CN1399683A - 具有果胶乙酰酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽，和编码多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用多肽的方法。

Description

具有果胶乙酰酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸

                        发明背景

发明领域

本发明涉及具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽，和编码该多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用所述多肽的方法。

相关技术的描述

果胶是植物细胞壁的重要结构成份。果胶的主链可以分成线性的同型聚半乳糖醛酸(无毛)区(可达200个1，4-连接的α-D-半乳糖醛酸(GalUA)残基)，和高度分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(有毛)区(由重复的α-(1，2)-L-鼠李糖-α-(1，4)-D-半乳糖醛酸二糖单位构成)。一般而言，大约半数的鼠李糖残基由中性寡糖替代，诸如阿拉伯聚糖、半乳聚糖、和阿拉伯半乳糖聚糖。大部分果胶物质还在有些α-D-半乳糖醛酸残基处发生酯化，在C-2和/或C-3位置的羧基处发生甲基化或在羟基处发生乙酰化。

果胶乙酰酯酶催化线性的同型聚半乳糖醛酸(无毛)区羧基处的乙酰基发生脱乙酰作用。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶催化高度分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(有毛)区羟基处的乙酰基发生脱乙酰作用。

已经由菊欧文菌(Erwinia chrysanthemi)(Shevchik等人，1997，分子微生物学(Molecular Microbiology)24：1285-1301)；豇豆(Vigna radiataL)(Breton等人，1996，FEBS通讯(FEBS Letters)388：139-142)；和黑曲霉(Aspergillus niger)(Searle-VanLeeuwen等人，1996，生物技术进展(Progress in Biotechnology)，第793-798页)分离了果胶乙酰酯酶。

已经由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kauppinen等人，1995，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)270：27172-27178；WO 93/20190)分离了鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。

已经由菊欧文菌分离了编码果胶乙酰酯酶的基因(Shevchik等人，1997，见上文)。

已经由棘孢曲霉分离了编码鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的基因(Kauppinen等人，1995，见上文)。

本发明的一个目的是提供具有果胶乙酰酯酶活性的改进多肽和编码该多肽的核酸。

                      发明概述

本发明涉及选自下组的具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽：(a)具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码的多肽；(c)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和/或插入的变体；(d)(a)或(b)的等位基因变体；和(e)(a)、(b)、或(d)的具有果胶乙酰酯酶活性的片段。

本发明还涉及编码多肽的分离核酸序列，包含该核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用所述多肽的方法。

                      图的简述

图1显示枯草芽孢杆菌168果胶乙酰酯酶的基因组DNA序列和推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

图2显示pDG268MCS的限制性图谱。

图3显示pHP13amp-MCS的限制性图谱。

图4显示pHP13amp-SAV的限制性图谱。

图5显示pUC18-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA的限制性图谱。

图6显示pDG268MCS-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图7显示pDG268MCSΔ-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图8显示pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图9显示包含“共有”amyQ启动子的核酸序列。

图10显示pDG268MCS-Pr_{“短共有”amyQ}/SAV的限制性图谱。

图11显示pDG268MCSΔneo-Pr_{短“共有”amyQ}/Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图12显示pCAsub3Δ-Pr_{“短共有”amyQ}/Pr_cryIIIA/SAV的限制性图谱。

                       发明详述具有果胶乙酰酯酶活性的多肽

术语“果胶乙酰酯酶活性”在这里定义为催化果胶GalUA残基羟基处的乙酰基发生脱乙酰作用的乙酰酯酶活性。为了本发明的目的，使用对硝基苯乙酸酯作为底物来测定果胶乙酰酯酶活性，即将4.5mM对硝基苯乙酸酯(溶于100mM MOPS/4mM CaCl₂，pH7.5)与乙酰酯酶一起于25℃保温，并于405nM测量对硝基苯酚离子的释放量，作为时间的函数。1个单位的果胶乙酰酯酶活性定义为于25℃和pH7.5每分钟由对硝基苯乙酸酯产生1.0μmol对硝基苯酚离子。

在第一个实施方案中，本发明涉及氨基酸序列与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸(即成熟多肽)具有至少大约65％、优选至少大约70％、更优选至少大约80％、甚至更优选至少大约90％、最优选至少大约95％、甚至最优选至少大约97％同一性且具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽(以下称为“同源多肽”)。在一个优选的实施方案中，同源多肽具有因5个氨基酸、优选4个氨基酸、更优选3个氨基酸、甚至更优选2个氨基酸、最优选1个氨基酸而与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸不同的氨基酸序列。为了本发明的目的，通过Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)，使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)以及同一性表格和如下多重比对参数来测定两种氨基酸序列之间的同一程度：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数是Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗＝5，对角线＝5。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段。在更优选的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明多肽包含SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本发明多肽包含SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段构成。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成。在另一个优选的实施方案中，多肽由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段构成。在另一个优选的实施方案中，多肽由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成。

SEQ ID NO：2的片段是由该氨基酸序列的氨基和/或羧基端删除了一个或多个氨基酸的多肽。片段优选包含至少310个氨基酸残基，更优选至少325个氨基酸残基，最优选至少350个氨基酸残基。

等位基因变体指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或多种候选形式。等位基因变异通过突变天然产生，而且可在种群内导致多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)，或者可编码具有改变氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

在第二个实施方案中，本发明涉及具有果胶乙酰酯酶活性且由在很低严谨条件、优选低严谨条件、更优选中严谨条件、更优选中-高严谨条件、甚至更优选高严谨条件、最优选很高严谨条件下与核酸探针发生杂交的核酸序列编码的分离多肽，所述核酸探针在相同条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约)。SEQ ID NO：1的亚序列可以是至少100个核苷酸的序列，优选至少200个核苷酸。此外，亚序列可编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽片段。多肽还可以是所述多肽的具有果胶乙酰酯酶活性的等位基因变体或片段。

SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段都可用于设计核酸探针，从而依照本领域众所周知的方法由不同属或种的菌株鉴定并克隆编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽的DNA。具体而言，这些探针可用于与目的属或种的基因组或cDNA的杂交，随后进行标准Southern印迹流程，以鉴定并分离其中的相应基因。这些探针可以显著比完整序列短，但是长度应为至少15个、优选至少25个、更优选至少35个核苷酸。也可使用更长的探针。DNA和RNA探针都可使用。通常对探针进行标记以检测相应基因(例如用³²P、³H、³⁵S、生物素、或亲和素)。本发明涵盖这些探针。

由此，可对由这些不同生物体制备的基因组DNA文库筛选与上述探针发生杂交且编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其它分离技术将来自这些其它生物体的基因组或其它DNA分开。将来自文库的DNA或分开的DNA转移至并固定在硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将载体材料用于Southern印迹。为了本发明的目的，杂交指在很低至很高严谨条件下核酸序列与对应于SEQ ID NO：1所示核酸序列、其互补链、或其亚序列的经标记核酸探针发生杂交。使用X射线胶片检测在这些条件下与核酸探针发生杂交的分子。

在一个优选的实施方案中，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的核酸序列或其亚序列。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是SEQID NO：1。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是大肠杆菌NRRL B-30151中所含质粒pCR2.1-yxiM所含的核酸序列，其中该核酸序列编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽。在另一个优选的实施方案中，核酸探针是大肠杆菌NRRL B-30151中所含质粒pCR2.1-yxiM所含的核酸序列的成熟多肽编码区，其中核酸序列编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，很低至很高严谨条件定义为于42℃在5x SSPE/0.3％ SDS/200μg/ml剪切和变性鲑鱼精DNA/不同浓度的甲酰胺中进行预杂交和杂交，随后进行标准Southern印迹流程。其中很低和低严谨度用25％甲酰胺，中和中-高严谨度用35％甲酰胺，高和很高严谨度用50％甲酰胺。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，最后于不同温度用2xSSC/0.2％ SDS将载体材料清洗3次，每次15分钟。其中清洗温度优选至少45℃(很低严谨度)，更优选至少50℃(低严谨度)，更优选至少55℃(中严谨度)，更优选至少60℃(中-高严谨度)，甚至更优选至少65℃(高严谨度)，最优选至少70℃(很高严谨度)。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严谨条件定义为，在比依照Bolton和McCarthy的计算方法(1962，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy of Scinece USA)48：1390)计算所得Tm低大约5℃至大约10℃的温度，在0.9MNaCl/0.09M Tris-HCl pH7.6/6mM EDTA/0.5％ NP-40/1x Denhardt氏液/1mM焦磷酸钠/1mM磷酸二氢钠/0.1mM ATP/0.2mg/ml酵母RNA中进行预杂交、杂交、和杂交后清洗，随后进行标准Southern印迹流程。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，在比计算所得Tm低5℃至10℃的温度，将载体材料用6x SCC/0.1％ SDS清洗1次15分钟，用6x SSC清洗2次15分钟。

在第三个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列但包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和/或插入的多肽变体。

变体多肽的氨基酸序列可能因插入或删除一个或多个氨基酸残基和/或用不同氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基而与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽不同。氨基酸变化优选较小本质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替代；小删除，通常是1个至大约30个氨基酸；氨基或羧基端的小延伸，诸如氨基端的甲硫氨酸；多达大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能有助于纯化的小延伸，诸如多组氨酸序列、抗原性表位、或结合结构域。

保守替代的范例是碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和甲硫氨酸)组内进行的替代。通常不改变比活的氨基酸替代在本领域是已知的，且描述于例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，《蛋白质》(Proteins)，Academic出版社，纽约。最普遍发生的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly，以及反向替换。

在第四个实施方案中，本发明涉及与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性的分离多肽。通过使用众所周知的Ouchterlony双向免疫扩散流程的免疫学交叉反应同一性测试来测定免疫化学特性。具体而言，依照Harboe和Ingild(N.H.Axelsen、J.Kroll、和B.Weeks编，《定量免疫电泳手册》(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章)，或者Johnstone和Thorpe(《免疫化学实践》(Immunochemistry in Practice)，Blackwell Scientific Publications，1982，更具体的说是第27-31页)描述的流程，通过免疫兔子(或其它啮齿类动物)来制备包含对具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位具有免疫反应性或者可与其结合的多克隆抗体的抗血清。具有免疫化学同一性的多肽是使用特异免疫化学技术以相同的方式(诸如沉淀物的完全融合)、相同的沉淀物形态学、和/或相同的电泳迁移率与抗血清发生反应的多肽。Axelsen、Bock、和Kroll在N.H.Axelsen、J.Kroll、和B.Weeks编，《定量免疫电泳手册》(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章中描述了免疫化学同一性的进一步解释。具有部分免疫化学同一性的多肽是使用特异免疫化学技术以部分相同的方式(诸如沉淀物的部分融合)、部分相同的沉淀物形态学、和/或部分相同的电泳迁移率与抗血清发生反应的多肽。Bock和Axelsen在N.H.Axelsen、J.Kroll、和B.Weeks编，《定量免疫电泳手册》(A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell ScientificPublications，1973，第11章中描述了部分免疫化学同一性的进一步解释。

