CN112888780A - 编码改进的转氨酶蛋白的核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有改进的ω‑转氨酶(ω‑TA)活性的蛋白，编码具有改进的ω‑TA活性的各个蛋白的核酸分子，以及立体选择性合成手性胺和氨基酸或增加对映体混合物中的手性胺异构体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有改进的ω-转氨酶(ω-TA)活性的蛋白，编码具有改进的ω-TA活性的各蛋白的核酸分子以及立体选择性地合成手性胺和氨基酸或在对映异构体混合物中增加手性胺异构体的方法。
生物催化可以基于自然界中可用的酶。通常，生产特定产品的需求产生了对特定酶的需求，该需求适合于经济上可行地大规模生产所需产品。酶工程是优化酶以经济地生产给定产品的一种选择。
胺和氨基酸在自然界中无处不在，不仅作为蛋白和核酸的一部分，而且作为神经递质(例如，肾上腺素和组胺)，作为辅酶(例如，辅酶A的半胱胺)或复合脂质(例如，磷脂酰乙醇胺的乙醇胺)的前体也非常重要。特别是药学上分类为生物碱的高级置换胺显示出各种结构形式，以及在各种生命形式中发现的生物效应。胺的生物活性，如抗生性、镇痛性或神经毒性活性，提高了其作为药物的潜力，因此使其成为新药研发上极有希望的候选者。手性胺立体中心的绝对构型对于与生物分子的相互作用以及对生物系统的作用类型至关重要。为生产所需的靶分子，产生正确的手性通常是一项挑战(Schaetzle,2011,InauguralDissertation,Ernst-Moritz-Arndt-University of Greifswald,Germany,“Identification,characterization and application of novel(R)-selective aminetransaminases”)。
制药公司研发管线中的很多活性化合物都是手性的。光学活性胺属于用于合成很多活性药物和农业产品的重要化合物类别。例如，L-苯丙氨酸是动物饲料中的重要添加剂。没有可用于化学合成对映异构体纯氨基酸的商业可行方法。然而，外消旋氨基酸的化学合成仍然很重要，因为在一些情况下通过生物催化方法可以将外消旋混合物拆分为纯异构体(Breuer等，2004,Angewandte Chemie International Edition 43,788-824)。
胺转氨酶或ω-转氨酶(ω-TA)是对生产手性伯胺具有重要意义的生物催化剂。ω-TA利用吡哆醛-5′-磷酸(PLP)作为辅因子，催化氨基从氨基供体向羰基部分的转移。因此，反应混合物由两种胺(氨基供体和产物)和两种羰基化合物(酮底物和副产物)组成。已发现有(S)-选择性和(R)-选择转氨酶两者，且到目前为止已有很好的描述。这些酶具有高度的立体选择性，因此，对于直接不对称胺化具有很大的潜力，其中使用廉价的氨基供体直接从非手性酮中产生高对映体过量的手性胺(Fesko等，2013,J.Molecular Catalysis B,Enzymatic 96,103-110)。
转氨酶已在很多手性胺和氨基酸的生物催化合成中引起关注。转氨酶可用于外消旋氨基酸的动力学拆分(从混合物中除去一种异构体)，也可用于从相应的前手性酮底物开始的不对称合成中。可以将转氨酶催化的反应认为是氧化还原反应，其中供体的氧化脱氨基与受体的还原性胺结合在一起(Rudat等，2012,AMB Express2:11)。
Cann等(2012,Org.Process Res.Dev.16,1953-1966)公开了ω-转氨酶成功用于立体选择性生产ω-转氨酶，ω-转氨酶是生产偏头痛药物的前体。讨论了酶促合成与化学合成的优缺点。
US 4,950,606描述了用于生产光学活性胺的方法。在此方法中，来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的ω-转氨酶通过从氨基供体对氨基的对映选择性转移将前手性酮或酮酸转化为胺。可以获得胺的(R)-和(S)-构型。
Park等(2013,Organic&Biomolecular Chemistry 11,6929-6933)公开了在使用异丙胺和各种其他化合物作为胺供体的情况下，不同转氨酶在从酮酸对映选择性合成非天然氨基酸中的行为。
Park等(2013,ChemCatChem 5,1734-1738)通过在一锅反应中使用外消旋芳基烷基胺作为氨基供体，证明了使用(R)-或(S)-选择性ω-转氨酶进行热力学上有利的前手性烷基酮的不对称胺化的可行性。该反应不需要添加过量氨基供体或除去共产物。
使用2-丙基胺、1-丙基胺和外消旋-2-丁基胺作为氨基供体的ω-转氨酶催化反应，与其中使用丙氨酸作为氨基供体的反应，已显示出产生高达3倍的转化。氨基酸β-丙氨酸和天冬酰胺是较差的氨基供体。对于一些含有芳香残基的甲基酮类，当使用过量的2-丁基胺或1-苯乙基胺作为氨基供体时，获得了高产率的光学醇胺类。不需要进一步的步骤来移动平衡(Fesko等，2013,J.Molecular Catalysis B,Enzymatic 96,103-110)
Shin&Kim(2001,Biosci.Biotechno.Biochem.65(8),1782-1788)公开了使用芳基胺，包括(S)-α-甲基苯甲基胺((S)-α-MBA)、1-甲基-3-苯丙基-胺、1-氨基四氢萘或1-氨基茚满作为胺供体，分离ω-转氨酶。发现酮酸类丙酮酸(ketoacids pyruvate)和乙醛酸(glyoxylate)或醛类丙醛(aldehydes propionaldehyde)和丁醛(butaraldehyde)是良好的氨基受体。
US 6,133,018公开了通过使用甲氧基丙酮和非手性氨基供体2-氨基丙烷与ω-转氨酶接触来生产(S)-1-甲氧基-2-氨基丙烷。
在Galkin等(1997,J.Fermentation and Bioengeneering 83(3),299-300)中描述了通过以D-氨基酸氨基转移酶(转氨酶)催化，使用D-丙氨酸作为氨基供体将酮酸转变为各个D-氨基酸来生产D-氨基酸的四酶系统。为了驱动D-氨基酸方向上的反应平衡，进一步的反应与D-氨基酸氨基转移酶偶联。丙酮酸和氨通过丙氨酸脱氢酶转化为L-丙氨酸，同时将NADH还原为NAD。L-丙氨酸被丙氨酸消旋酶转化为D-丙氨酸。通过从甲酸脱氢酶催化的甲酸形成二氧化碳来建立来自NAD的NADH再循环。丙酮酸通过D-氨基酸氨基转移酶反应从丙氨酸再循环。谷氨酸、亮氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸的D-对映异构体可以高收率的生产，而D-苯丙氨酸和D-酪氨酸以低收率合成，D-正缬氨酸仅以接近30％生产而氨基丁酸则仅以外消旋混合物形式生产。
WO 2010/089171 A2公开了以具有转氨酶活性的酶所催化的反应在包含至少一个酮基的多环环系中将至少一个酮基胺化成氨基的方法。
WO 2015/195707 A1(US2015361468 A1)公开了通过转基因细菌生产五碳聚合物构建嵌段。细菌生合成途径是由引入包含ω-转氨酶的多种酶操纵的。已发现ω-转氨酶催化戊二酸半醛向5-氨基戊酸的反应和逆反应，以及5-氨基戊醇向5-氧代戊醇、尸胺向5-氨基戊醛、N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷向N5-乙酰基-5-氨基戊醛的反应。分别将L-谷氨酸/2-氧代戊二酸或L-丙氨酸/丙酮酸用作氨基供体/受体。
KR 20030072067公开了嗜热芽孢杆菌属(thermophyllic Bacillus sp.)T30菌株(L-选择性芳香氨基酸转移酶(转氨酶))的分离，和使用该菌株作为生物催化剂用于在高反应温度下生产芳香L-氨基酸，从而增加酮酸底物的溶解度。
Koszelewski等(2010,ChemCat Chem 2(1),73-77,including“SupportingInformation”)公开了将全细胞催化剂用于从相应的前手性胺合成对映异构体纯的胺和拆分外消旋胺的用途。在大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中表达了来自巨大芽孢杆菌SC6394，反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)Y2k-2，紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)DSM30191，河流弧菌(Vibrio fluvialis)ω-转氨酶的W57G突变体和来源于节细菌(Arthrobacter)属种称为CNB05-01的突变体的不同ω-转氨酶。将冻干的大肠杆菌细胞用于动力学拆分和离体选择性胺化反应。
通过使用转氨酶可获得的产品范围受到大多数天然存在的ω-转氨酶性质的限制，即其在与酮相邻的位置不接受比乙基更大的底物(Savile等，2010,Science 329,305-309,including“Supporting Information”)。Park等(2014,Adv.Synth.Catal.356,212-220)从脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)中发现了一种(S)-选择性ω-转氨酶，其接受带有至多为正丁基置换基(即，2-氧代己酸正己酯)的受体底物，但不接受支链α-酮酸。来自脱氮副球菌的(S)-选择性ω-转氨酶的变体(V153A)确实显示出对线性酮酸(S)-1-苯丁基胺的活性提高，但不接受支链酮酸。
在作为胺供体的异丙胺的存在下，从经取代的四氢萘酮制备经置换(S)-氨基四氢萘的反应中，与各个野生型序列的氨基酸序列相比，包含17个氨基酸取代的嗜温性柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)ω-转氨酶的变体，显示出提高的热稳定性和显著改善的比活性(Martin等，2007,Biochemical Engineering Journal 37,246-255)。
Savile等(2010,Science 329,305-309,including“Supporting Information”)公开了通过涉及ω-转氨酶的生物催化方法来制备复合抗糖尿病药物西格列汀。生产了节杆菌属(R)-选择性ω-转氨酶(ATA-117)的各种变体。这些酶显示出广泛的底物范围，对异丙胺和有机溶剂的耐受性增加。各种被三氟甲基取代的胺和苯胺可通过这些酶来生产。与野生型酶相比，含有27个氨基酸取代的节杆菌属(R)-选择性ω-转氨酶的优化变体(ATA-117)用于在存在异丙胺作为胺供体的条件下通过前列腺素酮的胺化来生产西格列汀。
WO 2006/06339(US 7,247,460)公开了与每种野生型酶相比，在每种情况下都是热稳定的，具有增加的反应速率和对高胺供体浓度的耐受性的柠檬节杆菌ω-转氨酶变体。
尽管迄今为止已经获得了转氨酶的几种改进，但是在胺的不对称合成或外消旋胺的拆分过程中出现的局限性，如不利的平衡、底物和产物的抑制、热稳定性较差、底物特异性不充分和有时转氨酶的对应异构选择性较低仍必须被克服，以便在工业规模上高效生产广泛的胺。
因此，需要对ω-转氨酶进行进一步改进。特别是在生产所需的胺化、对映异构体富集的或纯净的产品方面，优选在特定的和/或经济上可行的生产方法下需要进一步改进的ω-转氨酶。
发明内容
本发明提供了在其氨基酸序列中包含修饰的ω-转氨酶(ω-TA)变体或在其氨基序列中包含另外的修饰的进一步修饰的ω-转氨酶(ω-TA)变体，与相应的野生型ω-TA相比，这些变体和包含进一步的氨基酸修饰的进一步修饰的变体具有改进的反应动力学、改善的底物接受性和改善的比活性。因此，本发明的变体和包含进一步的氨基酸修饰的变体，通过将其用于使用相应的野生型ω-TA不能实现的新胺化产品或相应产品前体的生产方法中，能够开发出经济高效的胺化产品生产工艺。
本文所述的ω-TA的变体或进一步修饰的变体具有优于已知的野生型和其他已知的ω-TA的优点。特别地，本文所述的修饰的或变体ω-TA具有可以产生对映异构体富集的或者对映异构体接近纯的或纯的化合物的优点，比如例如，不能用相应的野生型ω-转氨酶生产的支链或芳香氨基酸。本文所述的进一步修饰的ω-TA变体具有可产生磷酸化-氨基酸的对映异构体富集的、接近纯的或纯的化合物的优点。
SEQ ID NO 3中的位置1至477代表来自GenPept(PDB)的登录号为No 5G09_A的巨大芽孢杆菌的野生型ω-转氨酶(ω-TA)的氨基酸序列。
SEQ ID NO 6中的位置1至479代表来自GenPept(PDB)的登录号为No 5G2P_A的节杆菌属的野生型ω-TA的氨基酸序列。
SEQ ID NO 9中的位置1至476代表来自GenPept(PDB)的登录号为No KRF52528.1的杆菌属(土壤76801D1)的野生型ω-TA的氨基酸序列。
SEQ ID NO 12中的位置1至476代表来自WO 2006/06336 A2的SEQ ID NO 16的节杆菌属的ω-TA变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO 15中的位置1至476代表来自WO 2006/06336 A2的SEQ ID NO 2的节杆菌属的野生型ω-TA的氨基酸序列。
本文描述了具有ω-TA活性的蛋白，其中这些蛋白的氨基酸序列代表了具有ω-TA活性的已知蛋白的变体。特别地，本文所述的具有ω-TA活性的蛋白的氨基酸序列代表由SEQ ID NO 3中的位置1至477的氨基酸表示的，和/或由SEQ ID NO 6中的位置1至479的氨基酸表示的，和/或由SEQ ID NO 9中的位置1至476的氨基酸表示的，和/或由SEQ ID NO 12中的位置1至476的氨基酸表示的，和/或由SEQ ID NO 15中的位置1至476的氨基酸表示的氨基酸序列的变体，其中在SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12和SEQID NO 15中所示的每个氨基酸序列至少在位置25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410和414的氨基酸不同于在SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 6、SEQID NO 9、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 15所示的每个序列的相应氨基酸位置给出的氨基酸。
使用缩写“ω-TA”并且在本文中指“ω-转氨酶”。
如本文所用，术语“变体”指与本领域公知的主题不同的主题。关于核酸分子和蛋白，应将变体理解为分别包含核酸序列或氨基酸序列，其偏离相应的已知序列，但编码具有相同功能或催化相同反应的蛋白，例如，编码具有ω-TA活性的蛋白的功能。核酸分子序列和氨基酸序列与已知核酸序列和蛋白序列的偏离意味着与相应的已知核酸相比，所述序列分别包含核苷酸或氨基酸的置换(取代)和/或缺失和/或插入。
本发明的第一个方面涉及具有ω-TA活性的蛋白，其中所述蛋白选自以下：
a)包含如SEQ ID NO 3所示的从位置1至477的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
b)包含如SEQ ID NO 6所示的从位置1至479的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是T，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
c)包含如SEQ ID NO 9所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
d)包含如SEQ ID NO 12所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸和在位置187的氨基酸不是S，不是E，在位置197的氨基酸不是T，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
e)包含如SEQ ID NO 15所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸和在位置187的氨基酸不是S，不是E，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
f)具有与a)、b)、c)、d)、e)或f)所示的任何氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过在各种情况下对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是T或M，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，和对应于位置414的氨基酸不是P。
氨基酸缩写A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y的含义可以由下文中副标题“序列说明”段落的表4导出。
第一个氨基酸序列中“对应于位置x的氨基酸”(例如，在SEQ ID NO 3中的位置64)在本文中指，在第一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列配对序列比对下，如果第二个氨基酸序列的氨基酸编号与第一个氨基酸序列的氨基酸编号不同，当与第一个氨基酸序列比较时，显示在第一个氨基酸序列位置x的第二个氨基酸序列的氨基酸。
在本发明的上下文中，就序列同一性或与之相同的序列而言，术语“同一性”应理解为指在整个序列长度中第一核酸或氨基酸序列分别与另外的(第二)核酸或氨基酸序列所共享的相同氨基酸或核苷酸的数量，其以百分比表示。
“序列同一性”可以通过使用例如包含在已知软件如GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”中的全局或局部比对算法，通过两个氨基酸或两个核苷酸序列的比对来确定。这些软件使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上进行比对，最大程度地增加了匹配数，并最小化了空位数。在通常情况下，使用默认参数，空位创建罚分＝10和空位延伸罚分＝0.5(核苷酸和蛋白比对两者均使用)。对于核苷酸，默认评分矩阵是DNAFULL，以及对于蛋白，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。序列比对和序列同一性百分比的分数例如可以使用可在EBI的万维网站点(ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上访问的软件(如EMBOSS)确定。或者，可以通过使用众所周知的算法和诸如FASTA、BLAST等的输出格式对数据库(例如，EMBL，GenBank)进行检索来确定序列相似性或同一性，但是优选地，应当检索命中并配对比对以最终确定序列同一性。
优选地，借助于计算机程序，通过比较SEQ ID NO 18中给出的氨基酸序列来确定具有ω-TA活性的蛋白的同一性，以及分别通过比较SEQ ID NO 16或17中给出的核酸序列与其他蛋白或核酸分子来确定编码具有ω-TA活性的蛋白的核酸分子的同一性。如果要相互比较的序列长度不同，则应分别通过确定较短序列与较长序列共享的氨基酸或核苷酸数目的百分比来确定同一性。优选地，使用已知的和公众可获得的计算机程序ClustalW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994),4673-4680)确定同一性。ClustalW是由Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE),European Molecular Biology Laboratory,Meyerhofstrasse 1,D69117Heidelberg,Germany公开发布的。ClustalW也可以从多个不同的网页下载，其中包括IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire,B.P.163,67404 Illkirch Cedex,France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp:// ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI的所有镜像网页(European BioinformaticsInstitute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB101SD,UK)。
优选地，使用1.8版的ClustalW计算机程序来确定在本发明的背景中描述的蛋白与其他蛋白之间的同一性。在此，必须按照以下方式设置参数：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
优选地，使用1.8版的ClustalW计算机程序来确定例如在本发明的背景中描述的核酸分子的核苷酸序列与其他核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。在此，必须按照以下方式设置参数：
KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：非加权。
同一性还指所讨论的核酸分子或由其编码的蛋白之间在功能上和/或结构上等同。功能上等同指核酸分子序列或氨基酸序列编码具有ω-TA活性的蛋白。与上述分子同源并且表示这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变体，其代表具有相同生物学功能或催化相同反应的修饰，即编码具有ω-TA活性的蛋白。其可以是天然存在的变体，例如来自其他物种的序列，也可以是突变，其中这些突变可以自然方式发生或通过定向诱变引入。此外，变体可以是合成产生的序列。等位基因变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。然而，关于本发明，决定性的是那些变体编码具有ω-TA活性的蛋白，并且包含本文所述的根据本发明的蛋白的氨基酸置换(置换)、缺失或插入。
特殊类型的衍生物是例如由于遗传密码的简并性而与本发明上下文中描述的核酸分子不同的核酸分子。
