CN103534353A

CN103534353A - 修饰型氨基转移酶、其基因以及利用它们的光学活性氨基化合物的制造方法

Info

Publication number: CN103534353A
Application number: CN201280022839.4A
Authority: CN
Inventors: 伊藤纪幸; 川野茂; 八十原良彦
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2032-03-09
Also published as: CN103534353B; EP2684953A1; US20140004575A1; JPWO2012124639A1; WO2012124639A1; EP2684953A4; JP5927178B2; US9029113B2; EP2684953B1

Abstract

本发明提供用于从酮化合物高效地制造作为医药品、农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。通过对来自荧光假单胞菌的氨基转移酶进行修饰，得到与野生型的酶相比，立体选择性、耐热性、对胺化合物的抗性得以提高的具有氨基转移酶活性的多肽、编码该多肽的基因、高表达该基因的转化体。

Description

修饰型氨基转移酶、其基因以及利用它们的光学活性氨基化合物的制造方法

技术领域

本发明涉及能够通过氨基转移反应、将酮化合物高效地转化为光学活性氨基化合物的酶以及使用了该酶的光学活性氨基化合物的制造方法。所得到的光学活性氨基化合物能够作为医药品或农药等的中间体利用。

背景技术

目前为止已知的氨基转移酶有许多种类，但生成α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物的酶的报告例少(非专利文献1)。

因此，现有的酶中，对于目的化合物的立体选择性不充分、在适于底物的物性的温度条件或pH条件的反应中酶的稳定性低等，工业利用中存在问题的情况较多。

这样，在针对目的化合物的反应中，如能够提供立体选择性高、稳定性高的氨基转移酶，在光学活性氨基化合物的工业化生产上是有用的。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Trends in Biotechnology,28,324-332(2010)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供与由序列表的序列编号1记载的氨基酸序列所构成的野生型酶相比，反应性得到提高的修饰型氨基转移酶。还在于提供用于使用该酶、或生产该酶的转化体，从酮化合物高效地制造光学活性氨基化合物的方法。

解决问题的方法

本发明的发明者们为了实现上述目的，反复进行各种研究的结果，发现通过在来自荧光假单胞菌KNK08-18的氨基转移酶(由序列编号1所示的氨基酸序列所构成的多肽)中导入变异，能够得到与野生型的酶相比，活性、立体选择性、稳定性、由产物造成的抑制得到改善的氨基转移酶，从而完成了本发明。即，本发明提供以下内容。

项1.显示出以下(i)至(iii)的性质的多肽：

(i)与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性(sequenceidentity)为85%以上，

(ii)在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，

(iii)与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性更高。

项2.以下的(A)至(C)中任一项所示的多肽。

(A)由如下序列构成的多肽，所述序列为序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及第151位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列，

(B)多肽，其为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及第151位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，上述氨基酸部位以外的氨基酸的1个或多个被取代、添加、插入或缺失，并且，该多肽在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高，

(C)多肽，其为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及第151位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，除去了所述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，并且，在氨基供体的存在下，该多肽能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列构成的氨基转移酶相比较，其反应性更高的多肽。

项3.在项1或2中记载的多肽，其中，在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代群组中的1个或多个氨基酸取代：

第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸，

第420位被取代为脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及苏氨酸以外的氨基酸，

第17位被取代为非极性氨基酸，

第84位被取代为不带电氨基酸，

第171位被取代为碱性氨基酸，

第176位被取代为不带电氨基酸，

第262位被取代为非极性氨基酸，

第302位被取代为非极性氨基酸，

第421位被取代为不带电氨基酸，

第435位被取代为非极性氨基酸，

第29位被取代为碱性氨基酸，

第42位被取代为不带电氨基酸，

第116位被取代为非极性氨基酸，

第153位被取代为非极性氨基酸，

第190位被取代为非极性氨基酸，

第284位被取代为不带电氨基酸，

第209位被取代为非极性氨基酸，

第235位被取代为非极性氨基酸，

第236位被取代为非极性氨基酸，

第408位被取代为不带电氨基酸，

第418位被取代为不带电氨基酸，

第434位被取代为非极性氨基酸，

第442位被取代为非极性氨基酸，

第3位被取代为碱性氨基酸，

第11位被取代为不带电氨基酸，以及

第151位被取代为碱性氨基酸。

项4.在项1或2中记载的多肽，其中，在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代群组中的1个或多个氨基酸取代：

第161位被取代为苏氨酸或缬氨酸，

第420位被取代为组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸或色氨酸，

第17位被取代为异亮氨酸或亮氨酸，

第84位被取代为半胱氨酸，

第171位被取代为精氨酸，

第176位被取代为丝氨酸，

第262位被取代为缬氨酸，

第302位被取代为异亮氨酸，

第421位被取代为苏氨酸，

第435位被取代为丙氨酸，

第29位被取代为赖氨酸，

第42位被取代为酪氨酸，

第116位被取代为亮氨酸，

第153位被取代为苯丙氨酸，

第190位被取代为酪氨酸，

第284位被取代为异亮氨酸，

第209位被取代为丙氨酸，

第235位被取代为缬氨酸，

第236位被取代为异亮氨酸，

第408位被取代为苏氨酸，

第418位被取代为亮氨酸，

第434位被取代为丙氨酸，

第442位被取代为缬氨酸，

第3位被取代为精氨硼酸，

第11位被取代为甘氨酸，以及

第151位被取代为组氨酸。

项5.在项1或2中记载的多肽，其中，在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(1)～(15)中的任意氨基酸取代：

(1)第161位被取代为不带电氨基酸；第17位被取代为非极性氨基酸；且第420位被取代为组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，

(2)第161位被取代为不带电氨基酸；且第418位被取代为不带电氨基酸，

(3)第161位被取代为不带电氨基酸；第236位被取代为非极性氨基酸；且第442位被取代为非极性氨基酸，

(4)第161位被取代为不带电氨基酸；且第434位被取代为非极性氨基酸，

(5)第11位被取代为不带电氨基酸；第151位被取代为碱性氨基酸；第161位被取代为不带电氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选取代为缬氨酸，

(6)第161位被取代为不带电氨基酸；第209位被取代为非极性氨基酸；且第235位被取代为非极性氨基酸，

(7)第42位被取代为不带电氨基酸；且第408位被取代为不带电氨基酸，

(8)第17位被取代为非极性氨基酸；且第153位被取代为非极性氨基酸，

(9)第29位被取代为碱性氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸，

(10)第161位被取代为不带电氨基酸；且第284位被取代为不带电氨基酸，

(11)第3位被取代为碱性氨基酸；第17位被取代为非极性氨基酸；第116位被取代为非极性氨基酸；且第190位被取代为非极性氨基酸，

(12)第84位被取代为不带电氨基酸；且第420位被取代为苏氨酸以外的不带电氨基酸，

(13)第161位被取代为不带电氨基酸；且第17位被取代为非极性氨基酸，

(14)第161位被取代为不带电氨基酸；且第420位被取代为碱性氨基酸，以及

(15)第17位被取代为非极性氨基酸；且第420位被取代为碱性氨基酸。

项6.在项1或2中记载的多肽，在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(16)～(30)中的任意氨基酸取代：