抗体还可以是单克隆抗体。如可依照E.Harlow和D.Lane编，1988，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约的方法来制备和使用单克隆抗体。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少100％的果胶乙酰酯酶活性。

可由任何属的微生物获得本发明的多肽。为了本发明的目的，术语“由…获得”在这里与指定来源一起使用时将指由核酸序列编码的多肽是由该来源或插入了来自该来源的核酸序列的细胞产生的。在优选的实施方案中，多肽被分泌到细胞外。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，诸如芽孢杆菌多肽，或链霉菌多肽，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Srtreptomyces murinus)的多肽；或者革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)的多肽。

在优选的实施方案中，本发明的多肽是由Fergus G.Priest定义的芽孢杆菌属的菌株获得的(Abraham L.Sonenshein、James A.Hoch、和Richard Losick编，《枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌》(Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria)，美国微生物学学会(American Society For Microbiology)，华盛顿特区，1993，第3-16页)。

在更优选的实施方案中，多肽是由嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)获得的。

在最优选的实施方案中，多肽是枯草芽孢杆菌多肽，最优选枯草芽孢杆菌168的多肽，如具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。

公众可很容易由许多培养物收藏中心获得这些物种的菌株，诸如美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、CentraalbureauVoor Schimmelcultures(CBS)、和北方地区研究中心的农业研究机构专利培养物收藏中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection，Northern Region Research Center)(NRRL)。

此外，可使用上述探针由其它来源，包括由自然界(如土壤、堆肥、水等)分离的微生物，鉴定并获得这些多肽。用于由天然栖息地分离微生物的技术在本领域是众所周知的。然后可通过类似的筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库来衍生核酸序列。一旦用探针检测到编码多肽的核酸序列，可使用本领域普通技术人员知道的技术来分离或克隆该序列(参阅如Sambrook等人，1989，见上文)。

“分离”多肽在这里定义为通过SDS-PAGE测定基本上不含其它非果胶乙酰酯酶多肽的多肽，如至少大约20％纯，优选至少大约40％纯，更优选大约60％纯，甚至更优选大约80％纯，最优选大约90％纯，甚至最优选大约95％纯。

由本发明核酸序列编码的多肽还包括融合多肽或可切割融合多肽，其中多肽或其片段的N端或C端融合了另一种多肽。融合多肽是通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其片段)融合本发明的核酸序列(或其片段)而产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，包括连接编码多肽的编码序列使其处于相同读码框，并得以在相同启动子和终止子的控制下表达融合多肽。核酸序列

本发明还涉及编码本发明多肽的分离核酸序列。在一个优选的实施方案中，核酸序列列于SEQ ID NO：1。在另一个优选的实施方案中，核酸序列是包含于大肠杆菌NRRL B-30151所含质粒pCR2.1-yxiM中的序列。在另一个优选的实施方案中，核酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一个优选的实施方案中，核酸序列是大肠杆菌NRRLB-30151中所含质粒pCR2.1-yxiM所含的成熟多肽编码区。本发明还涵盖编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，且因遗传密码简并性而与SEQ ID NO：1不同的核酸序列。本发明还涉及编码SEQ ID NO：2的具有果胶乙酰酯酶活性的多肽片段的SEQ ID NO：1亚序列。

SEQ ID NO：1的亚序列是SEQ ID NO：1涵盖的但由5’和/或3’端删除了一个或多个核苷酸的核酸序列。亚序列优选包含至少930个核苷酸，更优选至少975个核苷酸，最优选至少1050个核苷酸。

本发明还涉及在SEQ ID NO：1的成熟多肽编序列中包含至少一处突变的突变型核酸序列，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术在本领域是知道的，包括由基因组DNA进行分离、由cDNA进行制备、或其联合。如通过使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆DNA片段，可实现由这些基因组DNA克隆本发明的核酸序列。参阅如Innis等人，1990，《PCR：方法和应用指南》(PCR：A Guide to Methods and Application)，Academic出版社，纽约。还可使用其它核酸扩增流程，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核酸序列的扩增(NASBA)。可由芽孢杆菌菌株或者另一种或相关生物体克隆核酸序列，因而例如可能是核酸序列的多肽编码区的等位基因或物种变体。

术语“分离核酸序列”在这里指通过琼脂糖电泳测定基本上不含其它核酸序列的核酸序列，如至少大约20％纯，优选至少大约40％纯，更优选至少大约60％纯，甚至更优选至少大约80％纯，最优选至少大约90％纯。例如，可通过用于遗传工程的标准克隆流程来获得分离核酸序列，从而将核酸序列由其天然位置重新置于不同位点(在此它将进行复制)。克隆流程可能包括切除并分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段、将片段插入载体分子、并将重组载体导入宿主细胞(在此核酸序列将复制多个拷贝或克隆)。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或其任意联合。

本发明还涉及与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列(即第76-1146位核苷酸)具有至少大约65％、优选大约70％、优选大约80％、更优选大约90％、甚至更优选大约95％、最优选大约97％同源性且编码活性多肽的核酸序列。为了本发明的目的，通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美国国家科学院进展(Proceedings of the NationalAcademy of Science USA)80：726-730)，使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)以及同一性表格和如下多重比对参数来测定两种核酸序列之间的同源性程度：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数是Ktuple＝3，缺口罚分＝3，窗＝20。

为了合成与多肽基本上相似的多肽，对编码本发明多肽的核酸序列进行修饰可能是必需的。术语与多肽“基本上相似”指多肽的非天然发生形式。这些多肽可能因某些改造方法而与由天然来源分离的多肽不同，如比活、热稳定性、最佳pH、等等不同的变体。可根据SEQ IDNO：1的多肽编码部分的核酸序列来构建变体序列，如其亚序列，和/或通过引入不产生与该核酸序列编码的多肽不同的氨基酸序列、但符合意欲用于生产酶的宿主生物体的密码子使用率的核苷酸替代，或者通过引入可产生不同氨基酸序列的核苷酸替代。有关核苷酸替代的一般性描述参阅如Ford等人，1991，蛋白质的表达和纯化(ProteinExpression and Purification)2：95-107)。

对于本领域熟练技术人员显而易见的是，可在对分子功能至关重要的区域以外进行这些替代而仍然产生有活性的多肽。可依照本领域已知流程，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参阅如Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)来鉴定对由本发明分离核酸序列编码的多肽活性至关重要因而优选不进行替代的氨基酸残基。在后一种技术中，在分子中带正电荷的每一个残基处引入突变，并对产生的突变体分子测试果胶乙酰酯酶活性，以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。还可通过诸如核磁共振分析、结晶学、或光亲和标记(参阅如de Vos等人，1982，科学(Science)255：306-312；Smith等人，1992，分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS通讯(FEBSLetters)309：59-64)等技术测定的三维结构分析来确定底物-酶作用位点。

本发明还涉及编码本发明多肽，且在很低严谨条件、优选低严谨条件、更优选中严谨条件、更优选中-高严谨条件、甚至更优选高严谨条件、最优选很高严谨条件下与核酸探针发生杂交的分离核酸序列，所述核酸探针在相同条件下与SEQ ID NO：1的核酸序列或其互补链；或其等位基因变体和亚序列(见上文定义)可发生杂交(Sambrook等人，1989，见上文)。

本发明还涉及如下产生的分离核酸序列：(a)在很低、低、中、中-高、高、或很高严谨条件下将DNA与(i)SEQ ID N0：1的第76-1146位核苷酸，(ii)(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离核酸序列。亚序列优选至少100个核苷酸的序列，更优选200个核苷酸，诸如编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽片段的序列。用于生成突变型核酸序列的方法

本发明还涉及用于生成突变型核酸序列的方法，包括在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其亚序列中引入至少一处突变，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成的多肽或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段。

通过定点诱变，使用本领域任何已知方法，可实现将突变引入核酸序列，即用一种核苷酸替换另一种核苷酸。特别有用的是利用包含目的插入片段的超螺旋双链DNA载体和包含期望突变的两种合成引物的流程。各自与载体相对链互补的寡核苷酸引物在变温循环中通过PfuDNA聚合酶获得延伸。在掺入引物后，产生了包含交错缺刻的突变型质粒。变温循环后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物，以消化亲本DNA模板并选择包含突变的合成DNA。也可使用其它本领域已知流程。核酸构建物

本发明还涉及包含本发明核酸序列并可操作连接一种或多种控制序列的核酸构建物，所述控制序列在合适表达宿主中在与控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。表达应理解为包括多肽生成中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

“核酸构建物”在这里定义为由天然发生的基因分离的，或经修饰以自然界中不存在的联合和并列方式包含核酸区段的单链或双链核酸分子。当核酸构建物包含表达本发明编码序列所需要的所有控制序列时，术语“核酸构建物”与术语“表达盒”是同义的。术语“编码序列”在这里定义为直接确定其蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列。通常通过mRNA 5’末端紧挨着位于开放读码框上游的核糖体结合位点(原核生物)和mRNA 3’末端紧挨着位于开放读码框下游的转录终止亚序列来确定基因组编码序列的边界。编码序列可包括但不限于DNA、cDNA、和重组核酸序列。

可以多种方式操作编码本发明多肽的分离核酸序列以提供多肽表达。在插入载体前，可能需要或必需对核酸序列进行操作，这取决于表达载体。利用重组DNA方法来修饰核酸序列的技术在本领域是众所周知的。

术语“控制序列”在这里定义为包括对表达本发明多肽必需或有利的所有成份。每一种控制序列对于编码多肽的核酸序列而言可以是天然的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最低限度，控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。为了引入特定的限制性位点以便于连接控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区，可与控制序列一起提供接头。术语“可操作连接”在这里定义为控制序列相对于DNA序列编码区位于适当位置使得控制序列可指导多肽表达的结构。

控制序列可以是合适的启动亚序列，即由用于表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动亚序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选定的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短型、和杂合型启动子，而且可以由编码细胞外或细胞内多肽的基因(对于宿主细胞而言，或是同源的或是异源的)获得。

用于指导本发明核酸构建物转录的合适启动子的范例，尤其是在细菌宿主细胞中转录的启动子，是由大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amvL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院进展(Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA)75：3727-3731)获得的启动子，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院进展(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)80：21-25)。“来自重组细菌的有用蛋白质”(Useful proteins fromrecombinant bacteria)(科学美国人(Scientific American)242：74-94，1980)和Sambrook等人(1989，见上文)描述了其它启动子。

控制序列还可以是合适的转录终止亚序列，即由宿主细胞识别来终止转录的序列。终止亚序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’端。在选定的宿主细胞中发挥功能的任何终止子都可用于本发明。

控制序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的5’端。在选定的宿主细胞中发挥功能的任何前导序列都可用于本发明。

