JP2023542204A - 細菌非特異的ペルオキシゲナーゼ（ｂｕｐｏ）並びにその方法及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、タンパク質工学及び生体触媒作用の分野に関し、より詳細には、ペルオキシゲナーゼ活性を有する新規ポリペプチド、並びにそれに関連する方法及び使用に関する。メラニン又はメラニン様色素の生成方法であって、色素生成活性を有するポリペプチドの使用を含む方法が提供され、上記ポリペプチドは、（ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ；ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ；ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ；ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；ｖ）ＣＸＸＬ；ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ；ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ；およびｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ；（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個のアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、ポリペプチド；並びに（ｃ）ペルオキシゲナーゼ活性を有する、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片からなる群から選択される。

Description

本発明は、タンパク質工学および生体触媒作用の分野に関する。より詳細には、本発明は、ペルオキシゲナーゼ活性を有する新規ポリペプチド、ならびにそれに関連する方法および使用に関する。

ペルオキシゲナーゼは、過酸化水素のみを使用して、芳香族および脂肪族炭素原子に対するヒドロキシル化およびエポキシ化反応を触媒することができる。これまでに知られている酵素は真菌起源であり、それらは２つのクラスに属する。クラスＩ（短いペルオキシゲナーゼ）酵素は、活性部位に電荷安定剤としてヒスチジンを有する二量体タンパク質（２６ｋＤａ ＭｒｏＵＰＯ／ＣｇｌＵＰＯ）で表される。それらは分子内ジスルフィド結合を含まないが、分子間ジスルフィド結合がモノマーを連結する。クラスＩＩまたは長いペルオキシゲナーゼは、活性部位に電荷安定剤としてアルギニンを有し、分子内ジスルフィド架橋を含む約４４ｋＤａのモノマータンパク質を含む。主な代表例は、ＡａｅＵＰＯおよびＰａｂＵＰＯである（非特許文献１）。その２つのクラスは、それらの活性部位における高度に保存されたモチーフ（クラスＩについては－ＥＨＤ－Ｓ－Ｅ－およびクラスＩＩについては－ＥＧＤ－Ｓ－Ｒ－Ｅ）の存在によって同定され得る。

シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は、モノオキシゲナーゼとして機能する補因子としてヘムを含む酵素のスーパーファミリーである。哺乳動物では、これらのタンパク質はステロイド、脂肪酸、および生体異物を酸化し、様々な化合物のクリアランス、ならびにホルモンの合成および分解に重要である。植物では、これらのタンパク質は、防御化合物、脂肪酸、およびホルモンの生合成に重要である。ＣＹＰ酵素は、動物、植物、真菌、原生生物、細菌および古細菌、ならびにウイルスのすべての生物界で特定されている。しかしながら、それらは遍在するわけではなく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）では見出されていない。５０，０００を超える異なるＣＹＰタンパク質が知られている。

ＣＹＰは、一般に、電子伝達鎖における末端オキシダーゼ酵素であり、Ｐ４５０含有系として広く分類される。「Ｐ４５０」という用語は、還元状態にあり、一酸化炭素と複合体を形成している場合の酵素の吸収極大の波長（４５０ｎｍ）における分光光度ピークに由来する。ほとんどのＣＹＰは、１つ以上の電子を送達して鉄（および最終的に分子状酸素）を還元するために、タンパク質パートナーを必要とする。

Ｐ４５０の顕著な反応性および基材の無秩序性は、長い間化学者の注目を集めてきた。困難な酸化に向けてＰ４５０を使用する可能性を実現するための最近の進歩には、（ｉ）天然の補因子を安価な過酸化物含有分子で置き換えることによってそれらの必要性を排除すること、（ｉｉ）Ｐ４５０と有機溶媒との適合性を探索すること、および（ｉｉｉ）Ｐ４５０の酸化を予測可能に導くための小型の非キラル補助剤の使用が含まれている。

真菌ペルオキシゲナーゼは、多くの反応においてＰ４５０を置換することができる有望な酵素群として浮上した。より良い言い方をすれば、生体触媒変換のためにＰ４５０の代わりにペルオキシゲナーゼが介入し、したがってそのようなプロセスのスケールアップを可能にし得る。Ｐ４５０の使用は、多成分系のために複雑であることが多い。ＢＭ３様Ｐ４５０の場合でさえ、補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび有意な脱共役速度への依存性が依然としてあり、これはさらに酵素不活性化をもたらす（非特許文献２）。

特許文献１は、アグロシベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｅｇｅｒｉｔａ）、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、ラッカリア・ビコロル（Ｌａｃｃａｒｉａ ｂｉｃｏｌｏｒ）およびコプリヌス・ラディアンス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｒａｄｉａｎｓ）由来の８つの異なる真菌ペルオキシゲナーゼを開示している。非特許文献３は、アリールアルコールおよびアルデヒドを酸化することが見出された、寒天担子菌株アグロシベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｅｇｅｒｉｔａ）（ＴＭ－Ａ１株）由来のペルオキシゲナーゼを開示している。特許文献２は、アグロシベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｅｇｅｒｉｔａ）ＴＭ－Ａ１のＡａＰペルオキシゲナーゼ酵素を使用して、ナフタレン、トルエンおよびシクロヘキサン等の非活性化炭化水素を酵素的にヒドロキシル化するための方法を開示している。特許文献３は、アグロシベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｅｇｅｒｉｔａ）ＴＭ－Ａ１のＡａＰペルオキシゲナーゼ酵素を使用することによるアルデヒドの中間体形成を介したアルコールからの酸の酵素的調製のための方法を開示している。

特許文献４は、様々な真菌ペルオキシゲナーゼを使用した、置換または非置換の直鎖または分岐鎖脂肪族炭化水素の２位または３位における酵素的ヒドロキシル化のための方法を開示している。

ペルオキシゲナーゼのタンパク質工学によって解決されるべきいくつかの問題が残っている。これらには、エナンチオ選択性および立体選択性だけでなく、ペルオキシダーゼ活性の防止または低下も含まれる。例えば、一旦ヒドロキシル化されると、芳香族は、生成物としてフェノキシラジカルを生成するペルオキシダーゼ活性のための基材と見なすことができるフェノールを与え、このラジカルは、望ましくないポリマーの形成をもたらす。文献で提案されている解決策は、ラジカルスカベンジャーを添加することであり、文献にはアスコルビン酸がその目的のために使用される多くの例がある。

しかしながら、既存のペルオキシゲナーゼの改善および（工業的）適用のための主な障害は、それらが真菌起源であるという事実である。これは、酵母または真菌の発現系を必要とし、生産および工学的努力を妨げる。細菌起源の２つの異なる種類のヘムペルオキシダーゼ酵素が当技術分野で説明されているが、これらはペルオキシゲナーゼであると疑われている。これらは、両方とも複雑な天然産物の合成に関与する、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）由来のＳｆｍＤ（非特許文献４）およびストレプトミセス・レフイネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ）由来のＯｒｆ１３／ＬｍｂＢ２（非特許文献５）である。ＳｆｍＤはサフラマイシンＡの合成に関与し、Ｏｒｆ１３はアンスラマイシンの生合成経路に関与する。

しかしながら、二次代謝産物の合成に関与する酵素は、幾分特有の基材使用を有し、ペルオキシゲナーゼ型の反応のための広範囲の生体触媒としての適用が制限されることが判明した。

ＷＯ２００８／１１９７８０ ＷＯ２００６／０３４７０２ ＤＥ１０３３２０６５Ａ１ ＷＯ２０１１／１２０９３８

Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３７，２０１７，ｐｐ．１－９ Ｈｏｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ２０１６，１７，１３９１ Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（８）：４５７５－４５８１ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８７，２０１２，ｐｐ．５１１２－５１２１ Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１１，５０，８９２６－８９３６

したがって、本発明者らは、非真菌起源であり、高い基材の無秩序性を有する、すなわち多様な組の（商業的に関連する）基材に対してペルオキシゲナーゼ活性を示す新規酵素を特定することに着手した。理想的には、酵素は、非真菌宿主細胞において高レベルで発現され得る。さらに、本発明者らは、組換え微生物宿主細胞を使用してメラニン型色素を生成するための酵素および方法を提供すること、例えば、生物の天然のメラニン形成能を高めること、または新規のメラニン生成（細菌）株を作製することを目的とした。

これらの目標の少なくともいくつかは、工業的使用のための目的の様々な反応に適用可能であることが判明した一組の新規な細菌不特定型ペルオキシゲナーゼ（ＢＵＰＯ）の特定によって満たされた。新規ＢＵＰＯの１つのサブファミリーはＯｒｆ１３／ＬｍｂＢ２といくらかの配列類似性を示したが、第２のサブファミリーはＳｆｍＤといくらかの配列類似性を示した。しかしながら、注目すべきことに、新規ＢＵＰＯは、既知の酵素と比較して異なる触媒特性を有することが見出された。これらは、置換または非置換の直鎖または分枝鎖の脂肪族または芳香族基材のヒドロキシル化または酸化を包含する。特に、本発明者らは、細菌宿主細胞中で発現させた場合に、暗色のメラニン型色素を生成する能力を有するＢＵＰＯを特定した。ＢＵＰＯの他の有用な新規用途には、任意選択で置換されたアルキルスルフィド、アリールスルフィドまたはアリールアルキルスルフィド基材のエナンチオ選択的スルホキシド化、置換または非置換のインジゴ染料の製造、および第一級アルコールの酸化が含まれる。

したがって、一態様において、本発明は、メラニンおよび／またはメラニン様色素の（バイオテクノロジー的）生成方法であって、
（ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個、好ましくは少なくとも２５０個、より好ましくは少なくとも２７０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個、好ましくは１８０個、より好ましくは２２０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有し、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）色素生成活性を有する、（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるポリペプチドの使用を含む方法に関する。