(16)第17位被取代为异亮氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸、

(17)第161位被取代为苏氨酸；且第418位被取代为亮氨酸，

(18)第161位被取代为苏氨酸；且第236位被取代为异亮氨酸；且第442位被取代为缬氨酸，

(19)第161位被取代为苏氨酸；且第434位被取代为丙氨酸，

(20)第11位被取代为甘氨酸；第151位被取代为组氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第262位被取代为缬氨酸，

(21)第161位被取代为苏氨酸；第209位被取代为丙氨酸；且第235位被取代为缬氨酸，

(22)第42位被取代为酪氨酸；且第408位被取代为苏氨酸，

(23)第17位被取代为亮氨酸；且第153位被取代为苯丙氨酸，

(24)第29位被取代为赖氨酸；且第262位被取代为缬氨酸，

(25)第161位被取代为苏氨酸；且第284位被取代为异亮氨酸，

(26)第3位被取代为精氨酸；第17位被取代为亮氨酸；第116位被取代为亮氨酸；且第190位被取代为酪氨酸，

(27)第84位被取代为半胱氨酸；且第420位被取代为丝氨酸，

(28)第17位被取代为异亮氨酸；且第161位被取代为苏氨酸、

(29)第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸，以及

(30)第17位被取代为异亮氨酸；且第420位被取代为组氨酸。

项7.一种分离得到的DNA，其编码项1～6中任一项中记载的多肽。

项8.一种载体，其包含项7中记载的DNA。

项9.一种转化体，其通过项8中记载的载体转化宿主细胞而得到。

项10.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于，在氨基供体的存在下，使项1～6的任一项中记载的多肽、或项7中记载的转化体和/或其处理物与酮化合物作用。

项11.在项8中记载的制造方法，其中，上述酮化合物为下述式(1)：

[化学式1]

(式中，R¹以及R²表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的芳烷基或任选具有取代基的芳基，R¹和R²两者任选互相结合形成环。条件式，R¹和R²的结构不同。)所示的非对称酮，其产物为下述式(2)：

[化学式2]

(式中，R¹以及R²与上述式(1)相同。＊表示手性碳原子。)所示的光学活性氨基化合物。

项12.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于，在氨基受体的存在下，使项1～6的任一项中记载的多肽或、项7中记载的转化体和/或其处理物与氨基化合物的对映体混合物作用。

项13.在项10中记载的制造方法，其中，上述氨基化合物的对映体为下述式(3)：

[化学式3]

(式中，R¹以及R²表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的芳烷基或任选具有取代基的芳基，R¹和R²两者任选互相结合形成环。条件是，R¹和R²的结构不同。)所示的对映体混合物，其产物为下述式(4)：

[化学式4]

(式中，R¹以及R²与上述式(3)相同。＊表示手性碳原子)所示的光学活性氨基化合物。

项14.在项11中记载的制造方法，其中，上述式(1)所示的酮化合物为选自1-萘满酮、2-萘满酮、5-甲氧基-2-萘满酮、6-甲氧基-2-萘满酮、7-甲氧基-2-萘满酮、8-甲氧基-2-萘满酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、1-Boc-3-吡咯烷酮、1-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、1-Boc-3-哌啶酮、1-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3,4-二甲氧基苯基丙酮所构成的群组中的1种以上酮化合物。

项15.在项13中记载的制造方法，其中，上述式(3)所示的氨基化合物为选自1-氨基四氢化萘、2-氨基四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基四氢化萘、1-苄基-3-氨基吡咯烷、1-Boc-3-氨基吡咯烷、1-Cbz-3-氨基吡咯烷、1-苄基-3-氨基哌啶、1-Boc-3-氨基哌啶、1-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3,4-二甲氧基苯异丙胺所构成的群组中的1种以上氨基化合物。

项16.在项10或11中记载的制造方法，其中，氨基供体为选自1-苯乙胺、2-丁胺、2-戊胺、2-庚胺、3-庚胺、正乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、异丙胺、异丁胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β-苯乙胺、环己胺以及它们的光学活性体所构成的群组中的1种以上化合物。项17.在项12或13中记载的制造方法，其中，氨基受体为丙酮酸或乙醛酸。项18.在项10～17的任一项中记载的光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于，反应温度保持在35℃以上。

发明的效果

通过对来自荧光假单胞菌KNK08-18株的氨基转移酶的氨基酸序列进行修饰，得到活性、立体选择性、稳定性、由产物导致的抑制等得到了改善的修饰型氨基转移酶。通过使用该酶，能够有效地生成光学活性氨基化合物。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。需要说明的是，本说明书中记述的DNA的分离、载体的制备、转化等基因操作，如没有特别说明，则能够利用MolecularCloning2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、CurrentProtocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates andWiley-Interscience)等书籍中记载的方法来进行。

在本说明书中，使用下述表示的IUPAC-IUB生物化学命名委员会(CBN)所采用的代码来表示氨基酸、肽、蛋白质。另外，只要没有特别说明，肽以及蛋白质的氨基酸残基的序列，就以从左端到右端，按照从N末端到C末端的方式表示。另外，为了容易参照，适用通常所用的下述命名法。1个方式为记载为“原氨基酸；位置；取代后的氨基酸”的方法，例如，位置64的酪氨酸取代为天冬氨酸表示为Tyr64Asp或Y84D。多重变异采用斜线记号“/”分开表示。例如，S41A/Y64D表示将位置41的丝氨酸取代为丙氨酸，并且将位置64的酪氨酸取代为天冬氨酸。

A＝Ala＝丙氨酸、C＝Cys＝半胱氨酸、

D＝Asp＝天冬氨酸、E＝Glu＝谷氨酸、

F＝Phe＝苯丙氨酸、G＝Gly＝甘氨酸、

H＝His＝组氨酸、I＝Ile＝异亮氨酸、

K＝Lys＝赖氨酸、L＝Leu＝亮氨酸、

M＝Met＝甲硫氨酸、N＝Asn＝天冬酰胺、

P＝Pro＝脯氨酸、Q＝Gln＝谷氨酰胺、

R＝Arg＝精氨酸、S＝Ser＝丝氨酸、

T＝Thr＝苏氨酸、V＝Val＝缬氨酸、

W＝Trp＝色氨酸、Y＝Tyr＝酪氨酸、

另外，在本说明书中，“非极性氨基酸”包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸，“不带电氨基酸”包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺，“酸性氨基酸”包括天冬氨酸以及谷氨酸，“碱性氨基酸”包括赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。

另外，酶活性的单位，如没有特别说明，则将1分钟产生1μmol产物的酶量作为1U。

1.野生型酶及其基因

在本发明中，导入变异之前的野生型酶为由序列表的序列编号1所示的454个氨基酸残基所构成、在氨基供体的存在下，具有从酮化合物生成光学活性氨基化合物(例如从7-甲氧基-2-萘满酮生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘)的活性的多肽。该多肽被记载为野生型酶。

多肽的来源没有限定，但优选为来自属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物、更优选来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、更加优选来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)KNK08-18株的氨基转移酶。本菌株于2004年(平成16年)10月5日作为保藏编号FERM P-20239，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。

本发明的野生型酶基因是指序列表的序列编号2所示的多核苷酸，例如，能够依照Molecular Cloning2nd Edition(Joseph Sambrook，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))等中记载的通常的基因工程技术从假单胞菌(Pseudomonas)属、优选从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)KNK08-18株中获得。