控制序列还可以是编码连接在多肽氨基末端并指导编码的多肽进入细胞分泌途经的氨基酸序列的信号肽编码区。核酸序列编码区的5’端可固有的包含天然与编码分泌多肽的编码区在翻译读码框中相连的信号肽编码区。或者，编码序列的5’端可包含对于编码序列而言是外来的信号肽编码区。当编码序列天然不包含信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。或者，可简单的用外源信号肽编码区取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，在选定的宿主细胞中指导表达的多肽进入分泌途经的任何信号肽编码区都可用于本发明。

对细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是由编码芽孢杆菌NCIB11837的麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌PrsA(prsA)的基因获得的信号肽编码区。Simonen和Palva(1993，微生物学回顾(Microbiological Reviews)57：109-137)描述了其它信号肽。

在优选的实施方案中，信号肽编码区是编码SEQ ID NO：2的第1-25位氨基酸的SEQ ID NO：1的第1-75位核苷酸。

控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，而且可通过催化或由多肽原产生的前肽的自身催化切割转变成成熟的有活性的多肽。可由编码枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶(aprE)和枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶(nprT)的基因获得前肽编码区。

当多肽的氨基端同时存在信号肽和前肽区时，前肽区位于多肽的氨基端，而信号肽区位于前肽区的氨基端。

本发明的核酸构建物还可包含编码有利于指导多肽表达的一种或多种因子的一种或多种核酸序列，如转录激活剂(如反式作用因子)、伴侣分子、和加工蛋白酶。在选定的宿主细胞中发挥功能的任何因子都可用于本发明。编码一种或多种这些因子的核酸与编码多肽的核酸序列不必前后串联。

转录激活剂是激活编码多肽的核酸序列转录的蛋白质(Kudla等人，1990，欧洲分子生物学杂志(EMBO Journal)9：1355-1364；Jarai和Buxton，1994，现行遗传学(Current Genetics)26：2238-244；Verdier，1990，酵母(Yeast)6：271-297)。可由编码嗜热脂肪芽孢杆菌NprA的基因(nprA)获得编码激活剂的核酸序列。

伴侣分子是辅助另一种多肽正确折叠的蛋白质(Hartl等人，1994，TIBS 19：20-25；Bergeron等人，1994，TIBS 19：124-128；Demolder等人，1994，生物技术杂志(Journal of Biotechnology)32：179-189；Craig，1993，科学(Science)260：1902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然(Nature)355：33-45；Puig和Gilbert，1994，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)269：7764-7771；Wang和Tsou，1993，FASEB杂志(The FASEB Journal)7：1515-11157；Robinson等人，1994，生物/技术(Bio/Technology)1：381-384；Jacobs等人，1993，分子微生物学(MolecularMicrobiology)8：957-966)。可由编码枯草芽孢杆菌GroE蛋白质和枯草芽孢杆菌PrsA的基因获得编码伴侣分子的核酸序列。对于其它范例，参阅Gething和Sambrook，1992，见上文；和Hartl等人，1994，见上文。

加工蛋白酶是切割前肽而产生成熟的有生物化学活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母(Yeast)10：67-69；Fuller等人，1989，美国国家科学院进展(Proceedings of the NationalAcademy of Scineces USA)86：1434-1438；Julius等人，1984，细胞(Cell)37：1075-1089；Julius等人，1983，细胞(Cell)32：839-852；美国专利号5,702,934)。可由编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的二肽氨肽酶、酿酒酵母的KexZ、Yarrowia lipolytica的二碱性加工内切蛋白酶(xpr6)、和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)金属蛋白酶(p45基因)的基因获得编码加工蛋白酶的核酸序列。

可能还希望添加相对于宿主细胞的生长来调控多肽表达的调控序列。调控系统的范例是引起基因应答化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而打开或关闭表达的调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac、和trp操纵基因系统。表达载体

本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述多种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，它可包含一个或多个便利的限制性位点从而能够在这些位点处插入或替代编码多肽的核酸序列。或者，可通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建物插入用于表达的适当载体来表达本发明的核酸序列。在生成表达载体时，编码序列位于载体中从而编码序列可操作连接用于表达的适当控制序列。

重组表达载体可以是可方便的进行重组DNA流程且能够表达核酸序列的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与载体将导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖染色体复制，如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可包括用于确保自身复制的任何手段。或者，载体可以是在导入宿主细胞后整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。此外，可使用(一起)包含待导入宿主细胞基因组中的总DNA的单个载体或质粒或者两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一种或多种能够容易的选择转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、向营养缺陷型提供原养等等的基因。细菌选择标记的范例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性的标记，诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四环素抗性。

本发明的载体优选包含能够使载体整合到宿主细胞基因组中或者使细胞中的载体不依赖基因组而自主复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖编码多肽的核酸序列或载体的任何其它元件，通过同源或非同源重组使载体整合到基因组中。或者，载体可包含额外核酸序列，用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中。额外核酸序列使得载体能够以精确的染色体定位整合到宿主细胞基因组中。为了提高精确定位整合的可能性，整合元件应当优选包含足够数目的与对应靶序列高度同源的核酸，诸如100-10,000bp，优选400-10,000bp，最优选800-10,000bp，由此增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，可通过非同源重组使载体整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体还可包含使载体能够在目的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的范例是能够在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，能够在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。复制起点可以是包含突变因而使其在宿主细胞中的功能具有温度敏感性的载体(参阅如Ehrlich，1978，美国国家科学院进展(Proceedings of theNational Academy of Scinece USA)75：1433)。

可以将超过一个拷贝的本发明核酸序列插入宿主细胞以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合到宿主细胞基因组中，或者通过使核酸序列包含可扩增选择标记基因(可通过在存在适当选择剂的情况中培养细胞来选择包含扩增拷贝的选择标记基因因而包含额外拷贝的核酸序列的细胞)，由此获得核酸序列拷贝数的增加。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的流程对于本领域熟练技术人员而言是众所周知的(参阅如Sambrook等人，1989，见上文)。宿主细胞

本发明还涉及包含本发明核酸序列的重组宿主细胞，可有利的用于重组生产多肽。可将包含本发明核酸序列的载体导入宿主细胞，从而以上文所述染色体整合体或自身复制的染色体外载体的形式维持载体。术语“宿主细胞”涵盖因复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，如原核生物，或者是非单细胞微生物，如真核生物。

有用的单细胞细胞是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)的细胞，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，或者链霉菌属(Streptomyces)的细胞，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌的细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性的芽孢杆菌。

例如可通过原生质体转化(参阅如Chang和Cohen，1979，分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)168：111-115)、使用感受态细胞(参阅如Young和Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)81：823-829；或Dubnau和Dayidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)56：209-221)、电穿孔(参阅如Shigekawa和Dower，1988，生物技术(Biotechniques)6：742-751)、或缀合(参阅如Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)169：5771-5778)实现将载体导入细菌宿主细胞。生产方法

本发明还涉及用于生成本发明多肽的方法，包括(a)培养野生型形式能够生成多肽的菌株以产生包含多肽的上清液；并(b)回收多肽。菌株优选芽孢杆菌属，更优选枯草芽孢杆菌。

本发明还涉及用于生成本发明多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的条件下培养宿主细胞；并(b)回收多肽。

本发明还涉及用于生成本发明多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区中具有至少一处突变的突变型核酸序列，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成的多肽；并(b)回收多肽。

在本发明的生产方法中，使用本领域已知方法，在适合于生成多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料-分批、或固相发酵)，在合适的培养基中且在能够表达和/或分离多肽的条件下培养细胞。使用本领域已知流程，在包含碳源、氮源、和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可由商业供应商处购买，或者可以依照公开的配方进行配制(如美国典型培养物收藏中心的目录)。若多肽分泌进入营养培养基，则可直接由培养基回收多肽。如多肽不是分泌型的，则可由细胞裂解物回收多肽。

可使用对多肽特异的本领域已知方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，本文所述酶测定法可用于测定多肽的活性。

可通过本领域已知方法来回收产生的多肽。例如，可通过常规流程由营养培养基回收多肽，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可通过多种本领域已知流程来纯化本发明多肽，包括但不限于层析(如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳(如制备性等电聚焦)、差异溶解(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参阅如《蛋白质纯化》(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。植物

本发明还涉及用编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽的本发明核酸序列转化因而以可回收的数量表达并生成多肽的转基因植物、植物部分、或植物细胞。可以由植物或植物部分回收多肽。或者，可以同样的使用包含重组多肽的植物或植物部分来改进食品或饲料的品质，如改进营养价值、美味性、和流变学特性，或者破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的范例是草，诸如草地草(蓝草、早熟禾)、草料草(诸如羊茅)、黑麦草、温带草(诸如剪股颖)、和谷类(如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉米)。

双子叶植物的范例是烟草、豆类(诸如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、蚕豆、和大豆)、和十字花科植物(诸如花椰菜、油菜籽、和密切相关的模型生物拟南芥)。

植物部分的范例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎。特定的植物组织，诸如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体、和细胞质，也认为是植物部分。此外，认为任何植物细胞(不管组织起源如何)都是植物部分。

本发明的范围还包括这些植物、植物部分、和植物细胞的后代。

可依照本领域已知方法来构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，将编码本发明多肽的一种或多种表达构建物引入植物宿主基因组，并将产生的经修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞，可构建成这样的植物或植物细胞。

便利的是，表达构建物是包含编码本发明多肽的核酸序列并可操作连接在选定植物或植物部分中表达核酸序列所需要的适当调控序列的核酸构建物。此外，表达构建物可包含可用于鉴定其中整合了表达构建物的宿主细胞的选择标记，和将构建物引入目的植物所必需的DNA序列(后者取决于将使用的DNA引入方法)。

例如根据希望何时、何处、如何表达多肽来确定调控序列的选择，诸如启动子和终止亚序列，任选信号或运输序列。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以具有发育、阶段、或组织特异性，而且基因产物可以靶向特定组织或植物部分(诸如种子或叶)。例如Tague等人(1988，植物生理学(Plant Physiology)86：506)描述了调控序列。

对于组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等人，1980，细胞(Cell)21：285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏组织(诸如种子、马铃薯块茎、和果实)的启动子(Edwards和Coruzzi，1990，遗传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)24：275-303)、或来自代谢组织(诸如分生组织)的启动子(Ito等人，植物分子生物学(PlantMolecular Biology)24：863-878)、种子特异性启动子诸如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或清蛋白启动子(Wu等人，1998，植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)39：885-889)、来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知种子蛋白质基因的蚕豆启动子(Conrad等人，1998，植物生理学杂志(Journal of PlantPhysiology)152：708-711)、来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人，1998，植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)39：935-941)、来自芸苔(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本领域已知的任何其它种子特异性启动子(如WO 91/14772中所述)。此外，启动子可以是叶特异性启动子，诸如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，植物生理学(Plant Physiology)102：991-1000)、绿藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因的启动子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)26：85-93)、或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)248：668-674)，或者是创伤诱导型启动子，诸如马铃薯pin2启动子(Xu等人，1993，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)22：573-588)。

