色体、或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何手段。或者载体可以是当导入宿主细胞后整合到基因组中并与它所整合的染色体一起复制的载体。此外可以使用单个载体或质粒或者两个或多个载体或质粒(它们共同包含将要导入宿主细胞基因组中的总DNA)或者转座子。

本发明载体优选包含一种或多种能够容易选择转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、使营养缺陷型变成原养型、等等的基因。细菌选择标记的范例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，诸如青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四环素抗性。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括(但不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、及其等同物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉素(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明载体优选包含能够使载体整合到宿主细胞基因组或能够使载体在细胞中不依赖基因组而自主复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖编码多肽的核酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体整合到基因组中的任何其它载体元件。或者载体可以包含用于通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的其它核酸序列。上述其它核酸序列使得载体能够在染色体中的精确位点整合到宿主细胞基因组中。为了提高在精确位点整合的可能性，整合元件应当优选包含足够数目的核酸，诸如100-10,000个碱基对，优选400-10,000个碱基对，最优选800-10,000个碱基对，这些核酸序列与相应的靶序列高度同源以增强同源重组的几率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体还可以包含使得载体能够在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的范例是使得能够在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点和使得能够在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的范例是2μ复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以是具有使其在宿主细胞中的功能为温度敏感型的突变的复制起点(参阅Ehrlich，1978，美国国家科学院进展(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA)75：1433)。

可以在宿主细胞中插入超过一个拷贝的本发明核酸序列，以提高基因产物的产量。核酸序列拷贝数的增加可以通过在宿主细胞基因组中整合至少另外一个拷贝的序列或者通过在核酸序列中包含可扩增的选择标记基因，可以通过在适当选择剂存在时培养细胞，选择包含选择标记基因的扩增拷贝、因此核酸序列的其它拷贝的细胞，从而获得。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的步骤对于本领域技术人员是众所周知的(参阅Sambrook等人，1989，见上文)。宿主细胞

本发明还涉及包含本发明核酸序列、可有利的用于多肽的重组生产的重组宿主细胞。可以将包含本发明核酸序列的载体导入宿主细胞，使得维持载体作为上述染色体的整合部分或作为自我复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖因复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物(如原核生物)或非单细胞微生物(如真核生物)。

有用的单细胞细胞是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括(但不限于)芽孢杆菌属细胞，如嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环形芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，如浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌和假单胞菌。在优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，所述芽孢杆菌属细胞是嗜碱性的芽孢杆菌。

可以通过原生质体转化(参阅Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学(Molecular General Genetics)168：111-115)、使用感受态细胞(参阅Young和Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)81：823-829)、Dubnau和Dayidoff-Abelson的方法(1971，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)56：209-221)、电穿孔(参阅Shigekawa和Dower，1988，生物技术(Biotechniques)6：742-751)、或缀合(参阅Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)169：5771-5278)，将载体导入细菌宿主细胞。

宿主细胞可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

在优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”如此处所用包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(由Kawksworth等人在《Ainsworth和Bisby氏真菌字典》(Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi)中定义的，第8版，1995，CABInternational，University Press，剑桥，英国)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人记录的，1995，见上文，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，见上文)。

在更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”如此处所用包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母、和属于半知菌纲的酵母(芽孢纲(Blastomycete))。因为酵母的分类将来可能改变，为了本发明的目的，应当如《酵母的生物学和活性》(Biology and Activities of Yeast)(F.A.Skinner、S.M.Passmore、和R.R.Davenport编，应用细菌学学会第9次座谈会(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series NO.9)，1980)所述定义酵母。

在甚至更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或Yarrowia属的细胞。

在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人定义的，1995，见上文)的亚门的所有丝状形态。丝状真菌的特点通常在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、和其它复杂多糖组成的菌丝壁。通过菌丝的延长进行营养生长，碳代谢是专性需氧的。正相反，酵母(诸如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行的，碳代谢可以是发酵性的。

在甚至更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是(但不限于)顶孢霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢霉属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属、或木霉属的物种的细胞。

在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、或Fusarium venenatum细胞。在甚至最优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei、或绿色木霉细胞。

可以通过已知本质上包括原生质体的形成、原生质体的转化、和细胞壁的再生的方法转化真菌细胞。用于转化曲霉属宿主细胞的合适步骤描述于EP 238 023和Yelton等人，1984，美国国家科学院进展(Proceedings of National Academy of Sciences USA)81：1470-1474。用于转化镰孢属物种的合适方法描述于Malardier等人，1989，基因(Gene)78：147-156和WO 96/00787。可以使用Becker和Guarente(J.N.Abelson和M.I.Simon编，酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，Academic Press公司，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)153：163；和Hinnen等人，1978，美国国家科学院进展(Proceedingsof the National Academy of Sciences USA)75：1920)描述的步骤转化酵母。生产方法