根据NC-IUBMB(国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会)的规定，转氨酶(TA)属于转移酶的类别(EC 2)。转移酶是将一个基团(例如，甲基或糖基)从一个化合物(通常视为供体)转移到另一个化合物(通常视为受体)的酶。转移酶的组包括转移含氮基团的酶(EC 2.6)。由TA催化的反应在形式上可视为是氧化还原反应，根据通用方程式(I)，通过将-NH2基团和-H转移到含羰基的化合物上来交换(胺)供体的氧化脱氨基和羰基受体的还原胺化，以换取该基团的＝OR1-CH(-NH2)-R2+R3-CO-R4→R1-CO-R2+R3-CH(-NH2)-R4。
同样由TA所催化的逆反应形式上可根据通用方程式(Ia)来描述R1-CO-R2+R3-CH(-NH2)-R4→R1-CH(-NH2)-R2+R3-CO-R4。
TA是吡哆醛5′-磷酸(PLP)依赖性酶。TA催化反应的独特特征是氨基的转移(通过良好建立的涉及共价底物-辅酶中间体机制)，这证明了这些酶在转移酶之间的分配是一个特殊的亚类，称为转氨酶或氨基转移酶(EC 2.6.1)。
TA在本领域中通常进一步分类为α-TA和ω-TA。该命名法基于由各自的TA转移的氨基酸的氨基的相对位置。对于胺而言，羧酸α-TA仅催化α-碳的氨基的氨基转移，其中ω-TA也作用于非α-胺并转移相应底物的远端氨基(Shin等，2003,Appl MicrobiolBiotechnol61,463-471)。然而，本领域已知一些ω-TA能够催化不带有羧基的(伯)胺化合物的氨基转移(Rudat等，2012,AMB Express 2(11)；Shin等，2003,Appl MicrobiolBiotechnol 61,463-471)。
如果蛋白具有TA活性，则特别可以用本领域已知和描述的方法检测ω-TA。Hwang&Kim(2004,Enzyme and Microbiol Technology34(5),429-436)开发了一种基于Cu-SO4/MeOH对α-氨基酸进行蓝色染色的蛋白ω-TA活性检测方法。Truppo等(2009,Org.Biomol.Chem.7,395-398)描述了基于多酶级联pH指示剂测定的用于高通量筛选ω-TA的测定，以及还公开了一种常规的HPLC分析测定。
使用哪种方法来检测根据本发明的蛋白是否具有ω-TA的活性不是决定性的。优选地，关于本发明，在“一般方法”第4项下描述的方法用于检测根据本发明的蛋白是否具有ω-TA的活性，特别是该方法用于检测根据本发明的ω-TA变体是否具有ω-TA的活性。
关于包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体，优选地将在“一般方法”第7项下描述的方法用于检测根据本发明的蛋白是否具有ω-TA的活性。
在本发明的优选实施方式中，根据本发明的蛋白是(S)-选择性ω-TA。
在本发明中，术语“(S)-选择性”指根据通用方程式(I)的(胺)受体的还原胺化产生的对映体过量于(R)-对映异构体的(S)-对映异构体。
由(S)-选择性ω-TA所催化的反应形式上可根据通用方程式(II)来描述
R1-CH(-NH2)-R2+R3-CO-R4→R1-CO-R2+R3-CH((S)-NH2)-R4。
与上文有关SEQ ID No 3、6、9、12或15所示的氨基酸序列所描述的氨基酸序列相比，根据本发明的ω-TA变体蛋白可显示出另外的氨基酸修饰(氨基酸置换、删除或插入)
除了上文a)或c)项所描述的ω-TA变体，SEQ ID NO 3从位置1至477所示的氨基酸序列或SEQ ID NO 9从位置1至477所示的氨基酸序列，分别在位置2和/或48和/或164和/或242和/或245和/或311和/或353和/或424可具有另外的氨基酸置换，和/或SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列在位置202和/或205和/或359和/或475和/或476可具有另外的氨基酸置换，和/或在位置477可具有氨基酸缺失，和/或SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列在位置69和/或90和/或268和/或318和/或322和/或452可具有另外的氨基酸置换。
除了上文b)或d)项所描述的ω-TA变体，SEQ ID NO 6从位置1至479所示的氨基酸序列或SEQ ID NO 12从位置1至476所示的氨基酸序列，分别在位置46和/或60和/或185和/或186和/或195和/或205和/或252和/或268和/或409和/或436可具有另外的氨基酸置换，和/或在SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列中在位置477和/或478和/或479的氨基酸可以被缺失。
除了上文e)项所描述的ω-TA变体，SEQ ID NO 15从位置1至476的氨基酸序列在位置48和/或164和/或242和/或245和/或255和/或424可具有另外的氨基酸置换。
因此，本发明的另一个实施方式涉及根据本发明的蛋白，其包含另外的氨基酸修饰，优选地那些实施方式是具有ω-TA活性的蛋白，其中所述蛋白选自以下
a)包含如SEQ ID NO 3所示的从位置1至477的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，在位置414的氨基酸不是P，在位置2的氨基酸不是S，在位置48的氨基酸不是D，在位置164的氨基酸不是Y，在位置202的氨基酸不是D，在位置205的氨基酸不是L，在位置242的氨基酸不是A，在位置245的氨基酸不是A，在位置311的氨基酸不是L，在位置353的氨基酸不是F，在位置359的氨基酸不是D，在位置424的氨基酸不是K，在位置475的氨基酸不是A，在位置476的氨基酸不是L，和在位置477的氨基酸被缺失；
b)包含如SEQ ID NO 6所示的从位置1至479的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是T，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，在位置414的氨基酸不是P，在位置46的氨基酸不是T，在位置60的氨基酸不是C，在位置185的氨基酸不是C，在位置186的氨基酸不是S，在位置195的氨基酸不是S，在位置205的氨基酸不是Y，在位置252的氨基酸不是V，在位置268的氨基酸不是S，在位置409的氨基酸不是R，在位置436的氨基酸不是A，和在位置477、478和479的氨基酸被缺失；
c)包含如SEQ ID NO 9所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，在位置414的氨基酸不是P，在位置2的氨基酸不是S，在位置48的氨基酸不是D，在位置69的氨基酸不是P，在位置90的氨基酸不是S，在位置164的氨基酸不是Y，在位置242的氨基酸不是A，在位置245的氨基酸不是A，在位置268的氨基酸不是T，在位置311的氨基酸不是L，在位置318的氨基酸不是E，在位置322的氨基酸不是R，在位置353的氨基酸不是S，在位置424的氨基酸不是K，和在位置452的氨基酸不是E；
d)包含如SEQ ID NO 12所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是T，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H和，位置414的氨基酸不是P，在位置46的氨基酸不是T，在位置60的氨基酸不是C，在位置185的氨基酸不是C，在位置186的氨基酸不是C，在位置195的氨基酸不是S，在位置205的氨基酸不是Y，在位置252的氨基酸不是V，在位置268的氨基酸不是S，在位置409的氨基酸不是R，和在位置436的氨基酸不是A；
e)包含如SEQ ID NO 15所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，在位置414的氨基酸不是P，在位置48的氨基酸不是D，在位置164的氨基酸不是Y，在位置242的氨基酸不是A，在位置245的氨基酸不是A，在位置255的氨基酸不是F，和在位置424的氨基酸不是K；
f)具有与a)中所定义的任何氨基酸序列(如SEQ ID NO 3所示从位置1至477的氨基酸序列)至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％相同的氨基酸序列的蛋白，不过对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是M，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，对应于位置414的氨基酸不是P，对应于位置2的氨基酸不是S，对应于位置48的氨基酸不是D，对应于位置164的氨基酸不是Y，对应于位置202的氨基酸不是D，对应于位置205的氨基酸不是L，对应于位置242的氨基酸不是A，对应于位置245的氨基酸不是A，对应于位置311的氨基酸不是L，对应于位置353的氨基酸不是F，对应于位置359的氨基酸不是D，对应于位置424的氨基酸不是K，对应于位置475的氨基酸不是A，对应于位置476的氨基酸不是L，和对应于位置477的氨基酸被缺失；
g)具有与b)中所定义的任何氨基酸序列(如SEQ ID NO 6所示从位置1至476的氨基酸序列)至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％相同的氨基酸序列的蛋白，不过对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是T，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，对应于位置414的氨基酸不是P，对应于位置46的氨基酸不是T，对应于位置60的氨基酸不是C，对应于位置185的氨基酸不是C，对应于位置186的氨基酸不是S，对应于位置195的氨基酸不是S，对应于位置205的氨基酸不是Y，对应于位置252的氨基酸不是V，对应于位置268的氨基酸不是S，对应于位置409的氨基酸不是R，对应于位置436的氨基酸不是A，和对应于位置477、478和479的氨基酸被缺失；
h)具有与c)中所定义的任何氨基酸序列(如SEQ ID NO 9所示从位置1至479的氨基酸序列)至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％相同的氨基酸序列的蛋白，不过对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是M，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，对应于位置414的氨基酸不是P，对应于位置2的氨基酸不是S，对应于位置48的氨基酸不是D，对应于位置69的氨基酸不是P，对应于位置90的氨基酸不是S，对应于位置164的氨基酸不是Y，对应于位置242的氨基酸不是A，对应于位置245的氨基酸不是A，对应于位置268的氨基酸不是T，对应于位置311的氨基酸不是L，对应于位置318的氨基酸不是E，对应于位置322的氨基酸不是R，对应于位置353的氨基酸不是S，对应于位置424的氨基酸不是K，和对应于位置452的氨基酸不是E；
i)具有与d)中所定义的任何氨基酸序列(如SEQ ID NO 12所示从位置1至476的氨基酸序列)至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％相同的氨基酸序列的蛋白，不过对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是T，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，对应于位置414的氨基酸不是P，对应于位置46的氨基酸不是T，对应于位置60的氨基酸不是C，对应于位置185的氨基酸不是C，对应于位置186的氨基酸不是C，对应于位置195的氨基酸不是S，对应于位置205的氨基酸不是Y，对应于位置252的氨基酸不是V，对应于位置268的氨基酸不是S，对应于位置409的氨基酸不是R，和对应于位置436的氨基酸不是A；
j)具有与e)中所定义的任何氨基酸序列(如SEQ ID NO 15所示从位置1至476的氨基酸序列)至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％相同的氨基酸序列的蛋白，不过对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是M，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，对应于位置414的氨基酸不是P，对应于位置48的氨基酸不是D，对应于位置164的氨基酸不是Y，对应于位置242的氨基酸不是A，对应于位置245的氨基酸不是A，对应于位置255的氨基酸不是F，和对应于位置424的氨基酸不是K。
SEQ ID NO 18中的位置1至476代表ω-TA变体蛋白的氨基酸序列，与以下SEQ IDNO 3(从位置1至477)、SEQ ID NO 6(从位置1至479)、SEQ ID NO 9(从位置1至476)、SEQ IDNO 12(从位置1至476)和SEQ ID NO 15(从位置1至476)所示的每个氨基酸序列相比，其包含上文所述的所有氨基酸修饰。
表1总结了与野生型ω-TA的每个氨基酸序列(在SEQ ID NO 3中的位置1至477，或在SEQ ID NO 6中的位置1至479，或在SEQ ID NO 9中的位置1至476，或在SEQ ID NO 15中的位置1至476)相比以及与来自节杆菌属的经修饰的ω-TA(在SEQ ID NO 12中的位置1至476)相比在根据本发明的ω-TA变体蛋白的氨基酸序列(在SEQ ID NO 18中的位置1至476)中存在的修饰。
表1
在表1中的“末端”表示在分别已知的(野生型)序列的氨基酸序列中存在的最后一个氨基酸之后的位置。
因此，本发明的优选实施方式涉及根据本发明的具有ω-TA活性的蛋白，其选自以下
a)包含如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列的蛋白；
b)具有与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过对应于SEQ IDNO 18的位置25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410和414的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸；
c)具有与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过对应于SEQ IDNO 18的位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475和476的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸。
在最优选的实施方式中，根据本发明编码ω-TA的蛋白是包含如SEQ ID NO 18所示从位置1至476的氨基酸序列的蛋白。
到目前位置，本文以上所述的蛋白在本文中通常称为ω-TA变体或根据本发明的蛋白变体。
发现将进一步的氨基酸修饰引入根据本发明的蛋白变体中进一步改善了ω-TA变体的活性，特别是在其底物特异性方面，这意味着与本文上文所述的ω-TA变体相比，这些进一步修饰的ω-TA变体更适于产生对映异构体富集的或接近纯的产物。作为根据本发明的蛋白，与本文所述的ω-TA变体相比，包含进一步修饰的ω-TA被进一步修饰。包含进一步修饰的ω-TA变体特别适合于生产对映异构体富集或对映异构体接近纯的磷酸氨基酸，并且在本文中指包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体或包含进一步的氨基酸修饰的根据本发明的蛋白。
关于具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体，用于显示蛋白具有ω-TA活性的优选方法例如在WO 2017/151573中进行了描述，用于显示具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的特别优选的方法在本文的“一般方法”第7项中进行了描述。
“对映异构体富集的”在本文中指在组合物中两种对映异构体之一以比另一种对映异构体更高的量存在，优选地至少60％的一种对映异构体存在于组合物中，更优选地65％的一种对映异构体存在于组合物中，又更优选地至少70％的一种对映异构体存在于组合物中，甚至更优选地至少75％的一种对映异构体存在于组合物中，甚至更优选地至少80％的一种对映异构体存在于组合物中，特别优选地至少85％的一种对映异构体存在于组合物中，最优选地至少90％的一种对映异构体存在于组合物中或特别优选地至少94％的一种对映异构体存在于组合物中。
“对映异构体近乎纯的”指在本文中两种对映异构体之一以至少95.0％的量存在于组合物中，优选地两种对映异构体之一以至少95.5％的量存在于组合物中，更优选地两种对映异构体之一以至少96.0％的量存在于组合物中，又更优选地两种对映异构体之一以至少96.5％的量存在于组合物中，甚至更优选地两种对映异构体之一以至少97.0％的量存在于组合物中，甚至更优选地两种对映异构体之一以至少98.0％的量存在于组合物中，特别优选地两种对映异构体之一以至少98.5％的量存在于组合物中，最优选地两种对映异构体之一以至少99.0％的量存在于组合物中或特别优选地两种对映异构体之一以至少99.5％的量存在于组合物中。
因此，根据本发明的另一个实施方式涉及具有ω-TA变体的活性的根据本发明的蛋白变体，其中与根据本发明的蛋白相比根据本发明的氨基酸序列还包含氨基酸修饰。
优选地，本发明的另一个实施方式关于具有包含进一步的氨基酸修饰的根据本发明的ω-TA活性(ω-TA变体)的蛋白的氨基酸序列，因此是具有ω-TA活性的根据本发明的蛋白，其选自以下
a)根据本发明的蛋白，不过在位置166的氨基酸是G和在位置327的氨基酸是Q；
b)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是Q和在位置384的氨基酸是S；
c)根据本发明的蛋白，不过在位置326的氨基酸是Q和在位置327的氨基酸是Q；
d)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是Q；
e)根据本发明的蛋白，不过在位置326的氨基酸是F和在位置327的氨基酸是Q；
f)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是C；
g)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是I；
h)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是M；
i)根据本发明的蛋白，不过在位置164的氨基酸是Y；
j)根据本发明的蛋白，不过在位置164的氨基酸是S；
k)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是V；
l)根据本发明的蛋白，不过在位置409的氨基酸是R；
m)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是S；
n)根据本发明的蛋白，不过在位置271的氨基酸是I；
o)根据本发明的蛋白，不过在位置329的氨基酸是G；
p)根据本发明的蛋白，不过在位置409的氨基酸是P；
q)根据本发明的蛋白，不过在位置414的氨基酸是M；
r)根据本发明的蛋白，不过在位置165的氨基酸是K；
s)根据本发明的蛋白，不过在位置414的氨基酸是R；
t)根据本发明的蛋白，不过在位置414的氨基酸是H；
u)根据本发明的蛋白，不过在位置165的氨基酸是C；
v)根据本发明的蛋白，不过在位置327的氨基酸是V；
w)根据本发明的蛋白，不过在位置164的氨基酸是C；
x)根据本发明的蛋白，不过在位置409的氨基酸是K。
本发明更优选的实施方式关于具有包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA活性的蛋白的氨基酸序列涉及具有ω-TA活性的蛋白，其选自以下
a)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置166的氨基酸S被G置换和在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
b)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换和在SEQ ID NO 18中位置384的氨基酸C被S置换；
c)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置326的氨基酸E被Q置换和在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
d)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
e)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置326的氨基酸E被F置换和在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
f)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被C置换；
g)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被I置换；
h)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被M置换；
i)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置164的氨基酸F被Y置换；