还可使用启动子增强子元件，从而在植物中实现更高水平的酶表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子与编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等人(1993，见上文)公开了水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子用于增强表达的用途。

选择标记基因和表达构建物的任何其它部分可选自本领域可获得的。

依照本领域已知的常规技术，包括由农杆菌介导的转化、由病毒介导的转化、显微注射、微粒轰击、biolisic转化、和电穿孔(Gasser等人，1990，科学(Science)244：1293；Potrykus，1990，生物/技术(Bio/Technology)8：535；Shimamoto等人，1989，自然(Nature)338：274)，将核酸构建物导入植物基因组。

目前，由根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的首选方法(回顾参阅Hooykas和Schilperoort，1992，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)19：15-38)。但是，它也可用于转化单子叶植物，虽然这些植物通常优选其它转化方法。目前，用于产生转基因单子叶植物的首选方法是胚性愈伤组织或发育中胚的微粒轰击(涂抹了转化DNA的金或钨微颗粒)(Christou，1992，植物杂志(Plant Journal)2：275-281；Shimamoto，1994，生物技术现行观点(Current Opinion Biotechnology)5：158-162；Vasil等人，1992，生物/技术(Bio/Technology)10：667-674)。用于转化单子叶植物的其它方法主要是基于原生质体转化(Omirulleh等人，1993，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)21：415-428)。

转化之后，依照本领域众所周知的方法，选择其中掺入了表达构建物的转化体并再生成完整植株。

本发明还涉及用于生成本发明多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的条件下培养包含编码具有果胶乙酰酯酶活性的多肽的本发明核酸序列的转基因植物或植物细胞；并(b)回收多肽。消除或降低果胶乙酰酯酶活性

本发明还涉及用于生成亲本细胞的突变型细胞的方法，包括破坏或删除编码多肽的核酸序列或其控制序列，导致在相同条件下培养时生成的多肽比亲本细胞少的突变型细胞。

通过修饰或灭活在细胞中表达具有果胶乙酰酯酶活性的多肽所必需的核酸序列，可方便的实现果胶乙酰酯酶活性降低的菌株的构建。待修饰或灭活的核酸序列可以是例如编码该多肽或其展示果胶乙酰酯酶活性所必需的部分的核酸序列，或者核酸序列可具有由该核酸序列的编码序列表达多肽所需要的调控功能。这种调控或控制序列的范例可以是启动亚序列或其功能部分，即足以影响多肽表达的部分。上文描述了可能修饰的其它控制序列。

通过对细胞进行诱变，并选择或筛选果胶乙酰酯酶生成能力降低的细胞，可进行核酸序列的修饰或灭活。可进行特异或随机的诱变，例如通过使用合适的物理或化学诱变剂，通过使用合适的寡核苷酸，或者通过对DNA序列进行PCR诱变。此外，可通过使用这些诱变剂的任意联合来进行诱变。

适用于该目的的物理或化学诱变剂的范例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。

在使用这些试剂时，通常在存在选定诱变剂的情况中在合适条件下将待诱变细胞保温，并选择展示果胶乙酰酯酶活性或产量降低的细胞，由此进行诱变。

通过在编码多肽的核酸序列或其转录或翻译所需要的调控元件中导入、替代、或删除一个或多个核苷酸，可实现本发明多肽生产的修饰或灭活。例如，可插入或删除核苷酸从而导入终止密码子、消除起始密码子、或改变开放读码框。依照本领域已知方法，通过定点诱变或PCR诱变，可实现这些修饰或灭活。虽然原则上可在体内(即直接在表达待修饰核酸序列的细胞上)进行修饰，但是优选如下文例示在体外进行修饰。

消除或降低选定宿主细胞的生成的简便方法的范例是通过基因取代或基因中断。在基因中断法中，在体外诱变对应于目的内源基因或基因片段的核酸序列以产生缺陷型核酸序列，然后转化到宿主细胞中以产生缺陷型基因。缺陷型核酸序列通过同源重组取代内源基因或基因片段。可能希望缺陷型基因或基因片段还编码标记，可用于选择其中编码多肽的基因遭到修饰或破坏的转化体。

或者，通过已建立的反义技术，使用与多肽编码序列互补的核苷酸序列，可实现核酸序列的修饰或灭活。更具体的说，导入与编码多肽的核酸序列互补的核苷酸序列，它可在细胞中转录并能与细胞中生成的多肽mRNA发生杂交，由此可降低或消除细胞的多肽生成。在互补反义核苷酸序列能够与多肽mRNA发生杂交的条件下，可降低或消除多肽的翻译量。

优选的是，按照本发明方法修饰的细胞是微生物起源，例如适用于生产期望蛋白质产物(对于细胞而言，或是同源的或是异源的)的真菌菌株。

本发明还涉及亲本细胞的突变型细胞，其中包括破坏或删除编码多肽的核酸序列或其控制序列，导致突变型细胞生成的多肽比亲本细胞少。

如此产生的多肽缺陷的突变型细胞作为宿主细胞用于表达同源和/或异源多肽特别有用。因此，本发明还涉及用于生成同源或异源多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的条件下培养突变型细胞；并(b)回收多肽。术语“异源多肽”在这里定义为对于宿主细胞而言不是天然的多肽、其中进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白、或通过重组DNA技术对宿主细胞的操作而改变了表达量的天然蛋白。

在另一个方面，本发明涉及用于生成基本上没有果胶乙酰酯酶活性的蛋白质产物的方法，包括将生成本发明多肽以及目的蛋白质产物二者的细胞进行发酵，在发酵之前、之中、或之后向发酵肉汤中加入有效量的能够抑制果胶乙酰酯酶活性的试剂，由发酵肉汤回收目的产物，并任选对回收的产物进行进一步纯化。

在另一个方面，本发明涉及用于生成基本上没有果胶乙酰酯酶活性的蛋白质产物的方法，包括在允许产物表达的条件下培养细胞，对产生的培养肉汤进行pH与温度的联合处理以充分降低果胶乙酰酯酶活性，并由培养肉汤回收产物。或者，可对由培养肉汤回收的酶制剂进行pH与温度的联合处理。pH与温度的联合处理可任选与果胶乙酰酯酶抑制剂处理联合使用。

依照本发明的这个方面，有可能消除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，仍然更优选至少95％，最优选至少99％的果胶乙酰酯酶活性。使用这种方法可达到果胶乙酰酯酶活性的完全消除。

pH与温度的联合处理优选在pH范围6.5-7和温度范围55-75℃进行足够时间以获得预期效果，通常30-60分钟是足够的。

可通过本领域已知方法来进行用于培养和纯化目的产物的方法。

用于生成基本上没有果胶乙酰酯酶活性的产物的本发明方法在酶生产中是特别感兴趣的。酶可选自如淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulytic enzyme)、氧化还原酶、或植物细胞壁降解酶。这些酶的范例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、蔗糖酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶溶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。果胶乙酰酯酶缺陷细胞还可用于表达制药学感兴趣的异源蛋白，诸如激素、生长因子、受体、等等。

应当理解，术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，还包括通过氨基酸替代、删除、或添加，或者其它修饰而增强了活性、热稳定性、pH耐受等等特性的多肽(如酶)。

在另一个方面，本发明涉及通过本发明方法产生的、基本上没有果胶乙酰酯酶活性的蛋白质产物。组合物

在还有一个方面，本发明涉及包含本发明多肽和合适载体的组合物。优选的是，组合物富集了本发明的多肽。在本文中，术语“富集”指组合物的果胶乙酰酯酶活性得到了提高，如富集因子为1.1。合适载体在本领域是众所周知的。

组合物可包含本发明多肽作为主要酶成份，如单组分组合物。或者，组合物可包含多种酶活性，诸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、蔗糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、另一种果胶溶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。另外的酶可由任何微生物产生。

可依照本领域已知方法制备多肽组合物，而且可以是液体或干燥形式的组合物。例如，多肽组合物可以是颗粒或微粒的形式。可依照本领域已知方法稳定组合物中将包含的多肽。

下文给出了本发明多肽组合物的优选用途的范例。可依照本领域已知方法测定本发明多肽组合物的剂量和使用组合物的其它条件。用途

本发明还涉及用于降解果胶物质的方法，包括在适合于降解果胶物质的条件下使果胶物质接触有效量的一种或多种本发明多肽。如上所述，一种或多种多肽可以包含于包含多肽与合适载体的组合物中。组合物还可包含对降解果胶物质有用的其它酶，诸如其它果胶溶酶、纤维素酶、和半纤维素酶。其它果胶溶酶可包括内切和外切果胶裂解酶、内切和外切甲基半乳糖醛酸聚糖酶、内切和外切果胶酸(酯)裂解酶、内切和外切半乳糖醛酸聚糖酶、果胶甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、和/或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶，或者已知降解果胶物质的任何其它酶。

使用本领域众所周知的方法，本发明的多肽及其组合物可用于降解具有不同酯化程度的可溶性和不溶性的果胶，从而使植物组织粘度降低、澄清、脱果胶、和泡软。

在一个优选的实施方案中，多肽作为试剂，单独或与其它酶联合用于降解或修饰乙酰化果胶。

在另一个优选的实施方案中，多肽作为试剂，单独或与其它酶一起用于降解或修饰植物细胞壁。

在另一个优选的实施方案中，多肽与对乙酰化或部分乙酰化果胶特异的其它酶一起使用。这些其它酶包括以高于对脱乙酰果胶作用的特异性攻击乙酰化和部分乙酰化果胶的所有酶，包括通过内切和/或外切方式攻击果胶主链的酶，或者攻击果胶侧链的酶。这样的一种酶是鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。参阅例如W0 93/20190。

在另一个优选的实施方案中，多肽与对脱乙酰或部分脱乙酰果胶特异的其它酶一起使用。这些其它酶包括以高于对乙酰化果胶作用的特异性攻击脱乙酰和部分脱乙酰果胶的所有酶，包括通过内切和/或外切方式攻击果胶主链的酶，或者攻击果胶侧链的酶。

在另一个优选的实施方案中，多肽与对乙酰化或部分乙酰化果胶特异的其它酶和对脱乙酰或部分脱乙酰果胶特异的其它酶一起使用。

可使用本领域众所周知的方法来测定降解含果胶物质必需的多肽剂量和条件。通常，本发明多肽的加入量相当于0.01-100mg酶蛋白质/kg含果胶物质。信号肽

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因以及与之可操作连接的编码由SEQ ID NO：2的第1-25位氨基酸构成的信号肽、由SEQ ID NO：1的第1-75位核苷酸构成的核酸序列的核酸构建物，其中所述基因对于所述核酸序列而言是外来的。

本发明还涉及包含这种核酸构建物的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于生成蛋白质的方法，包括(a)在适合于蛋白质生成的条件下培养重组宿主细胞；并(b)回收蛋白质。

