KR101291589B1 - Ｄ―아미노산 옥시다아제 및 ω―트랜스아미나아제를 이용한 호모알라닌의 탈라세미화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Ｄ-아미노산 옥시다아제 및 ω-트랜스아미나아제를 이용한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수용성 및 이상계 반응 시스템, 또는 전세포 이상계 반응 시스템에서 D-아미노산에 비트레오실라 헤모글로빈 및 D-아미노산 옥시다아제의 융합단백질(VHb-DAAO), 오메가-트랜스아미나아제(ω-TA) 및 아미노 공여체(amino donor)를 처리하면, VHb-DAAO이 D-호모알라닌을 산화시켜 2-케토부티레이트를 생산하고, ω-TA가 아미노 공여체를 이용하여 2-케토부티레이트로부터 L-호모알라닌으로 전환시킴으로써 광학적으로 순수한 L-호모알라닌를 산업적으로 대량 생산할 수 있는 새로운 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 비천연 아미노산의 탈라세미화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Ｄ-아미노산 옥시다아제 및 ω-트랜스아미나아제를 이용한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법에 관한 것이다.
약학적 화합물을 위한 구성 요소로서 광학적으로 순수한 비-단백질 생성 아미노산의 수요가 증가하기 때문에, 비천연 아미노산의 생산은 화학 공업에서 중요하다(비특허문헌 1 및 2 참조). 비천연 아민노산의 중요성을 고려해 볼 때, 광학적으로 순수한 형태로의 비천연 아미노산의 효과적인 합성은 유기 화학자 및 생물학자들에게 매력적인 도전이다(비특허문헌 3 참조). 종래에는 천연 아미노산을 추출 및 발효 방법에 의해 획득하였다. 그러나, 이런 종래의 방법에 의한 비천연 아미노산의 생산은 아직 제대로 확립되지 않았다(비특허문헌 4 참조).
다양한 비천연 아미노산들 중에, 특히 L-호모알라닌(L-homoalanine, 또는 "L-1"으로 나타낸다)은 브리바라세탐(brivaracetam), 레베티라세탐(levetiracetam) 및 에탐부톨(ethambutol) 등과 같은 여러 중요한 약물의 합성을 위한 중요한 키랄 매개체(chiral intermediate)로 사용되기 때문에 약리학적으로 매우 중요하다(비특허문헌 5 참조). 종래에는 L-호모알라닌을 타이로신 트랜스아미나아제(transaminase, 또는 "TA"로 나타낸다)(비특허문헌 6 참조), 아스팔테이트 TA(비특허문헌 7 참조) 및 ω-TA(비특허문헌 1 참조)를 이용한 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate, 또는 "2"로 나타낸다.)와 트랜스아미나아제의 반응에 의해 생산하였다. L-트레오닌(threonine)을 트레오닌 탈아미나아제를 이용하여 2-케토부티레이트로 전환시킨 후, 원 포트 반응(one-pot reaction)에서 트랜스아미나아제 반응에 의해 L-호모알라닌으로 전환시켰다(비특허문헌 7 및 8 참조). 또한, 프로테아제 촉매 반응에 의해 아미노산 에스테르로부터 L-호모알라닌을 생산하였고, 아미노아실라아제 촉매 반응에 의한 N-아세틸 유도체로부터 L-호모알라닌을 생산하였다(비특허문헌 5 참조). 또한, 최근에는 글루타메이트 디하이드로제나아제(glutamate dehydrogenase)가 암모니아를 직접적으로 2-케토부티레이트로 고정시키는 것으로 물질대사가 조작된 대장균(Escherichia coli)을 이용하여 글루코즈로부터 직접 L-호모알라닌을 생성하였다(비특허문헌 11 참조).
종래의 거울상선택적 합성(enantioselective synthesis)에서 효소의 적용은 다음의 2가지 방법으로 분류될 수 있다: 라세미체(racemate)의 반응속도론적 분할(kinetic resolution)(예를 들면, 프로테아제 및 아실라아제) 및 프로키랄(pro-chiral) 화합물로부터 비대칭 합성(asymmetric synthesis)(예를 들면, 타이로신 트랜스아미나아제 및 디하이드로제나아제 반응). 비대칭 합성은 반응속도론적 분할에 비해 약 2배인 100%의 최대 이론 수율을 나타내기 때문에 일반적으로 선호되고 있다. 그러나, 프로키랄 케토산은 rac-아미노산에 비해 더 비싸다(비특허문헌 6 참조). 최근에는, 탈라세미화 공정이 라세미체로부터 거울상이성질체로 순수한 아미노산을 생산하는데 100%의 최대 이론 수율의 능력을 가지기 때문에 상당한 선호되고 있다(비특허문헌 12 참조). 특히, 인겐자(Ingenza)사는 전세포 D-아미노산 옥시다아제(D-amino acid oxidase, DAAO) 및 이종 금속 촉매(Pd/C)를 이용하여 rac-호모알라닌으로부터 L-호모알라닌을 생산하는 탈라세미화 방법을 개발하였다(비특허문헌 13 참조). 상기 탈라세미화 방법은 100 mM의 기질 로딩에 대해 95% 전환으로 99% ee를 생성하였다. 상기 탈라세미화 방법은 아민(amine)-보란(borane)을 적용하는 기존의 다른 탈라세미화 방법과 비교할 때 더 경제적인 효과를 가진다(비특허문헌 11 및 12 참조). 그러나, 상기 탈라세미화 방법은 2-케토부티레이트로부터 이미노산의 가수분해를 방지하기 위해 비선택적 환원제의 농도가 상당히 높아야 하는 단점이 있다(비특허문헌 14 참조). 게다가, 금속 촉매는 금속 이온과 결합하는 경향이 있어서 상기 탈라세미화 반응의 방해가 나타나는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 L-호모알라닌의 효과적인 생산을 위한 상기와 같은 문제점을 극복할 수 있는 대안의 탈라세미화 방법을 개발하기 위해 예의노력한 결과, 비트레오실라 헤모글로빈과 D-아미노산 옥시다아제의 융합단백질(Vitreoscilla hemoglobin―D-amino acid oxidase, VHb―DAAO) 및 오메가-트랜스아미나아제(ω-transaminase, ω-TA)의 조합을 이용한 D-호모알라닌의 탈라세미화에 의해 광학적으로 순수한 L-호모알라닌을 효율적으로 생산할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 VHb-DAAO 및 ω-TA의 조합을 이용한 광학적으로 순수한 L-호모알라닌을 효율적으로 생산하기 위한 신규한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 D-호모알라닌에 VHb-DAAO 융합단백질, ω-TA 및 아미노 공여체를 동시에 또는 연속적으로 처리하는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) D-호모알라닌, VHb―DAAO 효소, ω-TA 효소, FAD, 벤질아민, 및 카탈라제를 포함하는 인산완충용액에 이소옥탄을 첨가하여 유기/수용성의 이상계(biphasic) 반응물을 제조하는 단계; 및,