j)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置164的氨基酸F被S置换；
k)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被V置换；
l)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置409的氨基酸T被R置换；
m)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被S置换；
n)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置271的氨基酸V被I置换；
o)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置329的氨基酸S被G置换；
p)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置409的氨基酸T被P置换；
q)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置414的氨基酸L被M置换；
r)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置165的氨基酸Q被K置换；
s)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置414的氨基酸L被R置换；
t)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置414的氨基酸L被H置换；
u)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置165的氨基酸Q被C置换；
v)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被V置换；
w)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置164的氨基酸F被C置换；
x)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置409的氨基酸T被K置换；
y)具有与a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的任何氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过如a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定义的各氨基酸位置分别亦存在于与每个a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的任何氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的蛋白序列的氨基酸序列中对应的氨基酸位置。
作为本发明的实施方式，包含进一步的氨基酸修饰的具有ω-TA变体活性的优选蛋白是如上定义的a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)和p)项下所定义的那些蛋白，更优选的是如上定义的a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)和h)项下所定义的那些蛋白和最优选的是如上定义的a)、b)和c)项下所定义的那些蛋白。
表2总结了与SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列(从位置1至476)相比在包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA的氨基酸序列中存在的另外的氨基酸修饰。
表2
本发明的一个进一步的实施方式涉及编码根据本发明的蛋白的核酸分子。
根据本发明的核酸分子可以是任何种类的核酸，只要核酸编码根据本发明的蛋白即可。核酸可以是核糖核酸分子(例如，RNA、mRNA)或脱氧核糖核酸分子(DNA，包括可包含或不包含内含子和编码DNA的基因组DNA)。
本发明特别感兴趣的是编码具有ω-TA活性的蛋白的核酸分子，所述ω-TA包含如SEQ ID NO 18中的位置1至476所示的氨基酸序列。
因此，本发明还涉及编码具有ω-TA的活性的蛋白的核酸分子，其选自以下
a)包含SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子；
b)编码包含SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列中从位置1至476的氨基酸序列的蛋白的核酸分子；
c)与SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ IDNO17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn；
d)与SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置4至6的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138的密码子具有核苷酸序列atg，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tty，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置589至591的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置754至756的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966的密码子具有核苷酸序列aar，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308的密码子具有核苷酸序列gtn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356的密码子具有核苷酸序列ggn；
e)与a)、b)、c)或d)所定义的核酸分子的互补链杂交的核酸分子，不过对应于SEQID NO 17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn；
f)与a)、b)、c)或d)所定义的核酸分子的互补链杂交的核酸分子，不过对应于SEQID NO 17中核苷酸位置4至6的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138的密码子具有核苷酸序列atg，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置205至207的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tty，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置589至591的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置754至756的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966的密码子具有核苷酸序列aar，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308的密码子具有核苷酸序列gtn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356的密码子具有核苷酸序列ggn；
g)由于密码子的简并性，从a)、b)、c)、d)、e)或f)所定义的核酸分子衍生的核酸分子；
h)编码与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的蛋白的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO18的位置25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410和414的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸；
i)编码与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的蛋白的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO18的位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475和476的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸；
j)包含如SEQ ID NO 16所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子。
SEQ ID NO 16显示了通过具有SEQ ID NO 18所示氨基酸序列的蛋白的反翻译(back-translation)获得的核苷酸序列，其中反映了遗传密码的简并性。
SEQ ID NO 17是因SEQ ID NO 16中遗传密码柔性(flexible)核苷酸的简并性被特定核苷酸置换获得的合成核酸分子。SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17两者均编码具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的具有ω-TA活性的蛋白。
在本发明的背景下，术语“与……杂交”指在常规杂交条件下(优选地在严格条件下)的杂交，例如，如在Sambrook等(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.ISBN:0879695773)或Ausubel等(Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons；第5版(2002),ISBN:0471250929)中所描述的。特别优选地，“杂交”是指在以下条件下的杂交：
杂交缓冲液：
2xSSC；10xDenhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比率1:1:1)；0.1％SDS；5mMEDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱鱼精子DNA；50μg/ml tRNA；
或者
25M磷酸钠缓冲液pH 7.2；1mM EDTA；7％SDS
杂交温度：T＝65至68℃
洗涤缓冲液：0.1xSSC；0.1％SDS
洗涤温度：T＝65至68℃.
与编码具有ω-TA活性的蛋白的核酸分子杂交的核酸分子可以来源于任何生物体；因此，其可以来源于细菌、真菌、动物、人类、植物或病毒。
与编码具有ω-TA活性的蛋白的核酸分子杂交的核酸分子优选地来源于微生物，更优选地来自真菌或细菌，最优选地来自细菌。
与所示分子杂交的核酸分子可以是分离的，例如，从基因组或从cDNA文库。可以使用本文所述的核酸分子鉴定和分离此类核酸分子，或者可以使用这些分子的一部分或者这些分子的反相互补来鉴定和分离，例如通过根据标准方法的杂交(参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.ISBN:0879695773；Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons；第5版(2002),ISBN:0471250929)或通过使用PCR扩增。
可以使用，例如，具有恰好是或基本上SEQ ID NO 2中所述的位置1至1431的核酸序列，或基本上SEQ ID NO 5中所述的位置1至1437的核酸序列，或基本上SEQ ID NO 8中所述的核酸序列，或基本上SEQ ID NO 11中所述的核酸序列，或基本上SEQ ID NO 14中所述的核酸序列，或基本上SEQ ID NO 17中所述的核酸序列，或者这些核酸序列的片段的核酸分子，作为分离编码具有ω-TA活性的蛋白的核酸序列的杂交样本。
用作杂交样品的片段也可以是使用常规合成技术制备的合成片段或寡核苷酸，其序列与本发明上下文中描述的核酸分子基本相同。一旦鉴定并分离了与本发明上下文中描述的核酸序列杂交的基因，就应确定该序列，并应分析由该序列编码的蛋白的性质，以确定其是否为具有ω-TA活性的蛋白。如何确定某一蛋白是否具有ω-TA活性的蛋白活性的方法是本领域技术人员公知的并且已在本文的上文中提及。
与在本发明的上下文中描述的核酸分子杂交的分子特别包括所提及的核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在本发明的上下文中，术语“衍生物”是指这些分子的序列与上文所述的核酸分子的序列在一个或多个位置上不同，并且与这些序列高度相同。与上述核酸分子的差异可能例如是由于缺失、添加、置换、插入或重组引起的。
本发明的另一个实施方式关于具有包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA活性的蛋白的核酸分子涉及编码具有ω-TA活性的蛋白的根据本发明的核酸分子，其选自以下
a)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置496至498的密码子具有核苷酸序列ggn和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
b)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列wsn；
c)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密码子具有核苷酸序列car和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
d)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
e)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密码子具有核苷酸序列tty和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
f)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
g)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列ath；
h)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列atg；
i)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tay；
j)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列wsn；
k)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列gtn；
l)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列mgn；
m)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列wsn；
n)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置811至813的密码子具有核苷酸序列ath；
o)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置985至987的密码子具有核苷酸序列ggn；
p)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列ccn；
q)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列atg；
r)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列aar；
s)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列mgn；
t)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列cay；
u)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列tgy；
v)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列gtn；
w)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tgy；
x)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列aar；
y)具有与a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的任何核酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的核酸序列的核酸分子，不过如a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定义的各密码子的核苷酸序列分别亦存在于与每个a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的核酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的核酸序列中对应的密码子的核苷酸位置。
根据本发明的优选的核酸分子是上文a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)和p)项下所定义的那些核酸分子，更优选的是上文a)至k)项下所定义的那些核酸分子，甚至更优选的是上文a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)项下所定义的那些核酸分子和最优选的是上文a)、b)和c)项下所定义的那些核酸分子。
核苷酸缩写a、c、g、t以及简并核苷酸r、y、s、w、k、m、b、d、h、v、n的那些缩写的含义可从小标题“序列说明”段落下面的表3中推导出来。哪些氨基酸由包含简并核苷酸的密码子编码可从小标题“序列说明”段落下面的表5中推导出来。
此外，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的重组核酸分子。
结合本发明，术语“重组核酸分子”应理解为指这样的核酸分子，其除了根据本发明的核酸分子以外还含有其他序列，所述其他序列是在根据本发明的重组核酸中存在的组合中不是天然存在的。在此，上述其他序列可以是任何序列，优选地其是功能性或调控序列(启动子、终止信号、增强子、核糖体结合位点(rbs)、增强转录、翻译或RNA稳定性的前导序列、亚细胞靶向序列等)，特别优选地其是在微生物中具有活性的功能性或调控序列，以及尤其特别优选地其是在真菌中(特别是在酵母中)或在细菌中具有活性的调控序列。用于产生根据本发明的重组核酸分子的方法是本领域技术人员公知的，并且包括遗传方法，如通过连接、遗传重组或核酸分子的新合成来键合核酸分子。例如，在Sambrok等(MolecularCloning,A Laboratory Manual,第3版(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY.ISBN:0879695773)或Ausubel等(Short Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons；第5版(2002),ISBN:0471250929)中描述了那些方法。
在一个进一步的实施方式中，根据本发明的重组核酸分子包含与调控序列连接的根据本发明的核酸分子，所述调控序列在原核或真核细胞中起始转录。
在细胞中“起始转录”的调控序列也称为启动子。
关于调控序列和质粒的信息是本领域技术人员熟知的，并且在例如万维网(http://parts.igem.org/Catalog)中的International Genetically EngineeredMachine(iGEM)Foundation(One Kendall Square,Suite B6104,Cambridge,MA 02139,USA)支持的Registry of Standard Biological Parts中对其进行了描述。
在文献中充分描述了在原核生物(例如，E.coli)和在真核生物中起始转录的调控序列，特别是描述了在酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中的表达。用于在各种宿主生物体中表达蛋白的各种系统的概述可以参见，例如，Methods inEnzymology153(1987),383-516和Bitter等(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)或Gomes等(2016,Advances in Animal and Veterinary Sciences,4(4),346)和Baghban等(2018,Current Pharmaceutical Biotechnology,19(6))。常见的酵母启动子是pAOX1、pHIS4、pGAL、pScADH2(Baghban等，2018，参见上文)。常见的细菌启动子是T5、T7、鼠李糖诱导型、阿拉伯糖诱导型、PhoA、人工trc(trp-lac)启动子，如Marschall等(2017,ApplMicrobiol Biotechnol 101,501–512)和Tegel等(2011,FEBS Journal 278,729–739)所述。