核酸序列可以可操作连接其它控制序列和外源基因。上文描述了这些其它控制相同。

蛋白质对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在这里的用意不是指特定长度的编码产物，因而涵盖肽、寡肽、和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖联合形成编码产物的两种或多种多肽。蛋白质还包括杂合多肽，它包含由至少两种不同蛋白质获得的部分或完整多肽序列的联合，其中一种或多种蛋白质对于宿主细胞而言可以是异源的或天然的。蛋白质还包括上述蛋白质和杂合蛋白的天然发生的等位基因和工程变异。

蛋白质优选激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。在更优选的实施方案中，蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。在甚至更优选的实施方案中，蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环化糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶溶酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

可由任何原核、真核、或其它来源获得基因。为了本发明的目的，术语“由…获得”在这里与指定来源一起使用时指蛋白质是由该来源或插入了来自该来源的基因的细胞产生的。

通过下列实施例进一步描述本发明，这些实施例不应当理解为对

发明范围的限制。

                       实施例

用作缓冲剂和底物的化学药品是至少试剂级的商品。细菌菌株

大肠杆菌DH5α，大肠杆菌JMl0l，枯草芽孢杆菌A164(ATCC6051A)，枯草芽孢杆菌168(Bacillus Stock Center，Columbus，OH)，和枯草芽孢杆菌PLl801 spoIIE∷Tn917(amyE、apr、npr)。引物和寡聚物

所有引物和寡聚物都是在Applied Biosystems 394型合成仪(Applied Biosystems公司，Foster City，CA)上依照制造商的指示合成的。实施例1：来自枯草芽孢杆菌168的果胶乙酰酯酶基因的分离和鉴定

使用QIAGEN细菌基因组DNA分离方案(QIAGEN，Valencia，CA)，依照制造商的指示，由枯草芽孢杆菌168分离基因组DNA。

将下文所示寡核苷酸引物1和2用于由枯草芽孢杆菌168基因组DNA通过PCR扩增果胶乙酰酯酶编码区。引物1在果胶乙酰酯酶编码区的上游引入了SacI位点和芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶(SAVINASE^TM，NovoNordisk A/S，Bagsvrd，丹麦，以下称为SAVINASE^TM基因)的核糖体结合位点，而引物2在果胶乙酰酯酶编码区的下游引入了NotI位点。

扩增反应(50μl)包含大约200ng枯草芽孢杆菌168基因组DNA、0.5μM每种引物、200μM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP、1x PCR缓冲液、3mM MgCl₂、和0.625U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)。将反应在RoboCycler 40温度循环仪(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)中进行循环，编程如下：第一个循环95℃ 9min；30个循环95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min；最后一个循环72℃ 3min。引物1：5＇-CGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGAAAAAATGGATGGCAGCG-3＇(SEQ ID NO.3)引物2：5＇-GCGGCCGCTTAAAAGCCAGCGATTCCCTG-3＇(SEQ ID NO.4)

使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，依照制造商的指示，克隆PCR产物。使用QIAprep8质粒试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)，依照制造商的指示，由大肠杆菌TOP10转化体分离质粒DNA。通过使用酶EcoRI、BglI、DraI、PuvI、NotI、和SacI的限制性分析鉴定包含预期插入片段的质粒，并命名为pCR2.1-yxiM。分离包含pCR2.1-yxiM质粒的大肠杆菌TOP10菌落，并使用QIAGEN质粒试剂盒依照制造商的指示制备质粒DNA以供测序。用该质粒转化大肠杆菌SURE细胞(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，将一个转化体命名为MDT28并保藏于NRRL培养物收藏中心。

使用Applied Biosystems 377 XL型自动化DNA测序仪，使用染料-终止物化学和基于公开的yxiM基因序列(Shevchik等人，1997，见上文)的合成寡核苷酸，进行DNA测序。

DNA序列分析确认了果胶乙酰酯酶基因的序列，相对于发表的yxiM基因序列(Shevehik等人，1997，见上文)存在两处差异：报道位于yxiM编码序列第247位的G残基变成了C残基，报道位于yxiM编码序列第447位的C残基变成了G残基。使用与上述相同方法、使用引物1和2、由枯草芽孢杆菌168基因组DNA产生的5份独立PCR产物的DNA序列分析确认了第247位为C残基，指出发表的G残基是错误的。该序列变化导致氨基酸变化，发表位于第83位的谷氨酸残基变成了谷氨酰胺残基。第447位的核苷酸变化不影响所编码蛋白质的氨基酸序列。

果胶乙酰酯酶克隆具有编码382个氨基酸的多肽的1146bp开放读码框。核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导氨基酸序列(SEQ ID NO：2)显示于图1。使用SignalP程序(Nielsen等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10：1-6)，预测了对应于SEQ ID NO：1的第1-75位核苷酸的25个残基的信号肽。

使用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以及同一性表格和下列多重比对参数进行了果胶乙酰酯酶氨基酸序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数是Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗＝5，对角线＝5。

比较性比对显示，枯草芽孢杆菌的果胶乙酰酯酶与来自菊欧文菌的果胶乙酰酯酶(EMBL Y09828)享有14.9％同一性的区域，与来自棘孢曲霉的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(EMBL X89714)享有14.4％同一性的区域。实施例2：pDG268MCS的构建

用Tth111I和EcoRI消化pDG268(Antoniewski等人，1990，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)172：86-93)。使用QiaquickDNA纯化试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)，依照制造商的指示，凝胶纯化大约6020bp的最大质粒片段。然后将回收的DNA与下文所示合成多接头相连接，在质粒中引入唯一的SfiI和BamHI位点。

       SfiI ApaI SmaI AatII HindIII ClaI BamHI NotI5＇-AATTGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCAAGCTTATCGATGCGGATCCGCGGCCGC

 3＇-CCGGAATTCCCGGGCCCTGCAGTTCGAATAGCTACGCCTAGGCGCCGGCGC(分别为SEQ ID NO：5和6)

用连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板(每升含16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl、和15g琼脂)上选择氨苄青霉素抗性转化体。依照Sambrook等人，1989，见上文，纯化质粒DNA，并用SfiI和NotI消化以鉴定包含这些位点(暗指上文所示多接头)的质粒(pDG268不含这两种限制性位点)。鉴定了包含这两种限制性位点且比pDG268小大约3.0kb(这是用合成多接头取代pDG268中lacZ基因的结果)的几个质粒。选择这样的一个质粒，命名为pDG268MCS(图2)。实施例3：pHP13ampMCS的构建

如下构建pHP13-amp，pHP13(Haima等人，1987，分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)209：335-342)的变体。用AatII消化pUC9，用Klenow片段和dNTP补平末端，并用HindIII消化。使用Qiaex试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)，凝胶纯化较大的2.2kb片段。用HpaI(它切割红霉素抗性基因的内部)消化pHP13，补平末端，并用HindIII消化。然后将由pHP13释放的较大的3.0kb片段与含pUC9的复制起点和氨苄青霉素抗性基因的2.1kb片段相连接。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5α中，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。如实施例1所述，由几个转化体纯化质粒DNA。由其中一个转化体回收命名为pHP13amp的质粒。

用EcoRI和HindIII消化质粒pHP13amp，并用将100pmol下列多接头在50mM NaCl、10mM Tris pH7.5、和1mM EDTA中退火(煮沸5分钟，然后在超过2个小时的时间里慢慢冷却至室温)产生的新MCS取代pUC9MCS：

        SfiI ApaI SmaI AatII sacI HindIII NotI NcoI SalI5＇-AGCTAGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCGAGCTCAAGCTTGCGGCCGCCATGGTCGACG

 3＇-TCCGGAATTCCCGGGCCCTGCAGCTCGAGTTCGAACGCCGGCGGTACCAGCTGCTTAA(分别为SEQ ID NO：7和8)

用连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由几个转化体纯化质粒DNA，并用NotI和SacI消化。这些酶可切割的质粒包含合成多接头。鉴定这样的一个质粒，命名为pHP13amp-MCS(图3)。通过经由多接头区的DNA测序进一步确认了该质粒。实施例4：SAVINASE^TM丝氨酸蛋白酶基因的分离

使用质粒pSX222(美国专利号5,621,089)作为模板以及下列两种引物(限制性位点标有下划线)，PCR扩增称为SAVINASE^TM(Novo NordiskA/S，Bagsvrd，丹麦)的芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的编码基因：

      ApAI      SacI5＇-CTCC GGGCCCATCT GAGCTCTATAAAAATGAGGAGGG-3＇(SEQ ID NO.9)

    BamHI5＇-CCTC GGATCCATACACAAAAAAACGCT-3＇(SEQ ID NO.10)

扩增反应(100μl)由下列成份组成：50ng pSX222、50pmol每种引物、1x Taq DNA聚合酶缓冲液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、200μM每种dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。扩增条件是：第一个循环95℃ 3min；30个循环95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一个循环72℃ 5min。

依照制造商的指示，将大约1230bp的PCR产物直接亚克隆到pCRII载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用基因特异引物通过DNA测序确认了基因的序列。一旦确认，用BamHI消化质粒，用Klenow片段补平，用ApaI进行消化，并将包含SAVINASE^TM基因的片段连接到pHP13ampMCS的ApaI/Ecl136II位点中。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由一个转化体分离出命名为pHP13amp-SAV(图4)的质粒，并使用构建物特异引物通过DNA测序进行确认。因连接重新产生了BamHI位点。实施例5：pUC18-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA的构建

由依照Pitcher等人的方法(1989，应用微生物学通讯(Letters inApplied Microbiology)8：151-156)由WO 95/02695中所述苏云金芽孢杆菌粉虫亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)菌株NB125分离的染色体DNA，使用下列引物，通过PCR扩增编码苏云金芽孢杆菌粉虫亚种晶体蛋白CryIIIA的cryIIIA基因的启动子：

       SmaI5＇-GAGA CCCGGGAGCTTTCAGTGAAGTACGTG-3＇(SEQ ID NO.11)5＇-GGGGCGTTACAATTCAAAG-3＇(SEQ ID NO.12)

扩增反应(100μl)由下列成份组成：50ng苏云金芽孢杆菌粉虫亚种NB125染色体DNA、50pmol每种引物、1x Pfu聚合酶缓冲液(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)、200μM每种dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和1.0U Pfu聚合酶(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)。扩增条件是：第一个循环95℃ 3min；30个循环95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一个循环72℃ 5min。用SmaI和HindIII消化大约1000bp的PCR产物，并连接到pUC18的SmaI/HindIII位点中。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由一个氨苄青霉素抗性转化体分离出命名为pUC18-Pr_cryIIIA的质粒。

用HindIII消化质粒pUC118-cryIIIA(WO 95/02695)，并使用Qiaquick DNA纯化试剂盒依照制造商的指示凝胶纯化包含cryIIIA基因和mRNA稳定序列的大约3000bp的HindIII片段。将该片段连接到pUC18-Pr_cryIIIA的HindIII位点中。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由一个氨苄青霉素抗性转化体分离出命名为pUC18-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA(图5)的质粒。通过用EcoRI消化质粒确认了片段的正确取向。实施例6：cryIIIA启动子-cryIIIA mRNA稳定序列-SAVINASE^TM基因表达盒的构建