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)培养其野生型形式能够产生所述多肽的菌株，以产生包含该多肽的上清液；和(b)回收多肽。优选菌株是镰孢属菌株，更优选Fusarium venenatum。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收多肽。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区中具有至少一个突变的突变型核酸序列，其中突变型核酸序列编码具有SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸的多肽；和(b)回收多肽。

本发明进一步涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养已经掺入了包含调控序列、外显子、和/或与编码多肽的内源核酸序列的另一外显子可操作连接的剪接供体位点的新转录单位的同源重组细胞；和(b)回收多肽。该方法基于基因激活技术的使用，例如美国专利号5,641,670中描述的。

在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法，在适合于产生多肽的培养基中培养细胞。例如，可以通过摇瓶培养和在实验室或工业发酵罐中进行的小量或大量发酵(包括连续、成批、补料分批、或固态发酵)，在合适的培养基中和在能够表达和/或分离多肽的条件下，培养细胞。在包含碳源、氮源、和无机盐的合适培养基中，使用本领域已知步骤进行培养。合适的培养基可以由供应商处购买，或者可以根据发表的组成成分配制(如美国典型培养物收藏中心的目录)。如果多肽分泌到培养基中，可以由培养基直接回收多肽。如果多肽是不分泌的，则可以由细胞裂解物回收多肽。

可以使用对多肽特异的本领域已知方法检测多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，酶实验可以用于测定此处所述多肽的活性。

可以通过本领域的已知方法回收产生的多肽。例如，可以通过传统步骤由培养基回收多肽，包括(但不限于)离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域的多种已知步骤纯化本发明多肽，包括(但不限于)层析(如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳步骤(如制备性等电聚焦)、差异溶解(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或抽提(参阅《蛋白质纯化》(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，纽约，1989)。植物

本发明还涉及经编码具有本发明胆碱氧化酶活性之多肽的核酸序列转化、以表达和产生可回收量的多肽的转基因植物、植物部分、或植物细胞。可以由植物或植物部分回收多肽。或者，包含重组多肽的植物或植物部分可以用于改进食品或饲料的质量，如改进营养价值、口感、和流变特性，或者用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶或单子叶植物。单子叶植物的范例是草，诸如牧场草(blue grass，Poa)，饲料草，诸如羊茅(festuca)、黑麦草(lolium)，温带草，诸如Agrostis，和谷类，如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高梁、和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的范例是烟草、豆类，诸如白羽扇豆、马铃薯、制糖甜菜、豌豆、蚕豆、和大豆，和十字花科植物(芸苔科)，诸如花椰菜、油籽油菜、和密切相关的模型生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)。

植物部分的范例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎。特定植物组织，诸如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体、和细胞质，同样被认为是植物部分。此外，任何植物细胞(无论组织来源如何)被认为是植物部分。

本发明的范围同样包括这些植物、植物部分、和植物细胞的后代。

可以根据本领域已知方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码本发明多肽的一种或多种表达构建物掺入植物宿主基因组，并将产生的经修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞，从而构建这样的植物或植物细胞。

方便的，表达构建物是包含编码本发明多肽、与在选定的植物或植物部分中表达核酸序列需要的适当调控序列可操作连接的核酸序列的核酸构建物。此外，表达构建物可以包含可用于鉴定已经整合了表达构建物的宿主细胞的选择标记和将构建物导入所述植物需要的DNA序列(后者依赖将要使用的DNA导入方法)。

根据例如何时、何地、和如何表达期望多肽，确定调控序列(诸如启动子和终止子序列)和任选的信号或转运序列。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成性的或诱导型的，或者可以是发育、阶段、或组织特异的，而且基因产物可以靶向特定组织或植物部分，诸如种子或叶。调控序列描述于例如Tague等人(1988，植物生理学(Plant Physiology)86：506)中。

为了组成性表达，可以使用35S-CaMV启动子(Franck等人，1980，细胞(Cell)21：285-294)。器官特异的启动子可以是例如来自贮存组织，诸如种子、马铃薯块茎、和果实的启动子(Edwards和Coruzzi，1990，遗传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)24：275-303)，或来自代谢组织，诸如分生组织的启动子(Ito等人，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24：863-878)，种子特异启动子，诸如来自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白、或清蛋白启动子(Wu等人，1998，植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)39：885-889)，来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等人，1998，植物生理学杂志(Journal of PlantPhysiology)152：708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人，1998，植物和细胞生理学(Plant and Cell Pysiology)39：935-941)，来自Brassica napus的贮存蛋白napA启动子，或者本领域已知的任何其它种子特异启动子，如WO 91/14772中描述的。此外，启动子可以是叶特异启动子，诸如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，植物生理学(Plant Physiology)102：991-1000)、绿藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)26：85-93)、或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)248：668-674)，或者创伤诱导型启动子，诸如马铃薯pin2启动子(Xu等人，1993，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)22：573-588)。