即，从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)KNK08-18株的基因组DNA中，按照WO2006/126498A1所记载的方法进行PCR，由此能够将由编码序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA或具有序列编号2所示的碱基序列的DNA等进行扩增，而制备野生型基因。

另外，利用有机合成化学的技术，能够获得由编码序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列所构成的DNA或具有序列表的序列编号2所示的碱基序列的DNA等野生型基因。

2.修饰型氨基转移酶

作为本发明的多肽的一个方式，可以列举如下多肽：其与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，且在氨基供体的存在下，能够进行从7-甲氧基-2-萘满酮生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，并且与野生型酶相比，其反应性高。

另外，本发明中“其反应性高”是指与野生型酶相比较时，显示以下(a)～(e)中的至少1种以上的性质。

(a)对于7-甲氧基-2-萘满酮的立体选择性高

(b)热稳定性高

(c)在(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的存在下的稳定性高

(d)对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性高

(e)由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制得到缓解

此外，野生型酶是指由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶。

本发明的多肽也可以为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中进行修饰而得到的多肽。另外，“修饰型氨基转移酶”优选具有序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的氨基酸中的1个、多个或数个氨基酸被取代、添加、插入或缺失而得到的氨基酸序列、与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的氨基转移酶的序列同一性为85%以上的多肽。另外，也可以在这些多肽的N末端以及C末端的任意一方或两方添加1个、多个或数个氨基酸。

作为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中进行的修饰，可以列举取代、添加、插入或缺失，既可以仅包含1种修饰(例如取代)，也可以包含2种以上的修饰(例如、取代和插入)。上述的“多个氨基酸”是指例如70个、优选50个、更优选20个、更加优选10个、8个、5个、4个、3个或2个氨基酸。

另外，进行修饰后的氨基酸序列与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、更加优选为96%以上、更加优选为97%以上、更加优选为98%以上、最优选为99%以上。

在N末端以及C末端的任意一方或两方添加有1个或多个氨基酸的修饰型氨基转移酶中，除去添加的氨基酸，评价其序列同一性。

本说明书中的多肽或多核苷酸的“序列同一性”由如下得到的数值表示：将对比的2条多肽或多核苷酸进行最适排列，将氨基酸或核酸碱基(例如、A、T、C、G、U或I)在两方的序列中一致的位置的数目除以比较氨基酸总数或比较碱基总数，然后，在该结果上乘以100得到的数值。

在氨基转移酶上添加其他酶、蛋白质或肽而使其表达时，将它们除去，来确定序列同一性。

具体而言，多肽或多核苷酸的序列同一性，能够通过利用“GENETYXVer.10”(GENETYX公司)的Maximum matching程序，使用缺省参数来确定。

在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，氨基酸被取代、插入、缺失、添加的位置没有特别限制，但从提高反应性的观点考虑，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，选自第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、190、284、209、235、236、262、302、408、418、420、421、434、435以及442位中的1个或多个氨基酸被取代的多肽、或在这些多肽的N末端、C末端的任意一方或两方添加有1个或多个氨基酸的多肽。

另外，作为本发明的多肽的一个优选方式，可以列举下述(A)～(C)中的任意多肽。

(A)由如下序列构成的多肽，所述序列为序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、190、284、209、235、236、262、302、408、418、420、421、434、

435以及442位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列，

(B)多肽，其为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、190、284、209、235、236、262、302、408、418、420、421、434、435以及442位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，上述氨基酸部位以外的氨基酸的1个或多个被取代、添加、插入或缺失，并且，该多肽在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列构成的氨基转移酶相比较，其反应性高，

(C)多肽，其为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、190、284、209、235、236、262、302、408、418、420、421、434、435以及第442位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，除去上述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，并且，在氨基供体的存在下，该多肽能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高。

以下，在上述(B)以及(C)的多肽中，序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，有时也将第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、190、284、209、235、236、262、302、408、418、420、421、434、435以及第442位以外的氨基酸部位记载为“任意修饰部位”。

上述(B)以及(C)的多肽中，“其反应性高”是指显示上述的(a)～(e)中的至少1种以上的性质，但优选在与将任意修饰部位取代、添加、插入或缺失前的多肽相比较时，显示以下的(f)～(j)中的至少1种以上的性质。

(f)对于7-甲氧基-2-萘满酮的立体选择性等同或更高

(g)热稳定性等同或更高

(h)在(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的稳定性等同或更高

(i)对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性等同或更高

(j)由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制的缓解作用等同或更高

在上述(B)的多肽的任意修饰部位所导入的氨基酸的修饰，既可以仅包括取代、添加、插入以及缺失中的1种修饰(例如取代)，也可以包括2种以上的修饰(例如、取代和插入)。上述(B)的多肽中，在任意修饰部位所被取代、添加、插入或缺失的氨基酸可以为1个、多个或数个，可以列举例如1～70个、优选1～50个、更优选1～20个、更加优选1～10个、1～8个、1～5个、1～4个、1～3个、或者1或2个。

另外，上述(C)的多肽中“除了上述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性”是指从序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，仅将上述任意修饰部位选出，仅比较该任意修饰部位而算出的序列同一性。该序列同一性的确定方法如上所述。

上述(C)的多肽中的“除了上述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性”为85%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、更加优选为96%以上、更加优选为97%以上、更加优选为98%以上、最优选为99%以上。

另外，通常为了保持多肽的功能，优选取代的氨基酸为与取代前的氨基酸具有类似性质的氨基酸。这样的氨基酸残基的取代被称为保守性取代。上述(B)以及(C)的多肽的任意修饰部位中被导入的氨基酸取代优选为保守性取代。即，作为上述任意修饰部位中的取代，可以列举例如：如果取代前的氨基酸为非极性氨基酸则取代为其他的非极性氨基酸、如果取代前的氨基酸为不带电氨基酸则取代为其他的不带电氨基酸、如果取代前的氨基酸为酸性氨基酸则取代为其他的酸性氨基酸、以及如果取代前的氨基酸为碱性氨基酸则取代为其他的碱性氨基酸。

另外，上述(B)以及(C)的多肽的任意修饰部位中，氨基酸被取代、插入或缺失的部位，优选避开由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶的高度保守区域。高度保守区域是指对于来源不同的多个酶，将氨基酸序列最适排列进行比较时，多个序列间氨基酸残基一致的位置。高度保守区域能够通过使用GENETYX等工具比较序列表的序列编号1所示的氨基酸序列和来自公知的微生物的氨基转移酶基因的碱基序列来确认。作为高度保守区域，例如，可以列举序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，第38、139、162、212、221、226、230、231、232、237、241、259、260、261、264、266、267、269、273、281、282、288、296、299、325、328、329、330、331、334、346、378、380以及388位的氨基酸。特别是在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，第288、259、121、261以及325位的氨基酸，被认为构成氨基转移酶的活性中心(FEBS journal(doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08468.x)；Biotechnology and Bioengineering99(2),275-284,2008)，优选氨基酸不被取代、插入或缺失而得以。

(反应性的提高)

在本发明的肽中，序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，对于在第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、190、284、209、235、236、262、302、408、418、420、421、434、435以及442位中取代的氨基酸的种类，没有特别限制，但从提高反应性的观点出发，优选导入有下述(1a)～(26a)所示的氨基酸取代中的1种或多种。