本发明的重组核酸分子的进一步的实施方式是包含根据本发明的核酸分子的载体或质粒。
“载体”是分子生物学领域中通常理解的，并且在本文中代表包含用于将遗传物质(DNA或RNA)转移到靶细胞中的核酸序列的核酸序列或载剂。载体可以是质粒，例如用于产生转基因植物的T-DNA或二元载体，用于在宿主细胞中表达核酸序列的表达载体，能够在不同宿主中繁殖的穿梭载体，或者载体可以是已被修饰以将外源遗传物质递送至宿主的病毒颗粒或噬菌体。
“质粒”是分子生物学领域中通常理解的，并且在本文中表示当其存在于与染色体DNA分离的宿主细胞中时，自主自我复制、通常是环状DNA分子。
根据本发明的核酸分子，根据本发明的重组核酸分子，根据本发明的载体或质粒，例如，通过在宿主细胞中表达根据本发明的核酸分子，可以用于生产根据本发明的蛋白。
本发明的另一个实施方式涉及包含或表达根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的蛋白，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒的宿主或宿主细胞。
编码具有ω-TA活性的蛋白的根据本发明的核酸分子可以在宿主细胞中表达，以供例如其增殖或生产本发明的蛋白。为了在宿主细胞中表达，可以将根据本发明的核酸分子包含在载体或质粒中，或者可以将其稳定地整合到各个宿主细胞的基因组中。根据本发明的核酸分子也可以被支持其引入宿主细胞的载体所包含。
本发明的进一步的实施方式涉及包含根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒，以及在每种情况下均包含根据本发明的蛋白的根据本发明的宿主或宿主细胞。
本发明的另一个实施方式涉及包含根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒，以及在每种情况下均表达根据本发明的蛋白的根据本发明的宿主或宿主细胞。
本发明的另一个实施方式涉及包含根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒，以及在每种情况下均表达某种蛋白的根据本发明的宿主或宿主细胞，其中所述蛋白具有ω-转氨酶的活性。
“表达核酸分子”在本文中应理解为指在核酸分子是RNA或mRNA的情况下，核酸分子被翻译成蛋白，优选地翻译成具有ω-TA活性的蛋白，或者在核酸分子是DNA或cDNA的情况下，其被转录(并且在含有内含子的基因组DNA被加工的情况下)成mRNA，优选地被转录成编码具有ω-TA活性的蛋白的mRNA，以及随后翻译成蛋白，优选地翻译成具有ω-TA活性的蛋白。
宿主中给定核酸分子的转录可以通过本领域技术人员公知的方法来证明，例如，通过Northern印迹分析或RT-PCR检测外源核酸分子的特异性转录物(mRNA)。
宿主或宿主细胞是否包含给定蛋白或包含来源于表达核酸分子的蛋白，可以通过本领域技术人员公知的方法确定，例如，通过免疫学方法，如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射免疫测定)。本领域技术人员熟悉用于制备与某种蛋白特异性反应(即，其与某种蛋白特异性结合)的抗体的方法(参见，例如，Lottspeich和Zorbas(eds.),1998,Bioanalytik,Spektrum akad,Verlag,Heidelberg,Berlin,ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司(Thermo Fisher Scientific,168Third Avenue,Waltham,MA USA 0245；GenScript,60Centennial Ave.,Piscataway,NJ 08854,USA)提供制备此类抗体的订购服务。
此外，本领域技术人员可以通过检测相应宿主细胞中具有ω-TA活性的蛋白的(附加)活性来测试宿主或宿主细胞是否包含根据本发明的蛋白。优选地，通过对根据本发明的宿主细胞的ω-TA活性与不包含根据本发明的蛋白的宿主细胞的相应活性，来检测在相应宿主细胞中具有ω-TA的附加活性的蛋白的活性。
如上文所述，可以检测蛋白是否具有ω-TA的活性。
根据本发明的宿主或宿主细胞可以由本领域技术人员通过遗传修饰或转化生物体的已知方法生产。
因此，本发明的另一个主题是根据本发明的宿主或宿主细胞，特别是原核或真核宿主或宿主细胞，其被根据本发明的核酸分子或被根据本发明的重组核酸分子或被根据本发明的载体或被根据本发明的质粒基因修饰(或转化)。优选地，根据本发明的基因修饰(转化)的宿主或宿主细胞表达具有ω-转氨酶活性的蛋白，更优选地，根据本发明的基因修饰(转化)的宿主或宿主细胞表达根据本发明的蛋白。
“被核酸分子基因修饰”或“被核酸分子转化”在本文中应理解为指通过技术和/或非天然存在的方法将核酸分子导入宿主或宿主细胞中，优选地通过分子生物学、生物技术或基因修饰领域的技术方法。
根据本发明的宿主或宿主细胞的后代(Descendant)、子代(offspring)或后代(progeny)也是本发明的实施方式，优选地，这些后代(Descendant)、子代(offspring)或后代(progeny)包含根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒，或包含根据本发明的蛋白，更优选地，这些后代(Descendant)、子代(offspring)或后代(progeny)包含根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒，以及在每种情况下均表达某一蛋白，其中所述蛋白具有ω-TA的活性，甚至更优选地，这些后代(Descendant)、子代(offspring)或后代(progeny)包含根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒，以及在每种情况下均表达某一蛋白，其中所述蛋白具有根据本发明的ω-TA的活性。
根据本发明的宿主或宿主细胞可以是来自任何原核或真核生物体的宿主或宿主细胞。宿主或宿主细胞可以是细菌或细菌细胞(例如，E.coli、芽孢杆菌属细菌，特别是枯草芽孢杆菌，土壤杆菌属，特别是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，假单胞菌属，特别是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，链霉菌属，红球菌属，特别是紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，需钠弧菌(Vibrio natrigens)，棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum))，或者真菌或真菌细胞(例如，伞菌属，特别是双孢菇(Agaricus bisporus)，曲霉属，木霉属或酵母，特别是S.cerevisiae，毕赤酵母属，如P.pastori)，以及植物或植物细胞，或者其可以是动物或动物细胞。
根据本发明的优选的宿主细胞是微生物的细胞。在本专利申请的框架内，这被理解为包括所有细菌和原生生物(例如，真菌，特别是酵母和藻类)，如在例如Schlegel"General Microbiology"(Georg Thieme Publishing House(1985),1-2)中对其所定义的。
关于微生物，根据本发明的宿主或宿主细胞优选是细菌/细菌细胞或酵母/酵母细胞，最优选地其是细菌/细胞细胞。关于细菌/细菌细胞，根据本发明的宿主或宿主细胞优选是芽孢杆菌属/芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌/大肠杆菌细胞，最优选地是大肠杆菌/大肠杆菌细胞。
或者，假单胞菌属，特别是荧光假单胞菌，链霉菌属，红球菌属，特别是紫红红球菌，弧菌属，特别是需钠弧菌，棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌或其他可以是根据本发明的宿主或宿主细胞。
本发明的一个优选实施方式涉及包含根据本发明的核酸分子的根据本发明的宿主或宿主细胞，其中根据本发明的核酸分子的特征在于所述核酸分子的密码子被改变，以使得其分别适于宿主或宿主细胞的密码子的使用频率。
根据本发明的宿主细胞可用于生产根据本发明的蛋白。根据本发明的蛋白可以用于在胺(供体)存在的条件下由羰基(受体)生产对映异构体富集的或接近对映异构体纯的胺的方法。
在通过根据本发明的蛋白生产对映异构体富集的或接近对映异构体纯的胺的方法中，催化反应形式上可以是通过本文的上述通用方程式(I)所述的。
因此，本发明的另一个实施方式涉及一种用于生产胺的方法，其包括以下步骤
a)提供胺受体分子；
b)提供胺供体分子；
c)将步骤a)中提供的所述胺受体分子和步骤b)中提供的所述胺供体分子与根据本发明的蛋白接触；
d)任选地，获得所述胺。
用于制备胺的根据本发明方法的优选实施方式是用于生产脂肪族胺(包括但不限于线性、支链或环状烷胺、烯胺、炔胺)的方法，或是用于生产芳胺的方法，或是用于生产氨基酸的方法，更有选地是用于生产α-氨基酸的方法，进一步更优选地是用于生产支链α-氨基酸、芳香α-氨基酸或包含取代的苯基的α-氨基酸的方法，最优选地是用于生产氨基酸正缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的方法。
对于包含进一步的氨基酸修饰的根据本发明的ω-TA变体而言，用于生产胺的根据本发明的方法优选地是用于生产包含磷的脂肪族胺(包括但不限于包含磷的线性、支链或环状烷胺、烯胺、炔胺)的方法，或是用于生产包含磷的芳胺的方法，或是用于生产包含磷的氨基酸的方法，更优选地是用于生产包含磷的α-氨基酸的方法，进一步更优选地是用于生产包含磷的支链α-氨基酸、包含磷的芳香α-氨基酸或包含磷的包含取代的苯基的α-氨基酸的方法，甚至更优选地是用于生产包含磷的α-氨基酸的方法，甚至进一步更优选地是用于生产包含甲基取代的磷的α-氨基酸的方法，最优选地是用于生产草铵膦的方法。
用于生产胺的根据本发明方法的步骤a)中的胺受体分子是包含羰基的分子，其接受来自胺供体分子的氨基基团，由此受体分子的羰基基团变成胺。
优选地，用于生产胺的根据本发明方法的步骤a)中的胺受体分子是脂肪族酮(包括但不限于线性、支链或环状烷酮、烯酮、炔酮)或是芳基酮或是酮酸，更优选地其是酮酸，进一步更优选地是α-酮酸，最优选地胺受体分子选自以下：2-氧代戊酸、4-甲基-2-氧代戊酸、苯基丙酮酸或4-羟基苯基丙酮酸。
对于包含进一步的氨基酸修饰的根据本发明的蛋白ω-TA变体而言，用于生产胺的根据本发明方法的步骤a)中的胺受体分子优选地是包含磷的脂肪族酮(包括但不限于线性、支链或环状烷酮、烯酮、炔酮)，或包含磷的芳基酮或包含磷的酮酸，更优选地胺受体分子是包含磷的酮酸，进一步更优选地胺受体分子是包含磷的α-酮酸，甚至更优选地是包含甲基取代的磷的α-酮酸，最优选地在步骤a)中的胺受体分子是4-[羟基(甲基)磷酰基]-2-氧代丁酸。
优选地，用于生产胺的根据本发明方法的步骤a)中的胺受体分子以30g/l(克每升)至300g/l之间的量提供，更优选地30g/l至250g/l之间，甚至更优选地40g/l至250g/l之间，进一步更优选地50g/l至250g/l之间。
用于生产胺的根据本发明方法的步骤b)中的胺供体分子是将胺基团贡献给胺受体分子的包含胺基团的分子，由此胺供体分子的胺基团变成羰基基团。
用于生产胺的根据本发明方法的步骤b)中的胺供体分子是手性、前手性或非手性胺，优选地胺供体分子分别是手性、前手性或非手性的烷基或芳基或芳基-烷基胺，更优选地胺供体分子是氨基酸或烷基胺。
对于氨基或芳基胺而言，用于生产根据本发明的胺的方法的步骤b)中使用的优选的氨基供体分子是β-丙氨酸、1-丙胺、(外消旋)2-丁胺、6-氨基己酸、异丙胺、苯甲胺、甲基苯甲胺、1-氨基茚满、1-甲基-3-苯基丙基胺。
在氨基供体是非手性氨基酸的情况下，甘氨酸是根据本发明用于生产胺的方法步骤b)中所提供的优选的氨基供体分子。在根据本发明的胺生产方法的步骤b)中的氨基供体是手性氨基酸的情况下，氨基酸优选地以其(S)-对映异构体代表。在用于生产根据本发明的胺的方法步骤b)中提供的具有(S)-构型的优选的氨基酸供体分子是(S)-甲基苯甲胺、(S)-1-氨基茚满、(S)-1-甲基-3-苯基丙基胺、(S)-天冬氨酸、(S)-天冬酰胺、(S)-丙氨酸、(S)-谷氨酰胺、(S)-谷氨酸、(S)-鸟氨酸、(S)-磷酸丝氨酸、(S)-苯丙氨酸、(S)-亮氨酸、(S)-酪氨酸、(S)-正缬氨酸。
在根据本发明的胺的生产方法的步骤b)中提供的最优选的氨基供体分子是异丙胺。
当将异丙胺用作根据本发明方法中的氨基供体分子时，通过ω-TA的作用将其转化为丙酮。丙酮是挥发性化合物，因此具有在相对较低温度下蒸发的优势。这允许在发生反应期间从反应混合物中除去由ω-TA产生的丙酮，从而导致有利的效果，即反应的平衡向通过根据本发明的胺的生产方法所产生的胺转移。由于缺少一种反应伙伴，因而由ω-TA催化的逆反应减少，这使得可以大量获得所需的胺。
优选地，用于生产胺的根据本发明方法步骤b)中的胺供体分子以10g/l(克每升)至250g/l之间的量提供，更优选地15g/l至200g/l之间，进一步更优选地17g/l至180g/l之间。
在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)中，优选在溶液中使步骤a)中提供的胺受体分子和步骤b)中提供的胺供体分子与根据本发明的蛋白接触。溶液可以是仅含有水的水溶液，也可以是含有水和有机溶剂的溶液。在使根据本发明的胺的制备方法的步骤c)中的根据本发明的蛋白与步骤a)中提供的胺受体分子和步骤b)中提供的胺供体分子在包含有机溶剂的水性溶液中接触的情况下，有机溶剂优选地选自DMSO(二甲基亚砜)、DMAc(二甲基乙酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、乙腈、甲苯、叔丁基甲基醚、己烷、庚烷。最优选的是DMSO、DMAc和甲苯。
优选地，包含有机溶剂的水溶液以高达10％，更优选地高达20％，进一步更优选地高达30％，甚至更优选地高达40％，最优选地高达50％的量包含有机溶剂。
使用包含有机溶剂的水溶液的优点是，在根据本发明的胺的生产方法的步骤a)中提供的胺受体分子和/或步骤b)中提供的胺供体分子具有较低溶解度的情况下其各自的溶解度可以改善，从而导致可用于ω-TA的底物的量更多。这导致更高的反应速度，其意味着以更小体积和更短时间以更高的量生产所需的胺，从而提高了时空产率。
在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)使根据本发明的蛋白与步骤a)中提供的胺受体分子和步骤b)中提供的胺供体分子在水溶液中接触的情况下，溶液优选地包含用于调节pH的缓冲系统。优选的缓冲系统是包含TRIS-HCl、MOPS、HEPES、TRIS、Bicine的那些。
优选地，其中根据本发明的蛋白在根据本发明用于生产胺的方法步骤c)中与步骤a)中提供的胺受体分子和步骤b)中提供的胺供体分子接触的水溶液的pH被调整至pH 4至pH 11之间的值，更优选地pH 5至pH 10之间的值，进一步更优选地pH 6至pH 10之间的值，甚至更优选地pH 7至pH 10之间的值，甚至进一步更优选地pH 8至pH 10之间的值，最优选地pH 8.5至pH 9.5之间的值。
优选地，在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)中，步骤a)中提供的胺受体分子与步骤b)中提供的胺供体分子与根据本发明的蛋白的接触发生在10℃至60℃之间的温度下，更优选地20℃至60℃之间，进一步更优选地25℃至55℃之间，甚至更优选地30℃至50℃之间，甚至进一步更优选地30℃至45℃之间，最优选地34℃至42℃。
在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)中，步骤a)中提供的胺受体分子与步骤b)中提供的胺供体分子与根据本发明的蛋白接触足以生产胺的一段时间。
优选地，在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)中，步骤a)中提供的胺受体分子与步骤b)中提供的胺供体分子与根据本发明的蛋白接触5小时至48小时以生产胺，更优选地5小时至36小时，进一步更优选地5小时至30小时，甚至更优选地5小时至24小时，甚至进一步更优选地5小时至18小时，最优选地5小时至14小时和特别优选地5小时至13小时。
对于在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)中，使根据本发明的蛋白与步骤a)中提供的胺受体分子和步骤b)中提供的胺供体分子的接触而言，所述蛋白可以不同形式与胺受体分子和胺供体分子接触，优选地，所述蛋白以部分纯化的形式与胺受体分子和胺供体分子接触，或者所述蛋白以纯化的形式与胺受体分子和胺供体分子接触，或当与胺受体分子和胺供体分子接触时所述蛋白存在于粗细胞提取物中，或当所述蛋白作为活的或无生命宿主细胞的组分存在时与胺受体分子和胺供体分子接触。
如果蛋白在根据本发明的胺的生产方法的步骤c)中与作为宿主细胞组分的胺受体分子和胺供体分子接触，则宿主细胞可以是包含用于培养宿主细胞的培养基那些，或宿主细胞可以不含培养宿主细胞的培养基，或宿主细胞可以被(进一步)处理，优选地宿主细胞几乎不含培养宿主细胞的培养基，更优选地宿主细胞已被(进一步)处理，甚至更优选地宿主细胞几乎不含培养宿主细胞的培养基且宿主细胞已被(进一步)处理。
“粗细胞提取物”在本文中指通过破坏活细胞而获得的提取物，所述细胞包含细胞中存在的所有或基本上所有的无机或有机物质(包括其他蛋白和/或核酸分子)。
“部分纯化的”在本文中指包含蛋白的组合物，其(仅)包含存在于表达所述蛋白的活细胞中的全部无机或有机物质(包括其他蛋白和/或核酸分子)的一部分。
部分纯化的提取物可以是通过例如常用的公知方法(如离心、过滤、任何类型的色谱分离、透析等)从粗细胞提取物中分级分离有机或无机物质获得。粗细胞提取物的分级分离可以使用相同或不同的分级分离方法重复进行，并且可以包括沉淀步骤。
“纯化的”在本文中指其比活性(干重分数中存在的蛋白活性除以物质总量，特别是干重分数中的其他蛋白)不能通过进一步的分级分离或纯化步骤增加的蛋白。
从上面对术语“纯化的”给出的普遍接受的定义不言而喻，“纯化的”可以但在大多数情况下并不意味着蛋白完全不含任何其他无机和/或有机化合物。优选地，纯化的在本文中指根据本发明的蛋白占包含所述蛋白的干重物质总量的至少95％，更优选地至少96％，进一步更优选地至少97％，甚至更优选地至少98％，甚至进一步更优选地至少99％，最优选地至少99.5％。
术语“活细胞”在本文中指能够生长和/或繁殖的细胞。
术语“非活细胞”在本文中指不能生长和/或繁殖的细胞。
尽管非活细胞不能再繁殖和/或生长，但是相对于本申请仍然显示出酶活性，特别是具有ω-TA活性的根据本发明的蛋白的活性。
如本文所用，术语“不含培养基”指用于培养(宿主)细胞的培养基已被去除，例如，通过离心和/或过滤。
从上面对术语“不含培养基”给出的普遍接受的定义不言而喻，“不含培养基”可以但在大多数情况下并不意味着细胞完全不含在培养基中存在的任何其他无机和/或有机化合物。优选地，纯化的在本文中指根据本发明的细胞占包含所述细胞但不含培养基的干重物质总量的至少95％，更优选地至少96％，进一步更优选地至少97％，甚至更优选地至少98％，甚至进一步更优选地至少99％，最优选地至少99.5％。
术语“宿主细胞已被(进一步)处理”在本文中指在将其在根据本发明的胺生产方法的步骤c)中与胺受体分子和胺供体分子接触之前已使用物理和/或化学方法对包含根据本发明的蛋白的宿主细胞进行了处理，已使用物理方法对其进行了处理，更优选地已将其干燥，进一步更优选地已将其冻干或喷雾干燥，最优选地已将其喷雾干燥。
细胞的干燥过程(特别是冷冻干燥和喷雾干燥过程)是本领域技术人员公知的。优选地，已对包含根据本发明的蛋白的宿主细胞进行冷冻干燥或喷雾干燥，最优选地，在将其在根据本发明的胺生产方法的步骤c)中接触之前，通过本文“常规方法”第9项下描述的方法对其进行喷雾干燥。
本领域技术人员公知具有ω-TA活性的蛋白是磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶。在一个优选的实施方式中，在存在PLP的条件下，在根据本发明的胺生产方法的步骤c)中，将所述蛋白与步骤a)中提供的胺受体分子和步骤b)中提供的胺供体分子接触，更优选地PLP以0.05g/l至2.0g/l之间的量存在，进一步更优选地以0.05g/l至1.5g/l之间的量，甚至更优选地以0.05g/l至1.0g/l之间的量，甚至进一步更优选地以0.075g/l至0.75g/l之间的量，最优选地以0.1g/l至0.5g/l之间的量。
在用于生产胺的方法中的强制性步骤d)中获得胺可意味着在步骤d)的组合物中存在胺，而无需进一步纯化所产生的胺，或者可以指对所生产的胺进行进一步纯化。可以通过本领域技术人员公知的方法进行胺的纯化。用于纯化胺的此类方法包括但不限于涉及沉淀的方法，包括色谱法、蒸馏、提取、吸附或过滤的方法。
用于生产根据本发明的胺的方法的一个优选的实施方式是用于生产包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物的方法，其包括以下步骤
a)提供胺受体分子；
b)提供胺供体分子；
c)将步骤a)中提供的所述胺受体分子和步骤b)中提供的所述胺供体分子与根据本发明的蛋白接触；
d)任选地，获得包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物。
如本文所用，术语“光学异构体”具有在化学领域中通常理解的含义，所述分子是两个立体异构体之一，这两个立体异构体是彼此不可重叠的结构镜像。术语“对映异构体”通常也称为“光学异构体”。
术语“对映异构体过量”(通常缩写为“ee”)是化学技术领域中的通常理解，并且在本文中用于指在组合物中一种对映异构体相对于另一种对映异构体过量，将其定义为每种对映异构体摩尔分数之间的绝对差值。对映异构体过量通常在本领域中以对映异构体过量百分比表示。例如，包含70％的(S)-对映异构体和30％的(R)-对映异构体的组合物具有关于(S)-对映异构体的ee＝40％(40％纯(S)-对映异构体+60％外消旋体(＝30％(S)+30％(R))。最后，外消旋对映异构体混合物具有ee＝0％，纯的(S)-或(R)-对映异构体具有ee＝100％。