使用质粒pUC18-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA作为DNA模板以及下文所述两种引物(限制性位点标有下划线)，PCR扩增cryIIIA基因的启动子和mRNA稳定序列：

   ApaI5＇-GGGCCCTCGAAACGTAAGATGAAACCT-3＇(SEQ ID NO.13)

   SacI5＇-GAGCTCCATAATACATAATTTTCAAACTG-3＇(SEQ ID NO.14)

扩增反应(100μl)由下列成份组成：50ngpUC18-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab、50pmol每种引物、1x Taq聚合酶缓冲液、200μM每种dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和1.0U Taq聚合酶。扩增条件是：第一个循环95℃ 3min；30个循环95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一个循环72℃ 5min。

依照制造商的指示，将大约630bp的PCR产物克隆到pCRII载体中，以产生pCRII-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab，使用M13测序引物和cryIIIA特异引物通过DNA测序进行确认。

凝胶纯化pCRII-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab的包含cryIIIA启动子以及mRNA稳定序列的大约630bp的SfiI-SacI片段，并连接经SfiI/SacI消化的pHP13amp-SAV。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由一个氨苄青霉素抗性转化体纯化命名为pHP13amp-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的质粒。

使用Qiaquick DNA纯化试剂盒依照制造商的指示凝胶纯化pHP 13amp-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的包含Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV盒的大约1850bp的SfiI-BamHI片段，并连接经SfiI/BamHI消化的pDG268MCS。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由一个氨苄青霉素抗性转化体纯化命名为pDG268MCS-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV(图6)的质粒。实施例7：pDG268MCSΔ-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的构建

用SnaBI和NruI(两种限制性位点都位于载体SacI位点的侧翼)消化pDG268MCS-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，连接，并转化到大肠杆菌DH5α中。在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由几个转化体纯化质粒DNA。用SacI消化质粒DNA，以鉴定删除了位于载体序列中的SacI位点因而切割只发生于cryIIIA启动子下游的SacI位点的质粒。鉴定了这样的一个质粒，命名为pDG268MCSΔ-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV(图7)。实施例8：pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的构建

用BalI消化pDG268MCSΔ-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，并用小牛肠碱性磷酸酶进行处理。用PstI和NotI消化质粒pBEST501(Itaya等人，1989，核酸研究(Nucleic Acids Research)17：4410)，用T4 DNA聚合酶I进行处理以产生平端，并进行琼脂糖凝胶纯化以分离包含新霉素抗性标记的片段。将经凝胶纯化的片段与经BalI消化的质粒连接在一起，并转化到DH5α中。在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。将选择的转化体点接到添加50μg/ml新霉素的LB平板上，以鉴定新霉素抗性转化体。由一些新霉素抗性转化体纯化质粒DNA，并用BglI进行消化(因新霉素抗性基因引入了额外的BglI位点而切割两次)，在4kb范围内产生两种片段，并用BamHI进行消化(预测只在SAVINASE^TM蛋白酶基因下游切割一次)，产生大约8kb的片段。鉴定了这样的一个质粒，命名为pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV(图8)。实施例9：“共有”amyQ启动子的构建

将下面两种寡核苷酸在一起退火，并用Klenow片段延伸产生在amyQ启动子的-10和-35区(以粗体字母标明)中包含突变(*)的68bp双链片段：

         SOE   **                  *5＇-GGAATAAAGGGGGGTTGACATTATTTTACTGATATGTATAATAT-3＇(SEQ IDNO.15)SacI3＇-AATAAAATGACTATACATATTATATTAAACATATTCTTTTACCTCGAG-5＇(SEQ ID NO.16)

使用下面两种引物通过PCR产生包含amyQ启动子上游区137bp的第二种双链片段：

SfiI5＇-GGCCTTAAGGGCCTGCA-3＇(SEQ ID NO.17)        SOE5＇-TGTCAACCCCCCTTTATTCCTT-3＇(SEQ ID NO.18)

然后通过传统的SOE(交叠延伸剪接)PCR法将这两种双链DNA片段融合在一起，产生命名为“共有”amyQ的突变型amyQ启动子。SOE交叠区标有下划线。在SOE反应中用于获得全长片段的引物如下：

   SfiI5＇- GGCCTTAAGGGCCTGCA-3＇(SEQ ID NO.17)

   SacI5＇- GAGCTCCATTTTCTTATACAAATTATAT-3＇(SEQ ID NO.19).

SOE反应(50μl)由下列成份组成：50ng 68bp SOE片段和50ng137bp SOE片段、1x Taq聚合酶缓冲液、200μM每种dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和2.5U Taq DNA聚合酶。条件是：第一个循环95℃ 3min；30个循环95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min；第3个循环后加入上述两种引物每种各50pmol，在剩余27个循环中扩增185bp的启动子片段；最后一个循环72℃ 5min。

依照制造商的指示，将大约185bp的PCR产物直接亚克隆到pCRII载体中，并使用正向和反向M13测序引物通过DNA测序确认产生了pCRII-Pr_{“共有”amyQ}。

amyQ启动子的完整序列(包括侧翼限制性位点)显示于图9(SEQ IDNO：20)。将下列突变引入含野生型amyQ启动子(SEQ ID NO：20)的核酸序列，以产生“共有”amyQ启动子(SEQ ID NO：21)：SEQ ID NO：20中位于-35区第135和136位(相对于转录起始位点)的T和T分别变成A和C，位于-10区第156位的A变成T。如图9(SEQ ID NO：22)所示，在-35区上游大约20bp，位于第116位的T无意中变成了A。该变化显然对启动子功能没有有害影响，因为它可以由关键的-10和-35区除去。实施例10：短“共有”amyQ启动子-SAVINASE^TM基因表达盒的构建

使用如下寡核苷酸引物由pCRII-Pr_{“共有”amyQ}通过PCR扩增短“共有”amyQ启动子：5＇-GGCCTTAAGGGCCTGCTGTCCAGACTGTCCGCT-3＇(SEQ ID NO.23)5＇-GAGCTCCATTTTCTTATACAAATTATAT-3＇(SEQ ID NO.19)

扩增反应(100μl)由下列成份组成：50ng pCRII-Pr_{“共有”amyQ}、50pmol每种引物、1x Taq聚合酶缓冲液、200μM每种dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和1.0U Taq聚合酶。扩增条件是：第一个循环95℃3min；30个循环95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一个循环72℃ 5min。

依照制造商的指示，将大约100bp的PCR产物克隆到pCRII载体中，产生pCRII-Pr_{短“共有”amyQ}，并使用正向和反向M13测序引物通过DNA测序进行确认。

用SfiI和SacI消化pCRII-Pr_{短“共有”amyQ}，并通过凝胶电泳分离包含启动子的大约100bp片段。用SfiI和SacI消化pHP13amp-SAV，并通过凝胶电泳分离大约6430bp的载体片段。将经纯化片段连接在一起，用该连接混合物转化枯草芽孢杆菌PL1801 spoIIE∷Tn9l7，并在添加5μg/ml氯霉素的胰蛋白示血琼脂基(TBAB)平板上选择氯霉素抗性转化体。由在添加1％脱脂奶粉的TBAB平板上产生透明圈的氯霉素抗性转化体纯化命名为pHP13amp-Pr_{短“共有”amyQ}/SAV的质粒。通过SfiI和BamHI消化确认质粒。

用SfiI和BamHI消化pHP13amp-Pr_{短“共有”amyQ}/SAV，并通过凝胶电泳分离包含Pr_{短“共有”amyQ}/SAV盒的大约1330pb片段。用SfiI和BamHI消化pDG268MCS，并通过凝胶电泳分离大约6040pb的载体片段。将经纯化片段连接在一起，用连接物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由氨苄青霉素抗性转化体之一纯化命名为pDG268MCS-Pr_{短“共有”}amyQ/SAV(图10)的质粒。通过SfiI和BamHI消化及随后的凝胶电泳进行确认。实施例11：串联短“共有”amyQ-cryIIIA启动子-cryIIIA mRNA稳定序列-SAVINASE^TM基因表达盒的构建

用SfiI和BamHI消化pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，并通过凝胶电泳分离大约6780pb的载体片段。用SfiI和BamHI消化pDG268MCS-Pr_{短“共有”amyQ}/SAV，并通过凝胶电泳分离大约1300pb的表达盒片段。将经纯化片段连接在一起，并转化到大肠杆菌DH5α中。在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由氨苄青霉素抗性转化体之一纯化出命名为pDG268MCSΔneo-Pr_{短“共有” amyQ}/SAV(图10)的质粒，并通过NcoI消化及随后的凝胶电泳进行确认。

用SfiI消化pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，用Klenow片段处理以产生平端，并用DraIII进行消化。通过凝胶电泳分离大约7060bp的载体片段。用Ecl136II和DraIII消化pDG268MCSΔneo-Pr_{短“共 有”amyQ}/SAV，并通过凝胶电泳分离包含短“共有”amyQ启动子的大约1540bp片段。将经纯化片段连接在一起，并转化到大肠杆菌DH5α中。在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由氨苄青霉素抗性转化体之一纯化出命名为pDG268MCSΔneo-Pr_{短”共有”amyQ}/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(图11)的质粒，并通过NcoI消化及随后的凝胶电泳进行确认。实施例12：pCAsub3Δ-Pr_{短“共有”amyQ}/cryIIIA/SAV的构建

用SacI和SalI消化质粒p2419MCS5-cat(98/22598)，并用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段和dNTP处理以产生平端。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)凝胶纯化大约4240bp的载体片段，并用T4 DNA连接酶进行处理。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。由氨苄青霉素抗性转化体之一纯化出命名为p2419catΔ的质粒，并使用实施例1中所述相同方法通过DNA测序进行确认。

使用QIAGEN细菌基因组DNA分离方案，由枯草芽孢杆菌A164分离基因组DNA。将下文所示寡核苷酸引物3和4用于由枯草芽孢杆菌A164基因组DNA通过PCR扩增amyE基因的片段。引物3引入了NotI位点，而引物4引入了Asp718位点。引物3：5＇-GCGGCCGCGATTTCCAATGAG-3＇(SEQ ID NO.24)引物4：5＇-GGTACCTGCATTTGCCAGCAC-3＇(SEQ ID NO.25)

如实施例1所述进行PCR。使用TOPO TA克隆试剂盒，依照制造商的指示，克隆PCR产物。使用QIAprep8质粒试剂盒，依照制造商的指示，由大肠杆菌TOP10转化体分离质粒DNA。通过使用酶EcoRI的限制性分析鉴定包含预期插入片段的质粒，并命名为pCR2.1-amyE。