(1a)第3位优选被取代为碱性氨基酸、更优选被取代为精氨酸，

(2a)第11位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为甘氨酸，

(3a)第17位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为异亮氨酸或亮氨酸、特别优选被取代为异亮氨酸，

(4a)第29位优选被取代为碱性氨基酸、更优选被取代为赖氨酸，

(5a)第42位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为酪氨酸，

(6a)第84位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为半胱氨酸，

(7a)第116位优选被取代为非极性氨基酸，更优选被取代为亮氨酸，

(8a)第151位优选被取代为碱性氨基酸、更优选被取代为组氨酸，

(9a)第153位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为苯丙氨酸，

(10a)第161位优选被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸、更优选被取代为不带电氨基酸、特别优选被取代为苏氨酸或缬氨酸，

(11a)第171位优选被取代为碱性氨基酸、更优选被取代为精氨酸，

(12a)第176位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为丝氨酸，

(13a)第284位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为异亮氨酸，

(14a)第190位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为酪氨酸，

(15a)第209位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为丙氨酸，

(16a)第235位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为缬氨酸，

(17a)第236位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为异亮氨酸，

(18a)第262位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为缬氨酸，

(19a)第302位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为异亮氨酸，

(20a)第408位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为苏氨酸，

(21a)第418位优选被取代为不带电氨基酸、更优选被取代为亮氨酸，

(22a)第420位优选被取代为脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及苏氨酸以外的氨基酸、更优选被取代为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、丝氨酸、更加优选被取代为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、特别优选被取代为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、最优选被取代为组氨酸，

(23a)第421位优选取代为不带电氨基酸、更优选被取代为苏氨酸，

(24a)第434位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为丙氨酸，

(25a)第435位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为丙氨酸，

(26a)第442位优选被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为缬氨酸。

(a)对于7-甲氧基-2-萘满酮的立体选择性

从提高立体选择性的观点考虑，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，优选选自第11、17、29、42、84、151、161、176、284、209、235、236、262、408、418、420、421、434、442位中的1个或多个氨基酸被取代的多肽、或在它们的N末端、C末端中的任意一方或两方添加有1个或多个氨基酸的多肽。

更优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下(1b)～(19b)所构成的群组中的1个或多个氨基酸取代的多肽：

(1b)第11位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为甘氨酸，

(2b)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸或亮氨酸、特别优选被取代为异亮氨酸，

(3b)第29位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为赖氨酸，

(4b)第42位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为酪氨酸，

(5b)第84位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为半胱氨酸，

(6b)第151位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸，

(7b)第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸、优选被取代为苏氨酸或缬氨酸，

(8b)第176位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为丝氨酸，

(9b)第284位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(10b)第209位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(11b)第235位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(12b)第236位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(13b)第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(14b)第408位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸，

(15b)第418位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(16b)第420位被取代为脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及苏氨酸以外的氨基酸、优选被取代为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、丝氨酸、更优选被取代为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、特别优选被取代为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、最优选被取代为组氨酸，

(17b)第421位取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸，

(18b)第434位取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，以及

(19b)第442位取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸。

另外，从进一步提高立体选择性的观点出发，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下的(1c)～(13c)所构成的群组中的氨基酸取代的多肽：

(1c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第418位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(2c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第284位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(3c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第236位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸；且第442位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(4c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第209位被取代为非极性氨基酸、更优选被取代为丙氨酸；且第235位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(5c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第434位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(6c)第42位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为酪氨酸；且第408位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸，

(7c)第29位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为赖氨酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(8c)第11位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为甘氨酸；第151位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸；且第62位被取代为非极性氨基酸、

优选被取代为缬氨酸，

(9c)第84位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为半胱氨酸；且第420位被取代为苏氨酸以外的不带电氨基酸、优选被取代为丝氨酸，

(10c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(11c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第420位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸，

(12c)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸；且第420位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸，以及

(13c)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸；且、第420位取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸。

(b)热稳定性

从提高热稳定性的观点出发，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，优选选自第3、17、116、190位中的1个或多个氨基酸被取代的多肽、或在它们的N末端、C末端中的任一方或两方添加有1个或多个氨基酸的多肽。

更优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下的(1d)～(4d)所构成的群组中的1个或多个氨基酸取代的多肽：

(1d)第3位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为精氨酸，

(2d)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(3d)第116位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸，以及

(4d)第190位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为酪氨酸。

此外，从进一步提高热稳定性的观点出发，优选为第3位优选被取代为碱性氨基酸、更优选被取代为精氨酸；第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸；且第116位取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸的多肽。

(c)(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的稳定性

从提高(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的稳定性的观点出发，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，优选第3、11、17、29、42、84、116、151、153、161、171、176、284、190、209、235、236、262、302、408、418、420、434、435、442位中的1个或多个氨基酸被取代的多肽、或在它们的N末端、C末端中的任一方或两方添加有1个或多个氨基酸的多肽。

更优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自以下的(1e)～(25e)所构成的群组中的1个或多个氨基酸取代的多肽：

(1e)第3位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为精氨酸，

(2e)第11位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为甘氨酸，

(3e)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸或亮氨酸，

(4e)第29位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为赖氨酸，

(5e)第42位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为酪氨酸，

(6e)第84位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为半胱氨酸，

(7e)第116位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(8e)第151位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸，

(9e)第153位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为苯丙氨酸，

(10e)第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸、优选被取代为苏氨酸或缬氨酸，

(11e)第171位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为精氨酸，

(12e)第176位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为丝氨酸，

(13e)第284位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(14e)第190位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为酪氨酸，

(15e)第209位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(16e)第235位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(17e)第236位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(18e)第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(19e)第302位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(20e)第408位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸，

(21e)第418位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(22e)第420位被取代为非极性氨基酸或苏氨酸以外的不带电氨基酸或碱性氨基酸、优选被取代为丙氨酸、组氨酸或丝氨酸，

(23e)第421位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸，

(24e)第434位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(25e)第435位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，以及

(26e)第442位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸。

此外，从进一步提高(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的稳定性的观点出发，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下的(1f)～(15f)所构成的群组中的氨基酸取代的多肽：

(1f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第418位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(2f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第236位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸；且第442位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(3f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第434位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(4f)第11位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为甘氨酸；第151位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸；第161位被取代为不带电氨基酸、优选取代为被苏氨酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(5f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第209位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸；且第235位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(6f)第42位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为酪氨酸；且第408位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸，

(7f)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸；且第153位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为苯丙氨酸，

(8f)第29位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为赖氨酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(9f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第284位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(10f)第3位被取代为碱性氨基酸、优选取代为精氨酸；第17位被取代为非极性氨基酸、优选取代为亮氨酸；第116位被取代为非极性氨基酸、优选取代为亮氨酸；且第190位被取代为非极性氨基酸、优选取代为酪氨酸，

(11f)第84位被取代为不带电氨基酸、优选取代为半胱氨酸；且第420位被取代为苏氨酸以外的不带电氨基酸、优选取代为丝氨酸，

(12f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选取代为苏氨酸；且第17位被取代为非极性氨基酸、优选取代为异亮氨酸，

(13f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选取代为苏氨酸；且第420位被取代为碱性氨基酸、优选取代为组氨酸，