用于生产包含对映异构体过量的(S)-胺组合物的根据本发明方法的一个优选的实施方式是用于生产对映异构体过量的脂肪族(S)-胺(包括但不限于线性、支链或环状烷胺、烯胺、炔胺)的方法，或用于生产对映异构体过量的芳基(S)-胺的方法，或用于生产对映异构体过量的(S)-氨基酸的方法，更优选地是用于生产对映异构体过量的(S)-α-氨基酸的方法，进一步更优选地是用于生产对映异构体过量的支链(S)-α-氨基酸、芳香(S)-α-氨基酸或包含取代的苯基的芳香(S)-α-氨基酸的方法，最优选地是用于生产对映异构体过量的氨基酸(S)-正缬氨酸、(S)-亮氨酸、(S)-苯丙氨酸或(S)-酪氨酸的方法。
对于包含进一步的氨基酸修饰的根据本发明的ω-TA变体而言，用于生产包含对映异构体过量的(S)-胺的组合物的根据本发明的方法优选地是用于生产对映异构体过量的包含磷的脂肪族(S)-胺(包括但不限于包含磷的线性、支链或环状烷基(S)-胺、烯基(S)-胺、炔基(S)-胺)的方法，是用于生产对映异构体过量的包含磷的芳基(S)-胺的方法，是用于生产对映异构体过量的包含磷的(S)-氨基酸的方法，更优选地是用于生产对映异构体过量的包含磷的(S)-α-氨基酸的方法，进一步更优选地是用于生产对映异构体过量的包含磷的支链(S)-α-氨基酸、包含磷的芳香(S)-α-氨基酸或包含磷的包含取代的苯基的芳香(S)-α-氨基酸的方法，甚至更优选地是用于生产对映异构体过量的包含磷的(S)-α-氨基酸的方法，甚至进一步更优选地是用于生产对映异构体过量的包含甲基取代的磷的(S)-α-氨基酸的方法，最优选地是用于生产对映异构体过量的(S)-草铵膦的方法。
用于生产包含对映异构体过量的(S)-胺的组合物的根据本发明方法的另一个优选实施方式是一种用于生产包含对映异构体过量(ee)至少20％，更优选地至少40％，进一步更优选地至少60％，甚至更优选地至少80％，甚至进一步更优选地至少90％，特别优选地至少94％，最优选地至少96％或特别优选地至少98％的(S)-胺的组合物的方法。
关于根据本发明用于生产胺的方法，步骤a)中所提供的胺受体分子的优选实施方式和所提供的量的优选实施方式，以及步骤b)中所提供的胺供体分子的优选实施方式和所提供的量的优选实施方式，在上文已定义的为据此可分别应用于步骤a)中的胺受体分子和步骤b)中的胺供体分子，用于生产包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物的方法中。然而，不言而喻的是，在用于生产包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物的方法中的步骤b)中提供的胺供体分子是手性分子的情况下，提供至少一种包含胺供体的(S)-对映异构体的对映异构体混合物，优选地提供胺供体的外消旋混合物。如果在经济成本上而言是可取的和可行的，则手性胺供体可以优选地在其中(S)-对映异构体是对映异构体过量的混合物中提供，更优选地，胺供体可以以包含高对映异构体过量的(S)-对映异构体的组合物的形式提供，在该情况下高对映异构体过量指对映异构体过量至少30％，更优选地至少40％，进一步更优选地至少60％，甚至更优选地至少80％，甚至进一步更优选地至少90％，特别优选地至少94％，最优选地至少96％或特别优选地至少98％。
关于溶液、水溶液、包含有机溶剂的水溶液、缓冲系统、pH值和/或温度、蛋白的形式(粗细胞提取物，部分纯化的蛋白，纯化的蛋白，以活的或非活的宿主细胞、(进一步)处理的宿主细胞、喷雾干燥的宿主细胞的组分形式存在的蛋白)、蛋白的量以及涉及用于生产胺的根据本发明的方法的步骤c)的PLP的存在情况和量，在上文已定义的为据此可应用于生产包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物的方法的步骤c)中。
关于用于生产胺的根据本发明的方法的步骤d)的优选实施方式，在上文已定义的为据此可应用于生产包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物的方法的步骤d)中。
除了已就用于生产胺的根据本发明的方法的步骤d)所定义的之外，优选地，包含对映异构体过量至少40％，更优选地至少70％，进一步更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％，甚至进一步更优选地至少95％，特别优选地至少97％，最优选地至少98％或特别优选地至少99％的(S)-胺的组合物是在用于生产包含比其(各自的)(R)-胺对映异构体过量的(S)-胺的组合物的方法的步骤d)中获得的。
根据本发明的蛋白还可以用于从包含(R)-和(S)-胺对映异构体的组合物中减少或消除立体异构体的方法中。当从包含(R)-和(S)-胺对映异构体的组合物中减少或消除立体异构体时，通过根据本发明的蛋白催化的反应遵循通用方程式(Ia)。与合成胺的反应相比(参见方程式(I))，在减少或消除包含(R)-和(S)-胺的组合物中的立体异构体的反应中，可以看到氨基供体和氨基受体彼此交换(参见方程式(Ia))。根据方程式(Ia)的反应的优点在于，可以在包含不同立体异构体的组合物中富集特定的立体异构体，或者换句话说，可以从组合物中除去特定的立体异构体，有时在本领域中也称为拆分对映异构体混合物。在通过化学合成生产化合物的情况下，这些方法特别重要，化学合成通常导致外消旋混合物。就工艺经济性或其他原因而言，此类化合物的化学合成可能是所需的生产工艺。然而，分离化学生产的对映异构体可能是困难的、昂贵的或者甚至是不可能的。根据本发明的蛋白可用于从此类化学生产的外消旋混合物中选择性除去立体异构体。
因此，本发明的进一步的实施方式涉及一种减少包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中胺对映异构体的量的方法，其包括以下步骤
a)提供包含(R)-胺和(S)-胺的对映异构体的组合物；
b)提供胺受体分子；
c)将步骤a)中提供的所述组合物和步骤b)中提供的所述胺受体与根据本发明的蛋白接触；
d)任选地，获得其中与在步骤a)中提供的所述组合物中存在的量相比胺对映异构体的量减少的组合物。
在用于减少在包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中胺对映异构体的量的方法中，这些方法中每种方法的步骤a)提供的组合物中存在多少结构上不同的(R)-胺和(S)-胺分子并不确定，只要存在至少一种(S)-胺和一种(R)-胺分子即可。
在用于减少包含(R)-和(S)-胺的组合物中的胺对映异构体的量的方法的步骤a)中提供的包含(R)-和(S)-胺的组合物包含至少一种(R)-胺和至少一种(S)-胺，其中至少一种(R)-胺和至少一种(S)-胺可以是同一分子的立体异构体或至少一种(R)-胺和至少一种(S)-胺可以是结构上不同的分子的立体异构体。
用于降低包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中胺对映异构体的量的方法的优选实施方式是用于降低脂肪族胺(包括但不限于线性、支链或环状烷胺、烯胺、炔胺)的对映异构体的量的方法，或用于降低芳基胺的对映异构体的量的方法，或用于降低氨基酸的对映异构体的量的方法，更优选地是用于降低α-氨基酸的对映异构体的量的方法，进一步更优选地是用于降低支链α-氨基酸的对映异构体、芳香α-氨基酸的对映异构体的量或包含取代的苯基的芳香α-氨基酸的对映异构体的量的方法，最优选地是用于降低选自以下的氨基酸的对映异构体的量的方法：正缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸。
对于包含进一步的氨基酸修饰的根据本发明的ω-TA变体而言，用于在包含(R)-和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的根据本发明的方法优选地是用于降低包含磷的脂肪族胺(包括但不限于包含磷的线性、支链或环状烷胺、烯胺、炔胺)的对映异构体的量的方法，或是用于降低包含磷的芳基胺的对映异构体的量的方法，或用于降低包含磷的氨基酸的对映异构体的量的方法，更优选地是用于降低包含磷的α-氨基酸的对映异构体的量的方法，进一步更优选地用于降低包含磷的支链α-氨基酸的对映异构体、包含磷的芳香α-氨基酸的对映异构体或包含磷的包含取代的苯基的芳香α-氨基酸的对映异构体的量的方法，甚至更优选地是用于降低包含取代的磷的α-氨基酸的对映异构体的量的方法，甚至进一步更优选地是用于降低包含甲基取代的磷的α-氨基酸的对映异构体的量的方法，最优选地是用于降低草铵膦的对映异构体的量的方法。
关于溶液、水溶液、包含有机溶剂的水溶液、缓冲系统、pH值和/或温度、蛋白的形式(粗细胞提取物，部分纯化的蛋白，纯化的蛋白，以活的或非活的宿主细胞、(进一步)处理的宿主细胞、喷雾干燥的宿主细胞的组分形式存在的蛋白)、蛋白的量以及涉及用于生产胺的根据本发明的方法的步骤c)的PLP的存在情况和量，在上文已定义的为据此可应用于在包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法的步骤c)中。
关于用于生产胺的根据本发明的方法的步骤d)的优选实施方式，在上文已定义的为据此可应用于在包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法的步骤d)中。
根据本发明的蛋白特别地可以用于减少包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中(S)-对映异构体的量或者基本上或几乎完全消除(S)-对映异构体的方法，从而生产其中(R)-胺以对映异构体过量存在的组合物。在形式上通过(S)-选择性ω-TA用于生产对映异构体富集的或几乎是对映异构体纯的胺的方法中催化的各反应可以用通用方程式(II)描述R1-CH((S,R)-NH2)-R2+R3-CO-R4→R1-CO-R2+R3-CH((R)-NH2)-R4
具有生物活性的很多化合物(如药物、农学中使用的活性化合物、辅助性食品添加剂、饲料添加剂等)均以对映异构体形式存在。在绝大多数情况下，仅一种对映异构体显示出所需的生物活性，而另一种对映异构体是无活性的，甚至常常显示出不良的副作用。如今，很多具有生物活性且作为药物、在农学上、作为辅助性食品或饲料添加剂(例如，氨基酸)使用的化合物仅能够通过化学合成的方式生产或仅在经济上可行的条件下生产，其中缺点是这些化合物仅以外消旋混合物形式提供。根据本发明的蛋白提供的优点是，可以从此类外消旋混合物中部分、显著或几乎全部除去(S)-胺的量，其具有这样的效果，即获得了包含生物活性对映异构体或前体的组合物，所述组合物用于生物活性对映异构体的生产过程中，或者在组合物中包含生物活性对映异构体或其前体，所述组合物中几乎不含无活性对映异构体。这减少了药物、农学产品或包含辅助性食品或饲料添加剂的产品的副作用。
在一个优选的实施方式中，用于降低包含(R)-胺和(S)-胺对映异构体的组合物中胺对映异构体的量的方法是用于降低包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中(S)-胺对映异构体的量的方法，其包括以下步骤
a)提供包含(R)-胺和(S)-胺的的组合物；
b)提供胺受体分子；
c)将步骤a)中提供的所述组合物和步骤b)中提供的所述胺受体分子与根据本发明的蛋白接触；
d)任选地，获得其中与在步骤a)中提供的所述组合物中存在的量相比(S)-胺对映异构体的量减少的组合物。
用于降低包含(R)-和(S)-胺对映异构体的组合物中(S)-胺对映异构体的量的方法的优选实施方式是用于降低脂肪族(S)-胺(包括但不限于线性、支链或环状烷(S)-胺、烯(S)-胺、炔(S)-胺)的量的方法，或用于降低芳基(S)-胺的量的方法，或用于降低(S)-氨基酸的量的方法，更优选地是用于降低(S)-α-氨基酸的量的方法，进一步更优选地是用于降低支链(S)-α-氨基酸、芳香(S)-α-氨基酸或包含取代的苯基的芳香(S)-α-氨基酸的量的方法，最优选地是用于降低选自以下的氨基酸的量的方法：(S)-正缬氨酸、(S)-亮氨酸、(S)-苯丙氨酸或(S)-酪氨酸。
对于根据本发明包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体而言，用于在包含(R)-和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的根据本发明的方法优选地是用于降低包含磷的脂肪族(S)-胺(包括但不限于包含磷的线性、支链或环状烷(S)-胺、烯(S)-胺、炔(S)-胺)的量的方法，或是用于降低包含磷的芳基(S)-胺的量的方法，或用于降低包含磷的(S)-氨基酸的量的方法，更优选地是用于降低包含磷的(S)-α-氨基酸的量的方法，进一步更优选地用于降低包含磷的支链(S)-α-氨基酸、包含磷的芳香(S)-α-氨基酸或包含磷的包含取代的苯基的芳香(S)-α-氨基酸的量的方法，甚至更优选地是用于降低包含取代的磷的(S)-α-氨基酸的量的方法，甚至进一步更优选地是用于降低包含甲基取代的磷的(S)-α-氨基酸的量的方法，最优选地是用于降低(S)-草铵膦的量的方法。
优选地，就分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法，步骤a)中所提供的包含(R)-胺和(S)-胺的组合物是包含选自由下列化合物组成的组的(R)-和/或(S)-胺：脂肪族(R)-和(S)-胺(包括但不限于线性、支链或环状烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)，或芳基(R)-和(S)-胺，或(R)-和(S)-氨基酸，更优选地(R)-和(S)-α-氨基酸，进一步更优选地支链(R)-和(S)-α-氨基酸、芳香(R)-和(S)-α-氨基酸或包含取代的苯基的芳香(R)-和(S)-α-氨基酸，最优选地氨基酸(R)-和(S)-正缬氨酸、(R)-和(S)-亮氨酸、(R)-和(S)-苯丙氨酸或(R)-和(S)-酪氨酸。
对于根据本发明包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体而言，优选地，就分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法，步骤a)中所提供的包含(R)-胺和(S)-胺的组合物是包含选自由下列化合物组成的组的(R)-和/或(S)-胺：包含磷的脂肪族(R)-和(S)-胺(包括但不限于包含磷的线性、支链或环状烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)，或包含磷的芳基(R)-和(S)-胺，或包含磷的(R)-和(S)-氨基酸，更优选地包含磷的(R)-和(S)-α-氨基酸，进一步更优选地包含磷的支链(R)-和(S)-α-氨基酸、包含磷的芳香(R)-和(S)-α-氨基酸或包含磷的包含取代的苯基的芳香(R)-和(S)-α-氨基酸，甚至更优选地包含取代的磷的(R)-和(S)-α-氨基酸，甚至进一步更优选地包含甲基取代的磷的(R)-和(S)-α-氨基酸，最优选地(R)-和(S)-草铵膦。
更优选地，就分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法，步骤a)中所提供的包含(R)-胺和(S)-胺的组合物是包含相同分子的(R)-和/或(S)-胺，更优选地其包含分别代表选自下列化合物组成的组中单一化合物的对映异构体的(R)-和(S)-胺：脂肪族(R)-和(S)-胺(包括但不限于线性、支链或环状烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)，或芳基(R)-和(S)-胺，或(R)-和(S)-氨基酸，更优选地(R)-和(S)-α-氨基酸，进一步更优选地支链(R)-和(S)-α-氨基酸、芳香(R)-和(S)-α-氨基酸或包含取代的苯基的芳香(R)-和(S)-α-氨基酸，最优选地氨基酸(R)-和(S)-正缬氨酸、(R)-和(S)-亮氨酸、(R)-和(S)-苯丙氨酸或(R)-和(S)-酪氨酸。
对于根据本发明包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体而言，优选地，就分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法，步骤a)中所提供的包含(R)-胺和(S)-胺的组合物是包含相同分子的(R)-和/或(S)-胺，更优选地其包含分别代表选自下列化合物组成的组中单一化合物的对映异构体的(R)-和(S)-胺：包含磷的脂肪族(R)-和(S)-胺(包括但不限于包含磷的线性、支链或环状烷(R)-和(S)-胺、烯(R)-和(S)-胺、炔(R)-和(S)-胺)，或包含磷的芳基(R)-和(S)-胺，或包含磷的(R)-和(S)-氨基酸，更优选地包含磷的(R)-和(S)-α-氨基酸，进一步更优选地包含磷的支链(R)-和(S)-α-氨基酸、包含磷的芳香(R)-和(S)-α-氨基酸或包含磷的包含取代的苯基的芳香(R)-和(S)-α-氨基酸，甚至更优选地包含取代的磷的(R)-和(S)-α-氨基酸，甚至进一步更优选地包含甲基取代的磷的(R)-和(S)-α-氨基酸，最优选地(R)-和(S)-草铵膦。
优选地，就分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法，步骤b)中所提供的胺受体分子是某一分子，其结构对应于如上文用于生产胺的方法步骤b)中所提供的胺供体分子所述的结构，除了以上，在胺的生产方法的步骤b)中所提供的在上文中描述为胺供体分子的那些分子的胺基被羰基取代。例如，如用于生产胺的方法步骤b)中所提供的胺供体分子所述的异丙胺的胺基团被羰基基团取代，导致产生分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法的步骤b)中的相应胺受体分子。
分别用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低胺对映异构体的量的方法或用于包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法的步骤b)中所提供的最优选的胺受体分子是丙酮。
关于溶液、水溶液、包含有机溶剂的水溶液、缓冲系统、pH值和/或温度、蛋白的形式(粗细胞提取物，部分纯化的蛋白，纯化的蛋白，以活的或非活的宿主细胞、(进一步)处理的宿主细胞、喷雾干燥的宿主细胞的组分形式存在的蛋白)、蛋白的量以及涉及用于生产胺的根据本发明的方法的步骤c)的PLP的存在情况和量，在上文已定义的为据此可应用于在包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法的步骤c)中。
关于用于生产胺的根据本发明的方法的步骤d)的优选实施方式，在上文已定义的为据此可应用于在包含(R)-胺和(S)-胺的组合物中降低(S)-胺对映异构体的量的方法的步骤d)中。
本发明的进一步的实施方式是使用根据本发明的蛋白用于生产胺(优选地用于生产(S)-胺)的用途。
根据本发明的蛋白用于在对映异构体混合物中降低胺的量(优选地(S)-胺的量)的用途也是本发明的实施方式。
根据本发明的核酸分子用于在根据本发明的宿主细胞中表达根据本发明的蛋白的用途也是本发明的实施方式。
本发明的另一个实施方式涉及用于转化或基因修饰根据本发明的宿主细胞，或用于生产根据本发明的蛋白的根据本发明的核酸分子，根据本发明的重组核酸分子，根据本发明的质粒或根据本发明的载体的用途。
用于生产胺或用于降低胺的量(优选地，在对映异构体混合物中(S)-胺的量)的根据本发明的宿主细胞的用途也是本发明的实施方式。
序列说明
在整个申请中，根据下述IUPAC编码使用核苷酸和氨基酸缩写：
表3
为了区分氨基酸和核苷酸，在此以小写形式写出上表中给出的大写核苷酸代码缩写。
表4
密码子的使用遵循下表中的所谓的“通用遗传密码”，其中在核糖核酸(RNA)序列中“t”被“u”代替。“TLC”代表氨基酸的三字母代码和“SLC”代表氨基酸的单字母密码。
表5
SEQ ID NO 1：通过反翻译SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列获得的编码来自巨大芽孢杆菌的ω-转氨酶(ω-TA)的核酸序列，其中所述反翻译遵循由于通用遗传密码的简并性的翻译原则。在位于位置1450至1452的终止密码子之前，在位置1432至1449将编码6个His氨基酸的核苷酸插入来自巨大芽孢杆菌的序列。
SEQ ID NO 2：编码具有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的ω-TA的核酸序列。在位于位置1450至1452的终止密码子之前，在位置1432至1449将编码6个His氨基酸的核苷酸插入来自巨大芽孢杆菌的序列。
SEQ ID NO 3：衍生自GenPept(PDB)的登录号5G09_A的来自巨大芽孢杆菌的ω-TA的氨基酸序列。所示的氨基酸是由SEQ ID NO 1和2所示的核酸序列编码的。通过序列修饰的方法在位置478至483将6个His氨基酸插入来自巨大芽孢杆菌的序列。
SEQ ID NO 4：通过反翻译SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列获得的编码来自节杆菌属的ω-TA的核酸序列，其中所述反翻译遵循由于通用遗传密码的简并性的翻译原则。
SEQ ID NO 5：编码具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的ω-TA的核酸序列。在位于位置1456至1458的终止密码子之前，在位置1438至1455将编码6个His氨基酸的核苷酸插入来自节杆菌属的序列。
SEQ ID NO 6：衍生自GenPept(PDB)的登录号5G2P_A的来自节杆菌属的ω-TA的氨基酸序列。所示的氨基酸是由SEQ ID NO 4和5所示的核酸序列编码的。通过序列修饰的方法在位置480至485将6个His氨基酸插入来自节杆菌属的序列。
SEQ ID NO 7：通过反翻译SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列获得的编码来自芽孢杆菌属(土壤76801D1)的ω-TA的核酸序列，其中所述反翻译遵循由于通用遗传密码的简并性的翻译原则。
SEQ ID NO 8：衍生自GenBank登录号LMTA01000079.1的来自芽孢杆菌属(土壤76801D1)的ω-TA的核酸序列。