用NotI和Asp718消化p2419catΔ，并使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化大约4240bp的载体片段。用NotI和Asp718消化pCR2.1-amyE，并使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化大约805bp的amyE片段。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)连接经纯化片段。用该连接物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。使用QIAprep8质粒试剂盒，依照制造商的指示，由大肠杆菌DH5α转化体分离质粒DNA。通过使用酶NotI的限制性分析鉴定包含预期插入片段的质粒，并命名为pCAsub3。

用BaHI和SphI消化pCAsub3以除去amyE片段，并用T4 DNA聚合酶及dNTP处理以产生平端。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化大约4140bp的载体片段，并用T4 DNA连接酶进行处理(恢复BamHI位点)。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。使用QIAprep8质粒试剂盒，依照制造商的指示，由大肠杆菌转化体分离质粒DNA。鉴定缺乏amyE片段的质粒，并命名为pCAsub3Δ。

用SfiI和BaHI消化pCAsub3Δ，并使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化大约4110bp的载体片段。用SfiI和BamHI消化pDG268MCSΔneo-Pr_{短“共有”amyQ}/Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，并使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化包含Pr_{短“共有”amyQ}/Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的大约1950bp片段。使用快速DNA连接试剂盒连接经纯化片段。用该连接物转化大肠杆菌DH5α，并在添加100μg/ml氨苄青霉素的2x YT平板上选择氨苄青霉素抗性转化体。使用QIAprep8质粒试剂盒，依照制造商的指示，由大肠杆菌转化体分离质粒DNA。通过使用酶EcoRI的限制性分析鉴定包含预期插入片段的质粒，并命名为pCAsub3Δ-Pr_{“短共有” amyQ}/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(图12)。实施例13：Pr_{“短共有”amyQ}/Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/yxiM整合体的构建

用SacI和NotI消化pCAsub3Δ-Pr_{“短共有”amyQ}/Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV以除去大部分SAVINASE^TM基因编码区，并使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化大约5030bp的载体片段。用SacI和NotI消化pCR2.1-yxiM，并使用QIAquick凝胶纯化试剂盒凝胶纯化包含果胶乙酰酯酶基因的大约1180bp片段。使用快速DNA连接试剂盒连接经纯化片段。用该连接物转化枯草芽孢杆菌PL1801 spoIIE∷Tn917，并在添加5μg/ml氯霉素的TBAB平板上选择氯霉素抗性转化体(Pr_{短“共 有”amyQ}/Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/yxiM盒大概整合于果胶乙酰酯酶基因座)。选择这样的一个整合体，并通过将整合体在添加渐高浓度至最大值60μg/ml氯霉素的TBAB平板上划线来诱导整合DNA的串联复制。该菌株命名为枯草芽孢杆菌MDT25。

使用实施例1中所述相同方法，由枯草芽孢杆菌MDT25分离基因组DNA。用枯草芽孢杆菌MDT25基因组DNA转化枯草芽孢杆菌A164Δ5(WO98/22598)，并在添加5μg/ml氯霉素的TBAB平板上选择氯霉素抗性整合体。分离这样的一个整合体，命名为枯草芽孢杆菌MDT26。实施例14：果胶乙酰酯酶的生产

将枯草芽孢杆菌菌株MDT25和MDT26在装有50ml乳杆菌MRS肉汤(Difco Laboratories，Detroit，MI)的250ml摇瓶中于37℃、250rpm培养28小时。通过于7000rpm离心5分钟回收上清液。将上清液样品在Novex SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA)上进行电泳，并通过考马斯蓝染色使蛋白质条带显影。在两份样品中都看见对应于成熟果胶乙酰酯酶预期大小(39kDal；第26-382位氨基酸)的蛋白质的强带。

将大约4.2μl粗制酶(10μg/ml)与0.5ml甜菜果胶(10mg/ml)或三醋精(50mM)(溶于Tris-HCl pH8.0缓冲液)在热混仪中于30℃保温15小时。使用Boehringer Mannheim酶联醋酸测定试剂盒(Boehringer Mannheim GMbH，Mannheim，德国)，依照制造商建议的条件，测量醋酸释放。结果显示，酶制剂对甜菜果胶和三醋精有活性。实施例15：重组果胶乙酰酯酶的纯化和鉴定

使用合适的碳源、氮源、和盐类，将芽孢杆菌菌株MDT25在3升发酵罐(1300rpm)中于pH6.8-7.2、37℃培养48小时。使用GS-3转头和Sorvall RC-5B离心机(Dupont，Wilmington，Delaware)，将1.5升体积的全培养肉汤以6000rev/min离心30分钟。回收上清液，并再次离心30分钟以除去任何沉淀物。首先将上清液滤过1.0μm GF/B Whatman滤纸(Whatman公司，Fairfield，NJ)，随后是Whatman 0.45μm PVDF注射滤器(Whatman公司，Fairfield，NJ)，时时更换滤器。回收了总体积1.0升的滤出上清液。将用水1∶2预稀释使电导率达到6.0mS的20ml体积的上清液，进一步用120ml水稀释使电导率达到1.47mS。将稀释上清液滤过Millipore快速0.22μm滤器(Millipore，贝德福德，MA)。

使用大约60ml树脂，在XK-26柱中制备Q-Sepharose Big Beads(Pharmacia Biotech公司，Piscataway，NJ)。用500ml 20mM Tris-HCl缓冲液pH8.0预先平衡柱子。然后将上清液样品上样到柱子上，随后用20mM Tris-HCl缓冲液pH8.0清洗直至达到基线。进行0-0.50MNaCl/20mM Tris-HCl pH8.0的600ml梯度，流速5ml/min，120min。收集10ml级分和130ml流过液，并使用4.5mM醋酸对硝基苯酯(溶于100mMMOPS/4mM CaCl₂，pH7.5)于25℃和405nm进行测定。在流过液中检测到超过85％的总活性。还使用8-16％ Tris-甘氨酸凝胶(Novex，SanDiego，CA)通过SDS-PAGE电泳分析了活性级分和流过液。通过SDS-PAGE发现，流过液中纯化蛋白质的纯度超过98％。根据NovexMark12 SDS-PAGE分子量标准(Novex，San Diego，CA)，纯化果胶乙酰酯酶的SDS-PAGE揭示了大约40kDal分子量的主带。

使用100mM三醋精(Sigma Chemical公司，St Louis，M0)(溶于20mM Tris-HCl pH8.0)于30℃ 10min测定活性，发现纯化果胶乙酰酯酶也显示对三醋精有活性。使用Boehringer Mannheim醋酸测定试剂盒，依照制造商建议的条件，改用96孔板，测量醋酸释放。实施例16：纯化果胶乙酰酯酶的N末端测序

在Applied Biosystems 476A型蛋白质测序仪(PerkinElmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA)上，使用联机HPLC和液相三氟乙酸(TFA)输送，对如实施例15所述获得的纯化果胶乙酰酯酶进行N末端测序。使用Novex 8-16％ Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，依照制造商建议的条件，对果胶乙酰酯酶制剂进行SDS-PAGE。在10％甲醇(溶于10mM CAPS pH11.0缓冲液)中于25伏2小时，将凝胶转印迹至PVDF膜(Novex，San Diego，CA)。在0.1％考马斯蓝R250(溶于40％甲醇/1％醋酸)中将PVDF膜染色，并切下观察到的条带。使用测序试剂(Perkin Elmer/Applied BiosystemsDivision，Foster City，CA)，将由印迹筒切下的条带测序。使用含3.5％四氢呋喃(溶于水与18ml含醋酸、醋酸钠、和己烷磺酸钠的预混浓缩液(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，FosterCity，CA))的缓冲液A和含乙腈的缓冲液B，通过联机HPLC进行乙内酰苯硫脲-氨基酸的检测。收集数据，并在Macintosh IIsi计算机上使用Applied Biosystems 610数据分析软件进行分析。由操作员通过对光源比较层析图来进行氨基酸鉴定。

40kDa切下条带的N末端测序确定如下：

AEPKVYQFDFGSGSMEPGYIGVRASD(SEQ ID NO.2)

                  生物学材料的保藏

根据布达佩斯条约的条款，下列生物学材料已经保藏于农业研究机构专利培养物收藏中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection)，北方地区研究中心(Northern RegionalResearch Center)，大学街1815号(1815 University Street)，Peoria，伊利诺斯州(Illinois)，61604，并给予下列编号：

      保藏物                编号        保藏日期大肠杆菌MDT28(pCR2.1-yxiM)  NRRL B-30151  1999年6月30日

该菌株已经进行了保藏，在该专利申请的待审期内，保证根据37C.F.R.  §1.14和35 U.S.C.  §122授权的专利和商标委员会所确定的人能够获得该培养物。该保藏物代表了保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本或其后续申请的国家中，可以按照该国专利法的要求提供该保藏物。但是，应当明白保藏物的可获得性并不构成对以侵犯由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。

本文描述和要求的发明不应限制于此处公开的具体实施方案的范围之内，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的例示。任何等同的实施方案意欲属于本发明的范围之内。事实上，对于本领域熟练技术人员而言，除了本文所示和所述以外对本发明的多种更改是显而易见的。这些更改也意欲属于所附权利要求的范围之内。若有抵触，以本公开书(包括定义)为准。

本文引用了多处参考文献，完整收入作为参考。

                           序列表<110>Thomas，Michael D.

 Brown，Kimberly M.<120>具有果胶乙酰酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸<130>5952.204-WO<140>PCT/US00/23521<141>2000-08-25<150>09/384,305<151>1999-08-26<160>25<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1149<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>1atgaaaaaat ggatggcagc ggtttttgtg atgatgctga tgctgtgttt tggcgggatt     60gagaatgtga aggcggcgga gccgaaggtg tatcagtttg actttggaag cggttcgatg    120gagcctggtt atattggtgt cagggcgtct gatcggtatg accggtcaaa gggctacggt    180tttcaaacac cggagaatat gagggatgtg gcggcatccg gggctggtgt gaagagtgat    240gcggttcagt ttttagcgta tgggacgaaa agcaataaca cgtttaatgt tgatctcccg    300aatggccttt atgaggtgaa ggtgacgctt ggcaatacgg caagggccag tgtggcagcg    360gagggcgtgt ttcaggtcat caatatgaca ggggatggcg cggaggatac gttccaaatt    420cccgtcaccg acgggcagct gaatctcctg gtgacagagg gaaaggcagg caccgctttt    480acgctcagcg ccttgaaaat aaagaaattg tctgatcagc cggtaacgaa tcgaaccatt    540tatgtcggcg gcgactcgac ggtgtgcaat tattatccgc tcaacagcag caagcaggcg    600ggctgggggc agatgctgcc tcactatatc gataaacaca cctttcaagt gagaaacatg    660gcgtctggcg ggcagatcgc gagagggttc agaaatgatg gacagcttga ggcgattctg    720aagtatatta aacccggaga ttattttatg ttgcagcttg gcattaatga cacaaatccg    780aagcataaag aatctgaagc ggagtttaaa gaggtgatgc gtgatatgat tcgtcaggta    840aaagcgaaag gagcggacgt catcctatca acgcctcagg gccgggcaac cgattttact    900tctgaaggca tccattcgtc tgtaaacaga tggtacaggg cctctatttt agctttggcc    960gaagaggaaa aaacatatct cattgactta aatgtcctca gctcggcata ctttacatcg    1020atcggtccgg aaagaacact cgggctttat atggatggag atacgctgca cccgaatcgc    1080gcgggggccg acgcactggc gcgattggct gttcaggagc taaaacgcca gggaatcgct    1140ggcttttaa                                                            1149<210>2<211>382<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<400>2Met Lys Lys Trp Met Ala Ala Val Phe Val Met Met Leu Met Leu Cys1            5               10               15Phe Gly Gly Ile Glu Asn Val Lys Ala Ala Glu Pro Lys Val Tyr Gln