还可以使用启动子增强子元件以在植物中实现更高的酶表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等人(1993，见上文)公开了使用水稻actinl基因第一个内含子增强表达。

选择标记基因和表达构建物的任何其它部分可以选自本领域可获得的那些。

根据本领域已知的传统技术将核酸构建物掺入植物基因组，包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微量注射、颗粒轰击、biolistic转化、和电穿孔(Gasser等人，1990，科学(Science)244：1293；Potrykus，1990，生物技术(Bio/Technology)8：535；Shimamoto等人，1989，自然(Nature)338：274)。

目前选择根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移方法用于产生转基因的双子叶植物(综述参阅Hooykas和Schilperoort，1992，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)19：15-38)。然而该方法同样可以用于转化单子叶植物，但是这些植物通常优选其它转化方法。目前选择胚性愈伤组织或发育胚的颗粒轰击(用转化DNA包被的显微金或钨颗粒)方法用于产生转基因的单子叶植物(Christou，1992，植物杂志(Plant Journal)2：275-281；Shimamoto，1994，生物技术的现行观点(Current OpinionBiotechnology)5：158-162；Vasil等人，1992，生物技术(Bio/Technology)10：667-674)。用于转化单子叶植物的另一种方法基于的是Omirulleh等人(1993，植物分子生物学(PlantMolecular Biology)21：415-428)描述的原生质体转化。

转化之后，选择已经掺入了表达构建物的转化体，并根据本领域众所周知的方法再生成完整植株。

本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养包含编码具有本发明胆碱氧化酶活性之多肽的核酸序列的转基因植物或植物细胞；和(b)回收多肽。除去或降低胆碱氧化酶活性

本发明还涉及产生亲本细胞的突变型细胞的方法，该方法包括破坏或缺失编码所述多肽的核酸序列或其调控序列，产生在相同条件下培养时生产的多肽比亲本细胞少的突变型细胞。

通过对在细胞中表达具有胆碱氧化酶活性的多肽需要的核酸序列进行修饰或灭活，可以方便的完成具有降低的胆碱氧化酶活性的菌株的构建。将要修饰或灭活的核酸序列可以是例如编码该多肽或其对展示胆碱氧化酶活性重要的部分的核酸序列，或该核酸序列可具有由该核酸序列的编码序列表达多肽需要的调控功能。这些调控或控制序列的范例可以是启动子序列或其功能性部分，即足以影响多肽表达的部分。上文描述了可能修饰的其它控制序列。

可以通过对细胞进行诱变，并选择或筛选其中胆碱氧化酶生产能力降低了的细胞，进行核酸序列的修饰或灭活。可以通过使用合适的物理或化学诱变剂，通过使用合适的寡核苷酸，或通过对DNA序列进行PCR产生的诱变，进行特异或随机的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任意组合进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的范例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲烷磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。

使用这些试剂时，通常通过在合适条件下在选定诱变剂存在时温育待诱变细胞，并选择展示胆碱氧化酶活性或产量降低的细胞，进行诱变。

可以通过在编码多肽的核酸序列或其转录或翻译需要的调控元件中导入、取代、或除去一个或多个核苷酸，实现本发明多肽生产的修饰或灭活。例如，可以插入或除去核苷酸，从而导入终止密码子、除去起始密码子、或改变开放阅读框架。可以根据本领域的已知方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变，实现这些修饰或灭活。虽然从理论上说，可以在体内(即直接在表达待修饰核酸序列的细胞上)进行修饰，但优选如下文所述在体外进行修饰。

消除或降低选定宿主细胞的产量的方便方法的范例是通过基因取代或基因中断。在基因中断方法中，在体外对对应于感兴趣的内源基因或基因片段的核酸序列进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后用该序列转化宿主细胞以产生缺陷型基因。通过同源重组，缺陷核酸序列取代了内源基因或基因片段。可能期望缺陷型基因或基因片段还编码可以用于选择其中编码多肽的基因已经被修饰或破坏的转化体的标记。

或者，可以通过已建立的反义技术，使用与多肽编码序列互补的核苷酸序列，进行核酸序列的修饰或灭活。更具体的说，可以通过导入与编码多肽的核酸序列互补的、可以在细胞中转录并能够与细胞中产生的多肽mRNA杂交的核苷酸序列，从而降低或消除细胞的多肽产量。在能使互补的反义核苷酸序列与多肽mRNA杂交的条件下，翻译的多肽的量由此被降低或消除。

根据本发明的方法，待修饰细胞优选微生物来源，例如适合于产生对细胞是同源或异源的期望蛋白质产物的真菌菌株。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变型细胞，所述突变型细胞包含对编码多肽的核酸序列或其调控序列的破坏或缺失，得到产生的多肽比亲本细胞少的突变型细胞。

如此产生的多肽缺陷的突变型细胞作为用于表达同源和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。因此，本发明进一步涉及生产同源或异源多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养突变型细胞；和(b)回收多肽。术语“异源多肽”此处定义为宿主细胞的非天然多肽、经修饰改变了天然序列的天然蛋白质、或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变了的天然蛋白质。