(14f)第17位被取代为非极性氨基酸、优选取代为亮氨酸；且第420位被取代为碱性氨基酸、优选取代为组氨酸，以及

(15f)第161位被取代为不带电氨基酸、优选取代为苏氨酸；第17位被取代为非极性氨基酸、优选取代为异亮氨酸；且第420位被取代为碱性氨基酸、优选取代为组氨酸。

(d)对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性

从提高对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性的观点出发，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，优选选自第17、84、420、421位中的1个或多个氨基酸被取代的多肽、或在它们的N末端、C末端中的任一方或两方添加有1个或多个氨基酸的多肽。

优选为序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中导入有选自如下的

(1g)～(4g)所构成的群组中的氨基酸取代的多肽：

(1g)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(2g)第84位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为半胱氨酸，

(3g)第420位被取代为非极性氨基酸或苏氨酸以外的不带电氨基酸、优选被取代为丙氨酸或丝氨酸，以及

(4g)第421位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸。

此外，从进一步提高对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性的观点出发，优选为序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，第84位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为半胱氨酸；且第420位被取代为苏氨酸以外的氨基酸、优选被取代为丝氨酸的多肽。

(e)由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制

从缓解由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制的观点出发，优选序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，优选选自第11、17、151、153、161、171、176、284、209、235、236、262、302、418、434、435、442位中的1个或多个氨基酸被取代的多肽、或在它们的N末端、C末端的任一方或两方添加有1个或多个氨基酸的多肽。

更优选为序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下的(1h)～(17h)所构成的群组中的1个或多个氨基酸取代的多肽：

(1h)第11位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为甘氨酸，

(2h)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸或亮氨酸，

(3h)第151位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸，

(4h)第153位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为苯丙氨酸，

(5h)第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸、优选被取代为苏氨酸或缬氨酸，

(6h)第171位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为精氨酸，

(7h)第176位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为丝氨酸，

(8h)第284位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(9h)第209位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(10h)第235位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(11h)第236位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(12h)第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(13h)第302位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸，

(14h)第418位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(15h)第434位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(16h)第435位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，以及

(17h)第442位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸。

此外，从进一步提高对于由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制的缓解作用的观点出发，优选为导入有选自如下群组的氨基酸取代的多肽：

(1i)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第418位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为亮氨酸，

(2i)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第236位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为异亮氨酸；且第442位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(3i)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；且第434位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸，

(4i)第11位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为甘氨酸；第151位被取代为碱性氨基酸、优选被取代为组氨酸；第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸取代；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

(5i)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第209位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为丙氨酸；且第153位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为苯丙氨酸，

(6i)第17位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为亮氨酸；且第153位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为苯丙氨酸，以及

(7i)第161位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为苏氨酸；第284位被取代为不带电氨基酸、优选被取代为异亮氨酸。

在本说明书中，能够进行在氨基供体的存在下从7-甲氧基-2-萘满酮生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，例如可以如下决定。

即，将含有酶的无细胞提取液100μL添加到具有下述组成的底物溶液305μL中，在30℃使其反应1小时后，添加6N的盐酸50μL，使反应停止。用高效液相色谱测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度。此时，每1mg酶的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘生成活性优选为1mU/mg以上、更优选为10mU/mg以上、更加优选为100mU/mg以上。生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度优选为80%ee以上、更优选为90%ee以上、更加优选为95%ee以上。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 21mM

磷酸钾(pH7.5) 0.1M

7-甲氧基-2-萘满酮 14mM

[利用高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Crownpak CR(＋)(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15(体积比)

流速：1mL/分钟

检测：220nm

柱温：47℃

(a)对于7-甲氧基-2-萘满酮的立体选择性高

在本说明书中，立体选择性是指从作为底物的酮化合物所生成的氨基化合物的光学纯度。另外，是指外消旋体的氨基化合物在酮化合物的存在下，一方的对映体的氨基优先转移至酮化合物时的选择性。

立体选择性，例如能够如下确定。

(a)-1

将含有酶的无细胞提取液100μL添加到具有下述组成的底物溶液305μL中，在30℃使其反应1小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用高效液相色谱测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 21mM

磷酸钾(pH7.5) 0.1M

7-甲氧基-2-萘满酮 14mM

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Crownpak CR(＋)(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15(体积比)

流速：1mL/分钟

检测：220nm

柱温：47℃

(a)-2

另外，立体选择性可以如下确定。

将目的氨基转移酶、来自WO2007/139255中记载的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)JCM8797株的L-乳酸脱氢酶PALDH以及来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IAM1030株的葡萄糖脱氢酶GDH的各自的酶基因分别插入质粒载体，或插入同一质粒载体等中，转化大肠杆菌等，在大肠杆菌内使酶表达。3种酶既可以在一个大肠杆菌中表达，也可以在二个或三个大肠杆菌中分别表达。将各个菌体用超声波等破碎，制备无细胞提取液。三种酶中，以相对于氨基转移酶的活性为过量的方式，混合PALDH以及GDH。在该酶混合液250μL中添加具有下述组成的底物溶液250μL，在35℃使其反应1.5小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用上述高效液相色谱测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度。

[底物溶液组成]

本说明书中，立体选择性高的修饰型氨基转移酶，是指进行上述反应时生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度，在(a)-1或(a)-2中的至少1个反应中，与野生型相比，高0.1%e.e.以上，优选高0.5%e.e.以上、更加优选高1.0%e.e.以上。优选是指在(a)-2的反应中与野生型相比，高0.1%e.e.以上，优选高0.5%e.e.以上、更加优选高1.0%e.e.以上。

(b)热稳定性高

酶的热稳定性，例如可以如下确定。

将表达目的氨基转移酶的重组大肠杆菌接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的5mL的2xYT培养基，在30℃振荡培养一晩。从所得到的培养液1mL中通过离心分离得到菌体。在该菌体中加入含有0.5mM磷酸吡哆醛的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)1mL，通过超声波破碎得到无细胞提取液。将该无细胞提取液500μL在75℃温育30分钟后，冷却至4℃。用含有0.5mM磷酸吡哆醛的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)稀释该无细胞提取液。将稀释的无细胞提取液100μL添加到具有下述组成的底物溶液305μL中，在30℃使其反应1小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用高效液相色谱测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度。通过与没有实施加热处理的样品相比，算出残余活性。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 21mM

磷酸钾(pH7.5) 0.1M

7-甲氧基-2-萘满酮 14mM

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil 5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

本说明书中，热稳定性高的修饰型氨基转移酶是指，进行上述评价时的残余活性与野生型相比，高1%以上、优选高5%以上、更加优选高10%以上、最优选高20%以上。

(c)(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的稳定性高

产物(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的酶的稳定性，例如可以如下确定。

(c)-1

在含有酶的无细胞提取液100μL中，加入含有1%的7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.3)900μL，在35℃或45℃温育。在反应0小时和20小时各取样100μL，将其用0.1M的磷酸钾水溶液(pH7.5)稀释为200倍。将各个稀释液200μL添加到具有下述组成的底物溶液800μL中，在30℃使其反应1小时后，添加6N的盐酸50μL，使反应停止。用下述高效液相色谱测定生成的苯乙酮的浓度。用将反应0小时设为100%时的反应20小时的残余活性来确定。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 25mM