「メラニン又はメラニン様色素」という用語は、自然界で広く見られ、フェノール又はインドール基材の酵素触媒酸化の生成物であるポリマー性の褐色黒色色素の群を包含することを意味する。特に、ユーメラニン、フェオメラニン、アロメラニンおよびピオメラニンが含まれる。

「色素生成活性」という用語は、本明細書で使用される場合、その前駆体からの１つまたは複数のメラニン又はメラニン様色素の形成を触媒する能力を指す。

特定の態様において、方法は、Ｌ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへのヒドロキシル化およびその後のドーパクロムへの酸化、ならびにメラニンまたはメラニン様色素の形成を含む。代替または追加の基材には、Ｌ－システインおよびＮ－（ヒドロキシフェニル）グリシンが含まれる。

本発明はまた、置換または非置換の直鎖または分枝鎖の脂肪族または芳香族基材のヒドロキシル化または酸化のための方法であって、基材を、ペルオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドおよび過酸化水素源と接触させることを含み、上記ポリペプチドは、本明細書で上に定義される（ａ）および（ｂ）のポリペプチド、または所望のペルオキシゲナーゼ活性を有する（ａ）もしくは（ｂ）のポリペプチドの断片から選択される方法に関する。

本明細書で使用される「ペルオキシゲナーゼ活性を有する」という用語は、以下の反応Ｓ＋Ｈ_２Ｏ_２→ＳＯ＋Ｈ_２Ｏを触媒する能力を指し、Ｓはヒドロキシル化される基材である。例えば、ＳがＲＨとして示される場合、触媒される反応は、ＲＨ＋Ｈ_２Ｏ_２→ＲＯＨ＋Ｈ_２Ｏである。

好ましくは、方法は、
任意選択で置換されたアルキルスルフィド、アリールスルフィドまたはアリールアルキルスルフィド基材のエナンチオ選択的スルホキシド化；
置換または非置換インドール基材を過酸化水素源およびポリペプチドと接触させることによる置換または非置換インジゴ染料の製造；
第一級アルコールの酸化
の１つまたは複数を含む。

発明の詳細な説明
「ペアワイズ配列同一性パーセンテージ」という用語は、一般に、２つのタンパク質配列がアラインメントされた場合、２つのアラインメントされた配列においてすべての位置にわたって同じアミノ酸を有するアミノ酸残基位置間の係数を意味する。本明細書に開示されるアミノ酸配列に関するパーセント（％）配列同一性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、参照配列、すなわち本開示のタンパク質分子または断片中のアミノ酸残基と対として同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、フリーエンドギャップ法によるグローバルアラインメント、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用してアラインメントした場合のペアワイズ配列同一性等の公開されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、ａ－またはβ－アミノカルボン酸を指す。タンパク質またはペプチドに関連して使用される場合、「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的には、その技術分野で認識されている定義を有するα－アミノカルボン酸、例えば、Ｌ－アラニン（ＡｌａまたはＡ）；Ｌ－アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；Ｌ－アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；Ｌ－アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；Ｌ－システイン（ＣｙｓまたはＣ）；Ｌ－グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；Ｌ－グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；Ｌ－ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；Ｌ－イソロイシン（ＩＬＥまたはＩ）：Ｌ－ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；Ｌ－リジン（ＬｙｓまたはＫ）；Ｌ－メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；Ｌ－フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；Ｌ－プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；Ｌ－セリン（ＳｅｒまたはＳ）；Ｌ－トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；Ｌ－トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；Ｌ－チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびＬ－バリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、修飾アミノ酸、合成アミノ酸または希少アミノ酸、例えばタウリン、オルニチン、セレノシステイン、ホモシスチン、ヒドロキシプロリン、チオプロリン、ヨードチロシン、３－ニトロチロシン、オルニチン、シトルリン、カナバニン、５－ヒドロキシトリプトファン、カルノシン、シクロロイシン、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｎ－アセチルシステイン、プロリノ１、アリルグリシンまたはアセチジン－２－カルボン酸が所望に応じて使用されてもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負に帯電した側鎖（例えば、Ａｓｐ、ＧＩｕ）；正に帯電した側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を有するものとして分類され得る。

「断片」は、本明細書で使用される場合、親タンパク質の一部を指し、その部分はペルオキシゲナーゼ活性を有する。そのような断片は、親タンパク質の連続アミノ酸を含み得る。「断片」はまた、親タンパク質の断片が一緒に融合されているタンパク質を指し得る。断片はまた、親タンパク質と比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸挿入等の修飾を含み得る。

本発明の方法は、当技術分野において開示または示唆されていない。

ＵＳ７，２９１，４９０は、ベンゾジアゼピンの生合成に関与する細菌酵素に関する。本発明の配列番号１６の代表的なＢＵＰＯに対するいくらかの配列類似性を示す開示された酵素の１つ（ＵＮＫＶまたはＯＲＦ１３；配列番号２６と呼ばれる）。ＯＲＦ１３は、チロシン３－ヒドロキシラーゼ活性を有することが実証されており、チロシンをＬ－ＤＯＰＡに変換するために使用される。ＷＯ０２／１０１０５１もまたこの酵素を開示しており、この酵素がいくつかの他の酵素が関与する反応のカスケードの第１段階でＬ－チロシンをＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンにヒドロキシル化する能力を有し、リンコマイシンまたはアンスラマイシンの形成をもたらすことを示唆している。しかしながら、メラニン型色素の生成、または本発明の他のヒドロキシル化／酸化反応のいずれかにおいてＯＲＦ１３酵素を使用することは教示も示唆もされていない。

Ｍａｒｔｉｎｅｚら（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｅｎｇ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１９，Ｖｏｌ．７，Ａｒｔ．２８５）は、組換えメラニン生成微生物の作製に向けて行われたアプローチおよびそれに関連する生成プロセスの要約および考察を提供している。主にチロシナーゼおよびラッカーゼであるメラニン形成酵素が参照されているが、両方とも銅含有酵素である。しかしながら、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のチロシナーゼを含むいくつかのチロシナーゼは、銅挿入のためのシャペロンを必要とする。酵素４－ヒドロキシフェニル酢酸（４－ＨＰＡ）ヒドロキシラーゼは、種々の一価および二価フェノールをヒドロキシル化し得る二成分フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存性モノオキシゲナーゼであり、したがってメラニン形成活性を示すことができる。重要なことに、引用技術は、本発明に開示されるようなヘム含有メラニン形成酵素について触れていない。さらにより驚くべきことに、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）で観察されたメラニン形成活性は、当技術分野ではチロシナーゼのみに起因する（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ．２００５ Ｏｃｔ；３８（５）：３２０－６；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１５ Ａｐｒ；３６２（８））が、本発明者らは、最も強力な色素生成酵素の一つとして配列番号１５のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）酵素を特定した。したがって、チロシナーゼおよびラッカーゼはメラニン生成のための微生物の天然のツールと見なすことができるが、本発明者らは、チロシン－ヒドロキシラーゼのような二次代謝経路からの、または本明細書においてＢＵＰＯと呼ばれる厳密に調節された酵素のいくつかが、異種宿主で発現された場合に効率的なメラニン生成を促進し得ることを初めて実証した。

ＵｎｉＰｒｏｔエントリＡ０Ａ３Ｎ４ＵＮＣ０は、Ｐ．パシフィカ（Ｐ．ｐａｃｉｆｉｃａ）のゲノムＤＮＡから得られたアミノ酸配列を開示している。この配列は仮想タンパク質と呼ばれる。これは本発明の配列番号１２の代表的なＢＵＰＯと１００％の配列同一性を有するが、この開示は、タンパク質が実際に生成可能であり、技術的機能を有することを教示または示唆していない。したがって、当技術分野は、本発明で実証されるようなヒドロキシル化または酸化方法におけるタンパク質の使用について触れていない。

一実施形態において、本発明の方法は、配列番号１６（表１を参照されたい）の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含む、「ＬｍｂＢ２型」または「ＩＩ型」ポリペプチドの使用を含む。

好ましくは、少なくともモチーフｉ）およびｖｉ）が存在する。

ＩＩ型酵素は、高度に活性で汎用性のあるペルオキシゲナーゼ活性を有することが判明した。保存されていると思われるモチーフを含む、本発明の例示的なＩＩ型酵素のアラインメントについては、図１を参照されたい。

本発明の例示的なポリペプチドは、以下のモチーフ：
ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶの少なくとも３つ、好ましくは４つ、より好ましくは５つ、さらにより好ましくは少なくとも６つを含む。

例えば、モチーフＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；およびＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶを含むポリペプチドが提供される。

さらに、（ａ）のポリペプチドは、以下のモチーフ：
ａ．ＬＷＲＡＭ
ｂ．ＥＤＬ［ＹＦ］ＤＮ［ＦＹ］［ＦＹ］、好ましくはＥＤＬＹＤＮＦＦ
の一方または両方をさらに含み得る。

本発明で使用するためのＩＩ型酵素は、表１に示される配列（配列番号１６、１５、１７もしくは１８；グループＩＩの酵素）のいずれか１つと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のペアワイズ配列を有するアミノ酸配列、またはペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含むか、またはそれからなり得る。一態様において、ＩＩ型酵素は、配列番号１６の少なくとも２００個、好ましくは少なくとも２５０個、より好ましくは少なくとも２８０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のペアワイズ配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