在其它方面，本发明涉及通过细胞发酵生产基本上不含胆碱氧化酶活性的蛋白质产物的方法，包括在发酵进行之前、之中、或之后，向发酵肉汤中加入有效量的能够抑制胆碱氧化酶活性的试剂，发酵产生本发明多肽以及感兴趣蛋白质产物的细胞，由发酵肉汤回收感兴趣的产物，并任选的对回收的产物进行进一步纯化。

在其它方面，本发明涉及生产基本上不含胆碱氧化酶活性的蛋白质产物的方法，包括在能够表达所述产物的条件下培养细胞，对产生的培养肉汤进行组合pH和温度处理以显著降低胆碱氧化酶活性，并由培养肉汤回收产物。或者，可以对由培养肉汤回收的酶制剂进行组合pH和温度处理。组合pH和温度处理可以任选的与胆碱氧化酶抑制剂处理联合使用。

根据本发明的这个方面，除去至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，仍更优选至少95％，最优选至少99％的胆碱氧化酶活性是可能的。使用该方法可以完全除去胆碱氧化酶活性。

组合pH和温度处理优选在pH范围6.5-7和温度范围35-70℃进行足够时间以达到期望效果，通常30-60分钟是足够的。

可以通过本领域的已知方法进行用于培养和纯化感兴趣产物的方法。

用于生产基本上不含胆碱氧化酶的产物的方法在真核多肽(特别是真菌蛋白质，诸如酶)的生产中特别令人感兴趣。酶可以选自如淀粉水解酶、脂肪水解酶、蛋白质水解酶、纤维素水解酶、氧化还原酶、或植物细胞壁降解酶。这些酶的范例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。胆碱氧化酶缺陷细胞还可以用于表达药用异源蛋白质，诸如激素、生长因子、受体等等。

可以理解，术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，还包括如经氨基酸取代、缺失、或添加修饰或其它这些修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等等的酶等多肽。

在其它方面，本发明涉及通过本发明方法产生的、基本上不含胆碱氧化酶活性的蛋白质产物。用途

本发明还致力于使用具有胆碱氧化酶活性的多肽的方法。

本发明多肽可以用于测量胆碱、卵磷脂、胆碱酯酶活性、和磷脂酶C和D活性的化学发光检测实验。参阅Anaokar等人，1979，临床化学(Clinical Chemistry)25：103-107；Artiss等人，1979，微量化学杂志(Microchemistry Journal)24：239-258；Immamura和Horiuti，1978，生化杂志(Journal of Biochemistry)83：677-680；和Okabe等人，1977，临床化学学报(Clin.Chim.Acta)80：87-94)。

编码本发明多肽的核酸序列可以用于增强有机体(特别是植物，如Arabidopsis)的冷和盐耐受力。参阅Rozwadowski等人，1991，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)173：472-478；Hayashi等人，1998，植物、细胞、和环境(Plant，Cell，and Environment)21：232-239；WO 96/1003；WO 96/29857；和WO 97/24026。

本发明由下列实施例进一步描述，这些实施例不应当理解为本发明范围的限制。

                  实施例

作为缓冲液和底物使用的化学药品是至少试剂级的商品。实施例1：发酵和菌丝组织

将Fusarium venenatum CC1-3，即镰孢属菌株ATCC 20334(Wiebe等人，1991，真菌学研究(Mycol.Research)95：1284-1288)的形态学突变体，在2升实验室等级发酵罐中进行培养，使用补料分批发酵方案，NUTRIOSE^TM(Roquette Freres，S.A.，Beinheim，法国)(作为碳源)和酵母提取物。在饲料中提供磷酸铵。将pH维持在6-6.5，将温度维持在30℃，积极溶氧。

在接种后的第2、4、6、和8天收获菌丝样品，并在液氮中速冻。将样品保存于-80℃，直至为了提取RNA而进行裂解。实施例2：cDNA文库的构建

根据Timberlake和Barnard的方法(1981，细胞(Cell)26：29-37)，由实施例1中所述菌丝样品提取总细胞RNA，并在将1％甲醛-琼脂糖凝胶印渍转膜后，通过Northern杂交分析RNA样品(Davis等人，1986，《分子生物学的基本方法》(Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier Publishing有限公司，纽约)。使用mRNA分离试剂盒mRNA Separator Kit^TM(Clontech Laboratories公司，PaloAlto，CA)，根据制造商的指示，由总RNA分离多聚腺苷酸化的mRNA部分。使用大约5μg poly(A)⁺ mRNA，根据Gubler和Hoffman的方法(1983，基因(Gene)25：263-269)合成双链cDNA，但其中使用NotI-(dT)18引物(Pharmacia Biotech Inc，.Piscataway，NJ)起始第一条链的合成。用绿豆核酸酶(Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，IN)处理cDNA，并用T4 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)补平末端。