丙酮酸钠 25mM

磷酸吡哆醛 2.5mM

Tris(pH8.5) 0.1M

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

(c)-2

另外，(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的酶的稳定性，例如也可以如下确定。

将培养液5mL离心分离，在所得到的菌体中加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。

在试管中，加入该无细胞提取液50μL、(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的10%或1.67%水溶液(pH7.5)600μL、0.46M丙酮酸钠水溶液(pH7.5)100μL、1M MOPS缓冲液(pH7.5)50μL、50mM PLP水溶液(pH7.5)10μL、水190μL，注入氩气后塞紧塞子，在30℃用搅拌器搅拌4小时。取样200μL，添加0.6N的盐酸50μL使反应停止，按照以下方法用高效液相色谱测定生成的7-甲氧基-2-萘满酮的浓度。确定将使用1.67%的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐水溶液时的活性设为100%时的使用10%水溶液时的相对活性。

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

在本说明书中，在(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘存在下的稳定性高的修饰型氨基转移酶是指，进行了上述评价时的残余活性，在(c)-1或(c)-2中的至少1个反应中与野生型相比高1%以上，优选高5%以上、更加优选高10%以上、最优选高20%以上。优选在(c)-1的反应中与野生型相比，高1%以上，优选高5%以上、更加优选高10%以上、最优选高20%以上。更加优选在(c)-1的反应中，在45℃温育的情况下，与野生型相比，高1%以上，优选高5%以上、更加优选高10%以上、最优选高20%以上。

(d)对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性高

对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性，可以如下确定。

将待评价的氨基转移酶的DNA整合入高表达载体pUCNT(WO94/03613)，使用该质粒转化大肠杆菌HB101。将转化的大肠杆菌纯化后，接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的5mL的2xYT培养基中，在30℃振荡培养28小时。将所得到的培养液通过超声波破碎得到无细胞提取液。在试管中加入该无细胞提取液50μL、含有1mM的磷酸吡哆醛的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)150μL、含有42mM的(S)-1-苯乙胺的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)200μL、含有20%的7-甲氧基-2-萘满酮的DMSO溶液5μL，注入氩气后塞紧塞子，在30℃用搅拌器搅拌1小时。添加6N的盐酸50μL使反应停止，用下述高效液相色谱测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的浓度，确定活性。

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil 5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

在本说明书中，对于7-甲氧基-2-萘满酮的活性高的修饰型氨基转移酶是指，进行了上述评价时的活性，以将野生型作为100%的相对活性计，为101%以上、优选为105%以上、更加优选为110%以上、最优选为120%以上。

(e)由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制得到缓解

由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制，可以如下确定。

将培养液5mL离心分离，在所得到的菌体中，加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。在试管中，加入该无细胞提取液100μL、(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的10%水溶液600μL、1.13M(S)-1-苯乙胺水溶液(pH7.5)100μL、1M MOPS缓冲液(pH7.5)50μL、50mM PLP水溶液(pH7.5)10μL、7-甲氧基-2-萘满酮10mg、水130μL，注入氩气后塞紧塞子，在30℃用搅拌器搅拌1小时。取样200μL，添加0.6N的盐酸50μL使反应停止，通过用下述高效液相色谱测定生成的苯乙酮的浓度，确定活性。

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil 5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

在本说明书中，由(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制得到缓解的修饰型氨基转移酶是指，进行了上述评价时的残余活性，与野生型相比，高1%以上、优选高5%以上、更加优选高10%以上、最优选高20%以上。

2.随机突变文库的构建和测验(assay)

说明搜寻本发明的修饰型氨基转移酶的方法。

(文库的制作)

首先，得到导入了随机突变的MTA基因。使用易错PCR法(Leung etal.，Technique 1，11-15，1989)或者基于相同原理的试剂盒、例如Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech公司制造)，得到在来自Pseudomonas fluorescens KNK08-18株的MTA基因全长(WO2006/126498)中随机导入了1个以上碱基序列的取代、插入、缺失的DNA片段。将该扩增片段组入适当的载体、例如高表达载体pUCNT(WO94/03613)，使用该质粒转化大肠杆菌HB101。将转化的大肠杆菌涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板培养基，得到单菌落的大肠杆菌。另外，也可以代替野生型基因，使用由上述方法得到的变异型酶基因，制作用同样的操作进一步导入变异的变异酶文库。能够从上述文库中，筛选本发明的修饰型氨基转移酶。作为筛选方法没有特别限定，优选为下述方法。

(对于产物的稳定性提高的酶的利用平板评价的筛选法)

将变异酶文库的各重组大肠杆菌涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板培养基，在30℃温育一晚，得到菌体。将所得到的菌体接种于含有4%的7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的LB平板培养基，在37℃温育一晩。野生型由于受到高浓度的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘对酶的抑制或者失活，而没有变色，但是保持活性的变异株生成作为不稳定化合物的7-甲氧基-2-氨基萘满酮，变为黒色。通过研究观察到着色的菌株的DNA序列，能够确定修饰型的氨基酸序列。

(无细胞测验)

将变异酶文库的各重组大肠杆菌接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的5mL的2xYT培养基(胰蛋白胨1.6%、酵母浸膏1.0%、氯化钠0.5%、pH7.0))，在30℃振荡培养28小时。在所得到的培养液500μL中加入含有1mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.5)500μL，通过超声波破碎得到无细胞提取液。使用该无细胞提取液研究上述的立体选择性和(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘稳定性，能够筛选出具有比野生型更优异性质的修饰型氨基转移酶。

3.多重变异酶·饱和突变的制作

对于所得到的修饰型氨基转移酶的变异位点，通过位点特异性变异导入，而修饰为其他的氨基酸，由此能够获得具有更加优异的性质的修饰酶。另外，将所得到的多个修饰型氨基转移酶的变异通过位点特异性变异导入，组合一方中的几个或者双方，由此能够制作一方的性质被强化或者兼具有双方的性质的修饰型氨基转移酶。这些酶也包含在本发明的酶中。

(变异酶的制作方法(1))

作为位点特异性变异导入法，可以列举例如：利用Olfert Landt等(Gene96 125-128 1990)、Smith等(Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and Hollaender,APlenum:New York)、Vlasuk等(Experimental Manipulation of GeneExpression,Inouye,M.:Academic Press,New York)、Hos.N.Hunt等(Gene 77 511989)的方法或QuikChange II Kit(Stratagene公司制)的市售试剂盒等。此外，在2处以上导入变异的情况下，能够通过重复基于上述方法的方法，得到编码作为目的的本发明的多肽的DNA。

4.本发明的DNA

本发明的DNA只要为编码由上述方法获得的多肽的DNA，且能够在按照后述方法所导入的宿主细胞内表达上述多肽的DNA，就可以为任何DNA，也可以包含任意的非翻译区域。例如，优选如下的DNA：编码与序列表1中记载的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，且在氨基供体的存在下具有从7-甲氧基-2-萘满酮生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的活性而且比野生型酶的反应性提高的多肽，且在严格条件下与包含与由序列表的序列编号2所示的碱基序列构成的DNA互补的碱基序列的DNA进行杂交的DNA。

其中，“在严格条件下与包含与由序列表的序列编号2所示的碱基序列构成的DNA互补的碱基序列的DNA进行杂交的DNA”是指，以由与序列表的序列编号2所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA作为探针，在严格条件下通过使用菌落·杂交法、菌斑·杂交法或者Southern杂交法等得到的DNA。