2) 상기 이상계 반응물을 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) D-호모알라닌, VHb―DAAO 발현 전세포, ω-TA 발현 전세포, 및 벤질아민를 포함하는 인산완충용액에 이소옥탄을 첨가하여 유기/수용성의 이상계 반응물을 제조하는 단계; 및,
2) 상기 이상계 반응물을 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 VHb―DAAO 효소, ω-TA 효소, FAD, 벤질아민, 및 카탈라제를 포함하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 VHb―DAAO 발현 전세포, ω-TA 발현 전세포, 및 벤질아민을 포함하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 VHb-DAAO 및 ω-TA의 조합에 의한 D-아미노산의 탈라세미화 방법은 광학적으로 순수한 L-호모알라닌을 기질 농도의 관점에서 산업적 규모로 효율적으로 생산할 수 있게 한다. 또한, 본 발명에 따른 탈라세미화 방법은 DAAO 및 ω-TA의 광범위한 기질 특이성에 의해 다양한 광학적으로 순수한 비천연 아미노산을 생성하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 탈라세미화 방법은 L-아미노산 옥시다아제를 (R)-ω-TA와 함께 적용시킴으로써 D-아미노산을 생성하는데도 사용될 수 있다.
도 1은 VHb-DAAO 및 ω-TA를 이용한 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 개요도이다.
도 2는 DAAO 및 VHb-DAAO의 발현 및 정제를 보여주는 그림이다:
(A)는 DAAO의 발현 및 정제에 관한 것으로서,
레인(Lane) 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물;
레인 3: DAAO를 과발현하는 재조합 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 4: 정제된 DAAO(40 kDa), 및
(B)는 VHb-DAAO의 발현 및 정제에 관한 것으로서,
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물;
레인 3: VHb-DAAO를 과발현하는 재조합 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 4: 정제된 VHb-DAAO(57 kDa).
도 3은 ω-TA의 발현 및 정제를 보여주는 그림이다:
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: ω-TA를 과발현하는 E. coli BL21의 조추출물;
레인 3: 정제된 ω-TA(49 kDa); 및
레인 4: 대조군 E. coli BL21의 조추출물.
도 4는 rac-호모알라닌과 VHb-DAAO의 반응속도록적 분할(kinetic resolution)을 보여주는 그래프이다(●: L-호모알라닌, ■: D-호모알라닌, ▲: ee).
도 5는 수용성(aqueous)(●: L-호모알라닌, ▼: D-호모알라닌, 및 ■: 2-케토부티레이트) 및 이상계(biphasic)(○:L-호모알라닌, △: D-호모알라닌, 및 □: 2-케토부티레이트) 반응 시스템에서, VHb-DAAO 및 ω-TA를 이용한 10 mM rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 그래프이다. 본 그래프에서, ▼ 및 △가 겹쳐져 있기 때문에 ▼가 보이지 않는 것이다.
도 6은 이상계 반응 시스템에서 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 ω-TA의 단일 발현과 ω-TA 및 VHb-DAAO의 공동 발현을 보여주는 그림이다:
(A)는 ω-TA의 단일 발현에 관한 것으로서,
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 3: ω-TA를 과발현하는 E. coli BL21의 조추출물, 및
(B) ω-TA 및 VHb-DAAO의 공동 발현에 관한 것으로서,
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 3: VHb-DAAO 및 ω-TA를 과발현하는 E. coli BL21의 조추출물.
도 8은 전세포(whole cell) 이상계 반응을 이용한 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 개요도이다.
도 9는 전세포 이상계 반응 시스템을 이용한 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 전세포 이상계 반응 시스템에서 VHb-DAAO 및 ω-TA를 이용한 500 mM rac-호모알라닌의 탈라세미화를 나타내는 그래프이다(●: L-1, ▲: D-1 및 ■: 2).
도 2는 DAAO 및 VHb-DAAO의 발현 및 정제를 보여주는 그림이다:
(A)는 DAAO의 발현 및 정제에 관한 것으로서,
레인(Lane) 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물;
레인 3: DAAO를 과발현하는 재조합 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 4: 정제된 DAAO(40 kDa), 및
(B)는 VHb-DAAO의 발현 및 정제에 관한 것으로서,
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물;
레인 3: VHb-DAAO를 과발현하는 재조합 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 4: 정제된 VHb-DAAO(57 kDa).
도 3은 ω-TA의 발현 및 정제를 보여주는 그림이다:
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: ω-TA를 과발현하는 E. coli BL21의 조추출물;
레인 3: 정제된 ω-TA(49 kDa); 및
레인 4: 대조군 E. coli BL21의 조추출물.
도 4는 rac-호모알라닌과 VHb-DAAO의 반응속도록적 분할(kinetic resolution)을 보여주는 그래프이다(●: L-호모알라닌, ■: D-호모알라닌, ▲: ee).
도 5는 수용성(aqueous)(●: L-호모알라닌, ▼: D-호모알라닌, 및 ■: 2-케토부티레이트) 및 이상계(biphasic)(○:L-호모알라닌, △: D-호모알라닌, 및 □: 2-케토부티레이트) 반응 시스템에서, VHb-DAAO 및 ω-TA를 이용한 10 mM rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 그래프이다. 본 그래프에서, ▼ 및 △가 겹쳐져 있기 때문에 ▼가 보이지 않는 것이다.