SEQ ID NO 9：衍生自GenPept(PDB)的登录号KRF52528.1的来自芽孢杆菌属(土壤76801D1)的ω-TA的氨基酸序列。所示的氨基酸是由如上文所述的SEQ ID NO 7和8所示的核酸序列编码的。
SEQ ID NO 10：通过反翻译SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列获得的编码来自节杆菌属的突变ω-TA的核酸序列，其中所述反翻译遵循由于通用遗传密码的简并性的翻译原则。
SEQ ID NO 11：编码具有如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的突变ω-TA变体的核酸序列。所述序列可衍生自WO 2006/063336 A2中的SEQ ID NO 15。
SEQ ID NO 12：可衍生自WO 2006/06336 A2中的SEQ ID NO 16的来自节杆菌属的突变ω-TA的氨基酸序列。所示的氨基酸是由如上文所述的SEQ ID NO 11和12所示的核酸序列编码的。
SEQ ID NO 13：通过反翻译SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列获得的编码来自节杆菌属的野生型ω-TA的核酸序列，其中所述反翻译遵循由于通用遗传密码的简并性的翻译原则。
SEQ ID NO 14：编码具有如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的野生型ω-TA的核酸序列。所述序列可衍生自WO 2006/063336 A2中的SEQ ID NO 1。
SEQ ID NO 15：可衍生自WO 2006/06336A2中的SEQ ID NO 2的来自节杆菌属的野生型ω-TA的氨基酸序列。所示的氨基酸是由如上文所述的SEQ ID NO 13和14所示的核酸序列编码的。
SEQ ID NO 16：通过反翻译SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列获得的编码改进的ω-TA的核酸序列，其中所述反翻译遵循由于通用遗传密码的简并性的翻译原则。
SEQ ID NO 17：编码具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的改进的ω-TA的核酸序列。
SEQ ID NO 18：改进的ω-TA的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO 3和9所示的来自巨大芽孢杆菌的氨基酸序列相比和与SEQ ID NO 6、12和15所示的来自节杆菌属的氨基酸序列相比，通过氨基酸置换获得改进。
SEQ ID NO 19：来自圆红酵母(Rhodotorula toruloides)(同义名：Rhodotorulagracilis)的D-氨基酸氧化酶(DAO1)基因的核酸编码序列。
SEQ ID NO 20：获自SEQ ID NO 19所示的编码序列的具有D-氨基酸氧化酶(DAO1)活性的蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO 21：来自圆红酵母的D-氨基酸氧化酶(DAO1)基因变体的核酸编码序列，与来自圆红酵母的核酸序列相比，在位置160-162的核苷酸鉴定的密码子中，和在位置172-174的核苷酸鉴定的密码子中，和在位置637-639的核苷酸鉴定的密码子中包含核苷酸取代(置换)。
SEQ ID NO 22：由SEQ ID NO 21所示的编码序列获得的具有D-氨基酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列。与圆红酵母的核酸序列的位置54、58和213相比，与SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列相比，所述氨基酸序列包含氨基酸取代(置换)，并因此是DAAO变体(突变体)的氨基酸序列。
SEQ ID NO 23：编码来自斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)的过氧化氢酶基因的核酸编码序列。
SEQ ID NO 24：从SEQ ID NO 23所示的编码序列获得的，具有过氧化氢酶活性的蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO 25：编码具有SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列的具有过氧化氢酶活性的蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO 26：图1中称为“lac操纵子”的遗传元件的核酸序列。
SEQ ID NO 27：图1中称为“Trc启动子”的遗传元件的核酸序列。
SEQ ID NO 28：图1中称为“rrnB”的遗传元件的核酸序列。
SEQ ID NO 29：图1中称为“顺反子”的遗传元件的核酸序列。
SEQ ID NO 30：图1中称为“rrnB终止子”的遗传元件的核酸序列。
附图说明
图1：质粒图，其显示了用于表达具有DAAO、ω-TA和过氧化氢酶活性的蛋白的遗传元件，其来自单一操纵子作为三顺反子RNA。涉及三顺反子RNA的转录和翻译的调控遗传元件的缩写说明：
lac操纵子：Ullmann,2001,Encyclopedia of Life Sciences,John Wiley&Sons,Ltd,ISBN:9780470015902；Ullmann,2009,Encyclopedia of Life Sciences(ELS),JohnWiley&Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0000849.pub2；由SEQ ID NO26所示的核酸序列组成。
Trc启动子：由E.coli trp和lacUV5启动子所衍生的合成启动子(Brosius等，1985,J Biol Chem 260,3539–3541)；由SEQ ID NO 27所示的核酸序列组成。
rrnB：不依赖于RhoI-的转录终止信号(Pfeiffer&Hartmann,1997,J MolBiol.265(4)385-393；Orosz等，1991,Eur J Biochem.201(3),653-659)；由SEQ ID NO 28所示的核酸序列组成。
t7增强子：来自t7基因的转录增强序列(所用的序列：ttaacttta)。
RBS1：核糖体结合位点(序列：gaggt)。
顺反子：转录终止序列；由SEQ ID NO 29所示的核酸序列组成。
RBS2：核糖体结合位点(所用的序列：aaggag)。
boxA：转录抗终止序列(所用的序列：tgctctttaacaa)。
顺反子：由SEQ ID NO 29所示的核酸序列组成的合成顺反子。
rrnB终止子：转录终止信号：由SEQ ID NO 30所示的核酸序列组成。
T2终止子：翻译终止信号(Orosz等，1991,Eur J Biochem.201(3),653-659)。
图2：显示与具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体相比，具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的由来自节杆菌属的，或具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的由来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白催化的从2-氧代缬氨酸的胺化生产(S)-正缬氨酸。
图3：显示与具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体相比，具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的由来自节杆菌属的，或具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的由来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白催化的从4-甲基-2-氧代-缬氨酸的胺化生产(S)-亮氨酸。
图4：显示与具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体相比，具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的由来自节杆菌属的，或具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的由来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白催化的从苯丙酮酸的胺化生产(S)-苯丙氨酸。
图5：显示与具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体相比，具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的由来自节杆菌属的，或具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的由来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白催化的从p-羟基苯丙酮酸的胺化生产(S)-酪氨酸。
具体实施方式
通用方法
1.ω-TA变体和具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的生产
由服务提供商Eurofins Genomics GmbH(Eurofins Genomics GmbH,AnzingerStr.7a,85560Ebersberg,Germany)合成了编码本文所述的具有ω-TA活性的蛋白的本文所述的已知核苷酸序列。
将核苷酸置换(替代)引入SEQ ID No 2、5、8、11、14所示的核酸序列。此替代可在编码参照多肽的核酸序列中以任何适合用于替代核酸序列中的核苷酸的方法来进行。这些方法在文献中被广泛地描述，并且以相应的顺序是本领域技术人员众所周知的。可以使用几种分子生物学方法来实现相应的核苷酸替代。用于制备根据本发明的突变的核酸序列和相应蛋白的有用方法包括对编码一个或多个预先选择的氨基酸的密码子进行定点诱变，从而以其编码不同氨基酸的方式改变选择的密码子。用于获得这些定点突变的方法是本领域技术人员熟知的且广泛地在文献中进行了描述(特别是：Directed Mutagenesis:APractical Approach,1991,Edited by M.J.McPHERSON,IRL PRESS)，或者是可能应用市售试剂盒的方法(例如，来自Qiagen或Stratagene公司的QUIKCHANGETM闪电诱变试剂盒)。在定点诱变后，将核酸转化到大肠杆菌菌株MG1655中。通过使用适当的筛选方法来选择含有具有有利的生物转化收率的突变多肽的细胞。在本文“通用方法”的第4项和第7项下描述了适宜的筛选方法。对编码改进的多肽的突变核酸序列进行序列验证。用于序列验证的方法是本领域技术人员众所周知的且广泛地在文献中进行了描述(例如Sambrook和Russell(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY))。
2.针对ω-TA变体的表达载体/宿主细胞
将编码野生型ω-TA(SEQ ID No 2、5、8、14)或包含突变的已知ω-TA(SEQ ID NO11)或如本文所述的ω-TA变体的核酸序列克隆进入市售pET22B载体(Merck KGaA,Frankfurter Str 250,64293Darmstadt,Germany)并在大肠杆菌菌株BL21DE3细胞中表达。
3.ω-TA变体的表达
将含有pET22B载体的大肠杆菌菌株BL21DE3的预培养物在含有20ml补充了羧苄青霉素的LB培养基中在37℃下180rpm的旋转摇床上培养过夜，所述pET22B载体已引入了编码ω-TA变体的相应核酸序列。通过将预培养物转移至含有250ml补充了羧苄青霉素的LB培养基的烧瓶中进行ω-TA蛋白的表达。在37℃下180rpm的旋转摇床上培养达到OD(光密度)0.6-0.8之间后，通过添加0.5mM IPTG(终浓度)诱导ω-TA蛋白的表达。将诱导的细胞培养物在20℃、180rpm振荡下孵育20h。根据生产厂商的方案，使用Qiagen(Qiagen GmbH,QiagenStrasse 1,40724Hilden)的Ni-NTA Fast Start试剂盒进行酶的纯化。
4.在胺受体和胺供体存在下进行ωTA变体的活性检测
向40μl三乙醇胺缓冲液(200mM在去离子水中的溶液，pH＝9,0)中，在室温下加入10μl磷酸吡哆醛(10mM在去离子水中的溶液)和10μl胺供体(2M在去离子水中的溶液，通过添加HCl水溶液调整至pH＝9,0)。随后，加入20μl胺受体(100mM在去离子水中的溶液)(如果胺受体不溶于水，则加入成比例的DMSO)。最后，在室温下加入20μl转氨酶(1,5mg/ml)，并将混合物在40℃下以800rpm在旋转摇床上孵育6-7h。在反应期间的不同时间间隔取等分试样通过HPLC分析来监测转胺反应。
5.用于具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的表达载体/宿主细胞。
通过使用包含两个反应步骤的方法进行具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的活性检测。
第一个反应步骤(步骤1)生产ω-TA的胺受体。该步骤由D-氨基酸氧化酶(DAAO或DAO，EC 1.4.3.3)催化。DAAO是含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的黄素蛋白，可根据以下通用方程式(III)催化D-氨基酸与氧的氧化脱氨反应，生成相应的2-氧代酸以及过氧化氢和氨：
α-D-氨基酸+H2O+O2→α-2-氧代羧酸+NH3+H2O2
在第一个反应步骤中具有用于生产α-2-氧代羧酸的DAAO活性的蛋白是来自球形假单胞菌(Rhodosporidium toruloides)的DAO1蛋白的DAAO变体。来自球形假单胞菌的野生型DAO1蛋白的编码核酸序列可衍生自GenBank登录号U6006.1(如SEQ ID NO 19所示)，并且由SEQ ID NO 19所示的核酸序列编码的相应氨基酸序列可衍生自UniProt登录号P80324(如SEQ ID NO 20所示)。本文中使用的DAAO变体在WO 2017/151573中作为突变体Ac305公开(第36页，表1)。与SEQ ID NO 20相比，突变体Ac305在位置54、58和213包含氨基酸置换(替代)。在突变体Ac305中，在SEQ ID NO 20中的位置54的氨基酸N被C置换(替代)，在SEQID NO 20中的位置58的氨基酸F被H置换(替代)和在SEQ ID NO 20中的位置213的氨基酸M被S置换(替代)。突变体Ac305的氨基酸序列如SEQ ID NO 22中所示。编码具有SEQ ID NO22所示的氨基酸序列的蛋白的相应核酸序列如SEQ ID NO 21中所示。步骤1的反应由具有SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列的具有DAAO活性的蛋白催化。
在第二个反应步骤(步骤2)中，通过在步骤1中具有DAAO活性的蛋白产生的α-2-氧代羧酸在存在胺供体的条件下根据通用方程式(I)通过具有ω-TA活性的蛋白转化成氨基酸。
从通过通用方程式(III)对步骤1的描述中可以清楚地看出，由具有DAAO活性的蛋白催化的D-氨基酸向酮酸的转化产生了过氧化氢(H2O2)。可能除去H2O2是理想的，但是并非在每种情况下都需要去除H2O2。结合本发明，通过添加具有过氧化氢酶活性的蛋白来完成H2O2的去除。
具有过氧化氢酶活性的蛋白(EC 1.11.1.6；过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶)是本领域公知的，并且根据下述通用方程式(IV)催化过氧化氢(H2O2)转化成水(H2O)和氧(O2)：
2H2O2→O2+2H2O
具有用于除去H2O2的来自斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)的过氧化氢酶活性的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 24中所示，并且可衍生自GenePept登录号WP_012986600.1。SEQ ID NO 23(可衍生自GenBank登录号NC_013891.1)显示了来自斯氏李斯特氏菌的具有SEQ ID NO 24中所示的氨基酸序列的过氧化氢酶蛋白的核酸编码序列。SEQID NO 25是也编码具有SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列的过氧化氢酶蛋白的核酸序列。与SEQ ID NO 23所示的核酸序列相比，SEQ ID NO 25所示核酸序列的密码子已经过改变而适于大肠杆菌的密码子使用。
为了生产具有DAAO活性的蛋白，具有ω-TA活性的蛋白和具有过氧化氢酶活性的蛋白，将编码相应三种蛋白的核酸序列克隆进入E.coli表达载体中，其方式是将所有三种蛋白从单一操纵子作为三顺反子RNA由trc-启动子(由来源于trp-和lacUV5-启动子的序列组成的杂合启动子)转录。关于从启动子转录的基因顺序是DAAO(SEQ ID NO 21)->编码包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的核酸分子(如本文中上文所述)->过氧化氢酶(SEQID NO 25)。SEQ ID NO 21在其5′-末端与编码氨基酸序列M A R I R L的核酸序列翻译融合。所使用的表达载体是基于pSE420的(描述和序列来自：Addgene,75Sidney St,Suite550A,Cambridge,MA 02139；https://www.addgene.org/vector-database/4064/或来自Thermo Fisher Scientific(Invitrogen),Thermo Fisher Scientific Inc.168ThirdAvenue,Waltham,MA 02451USA,https://www.thermofisher.com/search/results？query ＝pSE420&focusarea)。通过常用的已知方法将遗传元件引入经修饰的pSE420载体。在所使用的表达载体中存在的相关遗传元件如图1中所示。为了表达三种酶，将表达载体转移至大肠杆菌菌株MG1655细胞中。
6.包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的表达
将包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体克隆进入上文在“通用方法”的第5项中所述的三-顺反子表达载体中，并在大肠杆菌菌株MG1655细胞中表达。为此，将20ml在补充了卡那霉素的LB培养基中的预培养物在摇瓶中在37℃下以180rpm在旋转摇床上培养过夜。通过将预培养物转移至含有200ml补充了卡那霉素的LB培养基的烧瓶中进行ωTA蛋白的表达。通过添加1mM IPTG(终浓度)达到0.6-0.8的OD后诱导ωTA蛋白的表达。将诱导的细胞培养物在20℃下以180rpm振荡孵育20h。为了进行收获，将细胞培养物在4℃下以8000g离心15分钟，并将获得的细胞沉淀在-80℃下保存直至进行冷冻干燥或喷雾干燥。
7.具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的活性检测
在配有机械搅拌器，O2-气体入口管和pH控制给药装置的1升温度可调的玻璃双层反应器中，加入268ml 50w％外消旋(R,S)-草铵膦铵盐水溶液(对应于160,8g外消旋草铵膦铵盐)。通过pH控制给药单元在机械搅拌(250rpm)下添加2M异丙胺水溶液直至达到pH＝9,0。在整个反应期间，通过控制添加2M异丙胺水溶液将pH保持恒定。将反应器加热至内温35℃。
在烧杯中，将8g喷雾干燥的大肠杆菌菌株MG1655细胞、200mg磷酸吡哆醛、2ml聚丙二醇(P 2000)和138ml去离子水混合，所述细胞中含有图1中所述的表达载体，其表达野生型ω-TA蛋白和具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体。在35℃下，在搅拌(250rpm)下，将该混合物加入玻璃反应器中。通过O2-气体入口管，将氧气以0,1l/min的流速通入反应混合物中。将混合物搅拌24h，并通过在反应期间的不同时间间隔取等分试样通过HPLC分析来监测反应进程。随后，停止氧气进料以及异丙胺进料并在搅拌(250rpm)下以90℃让反应混合物变性30min。将残留混合物冷却至室温。
8.由ω-TA生产的胺的检测
A)转胺产物(S)-正缬氨酸、(S)-亮氨酸、(S)-酪氨酸和(S)-草铵膦铵盐的分析
通过HPLC分析监测转胺反应的过程。用于此操作的HPLC的方法学是基于Davankov等(1980,Chromatographia 13(11),677–685)发表的文章。
特别地，使用了下述HPLC参数：
色谱柱：Phenomenex Chirex 3126(D)–青霉胺150*4,6mm(目录号：00F-3126-E0)
流速：1ml/min
洗脱液：A)去离子水+0,5g/L CuSO4(v/v)
B)甲醇
A:B＝90:10(等度)
检测器：DAD 230nm
保温箱：30℃
运行时间：15min
B)转胺产物L-苯丙氨酸的分析：
通过HPLC分析监测转胺反应的过程。特别地，使用了下述HPLC参数：
色谱柱：Phenomenex Prodigy 3μm ODS-3 100A 100*4mm(目录号：00D-4222-D0)
流速：2ml/min
洗脱液：A)乙腈
B)去离子水
从A:B的梯度＝5:95至A:B＝95:5在7min内
检测器：VWD1 A,210nm
保温箱：40℃
运行时间：9min
9.细胞的喷雾干燥