杂交能够按照“Molecular Cloning，A laboratory manual，second edition(译文：分子克隆，实验手册，第二版)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)”等记载的方法进行。此处，在严格条件进行杂交的DNA能够列举例如通过使用将来自菌落或者菌斑的DNA固定化的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下、65℃进行杂交后，使用2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠构成)，在65℃的条件下清洗过滤器而能够获得DNA。优选在65℃用1倍浓度的SSC溶液清洗、更优选用0.5倍浓度的SSC溶液清洗、更加优选用0.2倍、0.1倍、0.05倍浓度的SSC溶液清洗而能够获得的DNA。

作为能够在上述条件下杂交的DNA，能够列举与序列表的序列编号2所示的DNA的序列同一性优选为74%以上、更优选为78%以上、更加优选为85%、90%、94%以上的DNA，所编码的多肽只要具有上述氨基转移活性，就包括在上述DNA中。

另外，本发明的DNA只要是本领域技术人员就能够通过化学合成等而容易地得到。

5.载体

作为用于将本发明的实施方式的DNA导入宿主微生物内使其表达的载体DNA，只要是能够在适当的宿主微生物内表达该DNA编码的基因的载体DNA则任何都可以。作为这样的载体DNA，可以列举例如质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体等。另外，也可以使用与其他宿主株之间能够进行基因交换的穿梭载体。

这样的载体包含可操作连接的启动子(lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子等控制因子，适合作为包含以与本发明的DNA可操作连接的表达单位的载体使用。可以列举例如pUC18(东洋纺株式会社制)、pUC19(东洋纺株式会社制)、pUCNT(国际公开第WO94/03613号公报)等。

控制因子是指具有功能性启动子以及任意相关的转录要素(例如增强子、CCAAT框、TATA框、SPI位点等)的碱基序列。

另外，可操作连接是指，调节基因的表达的启动子、增强子等各种调节元件和基因以在宿主细胞中以可操作的状态连接。控制因子的类型以及种类能够根据宿主变化是本领域技术人员所公知的事项。

关于能够在各种生物中利用的载体、启动子等，在“微生物学基础讲座8基因工学(共立出版、1987)”等中有详细记述。

6.宿主以及转化体

用于表达本发明的实施方式的DNA的宿主生物，只要是由包含编码各多肽的DNA的表达载体转化、能够表达导入DNA的多肽的生物，没有特别限制。作为能够利用的微生物，可以列举例如：埃希氏杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属以及乳杆菌(Lactobacillus)属等开发有宿主载体系的细菌、红球菌(Rhodococcus)属以及酵母菌(Streptomyces)属等开发有宿主载体系的放线菌、酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维氏酵母菌(Kluyveromyces)属、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)属、接合酵母菌(Zygosaccharomyces)属、耶氏酵母菌(Yarrowia)属、丝孢酵母菌(Trichosporon)属、拮抗酵母菌(Rhodosporidium)属、毕赤酵母菌(Pichia)属以及假丝酵母菌(Candida)属等开发有宿主载体系的酵母、脉孢菌(Neurospora)属、曲霉菌(Aspergillus)属、头孢菌(Cephalosporium)属以及木霉菌(Trichoderma)属等开发有宿主载体系的霉菌等。另外，在微生物以外，在植物、动物中也开发有各种宿主、载体系，特别是开发有在使用蚕的昆虫(Nature315，592-594(1985))菜籽、玉米或马铃薯等植物中大量表达异种蛋白质的系统，能够合适利用。这些之中，从导入以及表达效率考虑优选细菌，特别优选大肠杆菌。

包含本发明的DNA的表达载体能够利用公知的方法导入宿主微生物。例如，在作为宿主微生物使用大肠杆菌的情况下，通过使用市售的E.coliHB101感受态细胞(TakaraBio公司制)，能够将该载体导入宿主细胞。

7.光学活性氨基化合物的制造方法

接着，对使用具有本发明的实施方式的多肽或该多肽的生产能力的微生物制造光学活性氨基化合物的方法进行说明。

作为具有本发明的实施方式的多肽的生产能力的微生物，没有特别限定，可以列举例如导入有包含实施方式的DNA的载体的转化体。

作为本发明的光学活性氨基化合物的制造方法，可以列举：在与作为目的的氨基化合物具有相同骨架的酮化合物中，从氨基供体转移氨基，收集生成的光学活性氨基化合物的方法(以下，作为制造方法I)；和氨基化合物的对映体混合物中，将一方对映体的氨基选择性地转移至氨基受体，收集残余的对映体(光学活性氨基化合物)的方法(以下，作为制造方法II)。

首先，说明制造方法I。

(制造方法I)

制造方法I是在氨基供体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的转化体的培养物与酮化合物作用，制造光学活性氨基化合物的方法。

本制造方法是例如在氨基供体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的微生物的培养物与通式(1)所示的酮化合物作用，来制造通式(2)所示的光学活性氨基化合物的制造方法。

[化学式5]

[化学式6]

在上述式(1)以及(2)中，R¹以及R²表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的芳烷基或任选具有取代基的芳基，R¹和R²的两者也任选互相结合形成环，条件是，R¹和R²的结构不同。

R¹和R²优选为碳原子数1到20的任选具有取代基的烷基、碳原子数1到20的任选具有取代基的芳烷基或碳原子数2到20的任选具有取代基的芳基，更优选为碳原子数1到10的任选具有取代基的烷基、碳原子数3的12的任选具有取代基的芳烷基或碳原子数4到10的任选具有取代基的芳基。

作为芳基，可以列举苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、

二唑基、咪唑基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶氧基、噻吩氧基、

二唑氧基、咪唑氧基、噻唑氧基、呋喃氧基、吡咯氧基等。

作为烷基，可以列举甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基、环己基、环庚基等。作为芳烷基，可以列举苯甲基等。

这些基团也可以被进一步取代，作为其取代基，可以列举卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基等。另外，也可以经由取代基形成环。

作为上述酮化合物的具体的化合物，可以列举例如：1-萘满酮、2-萘满酮、5-甲氧基-2-萘满酮、6-甲氧基-2-萘满酮、7-甲氧基-2-萘满酮、8-甲氧基-2-萘满酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、1-Boc-3-吡咯烷酮、1-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、1-Boc-3-哌啶酮、1-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3,4-二甲氧基苯基丙酮等。

(氨基供体)

作为氨基供体，只要是本发明的多肽作用的氨基化合物则可使用任意氨基供体。作为具体例，可以列举1-苯乙胺、2-丁胺、2-戊胺、2-庚胺、3-庚胺、正乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、异丙胺、异丁胺、甘氨酸、丙氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β-苯乙胺、环己胺以及它们的光学活性体。其中，优选1-苯乙胺、丙氨酸。

(多肽的形态)

在制造方法I中，在氨基供体的存在下，使上述本发明的多肽或具有该多肽的生产能力的微生物的培养物与上述酮化合物作用。

这里，培养物是指含有菌体的培养液、培养菌体或其处理物。这里其处理物是指例如无细胞提取液、冻结干燥菌体、丙酮干燥菌体或这些菌体的磨碎物等。另外，这些多肽以及培养物也可以作为固定化酶或固定化菌体使用。此外，固定化可以用本领域技术人员众所周知的方法(例如交联法、物理的吸附法、包埋法等)进行。

(基于反应平衡、产物抑制的消除的反应性的改善)