一態様において、酵素は、配列番号１６のＡｒｇ１１５、Ｍｅｔ１１８、Ｐｈｅ１２５、Ｓｅｒ１２６、Ｌｅｕ１８０、Ｔｙｒ２００およびＰｈｅ２０４に対応する残基の１つまたは複数を含有するが、これは、これらの残基が組換え発現および／または触媒活性、特にメラニン生成にとって重要であることが判明したためである。例えば、酵素は、配列番号１６のＰｈｅ１２５、Ｓｅｒ１２６、Ｌｅｕ１８０、Ｔｙｒ２００及びＰｈｅ２０４に対応する残基のうちの１つまたは複数を含む。１つの特定の態様において、少なくともＴｙｒ２００が、好ましくはＡｒｇ１１５、Ｍｅｔ１１８、Ｐｈｅ１２５、Ｓｅｒ１２６、Ｌｅｕ１８０およびＰｈｅ２０４の１つまたは複数と組み合わせて存在する。別の実施形態において、少なくともＡｒｇ１１５および／もしくはＬｅｕ１８０が存在し、またはＬｙｓ１１５、Ｖａｌ１８０もしくはＩｌｅ１８０等の同様の残基が存在する。

配列番号１６の５０、５３および／または１１０位におけるＴｒｐ残基は、別の「嵩高い」残基、例えばＰｈｅ、ＴｙｒまたはＡｒｇで置き換えられてもよい。

１つの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５～１８のいずれか１つ、好ましくは配列番号１６に従う酵素、または、所望のペルオキシゲナーゼ／色素生成活性を有するその断片である。

別の実施形態において、本発明は、配列番号１２の少なくとも１５０個のアミノ酸残基に、好ましくは配列番号１２の残基ロイシン１５６から出発してアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有し、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含むアミノ酸配列を含む「ＳｆｍＤ型」または「Ｉ型」ポリペプチドを含む。

本発明の例示的なＩ型酵素のアラインメントについては、図２を参照されたい。

ＨＸＸＸＣモチーフは、酵素へのヘム取り込みに関連する。一実施形態において、Ｉ型酵素は、モチーフＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、好ましくはＨＡＲＶＣを含む。

Ｉ型ポリペプチドは、好ましくは、以下の残基／モチーフ：
ｉ）ＤＸＸＦＸＸＸＲ；好ましくはＤ［ＬＥＡＦＤＳＲＨＴ］［ＡＧＦＨＹ］Ｆ［ＧＮＣＬＲ］［ＩＡＶ］［ＶＥＬＫＩＲＳＤ］Ｒ、より好ましくはＤＳＹＦＬＶＥＲ；
ｉｉ）Ｒ［ＷＲ］ＸＸ［ＧＱ］ＨＸＸＦ；好ましくはＲ［ＷＲ］［ＶＩＲＭＫＨ］［ＲＹＣＬＶＱＫ］［ＧＱ］－Ｈ［ＨＬＹＱＲ］［ＶＬＩＡＳ］Ｆ、より好ましくはＲＷＫＱＱＨＱＬＦ；
ｉｉｉ）ＹＸＸＸＸＲ［ＰＶ］；好ましくはＹ［Ｎ／Ｔ／Ｑ／Ｖ／Ｅ／Ａ／Ｈ／Ｄ／Ｒ／Ｑ］［Ｅ／Ｔ／Ｄ／Ｓ／Ｑ／Ａ］－［Ｑ／Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ａ／Ｉ／Ｇ／Ｆ／Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｎ］［ＩＶ］ＲＰ、より好ましくはＹＥＳＲＩＲＰ；
ｉｖ）Ｈ２３２；
ｖ）［ＬＭ］２８１；好ましくはＬ２８１
（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、番号付けは、配列番号１２のアミノ酸配列に対応する）の１つまたは複数をさらに含む。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、および少なくとも上に定義されたモチーフｉ）を含む。例えば、それは、少なくともモチーフｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）、またはモチーフｉ）およびｉｉ）、またはモチーフｉ）およびｉｉｉ）を含む。例示的な酵素には、配列番号２～１３、および１９～２２（表２を参照されたい）を有するものが含まれる。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、ならびに少なくともモチーフｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）および／またはｖ）、例えば少なくともモチーフｉｉ）およびｉｉｉ）、またはモチーフｉｉｉ）およびｉｖ）、またはモチーフｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）を含む。好ましい実施形態において、少なくともモチーフＨＸＸＸＣおよびＨ２３２（モチーフｉｖ）が存在する。特定の態様において、ポリペプチドはモチーフｉ）を含まない。例示的な酵素には、配列番号２３～２９を有するものが含まれる。

一実施形態において、Ｉ型ポリペプチドは、好ましくは、残基／モチーフ：
ｉ）ＤＸＸＦＸＸＸＲ；好ましくはＤ［ＬＥＡＦＤＳＲＨＴ］［ＡＧＦＨＹ］Ｆ［ＧＮＣＬＲ］［ＩＡＶ］［ＶＥＬＫＩＲＳＤ］Ｒ、より好ましくはＤＳＹＦＬＶＥＲ；
ｉｉ）Ｒ［ＷＲ］ＸＸ［ＧＱ］ＨＸＸＦ；好ましくはＲ［ＷＲ］［ＶＩＲＭＫＨ］［ＲＹＣＬＶＱＫ］［ＧＱ］－Ｈ［ＨＬＹＱＲ］［ＶＬＩＡＳ］Ｆ、より好ましくはＲＷＫＱＱＨＱＬＦ；
ｉｉｉ）ＹＸＸＸＸＲ［ＰＶ］；好ましくはＹ［Ｎ／Ｔ／Ｑ／Ｖ／Ｅ／Ａ／Ｈ／Ｄ／Ｒ／Ｑ］［Ｅ／Ｔ／Ｄ／Ｓ／Ｑ／Ａ］－［Ｑ／Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ａ／Ｉ／Ｇ／Ｆ／Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｎ］［ＩＶ］ＲＰ、より好ましくはＹＥＳＲＩＲＰ；
ｉｖ）Ｈ２３２；および
ｖ）［ＬＭ］２８１
を含む。

Ｉ型ポリペプチドは、配列番号２～１３および１９～２９（Ｉ型酵素）のいずれか１つと少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のペアワイズ配列同一性を有するアミノ酸配列、またはペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含み得るか、またはそれからなり得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２～７、１０～１３、１９～２１、および２３～２９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％または９９％のペアワイズ配列同一性を示す。

例示的な酵素は、配列番号２～１３および１９～２９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１２に従う配列を有するポリペプチド、またはペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含む。好ましいＩ型酵素は、配列２、３、４、７、８、１１、１２、１３、２０、２１および２８のいずれか１つ、またはペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含むか、またはそれからなるものを含む。

本発明によるポリペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸配列またはタンパク質タグを（遺伝子融合によって）含み得る。一実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端タグを含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ末端タグを含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端タグおよびＣ末端タグの両方を含む。追加のタグ配列は、ポリペプチドの発現収率、折り畳み、可溶化、精製および／または固定化を補助し得る。そのような配列は、当技術分野で周知である。例示的な融合タグには、マルトース結合タンパク質、Ｎ利用物質Ａ（ＮｕｓＡ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、チオレドキシン、およびセルロース結合ドメイン、短いペプチドタグ、例えばオリゴヒスチジン（６×Ｈｉｓ；Ｈｉｓタグ）、オリゴリジン、Ｓ－ペプチド、およびＦＬＡＧペプチド等が含まれる。例示的な溶解性タグには、ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）またはＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）が含まれる。特定の態様において、酵素は、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含む。代替として、または追加的に、ＳＵＭＯタグが設けられる。

タグ配列は、ペルオキシゲナーゼ反応を触媒するために適用する前に、ポリペプチドから（タンパク質分解的に）除去され得る。例えば、ＳＵＭＯ融合タンパク質は、ＳＵＭＯ特異的プロテアーゼ、例えばＵｌｐ１を使用してＳＵＭＯ部分を除去するために切断され得る。

本発明はまた、本発明による１つまたは複数のポリペプチドを含む組成物に関する。例えば、組成物は、本発明の組換え発現酵素を含む全細胞、透過処理細胞、細胞抽出物または無細胞抽出物を含む。好ましい態様において、組成物は、異種酵素として本発明の１つまたは複数のポリペプチドを発現する細菌宿主細胞を含む細菌細胞培養物である。別の実施形態において、組成物は、可溶性または固定化形態の酵素を含む。組成物は、１つまたは複数のペルオキシゲナーゼ、１つまたは複数の基材、Ｈ_２Ｏ_２源、および／または生成物を含む反応混合物であってもよい。

本発明によるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも開示される。ポリヌクレオチドは、核酸コンストラクトまたは発現ベクターに含まれてもよく、好ましくは、ポリヌクレオチドは、発現宿主におけるポリペプチドの生成を指示する１つまたは複数の制御配列に動作可能に連結されている。例示的な発現ベクターは、当技術分野で公知である。ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞、トランスフェクトされた細胞、形質導入された細胞等の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。一実施形態において、ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターである。例えば、ポリペプチドは、ｐＥＴ系（ＩＰＴＧ誘導性）ベクターまたはｐＢＡＤ系（アラビノース誘導性）ベクターを用いて発現され得る。

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであってもよい。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、突然変異プロモータ、切断プロモータおよびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよく、宿主細胞と相同または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダであってもよい。リーダは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５´末端に動作可能に連結されている。宿主細胞において機能的である任意のリーダが使用され得る。制御配列はまた、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される転写ターミネータであってもよい。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３´末端に動作可能に連結されている。本発明では、宿主細胞内で機能する任意のターミネータが使用され得る。細菌宿主細胞のための好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ｛ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ－アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。制御配列はまた、プロモータの下流および遺伝子の発現を増加させる遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域であってもよい。適切なｍＲＮＡ安定剤領域の例は、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙｌｌｌＡ遺伝子および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子から得られる。

本発明のさらなる実施形態は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。一態様において、コード核酸配列は、発現ベクターの一部である。別の実施形態において、コード核酸配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。例えば、ゲノム編集法、相同組換え、およびＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系が関与する方法を含む当技術分野で公知の方法によって、コード遺伝子を宿主生物のゲノムに組み込むことが可能である。

宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え生成に有用な任意の細胞、例えば原核生物または真核生物であってもよい。

原核生物宿主細胞は、任意のグラム陽性またはグラム陰性細菌であってもよい。グラム陽性細菌には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。グラム陰性細菌には、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が含まれる。

特定の態様において、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。ｐＥＴ系ベクターでの発現には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ４１／Ｃ４３または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＡＩ株が使用され得るが、ｐＢＡＤ系ベクターには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ１０ｂｅｔａ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＡＩおよび他の標準株が使用される。

宿主細胞は、遺伝子操作、タンパク質分泌、タンパク質安定性および／またはペルオキシゲナーゼ酵素の発現もしくは分泌に望ましい他の特性を改善する特徴を有するように遺伝子改変されてもよい。例えば、宿主細胞は、本発明のポリペプチドに融合したタグ配列を除去することができる酵素を含有するように改変されてもよい。例えば、宿主細胞は、目的のＳＵＭＯおよびＨｉｓタグ付きペルオキシゲナーゼだけでなく、ＳＵＭＯタグ付きＵｌｐ１プロテアーゼもコードするベクターを含む。これらの２つのタンパク質の同時発現は、ＳＵＭＯタグからの目的の酵素のインビボ切断をもたらすが、依然としてニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって可溶性細胞溶解物から精製することができる形態の目的の酵素を残す。

また、（ａ）ポリペプチドの生成を助長する条件下で上記宿主細胞を培養すること、および（ｂ）ポリペプチドを回収することを含む、ペルオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法も提供される。

本発明の宿主を成長させるのに適した培地は、当技術分野で周知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）を参照されたい。一般に、適切な培地は、宿主系の増殖のための全ての必須栄養素を含有する。培地には、宿主－ベクター系のために選択される抗生物質が補充され得る。

発現されたポリペプチドは、本発明の酵素を含む全細胞、透過処理細胞、細胞抽出物または無細胞抽出物の形態で使用され得る。別の実施形態において、酵素は、可溶性または固定化形態で使用される。発現された酵素は、当該分野で公知の方法を使用して細胞から回収され得る。任意選択で、タンパク質は、当技術分野で周知の方法を使用して濃縮（例えば精製または部分的に精製）され得る。例えば、ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、固相結合、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除クロマトグラフィー）および／もしくは濾過、または沈殿を含む従来の手順により単離され得る。タンパク質リフォールディングステップは、所望に応じて、成熟タンパク質の構成を完成させる際に使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップで使用することができる。

本発明はまた、目的の基材のヒドロキシル化または酸化のための方法であって、基材を過酸化水素源およびペルオキシゲナーゼ活性を有する本発明によるポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。好ましくは、基材は、炭化水素基材、より好ましくは置換または非置換の直鎖または分岐の脂肪族または芳香族基材である。

ペルオキシゲナーゼによって必要とされる過酸化水素は、過酸化水素の水溶液または過酸化水素のその場製造のための過酸化水素前駆体として提供され得る。ペルオキシゲナーゼによって使用可能である過酸化物を溶解時に遊離する任意の固体エンティティは、過酸化水素の供給源として機能し得る。水または適切な水性媒体に溶解すると過酸化水素を生じる化合物には、金属過酸化物、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、ペルオキシ酸、アルキルペルオキシド、アシルペルオキシド、ペルオキシエステル、過酸化尿素、過ホウ酸塩およびペルオキシカルボン酸またはその塩が含まれる。

別の過酸化水素源は、オキシダーゼの基材と一緒のオキシダーゼ等の過酸化水素生成酵素系である。オキシダーゼおよび基材の組み合わせの例には、アミノ酸オキシダーゼ（例えばＵＳ６，２４８，５７５を参照されたい）および適切なアミノ酸、グルコースオキシダーゼ（例えばＷＯ９５／２９９９６を参照されたい）およびグルコース、乳酸オキシダーゼおよび乳酸塩、ガラクトースオキシダーゼ（例えばＷＯ００／５０６０６を参照されたい）およびガラクトース、ギ酸オキシダーゼおよびギ酸塩（Ｗｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．；２０２０，ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ Ｖｏｌｕｍｅ１２，Ｉｓｓｕｅ１０，ｐｐ．２７１３－２７１６）ならびにアルドースオキシダーゼ（例えばＷＯ９９／３１９９０を参照されたい）および適切なアルドースが含まれるが、これらに限定されない。

過酸化水素または過酸化水素源は、本発明の方法の開始時またはその間に、例えば過酸化水素の１回もしくは複数回の別個の添加として、または連続的な流加添加として添加され得る。過酸化水素の典型的な量は、０．００１ｍＭ～２５ｍＭのレベル、好ましくは０．００５ｍＭ～５ｍＭのレベル、特に０．０１～１ｍＭまたは０．０２～２ｍＭの過酸化水素のレベルに対応する。過酸化水素はまた、０．１ｍＭ～２５ｍＭのレベル、好ましくは０．５ｍＭ～１５ｍＭのレベル、より好ましくは１ｍＭ～１０ｍＭのレベル、最も好ましくは２ｍＭ～８ｍＭの過酸化水素のレベルに対応する量で使用され得る。本発明の方法は、固定化ペルオキシゲナーゼを用いて実行され得る。

ここで、本発明はまた、触媒としての、好ましくはペルオキシゲナーゼまたはメラニン型色素生成反応の触媒としての、本発明によるポリペプチドの使用に関する。

本発明の方法は、水性溶媒または緩衝系（反応媒体）中で実行され得る。適切な緩衝系は、当業者によって容易に認識され、Ｋ－ホスフェート（Ｋ－Ｐｉ）緩衝液を含む。

本発明による方法は、０～９０℃、好ましくは５～８０℃、より好ましくは１０～７０℃、さらにより好ましくは１５～６０℃、最も好ましくは２０～５０℃、特に２０～４０℃の温度で実行され得る。本発明の方法は、１０秒～（少なくとも）２４時間、好ましくは１分～（少なくとも）１２時間、より好ましくは５分～（少なくとも）６時間、最も好ましくは５分～（少なくとも）３時間、特に５分～（少なくとも）１時間の処理時間を採用し得る。

一実施形態において、本発明は、目的の基材のヒドロキシル化のための方法を提供する。例えば、本明細書に開示されるペルオキシゲナーゼは、置換フェノールまたはフェノール酸のヒドロキシル化を触媒するために好適に使用される。特定の態様において、配列番号７、１５、１６、１７もしくは１８の酵素、またはその活性断片が使用される。

驚くべきことに、本発明のペルオキシゲナーゼは、Ｌ－ＤＯＰＡおよびメラニンの合成に好適に使用されることが見出された。Ｌ－ＤＯＰＡは、レボドパまたはＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンとしても公知であり、ヒトならびに一部の動物および植物の通常の生物学の一部として作製および使用されるアミノ酸である。ヒト、ならびにそれらの生物学においてＬ－ＤＯＰＡを利用する他の動物の一部は、アミノ酸Ｌ－チロシンからの生合成を介してそれを作製する。Ｌ－ＤＯＰＡは、集合的にカテコールアミンとして知られている神経伝達物質ドーパミン、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）およびエピネフリン（アドレナリン）の前駆体である。さらに、Ｌ－ＤＯＰＡ自体は、脳およびＣＮＳによる神経栄養因子放出を媒介する。純粋な形態のＬ－ＤＯＰＡは、一般名「レボドパ」で精神賦活薬として販売されている。薬物としては、パーキンソン病およびドーパミン応答性ジストニアの臨床治療に使用される。

したがって、特定の態様において、本発明は、Ｌ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへのヒドロキシル化のための方法であって、任意選択でドーパクロムへの酸化およびメラニンの形成をさらに含む方法を提供する。この反応にとって特に興味深いのは、配列番号２、８、１１、１２、１３、１６、１７もしくは２０、好ましくは１２もしくは１６のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、または所望のＬ－Ｔｙｒヒドロキシル化活性を有するその断片を含むか、またはそれからなるポリペプチドである。ここで、本発明は、Ｌ－ＤＯＰＡの生物工学的生成のための方法を提供する。

メラニンは、紫外線の有害な影響から人体を保護する上で重要な役割を果たす。メラニンはまた、医学および美容学における重要な因子である。メラニンは、皮膚組織において形成または合成されることが知られている。過剰量のメラニンは皮膚を暗くし、メラニンの不均一な分布は肝斑およびそばかすを引き起こし、両方とも皮膚障害である。メラニンの生合成経路は、チロシンのＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）への触媒ヒドロキシル化およびＬ－ＤＯＰＡのドーパクロムへの変換を含む。

特定の態様において、本発明は、メラニンまたはメラニン様色素の生成方法を提供する。この反応にとって特に興味深いのは、配列番号２、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８および２０、好ましくは配列番号１５、１６もしくは１７のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、または所望の色素生成活性を有するその断片を含むか、またはそれからなるポリペプチドである。ここで、本発明は、メラニンおよび／またはメラニン関連の褐色または黒色色素の生物工学的生成のための方法を提供する。

遺伝子工学技術の適用により、微生物宿主細胞におけるメラニン形成に関与する本発明によるＢＵＰＯをコードする１つまたは複数の遺伝子を過剰発現させることが可能である。これにより、メラニン形成性生物の生産性の改善、ならびに多様な種類のメラニンを生成することができる新規な組換え微生物株の作製が可能になる。さらに、メラニン形成前駆体の供給に関連する経路を改変することによる微生物宿主の代謝工学は、グラムスケールの単純な炭素源からメラニンの全合成を行う能力を株に提供することができる。