将cDNA用NotI消化，通过琼脂糖凝胶电泳大小分离(大约0.7-4.5kb)，并连接经NotI和EcoRI切割并小牛肠碱性磷酸酶(BoehringerMannheim公司，Indianapolis，IN)去磷酸化的pZEr0-2.1(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。用连接混和物转化E.coli TOP10的感受态细胞(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在含卡那霉素(终浓度50μg/ml)的2YT琼脂平板(Miller，1992，《细菌遗传学短期课程：关于大肠杆菌及相关细菌的实验室手册》(A Short Course in BacterialGenetics.A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coliand Related Bacteria)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)上选择转化体。

使用质粒克隆载体pZErO-2.1，构建了两个独立的定向cDNA文库。文库A使用来自第4天收获的菌丝的mRNA构建，文库B使用来自第6天的mRNA构建。两个文库都没有为了检验细胞中基因表达模式的代表性“快照”而进行扩增。反而将文库铺板，测定滴度，并通过BNA测序分析来自两个文库的独立克隆。

文库A(第4天的细胞)包含大约7.5×10⁴个独立克隆，文库B(第6天的细胞)包含大约1.2×10⁵个克隆。由每个文库40个克隆分离小量DNA，并检验cDNA插入片段的存在和大小。在此分析中，文库A的40个克隆中的39个(97.5％)包含大小范围为600-2200bp(平均1050bp)的插入片段。相似的，文库B的40个克隆中的39个(97.5％)包含大小范围为800-3600bp(平均1380bp)的插入片段。实施例3：模板的制备和核苷酸测序

由实施例2中所述每种cDNA文库，由转化平板直接挑取1192个转化体菌落，转移到含200μl添加50μg/ml卡那霉素的2YT肉汤(Miller，1992，见上文)的96孔微量滴定板中。平板在不摇动下于37℃温育过夜。温育后每个孔加入100μl无菌的50％甘油。将转化体转接每个孔含1ml添加50μg/ml卡那霉素的Magnificent Broth^TM(MacConnellResearch，San Diego，CA)的第二份深盘96孔微量培养平板(AdvancedGenetic Technologies公司，Gaithersburg，MD)。将第一块微量滴定板冻存于-80℃。将第二份深盘平板在旋转摇床上剧烈振荡(300rpm)于37℃温育过夜。为了防止溢出和交叉污染并且使得充分换气，将每块第二份培养平板用聚丙烯垫(Advanced Genetic Technologies公司，Gaithersburg，MD)和塑料微量滴定盘盖覆盖。

使用经Utterback等人(1995，基因组科学和技术(Genome Sci.Technol.)1：1-8)修改的Advanced Genetic Technologies公司(Gaithersburg，MD)的96孔微量制备试剂盒方案，由每个孔分离DNA。用Perkin-Elmer Applied Biosystems377XL型自动化DNA测序仪(Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL Automatic DNASequencer)(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司，Foster City，CA)，使用染料终止物化学法(Giesecke等人，1992，病毒学方法杂志(Journal of Virology Methods)38：47-60)和反向lac测序引物，进行单向DNA测序。实施例4：DNA序列资料的分析

详查核苷酸序列数据的质量，将显示不恰当剪接或不清楚水平超过2％的样品丢弃或重复。借助FACTURA^TM软件(Perkin-Elmer AppliedBiosystems公司，Foster City，CA)手工整理载体序列。另外，当模糊碱基数目增加时，在每个样品末端截短序列。使用AutoAssembler^TM软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司，Foster City，CA)将所有序列相互比较以确定多样性。最后，使用GeneAssist^TM软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司，Foster City，CA)，以经修改的Smith-Waterman算法，使用阈值70的BLOSUM62矩阵，以三种读码框翻译所有序列并搜索非冗余数据库(non-redundant data base，NRDB)。NRDB由Genpept、Swiss-Prot、和PIR数据库汇集而成。实施例5：胆碱氧化酶cDNA克隆的鉴定

如实施例4所述，通过使用Applied Biosystems377XL型自动化DNA测序仪根据制造商的指示进行随机cDNA克隆的部分测序，并将推导的氨基酸序列与球形节杆菌胆碱氧化酶(TREMBL 59117)的氨基酸序列比较，鉴定了一个推定的胆碱氧化酶克隆。根据该克隆与球形节杆菌胆碱氧化酶氨基酸序列的比对，推测其是全长的。选择含pFD0808、命名为E.coli FD0808的该克隆进行核苷酸序列分析。实施例6：来自E.coli FD0808 的Fusarium venenatum胆碱氧化酶cDNA的核苷酸测序和鉴定

用Applied Biosystems377XL型自动化DNA测序仪，使用染料终止物化学法，进行DNA测序。使用转座子插入策略(Primer IslandTransposition Kit，Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，FosterCity，CA)产生毗连序列。将来自E.coliFD0808的胆碱氧化酶克隆进行测序，平均冗余度6.7。