도 6은 이상계 반응 시스템에서 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 ω-TA의 단일 발현과 ω-TA 및 VHb-DAAO의 공동 발현을 보여주는 그림이다:
(A)는 ω-TA의 단일 발현에 관한 것으로서,
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 3: ω-TA를 과발현하는 E. coli BL21의 조추출물, 및
(B) ω-TA 및 VHb-DAAO의 공동 발현에 관한 것으로서,
레인 1: 분자량 마커;
레인 2: 대조군 E. coli BL21의 조추출물; 및
레인 3: VHb-DAAO 및 ω-TA를 과발현하는 E. coli BL21의 조추출물.
도 8은 전세포(whole cell) 이상계 반응을 이용한 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 개요도이다.
도 9는 전세포 이상계 반응 시스템을 이용한 rac-호모알라닌의 탈라세미화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 전세포 이상계 반응 시스템에서 VHb-DAAO 및 ω-TA를 이용한 500 mM rac-호모알라닌의 탈라세미화를 나타내는 그래프이다(●: L-1, ▲: D-1 및 ■: 2).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 D-호모알라닌(D-homoalanine)에 비트레오실라 헤모글로빈과 D-아미노산 옥시다아제의 융합단백질(Vitreoscilla hemoglobin―D-amino acid oxidase, VHb―DAAO), 오메가-트랜스아미나아제(ω-transaminase, ω-TA) 및 아미노 공여체(amino donor)를 처리하는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 추가적으로 카탈라제(catalase) 및/또는 FAD(Flavin Adenine Dinucleotide) 효소를 함께 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, VHb―DAAO 융합단백질은 서열번호 3으로 나타내는 염기서열에 의해 암호화되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 비트레오실라 헤모글로빈(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)은 물로부터 산소 분자를 추출한 후 유기체의 세포활성 동안 붙잡았던 산소를 분비하는 역할을 하며, 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis) 유래 DAAO와 융합하여 VHb-DAAO의 융합단백질을 생성한다(비특허문헌 15 참조). 상기 VHb-DAAO 융합단백질은 세팔로스포린 C(cephalosporin C) 및 rac-3-플루오로알라닌의 생전환 공정에서 DAAO 활성 및 안정성을 유의적으로 증진한다(비특허문헌 1 및 16 참조). 본 발명의 한가지 실시양태에서, VHb-DAAO 및 DAAO 각각의 D-호모알라닌에 대한 효소 활성을 비교한 결과, VHb-DAAO이 DAAO에 비해 약 2.5배 높은 촉매 효율성을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 방법에 있어서, ω-TA는 서열번호 5로 나타내는 염기서열에 의해 암호화되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 아미노 공여체는 벤질아민(benzylamine)이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 다양한 아미노 공여체가 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, VHb-DAAO는 D-아미노산을 산화시켜 케토산이 되게 할 수 있는 한편, ω-TA는 케토산을 광학적으로 순수한 L-아미노산으로 전환하는데 사용된다.
본 발명의 탈라세미화 방법은 도 1에 기재된 개요도와 같이 반응이 일어난다. 구체적으로, VHb-DAAO 융합단백질은 D-호모알라닌을 산화시켜 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)를 생산하며, ω-TA는 아미노 공여체를 이용하여 2-케토부티레이트로부터 L-호모알라닌으로 전환시킨다(도 1 참조).
본 발명의 한가지 실시양태에서, D-호모알라닌에 VHb-DAAO, ω-TA, 벤질아민 및 카탈라제를 처리한 결과, FAD를 공동인자로 포함하는 플라보 효소 DAAO가 D-호모알라닌을 α-이미노산으로의 탈라세미화를 촉진시켰고, 그런 다음 α-이미노산이 2-케토부티레이트 및 암모니아로 동시에 가수분해시켰다. 그런 다음, 생산된 2-케토부티레이트가 아미노 공여체로서 벤질아민을 이용하여 ω-TA에 의해 L-호모알라닌으로 전환시켰다. 이때, 카탈라제 효소는 VHb-DAAO의 부산물인 과산화수소를 물과 산소로의 분해를 촉진시켰다.
또한, 본 발명은 수용성(aqueous) 및 이상계(biphasic) 반응 시스템에서 본 발명에 따른 D-호모알라닌의 탈라세미화를 수행하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은
1) D-호모알라닌, VHb―DAAO 효소, ω-TA 효소, FAD(Flavin Adenine Dinucleotide) 효소, 벤질아민, 및 카탈라제를 포함하는 인산완충용액에 이소옥탄을 첨가하여 유기/수용성의 이상계(biphasic) 반응물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 이상계 반응물을 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 탈라세미화 과정에서 벤질알데히드에 의한 ω-TA 반응 효율성을 방해하여 L-호모알라닌의 생산을 억제하기 때문에, 유기 용매가 수용액 시스템으로부터 벤질알데히드를 추출하기 위해, 수용성 및 이상계 반응 시스템에서 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)에서 D-호모알라닌 및 벤질아민은 수용액 상태인 것이 바람직하고, VHb-DAAO 융합단백질에 의해 D-호모알라닌로부터 생산된 2-케토부티레이트는 수용액 상태인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이들은 중성 pH에서 전하를 띄기 때문에 수용액 상태를 유지시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 인큐베이션은 35 ~ 40℃에서 진탕으로 인큐베이션시키는 것이 바람직하고, 진탕배양기를 이용하여 37℃에서 250 rpm으로 부드럽게 흔들어주면서 인큐베이션시키는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이는 이상계 반응물에서 계면의 효소 비활성을 야기하는 에멀젼으로 형성되는 방지하기 위해 진탕으로 인큐베이션시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 전세포(whole cell) 이상계 반응 시스템에서 본 발명에 따른 D-호모알라닌의 탈라세미화를 수행하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은