一実施形態では、本発明は、メラニンまたはメラニン様色素の発酵生成のための方法であって、
ｉ）異種ポリペプチドとして色素生成活性を有するＢＵＰＯを発現する微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｉｉ）宿主細胞を培養培地中で培養し、メラニン又はメラニン様色素の生成を可能にするステップ；および
ｉｉｉ）メラニンまたはメラニン様色素を単離するステップを含む方法を提供する。

例えば、ポリペプチドは、異種酵素、ｐＥＴ系ベクターまたはｐＢＡＤ系ベクターとして発現され得る。一実施形態において、ｐＥＴ系ベクターが使用される。

メラニンの発酵生成に使用するための好ましいＢＵＰＯは、配列番号２、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８および２０、好ましくは配列番号１５、１６もしくは１７の少なくとも６０％、または少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％の、好ましくは少なくともペアワイズ配列同一性を有するもの、または所望の色素生成活性を有するその断片である。例えば、Ｌｅｕ１８０及びＡｒｇ１１５に対応する残基がメラニン生成に重要であることが判明した。特定の態様において、これは配列番号１６のポリペプチド、または色素生成活性を示すその変異体、例えばＴｒｐ５０および／またはＴｒｐ５３がＡｒｇまたはＰｈｅ等の「嵩高い」残基に変化した突然変異体である。

宿主細胞は、細菌、酵母または真菌宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。これらの生物でメラニンを得るためのプロセスは、生産性に良い影響を与える培養条件および培地成分を特定することを目的とした実験的最適化方法を含み得る。例えば、温度、ｐＨ、酸素およびメラニン前駆体濃度等の培養パラメータが生産性に寄与することが判明している。色素生産との正の相関は、培地中のＬ－チロシンまたはそれを含有する成分の濃度を増加させることによって観察することができる。したがって、本発明の方法は、少なくとも１つのメラニン前駆体、好ましくはＬ－チロシンが補充された培養培地を使用することを含み得る。しかしながら、ほとんどの場合、典型的な培養培地には、酵母抽出物またはタンパク質加水分解物、例えばトリプトンが含まれる。したがって、メラニン形成プロセス中に、Ｌ－チロシンに加えていくつかの培地成分をポリマー色素に組み込み、純粋なユーメラニンではない色素を得ることができる。

したがって、宿主細胞は、より高純度のおよび／または精製がより容易なメラニンを生成するために、炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含む規定培地中で増殖させることができる。さらに、そのような培地に、チロシン等のメラニン前駆体を補充してユーメラニンを生成することができ、または前駆体、例えばチロシン、システインおよび／もしくはＮ－ヒドロキシフェニルグリシンの混合物を補充して、異なる特徴を有するメラニンを生成することができる。

例えば低ｐＨ沈殿またはクロマトグラフィー法を使用して、微生物細胞培養物からメラニン型色素を単離または精製するための、当技術分野で公知の様々な方法がある。

したがって、さらなる実施形態において、本発明は、メラニンまたはメラニン様色素を生成するための細菌酵素の使用を提供し、上記酵素は、
（ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有し、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）色素生成活性を有する、（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるポリペプチドの使用を含む方法に関する。

特に、本発明は、酵素の使用を提供し、上記細菌酵素は、全細胞、好ましくは異種酵素として上記酵素を発現する組換え微生物細胞に含まれる。

別の態様において、本発明は、第一級アルコールの酸化、好ましくはベラトリルアルコールのベラトリルアルデヒドへの酸化に関する。この反応にとって特に興味深いのは、配列番号１２、１５、１６、１７もしくは１８のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、または所望のアルコール酸化活性を有するその断片を含むか、またはそれからなるポリペプチドである。

さらに別の態様において、本発明は、スルホキシド化を触媒するポリペプチドに関する。任意選択で置換されたアルキルスルフィド、アリールスルフィドまたはアリールアルキルスルフィド基材のエナンチオ選択的スルホキシド化のための方法であって、基材を過酸化水素源および所望のスルホキシド化活性を有する本発明によるポリペプチドと接触させることを含む方法が提供される。例えば、基材は、メチルフェニルスルフィド、ベンジルフェニルスルフィド、アリルフェニルスルフィド、ベンジルメチルスルフィド、Ｎ－ブチルメチルスルフィド、エチルフェニルスルフィドおよびイソプロピルフェニルスルフィドからなる群から選択される。スルホキシド化のために特に興味深い酵素には、配列番号４、１５、１６、１７もしくは１８のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を示すもの、または所望の（チオアニソール）スルホキシド化活性を有するその断片が含まれる。

本発明はまた、置換または非置換インドールを過酸化水素源および本発明によるポリペプチドと接触させることを含む、置換または非置換インジゴ染料を調製するための方法を提供する。この反応にとって特に興味深いのは、本明細書に開示される任意のＩＩ型酵素、特に配列番号１５、１６、１７もしくは１８のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、または所望のインドールヒドロキシル化活性を有するその断片を含むか、またはそれからなるポリペプチドである。

本発明のさらなる態様：
１．
（ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有し、モチーフＨＸＸＸＣ、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）ペルオキシゲナーゼ活性を有する、（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、ペルオキシゲナーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。

２．以下の残基／モチーフ：
ｉ）ＤＸＸＦＸＸＸＲ；好ましくはＤ［ＬＥＡＦＤＳＲＨＴ］［ＡＧＦＨＹ］Ｆ［ＧＮＣＬＲ］［ＩＡＶ］［ＶＥＬＫＩＲＳＤ］Ｒ、より好ましくはＤＳＹＦＬＶＥＲ；
ｉｉ）Ｒ［ＷＲ］ＸＸ［ＧＱ］ＨＸＸＦ；好ましくはＲ［ＷＲ］［ＶＩＲＭＫＨ］［ＲＹＣＬＶＱＫ］［ＧＱ］－Ｈ［ＨＬＹＱＲ］［ＶＬＩＡＳ］Ｆ、より好ましくはＲＷＫＱＱＨＱＬＦ；
ｉｉｉ）ＹＸＸＸＸＲ［ＰＶ］；好ましくはＹ［Ｎ／Ｔ／Ｑ／Ｖ／Ｅ／Ａ／Ｈ／Ｄ／Ｒ／Ｑ］［Ｅ／Ｔ／Ｄ／Ｓ／Ｑ／Ａ］－［Ｑ／Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ａ／Ｉ／Ｇ／Ｆ／Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｎ］［ＩＶ］ＲＰ、より好ましくはＹＥＳＲＩＲＰ；
ｉｖ）Ｈ２３２；
ｖ）［ＬＭ］２８１；好ましくはＬ２８１
（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、番号付けは、配列番号１２のアミノ酸配列に対応する）の１つまたは複数をさらに含む、態様１（ｂ）のポリペプチド。

３．表１の配列番号１５、１６、１７および１８のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のペアワイズ配列同一性を有する配列（グループＩＩの酵素）、又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含む、態様１のポリペプチド。

４．配列が、配列番号１５、１６、１７および１８のいずれか１つ、好ましくは配列番号１６、又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片である、態様３のポリペプチド。

５．表２の配列番号２～１３および１９～２９のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含む、態様１または２のポリペプチド。

６．配列が、配列番号２、３、４、７、８、１１、１２、１３、２０、２１および２８のいずれか１つ、またはペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片である、態様５のポリペプチド。