该胆碱氧化酶克隆编码1629bp的开放阅读框架，编码543个氨基酸、分子量60,057的多肽。核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)显示于图1。使用SignalP程序(Nielsen等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10：1-6)，预测没有信号肽。

使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比对参数，进行胆碱氧化酶序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，框＝5，对角线＝5。

比较性比对显示Fusarium venenatum胆碱氧化酶与球形节杆菌胆碱氧化酶(TREMBL 59117)具有28.2％的同一性，与苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)胆碱脱氢酶(EMBL U39940)具有23.9％的同一性。在Fusarium venenatum胆碱氧化酶内存在3个潜在的N连接糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)，根据预测蛋白质的比对，这些位点之一在球形节杆菌胆碱氧化酶中是保守的。

              生物材料的保藏

下列生物材料已经根据布达佩斯条约保藏于农业研究机构专利培养物收藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection)，北方地区研究中心(Northern Regional ResearchCenter)，北方大学街1815号(1815 University Street)，Peoria，伊利诺斯州(Illinois)，61604，美国，保藏号如下：保藏物                        编号         保藏日期E.coli TOP10(pFD0808)      NRRL B-30066   1998年10月27日

该菌株已经进行了保藏，在该专利申请的待审期内，保证根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的专利和商标委员会所确定的人能够获得该培养物。该保藏物代表了保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本或其后续申请的国家中，可以按照该国专利法的要求提供该保藏物。但是，应当明白保藏物的可获得性并不构成对以侵犯由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。

由于此处公开的特殊实施方案意欲作为此处描述和要求的发明的多个方面的例示，所以本发明并非限制在这些实施方案的范围之内。任何相当的实施方案均属于本发明的范围之内。甚至于本领域技术人员根据上述描述显然能够理解本发明除了此处所示和所述之外的各种变化。这些变化也属于所附权利要求的范围之内。当发生冲突时，以本说明书包括定义为准。

此处引用的多处参考文献完整引入作为参考。序列表<110>Debbie Yaver

 Randy M.Berka

 Michael W.Rey<120>具有胆碱氧化酶活性的多肽及编码该多肽的核酸<130>5735.204-WO<140>To Be Assigned<141>1999-11-18<150>09/199,229<151>1998-11-24<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1863<212>DNA<213>Fusarium venenatum<400>1ctctgtccta ctgtacctac ctttcattca cttacaccag ccttcaacat gaccaccgag       60tttcttcctg cttcagccag ctctgcttac gattacatta tcgtgggtgg tggcacggct      120ggttgtgttc tagcttctcg tctctctgcc tacctccctg agcgcaaggt ccttgtcatt      180gagggtggtc cctcggactt cggtctcaac aatgttctta accttcgaga gtggttgtcg      240ctcctcggtg gtgacctcga ctacgactac cccacaactg agcagcccaa tggcaacagt      300catatccgac actcgcgagc caaggttctc ggtggttgct cctcgcacaa caccctcatc      360tccttccgcc ccttccgcca cgatatggac cgttgggtct ccaagggttg caagggatgg      420gactttgaaa ccgtcatgcg cagcgtcgac aacctgcgca accagctgaa ccccgtccac      480ccccgtcacc gtaaccagtt gactaaggac tgggtcaagg cttgctccga ggccatgggt      540attcccatca tccacgactt caaccacgag atctcagaga agggccaatt gacccaaggt      600gctggcttct tctccgtctc ttacaatccc gacaccggcc accgcagcag tgcttccgtc      660gcttacatcc accctatcct tcgaggcgac gagcgacgcc ccaacctgac tgttcttacc      720gaagcccatg tctcaaaggt cattgttgag aacgatgtcg ctacgggcat caacatcacc      780ctcaagtctg gcgaaaagca cactctccat gctcgcaagg agactattct gtgcgccggt      840gcggtcgata cacccagact cctcctccac tctggtattg gccccaaggc tcagctcgag      900tctctcaaca tccccgttgt caaggacatc cctggtgttg gcgaaaacct cttggatcac      960cccgagacca tcatcatgtg ggagctgaac aaggccgtcc ctgccaacca gaccactatg     1020gactctgatg ctggtatctt ccttcgacgg gagcctaaga atgctgccgg caacgacggt     1080gatgctgccg atgtcatgat gcactgctac caaattcctt tccacctcaa cacagagcgt     1140cttggatacc ccaagattaa ggatggttac gctttctgca tgacacccaa cattcctcgc     1200cctcgctctc gtggccgtat ctttttgacc tcggccgacc ctactgtcaa gccttccctc     1260gacttccgct acttcaccga ccccgagggt tacgatgcgg ctactcttgt tcacggtatc     1320aaggctgctc gtaagatcgc ccagcagagc cccttcaagg agtggctcaa gcaggaggtc     1380gcccctggcc ccaagattca gaccgatgag gagattagcg agtacgcccg tcgtgtcgct     1440cacaccgtct accaccctgc cggtaccacc aagatgggcg ataccgagcg agatgagatg     1500gctgttgtca accccgaact caaggtccgc ggcatcaaca agctccgaat tgttgatgct     1560ggtatcttcc ccgagatgcc cactatcaac cccatggtga cggtgcttgc ttgcggcgag     1620cgggctgccg agctcattgc tgccgaggac ggctggaagc ccaagcactc ccgactgtaa    1680agtgtttcgg atggtttcct gatcctccgc gagcgactcg gctcgagaga gttgttgtta    1740tggatatctg tatgattaaa tgattagcgt atgattgcat tcgtagcgag tatagtatta    1800ctgccgcata taggtagttg gaacaaaaat aaaacaatcc aaaccaaaaa aaaaaaaaaa    1860aaa                                                                  1863<210>2<211>543<212>PAT<213>Fusarium venenatum<400>2Met Thr Thr Glu Phe Leu Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Tyr Asp Tyr1               5                  10                  15Ile Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Val Leu Ala Ser Arg Leu