1) D-호모알라닌, VHb―DAAO 발현 재조합 전세포, ω-TA 발현 재조합 전세포, 및 벤질아민를 포함하는 인산완충용액에 이소옥탄을 첨가하여 유기/수용성의 이상계 반응물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 이상계 반응물을 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 탈라세미화 과정에서 생체 촉매로서 전세포를 이용하는 것은 세포의 용해 또는 정제를 용이하게 수행하게 하고 FAD의 결핍 하에서도 효율적으로 반응을 수행할 수 있으므로, 전세포 이상계 반응 시스템에서 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 VHb―DAAO 발현 재조합 전세포는 VHb―DAAO 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 제조된 형질전환체인 것이 바람직하고, ω-TA 발현 재조합 전세포는 ω-TA 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 제조된 형질전환체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 단계 1)에서 VHb―DAAO 및 ω-TA를 각각 포함하는 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 제조된 형질전환체를 제조함으로써, VHb―DAAO 및 ω-TA를 동시에 발현하는 재조합 전세포를 이용하여 수행하는 것도 가능하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)에서 이상계 반응물에 카탈라제 및/또는 FAD를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 VHb―DAAO 효소, ω-TA 효소, FAD, 벤질아민 및 카탈라제를 포함하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 VHb―DAAO 발현 재조합 전세포, ω-TA 발현 재조합 전세포 및 벤질아민을 포함하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아님은 당업자에게 명백한 사실이다. 따라서, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
VHb
-
DAAO
효소의 발현, 정제 및
전세포의
제조
로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis) 유래 DAAO 유전자(서열번호: 1의 염기서열로 나타냄) 및 VHb-DAAO 유전자(서열번호: 3의 염기서열로 나타냄)를 각각 증폭시킨 후, IPTG 유도 발현벡터 pET24ma17 벡터 내로 각각 클론시켰다. 그런 다음, 이런 클론된 벡터들을 E. coli BL21로 형질전환시킨 후, 30℃에서 3 L의 플라스크 내에서 카나마이신(50 mg/L)를 포함하는 1 L의 LB 배지에서 배양하였다. 세포 배양물의 광학 밀도가 600 nm에서 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)(Sigma-Aldrich, Korea)를 첨가하였다. C-말단 His6-태그된 단백질을 4℃에서 Ni-NTA 아가로즈 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 정제하였다(도 2). Ni-NTA 아가로즈로부터 정제된 단백질을 포함하는 용출된 용액을, 7% 글리세롤, 2 mM EDTA, 및 5 mM 2-메르캅토에탄올을 포함하는 100 mM 인산나트륨 완충용액(pH 8.0)으로 투석한 후, 한외여과 장치(Amicon, Millipore, USA)를 이용하여 농축하였다. 정제된 DAAO(서열번호: 2의 아미노산 서열로 나타냄) 및 VHb-DAAO(서열번호: 4의 아미노산 서열로 나타냄) 효소 용액에 글리세롤을 첨가한 후(25% 글리세롤), 추가적인 연구를 위해 -20℃에서 저장하였다. VHb-DAAO의 전세포(whole cell) 제조를 위해서, 세포 펠렛(cell pellet)을 유도한 후 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 전세포 용액에 글리세롤을 첨가한 후(25% 글리세롤), 추가적인 연구를 위해 -70℃에서 저장하였다.
ω-
TA
효소의 발현, 정제 및
전세포의
제조
비브리오 플루비아리스(Vibrio fluvialis) 유래 ω-TA인 ω-TAvf(서열번호: 5의 염기서열로 나타냄)의 암호화 영역을 PCR를 이용하여 증폭시킨 후, pET24ma 벡터 내로 클론시킨 다음, E. coli BL21 내로 도입하였다(비특허문헌 18 참조). E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 50 mg/L의 카나마이신을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG를 첨가하였다. 도입 6시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 20 uM 피리독살 50 인산염(pyridoxal 50-phosphate, PLP), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 및 10% 글리세롤을 포함하는 20 mL의 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 재현탁하였다. 초음파 분해를 이용한 세포파괴를 통해 조추출물을 획득하였다. His-태그된 ω-TAVf를 포함하는 재조합 E. coli 세포의 조추출물을 Ni-NTA 아가로즈 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 적용시켜 ω-TA(서열번호: 6의 아미노산 서열로 나타냄) 효소를 정제하였다(도 3). 그런 다음, 정제된 ω-TA 효소를 20 uM PLP를 포함하는 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.0)에 투석한 후 한외여과 장치(Amicon, Millipore, USA)로 농축시켰다. 정제된 ω-TA 효소 용액에 글리세롤을 첨가한 후(25% 글리세롤), 추가적인 연구를 위해 -20℃에서 저장하였다. ω-TA의 전세포 제조를 위해서, 세포 펠렛을 유도한 후 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 전세포 용액에 글리세롤을 첨가한 후(25% 글리세롤), 추가적인 연구를 위해 -70℃에서 저장하였다.
ω-
TA
와
VHb
-
DAAO
의 공동 발현
우선, ω-TA의 암호화 영역을 PCR을 이용하여 증폭하였다. 상기 PCR은 pET24ma:ω-TA로부터 유래된 프라이머 A1(5'-CCGCTCGAGATGAACAAACCGCAAAGCTGG-3') 및 프라이머 A2(5'-CCCAAGCTTTTATTAGGCAACCTCGGCAAAG-3')를 이용하여 수행하였다. 그런 다음, 상기 PCR 산물을 XhoI 및 HindIII로 분해한 후, pBAD/HisA 벡터(Invitrogen, USA) 내로 삽입하였다. 그런 다음, 상기 pBAD/HisA:ω-TA를 pET24ma:VHb-DAAO를 포함하는 E. coli BL21 내로 도입하여 형질전환체를 제조하였다. 그런 다음, 상기 형질전환체를 30℃에서 50 mg/L의 카나마이신 및 50 mg/L의 암피실린을 포함하는 1L LB 배지에서 성장시켰다. OD600이 0.2에 도달하였을 때, IPTG(0.5 mM) 및 아라비노즈(0.02%)를 배양 배지에 첨가한 후 배양하였다. 배양 6시간 후, 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척한 다음, ω-TA 및 VHb-DAAO의 발현 수준을 분석하였다. 한편, pBAD/HisA:ω-TA만을 포함하는 E. coli BL21를 이용한 ω-TA의 단일 발현은 세포 배양액에 50 mg/L의 암피실린만을 도입하였고, 배양 배지에 아라비노즈(0.02%) 만을 첨가하는 것을 제외하고 상술한 공동 발현의 절차와 동일하게 수행하였다.
DAAO
및
VHb
-
DAAO
의 D-호모알라닌에 대한 효소 활성의 확인
DAAO 및 VHb-DAAO의 효소 활성을 다음과 같이 측정한 후 비교하였다.