７．発現、可溶化、精製および／または固定化の増強を可能にするＮ末端および／またはＣ末端タンパク質タグをさらに含む、態様１から６のいずれか１つによるポリペプチド。

いくつかの新規ＩＩ型ＢＵＰＯポリペプチドのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。保存された配列モチーフ（ｉ）～（ｖｉｉｉ）、ならびに（ａ）および（ｂ）が上部に示されている。 いくつかの新規Ｉ型ＢＵＰＯポリペプチドのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。保存された配列モチーフ（ｉ）～（ｖ）、ならびにＨＸＸＣが上部に示されている。 本発明の新規ＢＵＰＯ間の進化的関係を示す系統樹を示す図である。公知の酵素ＳｆｍＤ（配列番号１）およびｌｍｂＢ２（配列番号１４）も含まれる。 例示的な精製ＢＵＰＯのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを示す図である。約４０５ｎｍのＳｏｒｅｔバンドの存在は、ヘム取り込みを示す。パネルＡ：配列番号１２；パネルＢ：配列番号７；パネルＣ：配列番号１１；パネルＤ：配列番号１８；パネルＥ：配列番号１７；パネルＦ：配列番号１６。 配列番号１２、配列番号１７または配列番号１６を有する酵素によるＬ－ＤＯＰＡへのＬ－チロシン変換のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。Ｌ－チロシンの標準は２．５０分の保持時間を有するが、Ｌ－ＤＯＰＡ標準（＊）は２．４１分の保持時間で溶出する。配列番号１２および１６によりＬ－チロシンの大部分がＬ－ＤＯＰＡに変換され、一方配列番号１７については、部分的な変換が観察された。 異なる基材に対するペルオキシゲナーゼ活性についての新規ＢＵＰＯ酵素のスクリーニングを示す図である。列Ａ、Ｂ：チロシンからのメラニン生成；列Ｃ、Ｄ：インドールからのインジゴ生成。列Ｅ、Ｆ：ベラトリルアルコール酸化；列Ｇ、Ｈ：ｐ－クレゾール酸化。すべての場合において、反応混合物は、５０ｍＭのＫ－リン酸緩衝液ｐＨ７．５および１～２０μＭの酵素溶液中に５ｍＭの基材を含有した。過酸化水素（最終濃度２ｍＭ）の添加によって反応を開始した。１時間後に写真を撮影した。 試験した酵素：配列１（ＳｆｍＤ）－Ａ１、Ｃ１、Ｅ１、Ｇ１；配列２－Ａ２、Ｃ２、Ｅ２、Ｇ２；配列５－Ａ３、Ｃ３、Ｅ３、Ｇ３；配列３－Ａ４、Ｃ４、Ｅ４、Ｇ４；配列１３－Ａ５、Ｃ５、Ｅ５、Ｇ５；配列４－Ａ６、Ｃ６、Ｅ６、Ｇ６；配列１２－Ａ７、Ｃ７、Ｅ７、Ｇ７；配列７－Ｂ１、Ｄ１、Ｆ１、Ｈ１；配列１１－Ｂ２、Ｄ２、Ｆ２、Ｈ２；配列１５－Ｂ３、Ｄ３、Ｆ３、Ｈ３；配列１８－Ｂ４、Ｄ４、Ｆ４、Ｈ４；配列１７－Ｂ５、Ｄ５、Ｆ５、Ｈ５；配列１６－Ｂ６、Ｄ６、Ｆ６、Ｈ６；対照（酵素なし）－Ｂ７、Ｄ７、Ｆ７、Ｈ７。メラニン生成に対応するウェルＡ６、Ａ７、Ｂ５およびＢ６に着色生成物が観察された。Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５およびＤ６は、インジゴ生成に対応する。Ｈ５およびＨ６は、ｐ－クレゾール酸化および重合に対応する。 例示的なＢＵＰＯ酵素を様々な基質と反応させることによって得られた反応混合物の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 パネル（Ａ）ｐ－クレゾールと酵素配列番号７、配列番号１６または配列番号１７との反応。ｐ－クレゾール標準は９．３８分の保持時間を有するが、観察されたヒドロキシル化／酸化生成物（＊）は２．８５分（番号７について）ならびに８．０５分および８．５５分（Ｎｏ．１６およびＮｏ．１７について）の保持時間で溶出した。配列番号１６を有する酵素は、所与の条件下で基材の大部分を変換した。 パネル（Ｂ）ｍ－クレゾールと酵素配列番号１６または配列番号１７との反応。ｍ－クレゾールの標準は９．４０分の保持時間を有するが、観察された生成物（＊）は７．６分、８．０５分および８．５５分の保持時間で溶出した。 パネル（Ｃ）ｐ－ニトロフェノールと配列番号１６または配列番号１７の酵素との反応。ｐ－ニトロフェノールの標準は３．５分の保持時間を有するが、観察された生成物（＊）は１．２５分、５．４分および５．７５分の保持時間で溶出した。 パネル（Ｄ）プロトカテク酸と酵素配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８との反応。プロトカテク酸の標準は１．２分の保持時間を有するが、観察された生成物（＊）は５．１分、５．４分および７．０分の保持時間で溶出した。 メチルフェニルスルフィド（チオアニソール）を例示的なＢＵＰＯ酵素と反応させることによって得られた反応混合物の代表的なＧＣＭＳクロマトグラムを示す図である。チオアニソールは１２．４２分の保持時間を有するが、観察された酸化生成物メチルフェニルスルホキシドは１７．５０分の保持時間で溶出した。パネルＡ：対照（酵素なし）；パネルＢ：配列番号４；パネルＣ：配列番号１５；パネルＤ：配列番号１６；パネルＥ：配列番号１７；パネルＦ：配列番号１８。 チロシンを補充した規定培地中で培養した代表的な色素生成ＢＵＰＯを発現する微生物細胞の培養物の上清を示す図である。 配列番号１６のポリペプチドにおける変異の、メラニン生成活性に対する効果。暗色は、メラニン型色素のレベルと相関する。

実施例１：新規ＢＵＰＯのクローニング、発現および精製

クエリ配列としてＳｆｍＤまたはＬｍｂＢ２のいずれかを使用して、非冗長配列のＮＣＢＩデータベース全体に対して広範なＢＬＡＳＴ検索を行った。次いで、ＳｆｍＤ様（Ｉ型）およびＯｒｆ１３／ＬｍｂＢ２様（ＩＩ型）酵素について系統樹（図３）を構築した。異なる分枝の代表を選択し、合成遺伝子として順序付けた。

選択された推定ＢＵＰＯをコードする合成遺伝子を、ｐＥＴ２８ａ、ｐＢＡＤ－ＨｉｓまたはｐＢＡＤ－Ｈｉｓ－ＳＵＭＯベクターのいずれかにクローニングした。サンガー配列決定による配列の確認後、最終的なコンストラクトを、ｐＥＴ２８系コンストラクトの場合化学的に適格な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株（Ｃ４３もしくはＢＬ２１ＡＩ）に、またはｐＢＡＤ系のコンストラクトの場合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ１０βに形質転換した。単一コロニーを選び、対応する抗生物質を補充した５ｍＬのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中で一晩増殖させた。

翌日、一晩培養物を、対応する抗生物質を含むテリフィック・ブロス（ＴＢ）で１：１００に希釈した。培養物を、ＯＤ６００＝０．６になるまで３７℃でインキュベートした。この時点で、０．５ｍＭの５－アミノレブリン酸（ヘム前駆体）と共に１ｍＭのＩＰＴＧ（ｐＥＴ２８コンストラクトの場合）または０．０２ｗ／ｖ％アラビノース（ｐＢＡＤコンストラクトの場合）を添加することによって発現を誘導した。すべての濃度は最終濃度として示される。２．５～５ｃｍの軌道を有する１５０～２００ｒｐｍのオービタルシェーカーにおいて、バッフル付き三角フラスコを用いて１７℃で４６～７２時間発現を行った。

細胞を、４℃で４０００×ｇの冷却遠心分離機を用いて回収した。１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを添加した５０ｍＭのｐＨ７．８のＫ－リン酸（ＫＰｉ）緩衝液に、細胞ペレットを再懸濁した。ＶｉｂｒａＣｅｌｌ超音波破砕機（５秒オン、１０秒オフ、合計時間５分、振幅７０％）を用いて細胞を破壊した。４℃で１９０００×ｇの冷却遠心機を用いることによって、清澄な無細胞抽出物（ＣＦＥ）を得た。

事前に平衡化したＮｉ－セファロースカラム（１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＫＰｉ緩衝液５０ｍＭ ｐＨ７．８）に、ＣＦＥを投入した。未結合タンパク質を３ＣＶの出発緩衝液で洗浄した後、３０ｍＭのイミダゾールを含有する３ＣＶの出発緩衝液で洗浄し、０．５Ｍのイミダゾールを含有する出発緩衝液で溶出した。溶出画分をプールし、ＥｃｏｎｏＰａｃ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して緩衝液をＫＰｉ緩衝液５０ｍＭ ｐＨ７．８；１５０ｍＭ ＮａＣｌに交換した。ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを収集して、精製タンパク質の濃度を推定した。次いで、タンパク質を液体窒素中で急速凍結し、－７０℃で保存した。テリフィック・ブロス（ＴＢ）培地１Ｌあたり約６０ｍｇの収率で、ＢＵＰＯのほとんどを精製することが可能であった。これらの酵素は赤色であり、ＵＶ－ＶｉｓｅスペクトルにＳｏｒｅｔバンドの存在を示し、これはヘム取り込みの証拠である。いくつかの例示的な酵素のスペクトルについては、図４を参照されたい。

実施例２：ペルオキシゲナーゼ活性の定性分析

精製酵素の第１のバッチを、確立されたＲｕｓｓｉｇのブルーアッセイ（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（４）：ｅ０１７５８４６）を使用してペルオキシゲナーゼ活性について試験した。標準アッセイ混合物は、１５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．５）、過剰量（約５～１０ｍＭ）のＨ_２Ｏ_２、１－メトキシナフタレン（１－ＭＮ）、および１０μＬの精製酵素を含み、総体積は１００μｌであった。酵素の添加によって反応を開始し、室温で５分間行った。反応生成物Ｒｕｓｓｉｇのブルーの生成を、６１０ｎｍでの吸光度の増加から決定した［（ε）１．４５×１０４ Ｍ－１ｃｍ－１］。アッセイはプレートリーダで行った。

少なくとも配列番号１５、１７および１８のＩＩ型酵素は、基材として１－ＭＮを利用することができるが、当技術分野で公知のＳｆｍＤ酵素は、基材として１－ＭＮを受容しなかった。酵素ＳｐｈｉｎｇｏＵＰＯもＳｐｉｎｏｓａＵＰＯも（配列番号１１および１３）１－ＭＮに対して活性ではなかったが、細菌宿主細胞におけるそれらの発現が暗色／黒色の培養培地を生じたことが注目されるのはさらに興味深い。これは、選択された酵素間の異なる基材範囲を示す。

実施例３：Ｌ－ＴｙｒのＬ－ＤＯＰＡおよびメラニンへのヒドロキシル化

５０ｍＭのＫＰｉ ｐＨ７．５中５ｍＭのＬ－Ｔｙｒ、５～２０μＭの精製酵素（配列１２、１６および１７）ならびに１ｍＭのＨ_２Ｏ_２からなる反応混合物（０．５ｍＬ）を２５℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間加熱することによって停止させた。反応混合物を１５０００×ｇで５分間遠心分離し、得られた上清を、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｆｌｕｏｒｏ－ｐｈｅｎｙｌ ５μｍ ４．６×２５０ｍｍカラムを使用して、０．８％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を含む水の直線勾配（１０～５０％）で１８分間かけて１．２ｍＬ／分の流速で逆相ＨＰＬＣ－ＤＡＤによって分析した。Ｌ－Ｔｙｒおよび市販のＬ－ＤＯＰＡを標準として使用した。試験した全ての酵素は、生成物としてＬ－ＤＯＰＡ（図５を参照されたい）およびメラニン（図６の列Ａ、Ｂを参照されたい）を生じることが見出されたが、これは、これらの酵素がモノフェノラーゼおよびジフェノラーゼ活性を有することを意味する。