以最高温度输入220℃在实验室(实验室规模)的喷雾干燥器中进行喷雾干燥实验。干燥器以200-800l/h(升/小时)在5-8巴下使用压缩空气或氮气。最大气流可达35m3/h(米3/小时)。
为了干燥烧瓶培养物或发酵材料(即，1升总体积)中的细菌细胞团块，通过离心将肉汤浓缩十倍(10x)，并且在离心后获得的培养上清液中重悬至终体积100ml。所获得的浓缩物需要适于泵送，并应通过磁力搅拌器不断混合。使用500l/h的气流，将吸气器设置为100％，将液体施加到0.7mm的喷嘴上。典型产品流量为10ml/min，以及施用的入口温度平均为–145℃和出口温度为85℃。将完成干燥的生物质称重，并以g/l的比例用于生物转化实验。
实施例
1. 2-氧代戊酸向(S)-正缬氨酸的转变
如“通用方法”的第3项所述表达并纯化具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的来自节杆菌属，或具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白，或者具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体。
向25μl在去离子水中的三乙醇胺缓冲液(200mM在去离子水中的溶液，pH＝9.0)，在室温下加入10μl在去离子水中的磷酸吡哆醛(PLP)(10mM在去离子水中的溶液)和10μl在去离子水中的异丙胺(2M在去离子水中的溶液，通过加入HCl水溶液调节至pH＝9.0)。随后，添加20μl 2-氧代戊酸(100mM在去离子水中的溶液)。最后，在室温下添加35μl包含1.5mg/ml每种ω-TA蛋白的溶液，并将混合物在40℃下以800rpm在旋转振荡器上孵育6h。如“通用方法”第8项所述，在反应期间的不同时间间隔取等分试样通过HPLC分析来监测转胺反应。
表6表示与具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的和具有SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型蛋白的那些相比具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体获得的结果。结果也显示在图2中。
表6
对表6的说明：
以小时(h)测量的“时间”表示从反应开始后消逝的时间。
“mAU*s”是毫(m)吸收(A)单位(U)乘以(*)秒(s)的缩写；描述HPLC色谱图中峰下面积的标准单位。峰下的面积越高，相应产物的量就越高。
从表6和图2可以得出，在由ω-TA变体催化的反应中由2-氧代戊酸生产(S)-正缬氨酸的过程比由来自节杆菌属和巨大芽孢杆菌的野生型蛋白催化的反应更快。此外，与由来自节杆菌属和巨大芽孢杆菌的野生型蛋白催化的反应相比，在由ω-TA变体催化的反应中，在反应过程中产生的(S)-正缬氨酸显著更早达到最大量。
2. 4-甲基-2-氧代戊酸向(S)-亮氨酸的转化
如“通用方法”的第3项所述表达并纯化具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自节杆菌属，或具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白，或者具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体。
向40μl三乙醇胺缓冲液(200mM在去离子水中的溶液，pH＝9.0)，在室温下加入10μl磷酸吡哆醛(10mM在去离子水中的溶液)和10μl异丙胺(2M在去离子水中的溶液，通过加入HCl水溶液调节至pH＝9.0)。随后，添加20μl 4-甲基2-氧代戊酸(100mM在去离子水中的溶液)。最后，在室温下添加20μl包含1.5mg/ml每种ω-TA蛋白的溶液，并将混合物在40℃下以800rpm在旋转振荡器上孵育6h。如“通用方法”第8项所述，在反应期间的不同时间间隔取等分试样通过HPLC分析来监测转胺反应。
表7表示与具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的和具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型蛋白的那些相比具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体获得的结果。结果也显示在图3中。
表7
对表7的说明：见对表6的说明
从表7和图3可以得出，来自节杆菌属和巨大芽孢杆菌的野生型酶不能通过4-甲基-2-氧代戊酸的胺化生产(S)-亮氨酸，而ω-TA变体则相当有效地生产(S)-亮氨酸。
3.苯丙酮酸向(S)-苯丙氨酸的转化
如“通用方法”的第3项所述表达并纯化具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自节杆菌属，或具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白，或者具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体。
向40μl三乙醇胺缓冲液(200mM在去离子水中的溶液，pH＝9.0)，在室温下加入10μl磷酸吡哆醛(10mM在去离子水中的溶液)和10μl异丙胺(2M在去离子水中的溶液，通过加入HCl水溶液调节至pH＝9.0)。随后，添加20μl在比例为1：1的DMSO/去离子水中的苯丙酮酸(100mM苯丙酮酸溶液)。最后，在室温下添加20μl包含1.5mg/ml每种ω-TA蛋白的溶液，并将混合物在40℃下以800rpm在旋转振荡器上孵育6h。如“通用方法”第8项所述，在反应期间的不同时间间隔取等分试样通过HPLC分析来监测转胺反应。
表8表示与具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的和具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型蛋白的那些相比具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体获得的结果。结果也显示在图4中。
表8
对表8的说明：见对表6的说明
从表8和图4可以得出，与由ω-TA变体生产的(S)-苯丙氨酸的量相比，来自节杆菌属的野生型酶不能从苯丙酮酸生产(S)-苯丙氨酸，来自巨大芽孢杆菌的野生型酶非常缓慢且以较低量生产(S)-苯丙氨酸。
4.p-羟基苯丙酮酸向(S)-酪氨酸的转化：
如“通用方法”的第3项所述表达并纯化具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自节杆菌属，或具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型ω-TA蛋白，或者具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体。
向40μl三乙醇胺缓冲液(200mM在去离子水中的溶液，pH＝9.0)，在室温下加入10μl磷酸吡哆醛(10mM在去离子水中的溶液)和10μl异丙胺(2M在去离子水中的溶液，通过加入HCl水溶液调节至pH＝9.0)。随后，添加20μl在比例为1：1的DMSO/去离子水中的p-羟基苯丙酮酸(100mM p-羟基苯丙酮酸溶液)。最后，在室温下添加20μl包含1.5mg/ml每种ω-TA蛋白的溶液，并将混合物在40℃下以800rpm在旋转振荡器上孵育6h。如“通用方法”第8项所述，在反应期间的不同时间间隔取等分试样通过HPLC分析来监测转胺反应。
表9表示与具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的来自节杆菌属的和具有SEQ IDNO 6所示的氨基酸序列的来自巨大芽孢杆菌的野生型蛋白的那些相比具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体获得的结果。结果也显示在图5中。
表9
对表9的说明：见对表6的说明
从表9和图5可以得出，来自节杆菌属和巨大芽孢杆菌的野生型酶不能通过p-羟基苯丙酮酸的胺化生产(S)-酪氨酸，而ω-TA变体则相当有效地生产(S)-酪氨酸。
5.通过包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体由4-[羟基(甲基)磷氧基]-2-氧代丁酸生产(S)-草铵膦
如“通用方法”的第6项所述，将具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体和如本文表2中所述的包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体与具有DAAO活性和具有过氧化氢酶活性的蛋白一起表达(参见“通用方法”，第5项)，随后如“通用方法”的第9项所述进行喷雾干燥。通过(R)-草铵膦的脱胺作用DAAO产生4-[羟基(甲基)磷氧基]-2-氧代丁酸。随后通过具有进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体，使用4-[羟基(甲基)磷氧基]-2-氧代丁酸作为氨基受体，并在胺化反应中转化成(S)-草铵膦。根据在“通用方法”第7项下描述的检测进行具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体和如本文表2中所述的包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体的活性检测。反应开始5h之后，如“通用方法”第8项中所述，通过HPLC分析，测定各反应中所产生的(S)-草铵膦的量来监测转胺反应。
表10表示由每个包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体产生的(S)-草铵膦(S-GA)的量和由具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列的ω-TA变体的量。
表10
对表10的说明：
为了鉴定氨基酸变化，第1列中的数字标识了SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列中的氨基酸位置。数字前出现的字符标识存在于SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列中各个位置的氨基酸。数字后出现的字符标识存在进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体氨基酸序列中各个位置上存在的氨基酸。与在SEQ ID NO 18中显示的氨基酸序列相比，在同一列的行中给出的两个数字(每个数字前后都有一个字符)标识了两个同时发生的氨基酸置换(替代)。
从表10可以得出，与具有SEQ ID NO 18所示氨基酸序列的ω-TA变体相比，包含进一步的氨基酸修饰的ω-TA变体产生更多的(S)-草铵膦。
Claims (13)
1.一种具有ω-转氨酶(ω-TA)活性的蛋白，其中所述蛋白选自以下：
a)包含如SEQ ID NO 3所示的从位置1至477的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
b)包含如SEQ ID NO 6所示的从位置1至479的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是T，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
c)包含如SEQ ID NO 9所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸不是E，在位置187的氨基酸不是S，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
d)包含如SEQ ID NO 12所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸和在位置187的氨基酸不是S，不是E，在位置197的氨基酸不是T，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
e)包含如SEQ ID NO 15所示的从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F，在位置64的氨基酸不是L，在位置88的氨基酸不是T，在位置157的氨基酸不是T，在位置165的氨基酸不是R，在位置169的氨基酸不是V，在位置174的氨基酸和在位置187的氨基酸不是S，不是E，在位置197的氨基酸不是M，在位置239的氨基酸不是S，在位置327的氨基酸不是S，在位置328的氨基酸不是V，在位置384的氨基酸不是Y，在位置389的氨基酸不是I，在位置391的氨基酸不是D，在位置396的氨基酸不是K，在位置410的氨基酸不是H，和在位置414的氨基酸不是P；
f)具有与a)、b)、c)、d)、e)或f)所示的任何氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％、甚至再更优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或特别优选地99％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过在各种情况下对应于位置25的氨基酸不是F，对应于位置64的氨基酸不是L，对应于位置88的氨基酸不是T，对应于位置157的氨基酸不是T，对应于位置165的氨基酸不是R，对应于位置169的氨基酸不是V，对应于位置174的氨基酸不是E，对应于位置187的氨基酸不是S，对应于位置197的氨基酸不是T或M，对应于位置239的氨基酸不是S，对应于位置327的氨基酸不是S，对应于位置328的氨基酸不是V，对应于位置384的氨基酸不是Y，对应于位置389的氨基酸不是I，对应于位置391的氨基酸不是D，对应于位置396的氨基酸不是K，对应于位置410的氨基酸不是H，和对应于位置414的氨基酸不是P。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其选自以下：
a)包含如权利要求1的段落a)中所定义的氨基酸序列的蛋白，除此之外，另外在位置2的氨基酸不是S，在位置48的氨基酸不是D，在位置164的氨基酸不是Y，在位置202的氨基酸不是D，在位置205的氨基酸不是L，在位置242的氨基酸不是A，在位置245的氨基酸不是A，在位置311的氨基酸不是L，在位置353的氨基酸不是F，在位置359的氨基酸不是D，在位置424的氨基酸不是K，在位置475的氨基酸不是A，在位置476的氨基酸不是L和在位置477的氨基酸缺失；
b)包含如权利要求1的段落b)中所定义的氨基酸序列的蛋白，除此之外，另外在位置46的氨基酸不是T，在位置60的氨基酸不是C，在位置185的氨基酸不是C，在位置186的氨基酸不是S，在位置195的氨基酸不是S，在位置205的氨基酸不是Y，在位置252的氨基酸不是V，在位置268的氨基酸不是S，在位置409的氨基酸不是R，在位置436的氨基酸不是A，和在位置477、478和479的氨基酸缺失；
c)包含如权利要求1的段落c)中所定义的氨基酸序列的蛋白，除此之外，另外在位置2的氨基酸不是S，在位置48的氨基酸不是D，在位置69的氨基酸不是P，在位置90的氨基酸不是S，在位置164的氨基酸不是Y，在位置242的氨基酸不是A，在位置245的氨基酸不是A，在位置268的氨基酸不是T，在位置311的氨基酸不是L，在位置318的氨基酸不是E，在位置322的氨基酸不是R，在位置353的氨基酸不是S，在位置424的氨基酸不是K，和在位置452的氨基酸不是E；
d)包含如权利要求1的段落d)中所定义的氨基酸序列的蛋白，除此之外，另外在位置46的氨基酸不是T，在位置60的氨基酸不是C，在位置185的氨基酸不是C，在位置186的氨基酸不是C，在位置195的氨基酸不是S，在位置205的氨基酸不是Y，在位置252的氨基酸不是V，在位置268的氨基酸不是S，在位置409的氨基酸不是R和在位置436的氨基酸不是A；
e)包含如权利要求1的段落d)中所定义的氨基酸序列的蛋白，除此之外，另外在位置48的氨基酸不是D，在位置164的氨基酸不是Y，在位置242的氨基酸不是A，在位置245的氨基酸不是A，在位置255的氨基酸不是F和在位置424的氨基酸不是K；
f)具有与a)、b)、c)、d)或e)中所定义的任何氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过如a)、b)、c)、d)或e)所定义的各氨基酸位置分别亦存在于与每个a)、b)、c)、d)或e)中所定义的氨基酸序列至少60％相同的蛋白序列的氨基酸序列中对应的氨基酸位置。
3.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的蛋白，其选自以下：
a)包含如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列的蛋白；
b)具有与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过对应于SEQ ID NO18的位置25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410和414的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸；
c)具有与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过对应于SEQ ID NO18的位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475、476和477的氨基酸代表在SEQID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其选自以下：
a)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置166的氨基酸是G和在位置327的氨基酸是Q；
b)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是Q和在位置384的氨基酸是S；
c)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置326的氨基酸是Q和在位置327的氨基酸是Q；
d)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是Q；
e)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置326的氨基酸是F和在位置327的氨基酸是Q；
f)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是C；
g)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是I；
h)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是M；
i)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置164的氨基酸是Y；
j)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置164的氨基酸是S；
k)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是V；
l)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置409的氨基酸是R；
m)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是S；
n)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置271的氨基酸是I；
o)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置329的氨基酸是G；
p)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置409的氨基酸是P；
q)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置414的氨基酸是M；
r)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置165的氨基酸是K；
s)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置414的氨基酸是R；
t)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置414的氨基酸是H；
u)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置165的氨基酸是C；
v)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置327的氨基酸是V；
w)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置164的氨基酸是C；
x)根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，不过在位置409的氨基酸是K。
5.根据权利要求4所述的蛋白，其选自以下：
a)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置166的氨基酸S被G置换和在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
b)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换和在SEQ ID NO 18中位置384的氨基酸C被S置换；