우선, D-호모알라닌(Sigma-Aldrich, Korea)에 대한 VHb-DAAO 및 DAAO의 Km 값을 산출하였다. 다양한 농도의 D-호모알라닌(0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 4, 5 mM)과 0.001 mg/ml의 효소가 있는 100 mM 인산 완충용액(pH 8.0)을 25℃에서 30분간 반응시킨 다음, 생성되는 2-옥소부틸산의 농도를 측정하였다. 이렇게 해서 산출한 DAAO 및 VHb-DAAO의 효소의 실험값을 Lineweaver-Burk Plot을 수행하여 효소의 Km값, kcat값 및 촉매 효율성을 각각 구하였다.
그 결과, D-호모알라닌에 대한 VHb-DAAO 및 DAAO의 Km 값은 각각 1.33 mM 및 1.23 mM을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, VHb-DAAO에서 VHb의 존재는 D-호모알라닌에 대한 효소의 친화성에 큰 영향이 미치지 않았다.
또한, D-호모알라닌에 대한 VHb-DAAO 및 DAAO의 kcat 값을 산출한 결과, VHb-DAAO 및 DAAO의 kcat 값은 각각 82.5 s-1 및 31.0 s-1을 나타내었다. 즉, VHb-DAAO는 DAAO에 비해 현저히 높은 kcat 값을 가지는 것으로 나타내었다.
아울러, D-호모알라닌에 대한 VHb-DAAO 및 DAAO의 촉매 효율성을 산출한 결과, VHb-DAAO의 촉매 효율성(62.0 s-1 mM-1)은 DAAO의 촉매 효율성(25.2 s-1 mM-1)과 비교하여 2.5배 더 높게 나타내었다. D-호모알라닌에 대한 VHb-DAAO 및 DAAO의 광학적 pH는 8.0이며, 이는 D-알라닌이 pH 8.0이라는 보고와 일치하는 것이다(비특허문헌 17 참조).
rac
-호모알라닌의
반응속도론적
분할 반응의 확인
100 mM rac-호모알라닌(Sigma-Aldrich, Korea)의 반응속도론적 분할은 VHb-DAAO(0.04 mg/mL), 1 uM FAD 및 카탈라제(0.05 mg/mL)를 포함하는 1 mL의 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)에서 수행하였다. 이때, 반응 바이알은 느슨하게 뚜껑을 덮은 후 추가적인 산소공급 없이 37℃에서 200 rpm으로 흔들어 주었다.
한편, 호모알라닌의 정량적 키랄 분석은 C18 시메트리 컬럼(Waters, MA)과 254 nm에서 워터 HPLC 시스템을 이용하여 수행한 후, 시료와 2,3,4,6-테트라-o-아세틸-α-D-글루코피라노실 이소티오사이어네이트(2,3,4,6-tetra-o-acetyl--d-glucopyranosyl isothiocyanate, GITC)17(Sigma-Aldrich, Korea)의 유도체화를 수행하였다(비특허문헌 17 참조).
또한, 각각의 거울상 이성질체의 분리는 50% 메탄올과 50% 물(0.1% TFA)의 혼합물을 1.0 mL/min의 유속으로 등용매용리를 통해 수행하였다. 각각의 거울상 이성질체의 정량을 위해, 적절한 양의 L-글루타메이트(내부 표준)를 정지 용액(아세토니트레이트)에 첨가한 다음, 혼합물을 GITC로 유도체를 합성하였다. 유도체화한 후, L-글루타메이트, L-호모알라닌 및 D-호모알라닌에 대한 머무름 시간은 각각 5.18, 8.04, 및 10.95분에서 관찰되었다.
그 결과, L-호모알라닌은 반응 11시간 후 52.4%의 전환으로 > 99% ee, 및 > 100의 거울상 선택성에 도달하였다(도 4).
수용성 및 이상계 반응 시스템에서,
VHb
-
DAAO
및 ω-
TA
를 이용한
rac
-호모알라닌의 탈라세미화의 확인
rac-호모알라닌의 성공적인 반응속도론적 분할은 VHb-DAAO 및 ω-TA 반응을 이용하여 rac-호모알라닌을 L-호모알라닌으로 탈라세미화하게 하였다. 탈라세미화 반응 동안, 비브리오 플루비아리스(Vibrio Fluvialis) JS17 유래 ω-TA를 클론시켜 E. coli에서 발현시켰다. 그런 다음, 발현된 ω-TA 효소를 Ni-NTA 친화성 컬럼에서 정제하였다(비특허문헌 18 참조). 우선, 0.02 mg/mL의 VHb-DAAO, 0.18 mg/mL의 ω-TA, 1 uM의 FAD 및 0.05 mg/mL의 카탈라아제를 이용하여 저농축물(10 mM)로 탈라세미화 반응을 수행하였다. 2-케토부티레이트(Sigma-Aldrich, Korea)의 완전한 아미노화를 확인하기 위해, 벤질아민(Sigma-Aldrich, Korea)의 농축물(20 mM)을 rac-호모알라닌 보다 2배 높게 유지시켰다.
그 결과, 전체적인 탈라세미화 반응은 10 mM의 rac-호모알라닌이 7.5 mM L-호모알라닌으로 > 99% ee으로 전환하는데 8시간이 걸렸다(도 5).
한편, 벤질알데히드(Sigma-Aldrich, Korea)에 의한 효소 억제는 ω-TA 반응 효율성을 수행하는데 주요 장애요인이다. 2-케토부티레이트 및 벤질아민 사이 반응에서 ω-TA 활성은 벤질알데히드가 3 mM을 초과할 때 거의 잃었다. 이에, 생산 억제를 극복하기 위해, 유기 용매가 수용성 시스템으로부터 벤질알데히드를 추출하도록 이상계 반응 시스템을 사용하였다. 벤질알데하이드와 다양한 유기 용매의 분배계수를 기준으로 하여, 유기/수용성 이상계 반응 시스템에 대한 이상적인 용매로 이소옥탄을 선택하였다(비특허문헌 1 참조). 이상계 반응 시스템에서, 호모알라닌, 벤질아민 및 2-케토부티레이트는 중성 pH에서 그들의 전하 때문에 수용액으로 존재하게 하였다. 생산 억제를 극복하기 위해, 1 mL의 이소옥탄을 수용액에 첨가하였다. 구체적으로, 1 mL의 이소옥탄을 100 mM rac-호모알라닌, 200 mM 벤질아민, 0.04 mg/L VHb-DAAO 효소, 0.36 mg/L ω-TA, 1 uM FAD 및 0.05 mg/L의 카탈라제(catalase)를 포함하는 1 mL의 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)에 주의하여 첨가한 후, 37℃에서 인큐베이트시켰다. 이때, 계면의 효소 비활성을 야기하는 에멀젼 형성을 억제하기 위해, 이상계 반응물을 37℃에서 250 rpm으로 진탕배양기에서 부드럽게 흔들어주었다. 한편, 2-케토부티레이트를 분석하기 위해, UV 200 nm에서 5 mM 황산 용액의 용리를 갖는 Aminex HPX-87H HPLC 컬럼(Bio-Rad, CA)을 사용하였다. 이때, 2-케토부티레이트의 머무름 시간은 9.61분이었다.