酵素発現細菌培養物の一部は暗色となったが、これは、細胞膜を通って拡散し得る、または細胞を通って拡散し得る反応生成物から培地中に形成されるメラニン様の暗色（褐色／黒色）色素を生成する、発現されたタンパク質の能力を示している。構成要素は、代謝経路から取り込まれたチロシンである可能性が最も高い。

暗い色の出現は、当技術分野で公知の酵素（ＳｆｍＤ、配列番号１およびＬｍｂＢ２、配列番号１４）では観察されなかったが、新たに発見された酵素の様々な代表物（配列番号２、８、１１、１３、１６、１７および２０）では明らかに観察された。観察された色素は、３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外濾過膜を通過することができた。同様の結果がインビトロで達成され得るかどうかを試験するために、個々の精製酵素を用いて実験を行った（図６）。

チロシンからＬ－ＤＯＰＡおよびドーパクロムへの変換のための反応スキーム：

実施例４：置換フェノールおよびフェノール酸のヒドロキシル化

上記と同じ手順を用いて、逆相ＨＰＬＣを使用して、酵素１２、１５、１６、１７および１８を有するｐ－クレゾール（図６、列Ｇ、Ｈ；および図７Ａ）ならびにｍ－クレゾール（図７Ｂ）について、ヒドロキシル化ならびにオリゴマーおよび不溶性ポリマーへのさらなる酸化が示された。ＨＰＬＣ分析の前に、不溶性ポリマーを１５０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去した。

ｐ－ニトロフェノール（図７Ｃ）およびプロトカテク酸（図７Ｄ）のヒドロキシル化もＨＰＬＣによって確認された。ｐ－ニトロフェノールの場合、配列番号１２、１６および１７の酵素を使用して活性が観察され、一方プロトカテク酸の場合、配列番号１２、１５、１６、１７および１８の酵素について活性が確認された。

実施例５：メラニン型色素の発酵生成

方法
ｐＥＴまたはｐＢＡＤ系ベクターのいずれかにおいて異なるＢＵＰＯを過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用して、メラニンの生成を試験した。ｐＥＴ２８系コンストラクトの場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞を、カナマイシンおよび５－アミノレブリン酸を補充した自己誘導培地で使用した。ｐＢＡＤ系コンストラクトの場合、アンピシリン、５－アミノレブリン酸および０．０２％アラビノースを補充したＴＢ培地で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ１０ベータ細胞を使用した。１００μＬの前接種材料（一晩培養物）を９００μＬの上述の培地と混合することによって発現を行ったが、発現は、３０℃で２０時間、ディープウェルマイクロタイタープレート（ＤＷＭＴＰ）で行った。さらに、Ｌ－チロシン（１ｇ／Ｌ）を培地に添加して、同じ実験を行った。自己誘導ＴＢ組成物（ｇ／Ｌ）：Ｋ－リン酸緩衝液（１４．８５、標準ＴＢ緩衝液と同じ組成）を添加したトリプトン（１２）、酵母抽出物（２４）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（３．３）、ＭｇＳＯ_４（０．１５）、グルコース（０．５）、ラクトース（２．０）。

結果
実験の第１の組（培地へのチロシンの添加なし）では、ｐＥＴ２８コンストラクトを使用した培養物でのみ暗いメラニン型色素形成が観察された。色素形成は、配列番号７、８、１２もしくは２０（低強度）、または配列番号１１、１８、１７、１６および１５（高強度）に対応する酵素を発現する宿主細胞の培養物において観察された。

培地にチロシンを補充した場合、ｐＢＡＤ系コンストラクトを含む培養物の一部もメラニン生成を示した。これらは、以下の配列番号：１３、１２および２（高強度）に対応する培養物であった。ｐＥＴコンストラクト由来のＢＵＰＯを発現する宿主細胞の培養物は、全ての培養物、最も顕著には酵素１２、８および２０の培養物について、メラニン生成の増加と共に同じ結果を生じた。

複合培地（ＴＢおよび自己誘導培地）における発酵メラニン生成の実験の後、唯一の炭素源としてグルコースを含み、０．５ｇ／Ｌチロシンを補充した最少培地（Ｍ９＋微量元素、当技術分野で公知のレシピ）におけるメラニン生成を評価した。発現は、ｐＥＴ２８コンストラクト由来の異種ＢＵＰＯポリペプチドを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞を使用して行った。誘導は、０．５ｍＭの５－アミノレブリン酸を添加した１ｍＭのＩＰＴＧを使用して行った。この実験で試験した酵素は以下を含んでいた：配列番号２０、７、４、１６（２つの二重突然変異：Ｒ１１５Ａ／Ｌ１８０ＡおよびＲ１１５Ａ／Ｌ１８０Ｓ）、１２、８、１３、１８、１１、１６、１７および１５。

得られた培養物は、一連のメラニン生成を示し、着色した色素に基づいて視覚的に観察することができた（より暗い培養物はより多量のメラニンに対応する）。予想外にも、一部の培養物は、他の培養物よりも大量のメラニンを生成することができた。例えば、図９に示されるように、配列番号２０、７または４の酵素、および酵素１６の２つの突然変異の培養物は、メラニンを比較的少量しか生成せず、酵素１２、８、１３、１８および１１の培養物は、中程度の量のメラニンを生成したが、酵素１６、１７および１５の培養物は大量のメラニンを生成した。

実施例６：突然変異誘発試験

次に、配列番号１６のポリペプチドを、メラニン型色素の製造に関連する残基を特定するように設計された突然変異誘発試験における代表的な色素生成酵素として使用した。

アラニンおよび他の類似の残基または系統発生研究において存在する残基への変化を評価した。これらは、Ｔｒｐ５０、Ｔｒｐ５３、Ｔｙｒ１１０、Ａｒｇ１１５、Ｍｅｔ１１８、Ｐｈｅ１２５、Ｓｅｒ１２６、Ｌｅｕ１８０、Ｔｙｒ２００およびＰｈｅ２０４を含んでいた。いくつかの突然変異は、ポリペプチドの発現レベルに有意に影響を及ぼすことが判明した。例えば、以下の単一点突然変異の１つをコードするコンストラクトからはタンパク質を生成することができなかった：Ｔｙｒ１１０Ａｌａ、Ｔｒｐ５３Ａｌａ、Ｐｈｅ１２５Ａｌａ、Ｔｙｒ２００Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２００Ｌｅｕ、Ｔｙｒ２００Ｖａｌ、Ｔｙｒ２００Ａｌａ、Ｐｈｅ２０４ＨｉｓおよびＰｈｅ２０４Ａｌａ。残りの突然変異は、発現および精製することができたが、一部では発現収率が低減した（データは示さず）。
さらに、メラニン生成活性は、いくつかの点突然変異によって深刻な影響を受けた。これらは、Ｌｅｕ１８０Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１８０Ａｌａ、Ａｒｇ１１５ＡｌａおよびＰｈｅ２０４Ｌｅｕである。図１０を参照されたい。これらのデータは、ＩＩ型ＢＵＰＯの少なくとも残基Ｌｅｕ１８０およびＡｒｇ１１５がメラニン生成活性に必須であることを実証している。

実施例７：インドールのヒドロキシル化

インドールのヒドロキシル化を触媒することによって青色色素インジゴを形成する能力について、代表的な酵素を試験した。
室温でＫ－リン酸緩衝液ｐＨ８中、基材として５ｍＭインドールを使用して反応を行った。２ｍＭの過酸化水素の添加によって反応を開始した。強い青色としてのインジゴの形成は、酵素ＮｏｂｒａＵＰＯ（配列番号１７）およびＮｏｔＵＰＯ（配列番号１６）で観察され、ＡｃｔＵＰＯ（配列番号１８）では明るい青色が観察された。図６、列Ｃ、Ｄを参照されたい。これらの知見は、これらの酵素が、全細胞、無細胞抽出物、または可溶性もしくは固定化形態の精製酵素のいずれかを使用して、インジゴイド染料の生成のためのインドールおよび置換インドールの変換に使用され得ることを示している。

実施例８：第一級アルコールの酸化

ベラトリルアルコール（ＶＡ）のベラトリルアルデヒドへの酸化は、通常、リグニン－ペルオキシダーゼ活性の尺度と見なされる。これは、３４０ｎｍ（ε３４０＝９３ｍＭ－１ｃｍ－１）で形成されたアルデヒドの吸光度を測定することによって行うことができる。

すべての酵素（１０μＬ）を、５０ｍＭのＫＰｉ ｐＨ８．０中の５ｍＭのＶＡ（１７０μＬ）と混合し、２０μＬの５０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２（５ｍＭ ｆ．ｃ．）を添加して反応を開始した。Ｈ_２Ｏ_２を添加せずに対照反応を設定した。吸光度の変化をプレートリーダで測定した。

ＶＡ酸化の触媒作用の明確な確認が、Ｎｏｂｒａ（配列１７）、Ｎｏｔ（配列１６）およびＳｔｒｐｅｔＵＰＯ（配列１５）、Ｐｐａｃ（配列１２）およびＡｃｔ（配列１８）について観察された。図６の列Ｅ、Ｆを参照されたい。

実施例９：インデン、チオナフテンおよびスルホキシド化反応のオキシ官能化

全ての基材を１ｍＬのメタノールに溶解し、７ｍＬのＫＰｉ ｐＨ７．５で希釈して５ｍＭの基材溶液を得た。反応設定は、５ｍＭの基材を含有する４００μＬの５０ｍＭ ＫＰｉ ｐＨ７．５、５０μＬの酵素ストック溶液および２５～５０μＬの２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２（最終濃度１～２ｍＭ）を混合することからなっていた。反応物を軌道振盪（１インチ軌道、１５０ｒｐｍ、２８℃）しながらエッペンドルフチューブ内で１～２４時間インキュベートし、その後、酢酸エチルで抽出することによって反応を停止させた（ＧＣＭＳまたはキラルＧＣ分析のため）。酢酸エチル抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、１μＬをＧＣＭＳ用のＨＰ５カラムまたはキラルＧＣ－ＦＩＤ分析用のＣｈｉｒａｌｄｅｘ Ｇ－ＴＡカラムに注入した（両方ともＳｈｉｍａｄｚｕ機器を使用して行った）。代替として、キラルＯＤ－Ｈカラムを有するＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓを鏡像体過剰率の定量に使用することができる。