c)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置326的氨基酸E被Q置换和在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
d)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
e)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置326的氨基酸E被F置换和在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被Q置换；
f)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被C置换；
g)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被I置换；
h)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被M置换；
i)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置164的氨基酸F被Y置换；
j)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置164的氨基酸F被S置换；
k)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被V置换；
l)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置409的氨基酸T被R置换；
m)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被S置换；
n)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置271的氨基酸V被I置换；
o)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置329的氨基酸S被G置换；
p)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置409的氨基酸T被P置换；
q)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置414的氨基酸L被M置换；
r)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置165的氨基酸Q被K置换；
s)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置414的氨基酸L被R置换；
t)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置414的氨基酸L被H置换；
u)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置165的氨基酸Q被C置换；
v)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置327的氨基酸T被V置换；
w)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置164的氨基酸F被C置换；
x)具有SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列从位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQ ID NO 18中位置409的氨基酸T被K置换；
y)具有与a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的任何氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白，不过如a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定义的各氨基酸位置分别亦存在于与每个a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的氨基酸序列具有至少60％同一性的蛋白序列的氨基酸序列中对应的氨基酸位置。
6.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其编码选自以下的具有ω-TA活性的蛋白：
a)包含SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子；
b)编码包含SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列中从位置1至476的氨基酸序列的蛋白的核酸分子；
c)与SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列具有至少60％同一性的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置589至591的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn；
d)与SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列具有至少60％同一性的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置4至6的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138的密码子具有核苷酸序列atg，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置178至180的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置268至270的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tty，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ IDNO17中核苷酸位置553至555的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置589至591的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQID NO17中核苷酸位置613至615的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置733至735的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置754至756的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQID NO17中核苷酸位置802至804的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置964至966的密码子具有核苷酸序列aar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQID NO17中核苷酸位置1057至1059的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308的密码子具有核苷酸序列gtn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356的密码子具有核苷酸序列ggn；
e)与a)、b)、c)或d)所定义的核酸分子的互补链杂交的核酸分子，不过对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn；
f)与a)、b)、c)或d)所定义的核酸分子的互补链杂交的核酸分子，不过对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置4至6的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置73至75的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置136至138的密码子具有核苷酸序列atg，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置142至144的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置178至180的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置190至192的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置205至207的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置262至264的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置268至270的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置469至471的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tty，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列car，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置505至507的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置520至522的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置553至555的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置556至558的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置559至561的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置583至585的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ IDNO 17中核苷酸位置589至591的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置604至606的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置613至615的密码子具有核苷酸序列tgy，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置715至717的密码子具有核苷酸序列ccn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置724至726的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置733至735的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置754至756的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置763至765的密码子具有核苷酸序列ath，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置802至804的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置931至933的密码子具有核苷酸序列gtn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置952至954的密码子具有核苷酸序列gcn，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置964至966的密码子具有核苷酸序列aar，对应于SEQID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置982至984的密码子具有核苷酸序列ggn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1057至1059的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1075至1077的密码子具有核苷酸序列aay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列tay，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1165至1167的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1171至1173的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1186至1188的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列acn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1228至1230的密码子具有核苷酸序列mgn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列ytn，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1270至1272的密码子具有核苷酸序列gar，对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1306至1308的密码子具有核苷酸序列gtn和对应于SEQ ID NO 17中核苷酸位置1354至1356的密码子具有核苷酸序列ggn；
g)由于密码子的简并性，从a)、b)、c)、d)、e)或f)所定义的核酸分子衍生的核酸分子；
h)编码与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％同一性的蛋白的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO 18的位置25、64、88、157、165、169、174、187、239、327、328、384、389、391、396、410和414的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸；
i)编码与如SEQ ID NO 18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60％同一性的蛋白的核酸分子，不过对应于SEQ ID NO 18的位置2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475和476的氨基酸代表在SEQ ID NO 18中所示的氨基酸序列中各个位置所示的那些氨基酸；
j)包含如SEQ ID NO 16所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子。
8.根据权利要求6或权利要求7中任一项所述的核酸分子，其编码选自以下的具有ω-TA活性的蛋白：
a)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置496至498的密码子具有核苷酸序列ggn和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
b)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1150至1152的密码子具有核苷酸序列wsn；
c)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密码子具有核苷酸序列car和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
d)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
e)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置976至978的密码子具有核苷酸序列tty和在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
f)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列car；
g)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列ath；
h)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列atg；
i)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tay；
j)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列wsn；
k)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列gtn；
l)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列mgn；
m)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列wsn；
n)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置811至813的密码子具有核苷酸序列ath；
o)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置985至987的密码子具有核苷酸序列ggn；
p)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列ccn；
q)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列atg；
r)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列aar；
s)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列mgn；
t)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1240至1242的密码子具有核苷酸序列cay；
u)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置493至495的密码子具有核苷酸序列tgy；
v)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置979至981的密码子具有核苷酸序列gtn；
w)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置490至492的密码子具有核苷酸序列tgy；
x)包含如SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核酸序列中从位置1至1428的核酸序列的核酸分子，除此之外，在SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中核苷酸位置1225至1227的密码子具有核苷酸序列aar；
y)具有与a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的任何核酸序列具有至少60％同一性的核酸序列的核酸分子，不过如a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)所定义的各密码子的核苷酸序列分别亦存在于与每个a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)或x)中所定义的核酸序列具有至少60％同一性的核酸序列中对应的密码子的核苷酸位置。
9.一种重组核酸分子，其包含根据权利要求6至8中任一项所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子是载体或质粒。
11.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白，或包含根据权利要求6至8中任一项所述的核酸分子，或者包含根据权利要求9或权利要求10中任一项所述的重组核酸分子。
12.一种用于生产胺的方法，其包括以下步骤：
a)提供胺受体分子；
b)提供胺供体分子；
c)将步骤a)中提供的所述胺受体分子和步骤b)中提供的所述胺供体分子与根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白接触。
13.一种用于在包含(R)-和(S)-胺对映异构体的组合物中降低胺对映异构体的量的方法，其包括以下步骤:
a)提供包含(R)-和(S)-胺对映异构体的组合物；
b)提供胺受体分子；
c)将在步骤a)中提供的所述组合物和步骤b)中提供的所述胺受体与根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白接触。
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