      20               25               30Phe Asp Phe Gly Ser Gly Ser Met Glu Pro Gly Tyr Ile Gly Val Arg

   35               40               45Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Ser Lys Gly Tyr Gly Phe Gln Thr Pro50               55               60Glu Asn Met Arg Asp Val Ala Ala Ser Gly Ala Gly Val Lys Ser Asp65               70               75               80Ala Val Gln Phe Leu Ala Tyr Gly Thr Lys Ser Asn Asn Thr Phe Asn

         85               90                95Val Asp Leu Pro Asn Gly Leu Tyr Glu Val Lys Val Thr Leu Gly Asn

      100              105              110Thr Ala Arg Ala Ser Val Ala Ala Glu Gly Val Phe Gln Val Ile Asn

   115              120              125Met Thr Gly Asp Gly Ala Glu Asp Thr Phe Gln Ile Pro Val Thr Asp130              135               140Gly Gln Leu Asn Leu Leu Val Thr Glu Gly Lys Ala Gly Thr Ala Phe145              150              155              160Thr Leu Ser Ala Leu Lys Ile Lys Lys Leu Ser Asp Gln Pro Val Thr

         165              170               175Asn Arg Thr Ile Tyr Val Gly Gly Asp Ser Thr Val Cys Asn Tyr Tyr

      180              185              190Pro Leu Asn Ser Ser Lys Gln Ala Gly Trp Gly Gln Met Leu Pro His

  195               200              205Tyr Ile Asp Lys His Thr Phe Gln Val Arg Asn Met Ala Ser Gly Gly210               215              220Gln Ile Ala Arg Gly Phe Arg Asn Asp Gly Gln Leu Glu Ala Ile Leu225              230              235               240Lys Tyr Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Phe Met Leu Gln Leu Gly Ile Asn

         245              250               255Asp Thr Asn Pro Lys His Lys Glu Ser Glu Ala Glu Phe Lys Glu Val

      260              265              270Met Arg Asp Met Ile Arg Gln Val Lys Ala Lys Gly Ala Asp Val Ile

   275              280              285Leu Ser Thr Pro Gln Gly Arg Ala Thr Asp Phe Thr Ser Glu Gly Ile290              295               300His Ser Ser Val Asn Arg Trp Tyr Arg Ala Ser Ile Leu Ala Leu Ala305              310              315               320Glu Glu Glu Lys Thr Tyr Leu Ile Asp Leu Asn Val Leu Ser Ser Ala

         325              330               335Tyr Phe Thr Ser Ile Gly Pro Glu Arg Thr Leu Gly Leu Tyr Met Asp

      340              345              350Gly Asp Thr Leu His Pro Asn Arg Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Arg

   355              360              365Leu Ala Val Gln Glu Leu Lys Arg Gln Gly Ile Ala Gly Phe

370             375               380<210>3<211>51<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>3cgagctctat aaaaatgagg agggaaccga atgaaaaaat ggatggcagc g            51<210>4<211>29<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>4gcggccgctt aaaagccagc gattccctg                                      29<210>5<211>54<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>5aattggcctt aagggcccgg gacgtcaagc ttatcgatgc ggatccgcgg ccgc          54<210>6<211>51<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>6ccggaattcc cgggccctgc agttcgaata gctacgccta ggcgccggcg c             51<210>7<211>58<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>7agctaggcct taagggcccg ggacgtcgag ctcaagcttg cggccgccat ggtcgacg      58<210>8<211>58<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>8tccggaattc ccgggccctg cagctcgagt tcgaacgccg gcggtaccag ctgcttaa      58<210>9<211>37<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>9ctccgggccc atctgagctc tataaaaatg aggaggg                             37<210>10<211>27<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>10cctcggatcc atacacaaaa aaacgct                                        27<210>11<211>30<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>11gagacccggg agctttcagt gaagtacgtg                            30<210>12<211>19<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>12ggggcgttac aattcaaag                                        19<210>13<211>27<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>13gggccctcga aacgtaagat gaaacct                               27<210>14<211>29<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>14gagctccata atacataatt ttcaaactg                             29<210>15<211>44<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>15ggaataaagg ggggttgaca ttattttact gatatgtata atat            44<210>16<211>48<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>16aataaaatga ctatacatat tatattaaac atattctttt acctcgag        48<210>17<211>17<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>17ggccttaagg gcctgca                                          17<210>18<211>22<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>18tgtcaacccc cctttattcc tt                                             22<210>19<211>28<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>19gagctccatt ttcttataca aattatat                                       28<210>20<211>185<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>20ggccttaagg gcctgcaatc gattgtttga gaaaagaaga agaccataaa aataccttgt     60ctgtcatcag acagggtatt ttttatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaatagga    120ataaaggggg gttgttatta ttttactgat atgtaaaata taatttgtat aagaaaatgg    180agctc                                                      185<210>21<211>185<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>21ggccttaagg gcctgcaatc gattgtttga gaaaagaaga agaccataaa aataccttgt     60ctgtcatcag acagggtatt ttttatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaaaagga    120ataaaggggg gttgacatta ttttactgat atgtataata taatttgtat aagaaaatgg    180agctc                                                      185<210>22<211>185<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>22ggccttaagg gcctgcaatc gattgtttga gaaaagaaga agaccataaa aataccttgt     60ctgtcatcag acagggtatt ttttatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaatagga    120ataaaggggg gttgacatta ttttactgat atgtataata taatttgtat aagaaaatgg    180agctc                                                      185<210>23<211>33<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>23ggccttaagg gcctgctgtc cagactgtcc gct                             33<210>24<211>21<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>24gcggccgcga tttccaatga g                                          21<210>25<211>21<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>25ggtacctgca tttgccagca c                                          21

Claims (43)

1.选自下组的具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽：

(a)具有与SEQ ID NO：2成熟多肽的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由在低严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码的多肽；

(c)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和/或插入的变体；

(d)(a)或(b)的等位基因变体；和

(e)(a)、(b)、或(d)的具有果胶乙酰酯酶活性的片段。

2.权利要求1的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列。

3.权利要求2的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列。

4.权利要求3的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少80％同一性的氨基酸序列。

5.权利要求4的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少90％同一性的氨基酸序列。

6.权利要求5的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列。

7.权利要求1-6任一项的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

8.权利要求1-7任一项的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段构成。

9.权利要求8的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成。

10.权利要求9的多肽，其由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成。

11.权利要求1的多肽，其由在低严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码。

12.权利要求11的多肽，其由在低严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，或(ii)(i)的互补链发生杂交的核酸序列编码。

13.权利要求1的多肽，其由在中严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码。

14.权利要求13的多肽，其由在中严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，或(ii)(i)的互补链发生杂交的核酸序列编码。

15.权利要求1的多肽，其由在高严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码。

16.权利要求15的多肽，其由在高严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，或(ii)(i)的互补链发生杂交的核酸序列编码。

17.权利要求1的多肽，其中所述多肽是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和/或插入的变体。

18.权利要求1的多肽，其由大肠杆菌NRRL B-30151中所含质粒pCR2.1-yxiM所含核酸序列编码。

19.权利要求1-18任一项的多肽，其具有SEQ ID NO：2的果胶乙酰酯酶活性的至少20％。

20.与权利要求1-19任一项的多肽具有相同果胶乙酰酯酶活性的多肽。

21.包含编码权利要求1-20任一项所述多肽的核酸序列的分离核酸序列。

22.包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一处突变的核酸序列的分离核酸序列，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成的多肽。

23.如下产生的分离核酸序列：(a)在低严谨条件下将DNA与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离核酸序列。

24.如下产生的权利要求23的分离核酸序列：(a)在中严谨条件下将DNA与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离核酸序列。

25.如下产生的权利要求24的分离核酸序列：(a)在高严谨条件下将DNA与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离核酸序列。

26.包含权利要求21的核酸序列以及与之可操作连接的在合适表达宿主中指导多肽生成的一种或多种控制序列的核酸构建物。

27.包含权利要求26的核酸构建物的重组表达载体。

28.包含权利要求26的核酸构建物的重组宿主细胞。

29.用于生成突变型核酸序列的方法，包括(a)在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中引入至少一处突变，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成的多肽；并(b)回收突变型核酸序列。

30.由权利要求29的方法产生的突变型核酸序列。

31.用于生成多肽的方法，包括(a)培养包含权利要求30的编码多肽的突变型核酸序列的菌株以产生包含该多肽的上清液；并(b)回收多肽。

32.用于生成权利要求1-20任一项的多肽的方法，包括(a)培养菌株以产生包含多肽的上清液；并(b)回收多肽。

33.用于生成权利要求1-20任一项的多肽的方法，包括(a)在适合于生成多肽的条件下培养包含核酸构建物的宿主细胞，其中核酸构建物包含编码多肽的核酸序列；并(b)回收多肽。

34.用于生成多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一处突变的突变型核酸序列，其中突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸构成的多肽；并(b)回收多肽。

35.用于生成突变型细胞的方法，包括破坏或删除编码权利要求1-20任一项的多肽的核酸序列或其控制序列，导致突变体生成的多肽比亲本细胞少。

36.由权利要求35的方法产生的突变体。

37.权利要求36的突变体，其中还包含编码异源蛋白的核酸序列。

38.用于生成异源多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的条件下培养权利要求37的突变体；并(b)回收多肽。

39.包含编码蛋白质的基因并可操作连接编码信号肽、由SEQ IDNO：1的第1-75位核苷酸构成的核酸序列的核酸构建物，其中所述基因对于该核酸序列而言是外来的。

40.包含权利要求39的核酸构建物的重组表达载体。

41.包含权利要求39的核酸构建物的重组宿主细胞。

42.用于生成蛋白质的方法，包括(a)在适合于蛋白质生成的条件下培养权利要求41的重组宿主细胞；并(b)回收蛋白质。

43.用于降解果胶物质的方法，包括在适合于降解果胶物质的条件下使果胶物质接触有效量的包含合适载体和权利要求1-20任一项的一种或多种多肽的组合物。

Images