        20                  25                  30Ser Ala Tyr Leu Pro Glu Arg Lys Val Leu Val Ile Glu Gly Gly Pro

    35                  40                  45Ser Asp Phe Gly Leu Asn Asn Val Leu Asn Leu Arg Glu Trp Leu Ser

50                  55                  60Leu Leu Gly Gly Asp Leu Asp Tyr Asp Tyr Pro Thr Thr Glu Gln Pro65                  70                  75                  80Asn Gly Asn Ser His Ile Arg His Ser Arg Ala Lys Val Leu Gly Gly

            85                  90                  95Cys Ser Ser His Asn Thr Leu Ile Ser Phe Arg Pro Phe Arg His Asp

        100                 105                 110Met Asp Arg Trp Val Ser Lys Gly Cys Lys Gly Trp Asp Phe Glu Thr

    115                 120                 125Val Met Arg Ser Val Asp Asn Leu Arg Asn Gln Leu Asn Pro Val His

130                 135                 140Pro Arg His Arg Asn Gln Leu Thr Lys Asp Trp Val Lys Ala Cys Ser145                 150                 155                 160Glu Ala Met Gly Ile Pro Ile Ile His Asp Phe Asn His Glu Ile Ser

            165                 170                 175Glu Lys Gly Gln Leu Thr Gln Gly Ala Gly Phe Phe Ser Val Ser Tyr

        180                 185                 190Asn Pro Asp Thr Gly His Arg Ser Ser Ala Ser Val Ala Tyr Ile His

    195                 200                 205Pro Ile Leu Arg Gly Asp Glu Arg Arg Pro Asn Leu Thr Val Leu Thr

210                 215                 220Glu Ala His Val Ser Lys Val Ile Val Glu Asn Asp Val Ala Thr Gly225                 230                 235                 240Ile Asn Ile Thr Leu Lys Ser Gly Glu Lys His Thr Leu His Ala Arg

            245                 250                 255Lys Glu Thr Ile Leu Cys Ala Gly Ala Val Asp Thr Pro Arg Leu Leu

        260                 265                 270Leu His Ser Gly Ile Gly Pro Lys Ala Gln Leu Glu Ser Leu Asn Ile

    275                 280                 285Pro Val Val Lys Asp Ile Pro Gly Val Gly Glu Asn Leu Leu Asp His

290                 295                 300Pro Glu Thr Ile Ile Met Trp Glu Leu Asn Lys Ala Val Pro Ala Asn305                 310                 315                 320Gln Thr Thr Met Asp Ser Asp Ala Gly Ile Phe Leu Arg Arg Glu Pro

            325                 330                 335Lys Asn Ala Ala Gly Asn Asp Gly Asp Ala Ala Asp Val Met Met His

        340                 345                 350Cys Tyr Gln Ile Pro Phe His Leu Asn Thr Glu Arg Leu Gly Tyr Pro

    355                 360                 365Lys Ile Lys Asp Gly Tyr Ala Phe Cys Met Thr Pro Asn Ile Pro Arg

370                 375                 380Pro Arg Ser Arg Gly Arg Ile Phe Leu Thr Ser Ala Asp Pro Thr Val385                 390                 395                 400Lys Pro Ser Leu Asp Phe Arg Tyr Phe Thr Asp Pro Glu Gly Tyr Asp

            405                 410                 415Ala Ala Thr Leu Val His Gly Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ile Ala Gln

        420                 425                 430Gln ser pro Phe Lys Glu Trp Leu Lys Gln Glu Val Ala Pro Gly Pro

    435                 440                 445Lys Ile Gln Thr Asp Glu Glu Ile Ser Glu Tyr Ala Arg Arg Val Ala