그 결과, 이상계 반응 시스템을 이용한 벤즈알데히드의 제거는 수용성 배지와 비교하여 실질적으로 증가하였다(도 5). rac-호모알라닌이 99%의 전환(> 99% ee)에 도달하는데에 8시간이 걸렸다.
그런 다음, 탈라세미화 반응을 0.04 mg/mL의 VHb-DAAO 및 0.36 mg/mL의 ω-TA를 이용한 이상계 반응 시스템에서 100 mM rac-호모알라닌 및 200 mM 벤질아민으로 수행하였다.
그 결과, 상기 탈라세미화 반응 24시간 후, L-1은 98.8%의 전환(> 99% ee)으로 생성되었다(도 6).
전세포
이상계
반응 시스템에서,
VHb
-
DAAO
및 ω-
TA
를 이용한
rac
-호모알라닌의
탈라세미화의
확인
효소 공정에서 생체촉매로서 전세포를 이용하는 것은 세포의 용해 또는 정제에 대한 비용을 절감시켜 단순하고 경제적인 제조의 이점을 가진다(비특허문헌 19 참조). 또한, 전세포 반응 시스템은 비싼 공동인자 FAD의 결핍 하에서도 효율적으로 수행될 수 있는 이점을 가진다. 이에, ω-TA 유전자 및 VHb-DAAO를 분리된 pET24ma 시스템에 클론시킨 다음, 잘 발현되는지 확인하였다. 그런 다음, 단일 세포에서도 효소를 발현하는 재조합 E. coli 시스템을 개발하기 위해, ω-TA 유전자를 pBAD/HisA 벡터에 클론시켰다. 그런 다음, 상기 클론된 벡터를 VHb-DAAO를 포함하는 pET24ma 벡터를 함유하는 E. coli 시스템 내로 도입하였다.
그 결과, ω-TA는 개별적으로 발현될 때, pBAD/HisA 벡터에서 높은 수준의 수득률을 나타내는 반면에, 재조합 E. coli 시스템에서 VHb-DAAO와 공동으로 발현될 때, ω-TA의 발현 수준은 현저히 감소하였다. 그럼에도 불구하고, VHb-DAAO는 높은 수준의 발현을 나타내었다(도 7). 따라서, E. coli 세포와 분리된 pET24ma 시스템에서 발현되는 ω-TA 효소를 이용하여 전세포 반응을 수행하였다.
그런 다음, 전세포 반응에서 탈라세미화는 100 mM rac-호모알라닌과 200 mM 벤질아민을 갖는 이상계 반응 시스템에서 수행하였다(도 8). 구체적으로, 1 mL의 이소옥탄을 100 mM rac-호모알라닌, 200 mM 벤질아민, 0.82 mg/L VHb-DAAO 전세포, 0.36 mg/L ω-TA 전세포를 포함하는 1 mL의 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)에 주의하여 첨가한 후, 37℃에서 인큐베이트시켰다.
그 결과, 0.82 mg/mL의 VHb-DAAO 전세포 및 0.36 mg/mL의 ω-TA 전세포를 이용하는 경우, 전세포 반응은 10시간 내에 99.1% 전환(> 99% ee)을 나타내었다(도 9). 이는 카탈라제 및 FAD의 결핍 하에서도 성공적인 탈라세미화 반응을 나타내었다. D-호모알라닌은 4시간의 전세포 반응 내에 완전히 제거되었다.
그런 다음, 500 mM rac-호모알라닌의 반응 동안, 10 mL의 이소옥탄을 500 mM rac-호모알라닌, 500 mM 벤질아민, 1.64 mg/L VHb-DAAO 전세포 및 0.9 mg/L ω-TA 전세포를 포함하는 10 mL의 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)에 주의하여 첨가하였다. 그 결과, 전세포 반응은 36시간 내에 97% 전환(> 99% ee)을 나타내었다(도 10).