配列番号１６および１７の酵素について、ＧＣ－ＭＳを使用して、インデンの１，２－エポキシインダンおよび２－インデン－２－オンへの変換、ならびにチオナフテンのヒドロキシ－ベンゾチオフェンおよびベンゾチオフェン－２－オンへの変換を確認した。

配列番号４、１５、１６、１７および１８の酵素について、ＧＣＭＳ分析を用いて、各種スルフィド基材（メチルフェニルスルフィド、ベンジルフェニルスルフィド、アリルフェニルスルフィド、ベンジルメチルスルフィド、Ｎ－ブチルメチルスルフィド、エチルフェニルスルフィドおよびイソプロピルフェニルスルフィド）のスルホキシド化を確認した。

さらに、キラルＧＣおよびキラルＨＰＬＣ分析を使用して、ＢＵＰＯがチオアニソールのエナンチオ選択的スルホキシド化を触媒することができることが判明した（データは示さず）。これは、酸素がヘム鉄から移動することを示すため、真のペルオキシゲナーゼ活性の別の証明である。試験した酵素は、主にＳ－エナンチオマー（酵素１８：４２％ｅｅ、酵素１７：２３％ｅｅ、酵素１６：３３％ｅｅ）を生成することが判明した。

Claims (22)

1. メラニンおよび／またはメラニン様色素の生成方法であって、
   （ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
   ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
   ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
   ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
   ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
   ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
   ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
   ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
   ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
   （式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
   （ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣを含む、ポリペプチド；
   （ｃ）色素生成活性を有する、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片
   からなる群から選択されるポリペプチドの使用を含む方法。
2. Ｌ－チロシンのＬ－ＤＯＰＡへのヒドロキシル化およびその後のドーパクロムへの酸化、ならびにメラニンおよび／またはメラニン様色素の形成を含む、請求項１に記載の方法。
3. メラニンおよび／またはメラニン様色素の発酵生成を含み、
   ｉ）色素生成活性を有する異種ポリペプチドを発現する微生物宿主細胞を提供するステップ；
   ｉｉ）前記宿主細胞を培養培地中で培養し、メラニンおよび／またはメラニン様色素の生成を可能にするステップ；ならびに
   ｉｉｉ）メラニンおよび／またはメラニン様色素を単離するステップ
   を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記宿主細胞が、細菌、酵母または真菌宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項３に記載の方法。
5. 前記培養培地が、任意選択でＬ－システインと組み合わせて、少なくとも１種のメラニン（様）色素前駆体、好ましくはＬ－チロシンを含む、請求項２または３に記載の方法。
6. 置換または非置換の直鎖または分岐鎖の脂肪族または芳香族基材のヒドロキシル化または酸化方法であって、前記基材を、ペルオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドおよび過酸化水素源と接触させることを含み、前記ポリペプチドは、
   （ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
   ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
   ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
   ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
   ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
   ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
   ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
   ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
   ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
   （式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
   （ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣを含む、ポリペプチド；
   （ｃ）ペルオキシゲナーゼ活性を有する、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片
   からなる群から選択される、方法。
7. 以下の反応：
   任意選択で置換されたアルキルスルフィド、アリールスルフィドまたはアリールアルキルスルフィド基材のエナンチオ選択的スルホキシド化；
   置換または非置換インドール基材を過酸化水素源および前記ポリペプチドと接触させることによる置換または非置換インジゴ染料の製造；
   第一級アルコールの酸化
   の１つまたは複数を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記ポリペプチドが、図２の配列番号１２の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有し、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣ、またはペルオキシゲナーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片を含むアミノ酸配列を含む、請求項６または７に記載の方法。
9. 前記ポリペプチドが、図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
   ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
   ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
   ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
   ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
   ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
   ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
   ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
   ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
   （式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つ；またはペルオキシゲナーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片を含むアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
10. メチルフェニルスルフィド、ベンジルフェニルスルフィド、アリルフェニルスルフィド、ベンジルメチルスルフィド、Ｎ－ブチルメチルスルフィド、エチルフェニルスルフィドおよびイソプロピルフェニルスルフィドからなる群から選択される基材のエナンチオ選択的スルホキシド化を含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
11. ベラトリルアルコールのベラトリルアルデヒドへの酸化を含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ポリペプチドが全細胞もしくは無細胞抽出物に含まれるか、または前記ポリペプチドが精製酵素として使用される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. （ａ）のポリペプチドが、以下のモチーフ：
    ａ．ＬＷＲＡＭ
    ｂ．ＥＤＬ［ＹＦ］ＤＮ［ＦＹ］［ＦＹ］、好ましくはＥＤＬＹＤＮＦＦ
    の一方または両方をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. （ａ）のポリペプチドが、配列番号１６のＡｒｇ１１５、Ｍｅｔ１１８、Ｐｈｅ１２５、Ｓｅｒ１２６、Ｌｅｕ１８０、Ｔｙｒ２００およびＰｈｅ２０４に対応する残基の１つまたは複数を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ポリペプチドが、表１の配列番号１５、１６、１７および１８のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. （ｂ）のポリペプチドが、以下の残基／モチーフ：
    ｉ）ＸＸＦＸＸＸＲ；好ましくはＤ［ＬＥＡＦＤＳＲＨＴ］［ＡＧＦＨＹ］Ｆ［ＧＮＣＬＲ］［ＩＡＶ］［ＶＥＬＫＩＲＳＤ］Ｒ、より好ましくはＤＳＹＦＬＶＥＲ；
    ｉｉ）Ｒ［ＷＲ］ＸＸ［ＧＱ］ＨＸＸＦ；好ましくはＲ［ＷＲ］［ＶＩＲＭＫＨ］［ＲＹＣＬＶＱＫ］［ＧＱ］－Ｈ［ＨＬＹＱＲ］［ＶＬＩＡＳ］Ｆ、より好ましくはＲＷＫＱＱＨＱＬＦ；
    ｉｉｉ）ＹＸＸＸＸＲ［ＰＶ］；好ましくはＹ［Ｎ／Ｔ／Ｑ／Ｖ／Ｅ／Ａ／Ｈ／Ｄ／Ｒ／Ｑ］［Ｅ／Ｔ／Ｄ／Ｓ／Ｑ／Ａ］－［Ｑ／Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ａ／Ｉ／Ｇ／Ｆ／Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｎ］［ＩＶ］ＲＰ、より好ましくはＹＥＳＲＩＲＰ；
    ｉｖ）Ｈ２３２；
    ｖ）［ＬＭ］２８１；好ましくはＬ２８１
    （式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、番号付けは、配列番号１２のアミノ酸配列に対応する）の１つまたは複数をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ポリペプチドが、表２の配列番号２～１３および１９～２９のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％のペアワイズ配列同一性を有する配列、又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ポリペプチドが、配列番号２、３、４、７、８、１１、１２、１３、２０、２１及び２８のいずれか１つ、又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記ポリペプチドが、配列番号２、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８および２０、好ましくは配列番号１５、１６若しくは１７のいずれか、又はこれらの色素生成活性を有するその断片である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ポリペプチドが、発現、可溶化、精製および／または固定化の増強を可能にするＮ末端および／またはＣ末端タンパク質タグをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. メラニンまたはメラニン様色素の生成のための細菌酵素の使用であって、前記酵素は、
    （ａ）図１の配列番号１６の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも５０％のペアワイズ配列同一性を有し、以下のモチーフ：
    ｉ）ＲＸＦＷＸＲＷＸＸＧＨＱ、好ましくはＲ［ＬＶ］ＦＷＹＲＷＩＡＧＨＱ；
    ｉｉ）ＬＸＸＬＸＸＣＸＤ、好ましくはＬ［ＤＥ］［ＡＬＶ］Ｌ［ＡＣＳＴ］［ＴＡＳ］Ｃ［ＩＶ］Ｄ；
    ｉｉｉ）ＰＲＸＸＹＨ、好ましくはＰＲ［ＡＤ］［ＨＱ］ＹＨ；
    ｉｖ）ＲＸＲ［ＭＬ］ＡＬＱＨ、好ましくはＲ［ＡＰＴ］Ｒ［ＭＬ］ＡＬＱＨ；
    ｖ）ＣＸＸＬ、好ましくはＣ［ＥＡＲ］［ＡＥ］Ｌ；
    ｖｉ）ＨＸＸＩＡＸＨ、好ましくはＨ［ＤＳ］［ＨＦ］ＩＡ［ＮＤ］Ｈ；
    ｖｉｉ）ＤＬＸＨＸＧ、好ましくはＤＬ［ＡＳ］Ｈ［ＮＨ］Ｇ；および
    ｖｉｉｉ）ＶＤＧＸＨＨＰＶ、好ましくはＶＤＧ［ＡＲ］ＨＨＰＶ；
    （式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも２つを含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｂ）図２の配列番号１２の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基にアラインメントされた場合、少なくとも３０％のペアワイズ配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、モチーフＨＸＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、好ましくはＨ［ＩＲＫＡＱＶＧ］［ＧＮＥＬＳＹＲＨＭ］［ＶＩ］Ｃ、より好ましくはＨＡＲＶＣを含む、ポリペプチド；
    （ｃ）色素生成活性を有する、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、使用。
22. 前記細菌酵素が、全細胞、好ましくは異種酵素として前記酵素を発現する組換え微生物細胞に含まれる、請求項２１に記載の使用。

Images