450                 455                 460His Thr Val Tyr His Pro Ala Gly Thr Thr Lys Met Gly Asp Thr Glu465                 470                 475                 480Arg Asp Glu Met Ala Val Val Asn Pro Glu Leu Lys Val Arg Gly Ile

            485                 490                 495Asn Lys Leu Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Phe Pro Glu Met Pro Thr

        500                 505                 510Ile Asn Pro Met Val Thr Val Leu Ala Cys Gly Glu Arg Ala Ala Glu

    515                 520                 525Leu Ile Ala Ala Glu Asp Gly Trp Lys Pro Lys His Ser Arg Leu

530                 535                 540

Claims (39)

1.具有胆碱氧化酶活性、选自下组的分离多肽：

(a)具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由在低严谨条件下与选自下述的序列可杂交的核酸序列编码的多肽：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链；

(c)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的变体；

(d)(a)或(b)的等位基因变体；和

(e)具有胆碱氧化酶活性的(a)、(b)、或(d)的片段。

2.权利要求1的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少65％同一性的氨基酸序列。

3.权利要求2的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少70％同一性的氨基酸序列。

4.权利要求3的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列。

5.权利要求4的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少90％同一性的氨基酸序列。

6.权利要求5的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸有至少95％同一性的氨基酸序列。

7.权利要求1-6任一项的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

8.权利要求1-7任一项的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段组成。

9.权利要求8的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

10.权利要求9的多肽，其由SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸组成。

11.权利要求1的多肽，其由在低严谨条件下与下述序列可杂交的核酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链。

12.权利要求11的多肽，其由在低严谨条件下与下述序列可杂交的核酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。

13.权利要求1的多肽，其由在中等严谨条件下与下述序列可杂交的核酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链。

14.权利要求13的多肽，其由在中等严谨条件下与下述序列可杂交的核酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。

15.权利要求1的多肽，其由在高严谨条件下与下述序列可杂交的核酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链。

16.权利要求15的多肽，其由在高严谨条件下与下述序列可杂交的核酸序列编码：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。

17.权利要求1的多肽，其中该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的变体。

18.权利要求1的多肽，其由E.coli NRRL B-30066所含质粒pFD0808中所含核酸序列编码。

19.权利要求1-18任一项的多肽，其具有SEQ ID NO：2的胆碱氧化酶活性的至少20％。

20.具有与权利要求1-19任一项的多肽相同的胆碱氧化酶活性的多肽。

21.包含编码权利要求1-20任一项之多肽的核酸序列的分离核酸序列。

22.包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的核酸序列的分离核酸序列，其中突变型核酸序列编码由SEQ IDNO：2的第1位至第543位氨基酸组成的多肽。

23.通过(a)在低严谨条件下将DNA与下述序列杂交：(i)SEQ IDNO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链；和(b)分离核酸序列，由此产生的分离核酸序列。

24.权利要求23的分离核酸序列，其通过(a)在中等严谨条件下将DNA与下述序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链；和(b)分离核酸序列，由此而产生的。

25.权利要求24的分离核酸序列，其通过(a)在高严谨条件下将DNA与下述序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO：1的第49位至第1677位核苷酸的基因组DNA序列，(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链杂交；和(b)分离核酸序列，由此而产生的。

26.包含与一种或多种指导在合适表达宿主中产生多肽的控制序列可操作连接的权利要求21的核酸序列的核酸构建物。

27.包含权利要求26的核酸构建物的重组表达载体。

28.包含权利要求26的核酸构建物的重组宿主细胞。

29.产生突变型核酸序列的方法，包括(a)在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中导入至少一个突变，其中突变型核酸序列编码具有SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸的多肽；和(b)回收突变型核酸序列。

30.通过权利要求29的方法产生的突变型核酸序列。

31.产生多肽的方法，包括(a)培养包含编码多肽的权利要求30的突变型核酸序列的菌株，以产生包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。

32.产生权利要求1-20任一项的多肽的方法，包括(a)培养菌株，以产生包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。

33.产生权利要求1-20任一项的多肽的方法，包括(a)在适合于产生多肽的条件下培养包含具有编码多肽之核酸序列的核酸构建物的宿主细胞；和(b)回收多肽。

34.产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的突变型核酸序列，其中突变型核酸序列编码具有SEQ ID NO：2的第1位至第543位氨基酸的多肽；和(b)回收多肽。

35.产生权利要求1-20任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养已经掺入了包含调控序列、外显子、和/或与编码多肽的内源核酸序列的另一个外显子可操作连接的剪接供体位点的新转录单位的同源重组细胞；和(b)回收多肽。

36.产生细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-20任一项的多肽的核酸序列或其控制序列，导致产生的多肽比细胞少的突变体。

37.通过权利要求36的方法产生的突变体。

38.权利要求37的突变体，其中进一步包含编码异源蛋白质的核酸序列。

39.产生异源多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养权利要求38的突变体；和(b)回收多肽。

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