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<210> 1
<211> 1107
<212> DNA
<213> Rhodotorula gracilis
<400> 1
atgcactcgc agaagcgcgt cgttgtcctc ggatcaggcg ttatcggtct gagcagcgcc 60
ctcatcctcg ctcggaaggg ctacagcgtg catattctcg cgcgcgactt gccggaggac 120
gtctcgagcc agactttcgc ttcaccatgg gctggcgcga attggacgcc tttcatgacg 180
cttacagacg gtcctcgaca agcaaaatgg gaagaatcga ctttcaagaa gtgggtcgag 240
ttggtcccga cgggccatgc catgtggctc aaggggacga ggcggttcgc gcagaacgaa 300
gacggcttgc tcgggcactg gtacaaggac atcacgccaa attaccgccc cctcccatct 360
tccgaatgtc cacctggcgc tatcggcgta acctacgaca ccctctccgt ccacgcacca 420
aagtactgcc agtaccttgc aagagagctg cagaagctcg gcgcgacgtt tgagagacgg 480
accgttacgt cgcttgagca ggcgttcgac ggtgcggatt tggtggtcaa cgctacggga 540
cttggcgcca agtcgattgc gggcatcgac gaccaagccg ccgagccaat ccgcgggcaa 600
accgtcctcg tcaagtcccc atgcaagcga tgcacgatgg actcgtccga ccccgcttct 660
cccgcctaca tcattccccg accaggtggc gaagtcatct gcggcgggac gtacggcgtg 720
ggagactggg acttgtctgt caacccagag acggtccagc ggatcctcaa gcactgcttg 780
cgcctcgacc cgaccatctc gagcgacgga acgatcgaag gcatcgaggt cctccgccac 840
aacgtcggct tgcgacctgc acgacgaggc ggaccccgcg ttgaggcaga acggatcgtc 900
ctgcctctcg accggacaaa gtcgcccctc tcgctcggca ggggcagcgc acgagcggcg 960
aaggagaagg aggtcacgct tgtgcatgcg tatggcttct cgagtgcggg ataccagcag 1020
agttggggcg cggcggagga tgtcgcgcag ctcgtcgacg aggcgttcca gcggtaccac 1080
ggcgcggcgc gggagtcgaa gttgtag 1107
<210> 2
<211> 1545
<212> PRT
<213> Rhodotorula gracilis
<400> 2
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
435 440 445
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
530 535 540
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
565 570 575
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
580 585 590
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
595 600 605
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
610 615 620
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
625 630 635 640
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
645 650 655
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
660 665 670
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
675 680 685
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
690 695 700
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
705 710 715 720
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
725 730 735
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
740 745 750
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
755 760 765
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
770 775 780
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
785 790 795 800
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
805 810 815
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
820 825 830
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
835 840 845
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
850 855 860
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
865 870 875 880
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
885 890 895
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
900 905 910
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
915 920 925
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
930 935 940
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
945 950 955 960
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
965 970 975
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
980 985 990
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
995 1000 1005
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1010 1015 1020
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1025 1030 1035 1040
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1045 1050 1055
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1060 1065 1070
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1075 1080 1085
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1090 1095 1100
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1105 1110 1115 1120
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1125 1130 1135
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1140 1145 1150
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1155 1160 1165
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1170 1175 1180
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1185 1190 1195 1200
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1205 1210 1215
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1220 1225 1230
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1235 1240 1245
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1250 1255 1260
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1265 1270 1275 1280
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1285 1290 1295
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1300 1305 1310
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1315 1320 1325
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1330 1335 1340
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1345 1350 1355 1360
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1365 1370 1375
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1380 1385 1390
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1395 1400 1405
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1410 1415 1420
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1425 1430 1435 1440
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1445 1450 1455
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1460 1465 1470
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1475 1480 1485
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1490 1495 1500
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1505 1510 1515 1520
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1525 1530 1535
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1540 1545
<210> 3
<211> 1545
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vitreoscilla hemoglobin-D-amino acid oxidase
<400> 3
atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60
ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120
cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180
gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240
attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 300
gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 360
gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 420
tacgctcaag cggttgaaat gcactcgcag aagcgcgtcg ttgtcctcgg atcaggcgtt 480
atcggtctga gcagcgccct catcctcgct cggaagggct acagcgtgca tattctcgcg 540
cgcgacttgc cggaggacgt ctcgagccag actttcgctt caccatgggc tggcgcgaat 600
tggacgcctt tcatgacgct tacagacggt cctcgacaag caaaatggga agaatcgact 660
ttcaagaagt gggtcgagtt ggtcccgacg ggccatgcca tgtggctcaa ggggacgagg 720
cggttcgcgc agaacgaaga cggcttgctc gggcactggt acaaggacat cacgccaaat 780
taccgccccc tcccatcttc cgaatgtcca cctggcgcta tcggcgtaac ctacgacacc 840
ctctccgtcc acgcaccaaa gtactgccag taccttgcaa gagagctgca gaagctcggc 900
gcgacgtttg agagacggac cgttacgtcg cttgagcagg cgttcgacgg tgcggatttg 960
gtggtcaacg ctacgggact tggcgccaag tcgattgcgg gcatcgacga ccaagccgcc 1020
gagccaatcc gcgggcaaac cgtcctcgtc aagtccccat gcaagcgatg cacgatggac 1080
tcgtccgacc ccgcttctcc cgcctacatc attccccgac caggtggcga agtcatctgc 1140
ggcgggacgt acggcgtggg agactgggac ttgtctgtca acccagagac ggtccagcgg 1200
atcctcaagc actgcttgcg cctcgacccg accatctcga gcgacggaac gatcgaaggc 1260
atcgaggtcc tccgccacaa cgtcggcttg cgacctgcac gacgaggcgg accccgcgtt 1320
gaggcagaac ggatcgtcct gcctctcgac cggacaaagt cgcccctctc gctcggcagg 1380
ggcagcgcac gagcggcgaa ggagaaggag gtcacgcttg tgcatgcgta tggcttctcg 1440
agtgcgggat accagcagag ttggggcgcg gcggaggatg tcgcgcagct cgtcgacgag 1500
gcgttccagc ggtaccacgg cgcggcgcgg gagtcgaagt tgtag 1545
<210> 4
<211> 514
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vitreoscilla hemoglobin-D-amino acid oxidase
<400> 4
Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val
1 5 10 15
Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu
20 25 30
Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln
35 40 45
Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala
50 55 60
Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys
65 70 75 80
Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro
85 90 95
Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val
115 120 125
Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala
130 135 140
Val Glu Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val
145 150 155 160
Ile Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val
165 170 175
His Ile Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe
180 185 190
Ala Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr
195 200 205
Asp Gly Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp
210 215 220
Val Glu Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg
225 230 235 240
Arg Phe Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp
245 250 255
Ile Thr Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly
260 265 270
Ala Ile Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr
275 280 285
Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu
290 295 300
Arg Arg Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu
305 310 315 320
Val Val Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp
325 330 335
Asp Gln Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser
340 345 350
Pro Cys Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala
355 360 365
Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr
370 375 380
Gly Val Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg
385 390 395 400
Ile Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly
405 410 415
Thr Ile Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro
420 425 430
Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro
435 440 445
Leu Asp Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg
450 455 460
Ala Ala Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser
465 470 475 480
Ser Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln
485 490 495
Leu Val Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser
500 505 510
Lys Leu
<210> 5
<211> 1362
<212> DNA
<213> Vibrio Fluvialis
<400> 5
atgaacaaac cgcaaagctg ggaagcccgg gccgagacct attcgctcta tggtttcacc 60
gacatgcctt cgctgcatca gcgcggcacg gtcgtcgtga cccatggcga gggaccctat 120
atcgtcgatg tgaatggccg gcgttatctg gacgccaact cgggcctgtg gaacatggtc 180
gcgggctttg accacaaggg gctgatcgac gccgccaagg cccaatacga gcgttttccc 240
ggttatcacg cctttttcgg ccgcatgtcc gatcagacgg taatgctgtc ggaaaagctg 300
gtcgaggtgt cgccctttga ttcgggccgg gtgttctata caaactcggg gtccgaggcg 360
aatgacacca tggtcaagat gctatggttc ctgcatgcag ccgagggcaa accgcaaaag 420
cgcaagatcc tgacccgctg gaacgcctat cacggcgtga ccgccgtttc ggccagcatg 480
accggcaagc cctataattc ggtctttggc ctgccgctgc cgggctttgt gcatctgacc 540
tgcccgcatt actggcgcta tggcgaagag ggcgaaaccg aagagcagtt cgtcgcccgc 600
ctcgcccgcg agctggagga aacgatccag cgcgagggcg ccgacaccat cgccggtttc 660
tttgccgaac cggtgatggg cgcgggcggc gtgattcccc cggccaaggg gtatttccag 720
gcgatcctgc caatcctgcg caaatatgac atcccggtca tctcggacga ggtgatctgc 780
ggtttcggac gcaccggtaa cacctggggc tgcgtgacct atgactttac acccgatgca 840
atcatctcgt ccaagaatct tacagcgggc tttttcccca tgggggcggt gatccttggc 900
ccggaacttt ccaaacggct ggaaaccgca atcgaggcga tcgaggaatt cccccatggc 960
tttaccgcct cgggccatcc ggtcggctgt gctattgcgc tgaaagcaat cgacgtggtg 1020
atgaatgaag ggctggctga gaacgtccgc cgccttgccc cccgtttcga ggaaaggctg 1080
aaacatatcg ccgagcgccc gaacatcggt gaatatcgcg gcatcggctt catgtgggcg 1140
ctggaggctg tcaaggacaa ggcaagcaag acgccgttcg acggcaacct gtcggtcagc 1200
gagcgtatcg ccaatacctg caccgatctg gggctgattt gccggccgct tggtcagtcc 1260
gtcgtccttt gtccgccctt tatcctgacc gaggcgcaga tggatgagat gttcgataaa 1320
ctcgaaaaag cccttgataa ggtctttgcc gaggttgcct ga 1362
<210> 6
<211> 453
<212> PRT
<213> Vibrio Fluvialis
<400> 6
Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val
20 25 30
Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
50 55 60
His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
65 70 75 80
Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
85 90 95
Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe
100 105 110
Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu
115 120 125
Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu
130 135 140
Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
145 150 155 160
Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
165 170 175
Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu
180 185 190
Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr
195 200 205
Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro
210 215 220
Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln
225 230 235 240
Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
245 250 255
Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
260 265 270
Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr
275 280 285
Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser
290 295 300
Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala
325 330 335
Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
340 345 350
Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
355 360 365
Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val
370 375 380
Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser
385 390 395 400
Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro
405 410 415
Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala
420 425 430
Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
435 440 445
Phe Ala Glu Val Ala
450
Claims (17)
- D-호모알라닌(D-homoalanine)에 비트레오실라 헤모글로빈과 D-아미노산 옥시다아제의 융합단백질(Vitreoscilla hemoglobin―D-amino acid oxidase, VHb―DAAO), 오메가-트랜스아미나아제(ω-transaminase, ω-TA) 및 아미노 공여체(amino donor)를 처리하는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 1항에 있어서, 카탈라제(catalase)를 함께 처리하는 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 1항에 있어서, VHb―DAAO 융합단백질은 서열번호 3으로 나타내는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 1항에 있어서, ω-TA는 서열번호 5로 나타내는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 1항에 있어서, 아미노 공여체는 벤질아민(benzylamine)인 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 1항에 있어서, VHb―DAAO 융합단백질이 D-호모알라닌을 산화시켜 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)를 생산하고, ω-TA가 아미노 공여체를 이용하여 2-케토부티레이트로부터 L-호모알라닌으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 도 1에 기재된 반응으로 수행되는 것을 특징으로 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 1) D-호모알라닌, VHb―DAAO 효소, ω-TA 효소, FAD(Flavin Adenine Dinucleotide) 효소, 벤질아민, 및 카탈라제를 포함하는 인산완충용액에 이소옥탄을 첨가하여 유기/수용성의 이상계(biphasic) 반응물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 이상계 반응물을 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 8항에 있어서, 단계 1) D-호모알라닌 및 벤질아민은 수용액 상태인 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 8항에 있어서, 단계 2)의 인큐베이션은 35 ~ 40℃에서 진탕으로 인큐베이션시키는 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 1) D-호모알라닌, VHb―DAAO 발현 재조합 전세포(whole cell), ω-TA 발현 재조합 전세포, 및 벤질아민를 포함하는 인산완충용액에 이소옥탄을 첨가하여 유기/수용성의 이상계 반응물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 이상계 반응물을 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는, L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 11항에 있어서, 단계 1)의 VHb―DAAO 발현 재조합 전세포는 VHb―DAAO 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 제조된 형질전환체인 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 11항에 있어서, 단계 1)의 ω-TA 발현 재조합 전세포는 ω-TA 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 제조된 형질전환체인 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- 제 11항에 있어서, 단계 1)에서 카탈라제 또는 FAD를 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 L-호모알라닌 생산을 위한 D-호모알라닌의 탈라세미화 방법.
- VHb―DAAO 효소, ω-TA 효소, FAD, 벤질아민 및 카탈라제를 포함하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물.
- VHb―DAAO 발현 재조합 전세포, ω-TA 발현 재조합 전세포 및 벤질아민을 포함하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물.
- 제 16항에 있어서, 카탈라제 또는 FAD를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 D-호모알라닌의 탈라세미화를 위한 조성물.
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| KR1020120025383A KR101291589B1 (ko) | 2012-03-13 | 2012-03-13 | Ｄ―아미노산 옥시다아제 및 ω―트랜스아미나아제를 이용한 호모알라닌의 탈라세미화 방법 |
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| KR101291589B1 true KR101291589B1 (ko) | 2013-08-05 |
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| KR (1) | KR101291589B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543263A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-05-04 | 吉林大学 | 一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系、构建方法及应用 |
-
2012
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Appl Microbiol Biotechnol. 2011, Vol.90, pp.903-910 * |
| Chem. Connun. 2009, pp.2127-2129 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543263A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-05-04 | 吉林大学 | 一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系、构建方法及应用 |
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