利用了氨基转移反应的氨基化反应一般为可逆反应，因此一般平衡点处表观上反应停止。通过组合消除这些反应平衡的公知的方法，能够改善使用本发明的多肽的反应。例如，如WO2007/139055公报所记载，作为氨基供体使用丙氨酸，通过使副生成的丙酮酸与乳酸脱氢酶和辅酶再生用的葡萄糖脱氢酶共同作用而变换为乳酸，消除反应平衡的方法，较为有效。同样作为氨基供体使用丙氨酸，将副生成的丙酮酸用丙酮酸脱羧酶除去的方法(WO2007/093372A1公报)、使用丙氨酸脱氢酶的方法(US2009/0117627A1公报、Evonik Degussa GmbH)、用过氧化氢除去的方法(US2008/0213845A1公报)、使用乙酰丁酸合成酶的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11)，3030-3033(2008))等也较为有效。

(底物浓度)

作为在反应中使用的底物的浓度，酮化合物在反应液组成中为0.1～80重量%，优选为1～50重量%，另外，氨基供体在手性胺时，优选相对于酮化合物，以80～1200摩尔%、优选以100～600摩尔%的浓度使用。此外，在作为上述氨基供体使用外消旋体的氨基化合物时，一方的对映体也可以以上述的浓度使用。

(反应pH)

希望本发明的多肽的最适pH的下限优选为pH4.0以上，更优选为pH5.0以上。上限优选为pH10.0以下，更优选为pH9.0以下。

在使多个多肽共同作用的情况下，优选选择使用的全部的多肽稳定且高活性地作用的pH。

(反应温度)

本发明的多肽的反应温度，从最适温度以及热稳定性的观点考虑，优选为25℃以上，更优选为30℃以上，更加优选为35℃以上、40℃以上、45℃以上，另外，优选为80℃以下，更优选为70℃以下，更加优选为60℃以下。

在使多个多肽共同作用的情况下，优选选择使用的全部的多肽稳定且高活性地作用的反应温度。

(溶剂)

反应溶剂通常使用离子交换水、缓冲液等水性介质，但也可以在含有有机溶剂的体系中进行反应。作为有机溶剂，可以列举例如：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇等醇类溶剂、戊烷、己烷等脂肪族烃类溶剂、苯、甲苯等芳香族烃类溶剂、二氯甲烷、氯仿等卤化烃类溶剂、乙醚、异丙醚等醚类溶剂、乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂、丙酮、甲乙酮等酮类溶剂、其他也可以适当使用乙腈等。

(两相体系)

根据需要，也可以加入在水中的溶解度以上的上述有机溶剂，以两相体系进行反应。通过使有机溶剂在反应体系中共存，选择率、转换率、收率等提高的情况也较多。

(反应时间)

反应通常为1小时～1周、优选为1～72小时，优选选择在这样的时间内反应结束的反应条件。

(提取精制)

通过上述的反应，生成光学活性氨基化合物。生成的光学活性氨基化合物可以通过提取、蒸馏、再结晶、色谱柱分离等公知的方法从反应混合液中分离。

例如，在将pH调整为酸性后，利用乙醚、异丙醚等醚类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类；己烷、辛烷、苯等烃类；二氯甲烷等卤化烃等一般的溶剂，将生成的光学活性氨基化合物直接残留在水相中，能够将未反应底物以及与由氨基转移反应产生的氨基供体对应的酮化合物选择性地除去。

生成的光学活性氨基化合物以及未反应的氨基供体例如可以将pH调节为碱性，同样地用一般性的有机溶剂提取。生成的光学活性氨基化合物和未反应的氨基供体例如能够利用蒸馏进行分离。

(制造方法II)

接着说明本发明的制造方法II。

本制造方法是在氨基受体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用的光学活性氨基化合物的制造方法。

本制造方法，例如通过在氨基受体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的微生物的培养物与通式(3)所示的氨基化合物的对映体混合物作用，来获得通式(4)所示的光学活性氨基化合物。

[化学式7]

[化学式8]

上述式(3)以及(4)中的R¹、R²与上述式(1)以及(2)中的R¹、R²相同。

作为上述光学活性氨基化合物的具体的化合物，可以列举例如：1-氨基四氢化萘、2-氨基四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基四氢化萘、1-苄基-3-氨基吡咯烷、1-Boc-3-氨基吡咯烷、1-Cbz-3-氨基吡咯烷、1-苄基-3-氨基哌啶、1-Boc-3-氨基哌啶、1-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3,4-二甲氧基苯异丙胺等。

(氨基受体)

在本方法中，使用酮化合物作为氨基受体。

作为酮化合物，只要具有作为氨基受体的活性则可以为任何酮化合物，优选为丙酮酸或乙醛酸。

在制造方法II中，在上述氨基受体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用。

这里，氨基化合物的对映体混合物是指对映体和其镜像体的混合物。通常由于外消旋体廉价且易于获得，所以优选使用外消旋体。但是不限定于外消旋体，例如，也可以优选使用含有的对映体比镜像体略微过剩的混合物，利用制造方法II，提高其光学纯度。

需要说明的是，培养物的意思与上述的制造方法I的情况相同。

另外，氨基化合物的浓度在反应液组成中为0.1～80重量%，优选为1～50重量%。氨基受体的浓度优选相对于氨基化合物以30～100摩尔%、优选以50～60摩尔%使用。反应pH、反应温度、反应溶剂可以使用与制造方法I同样的条件。

利用上述的反应生成光学活性氨基化合物。生成的光学活性氨基化合物能够以与制造方法I同样的方法从反应混合液分离出来。

实施例

以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

变异酶文库的制作

以包含来自WO2006/126498A1记载的Pseudomonas fluorescensKNK08-18株的氨基转移酶(MTA)基因的质粒pNTMTA为模板，使用引物1：5’-TGGAGTGGCCATATGAACAGCAACAACAAAGC-3’(序列表的序列编号3)以及引物2：5’-TGGTCAGCGAATTCTTACCAGGGGTTGGCAACG-3’(序列表的序列编号4)利用易错(error-prone)PCR法(Leung et al.，Technique 1，11-15，1989)，得到在MTA基因中导入了随机变异的DNA扩增片段。

将该扩增片段用限制酶NdeI以及EcoRI消化后，组入用同样的酶处理后的高表达载体pUCNT(WO94/03613)中，得到多种变异酶表达质粒混合物。使用该质粒混合物转化大肠杆菌HB101，涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板培养基。繁殖的菌落为具有导入有变异的MTA基因的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌菌群作为变异酶文库。

实施例2

(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘耐受性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(1)

将实施例1中制得的变异酶文库在含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板培养基上划线，将繁殖的大肠杆菌接种于含有4%的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的LB平板培养基。保持氨基转移酶活性的菌株生成作为不稳定化合物的7-甲氧基-2-萘满酮，变色为黑色。接种于平板后，在37℃温育1晚，野生型酶丧失酶活性而没有变色，但在变异酶文库中在几个菌株中观察到了着色，可以认为这些菌株具有的修饰型酶保持着比野生型更高的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘抗性。这些菌株被接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的2xYT培养基，从所得到的菌体中提取质粒。通过调查提取得到的质粒的DNA序列，确定修饰型的氨基酸序列。其结果表示于表1中。

[表1]

实施例3

立体选择性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(1)：对于7-甲氧基-2- 萘满酮的立体选择性(30℃、PEA法)

将实施例2中得到的重组大肠杆菌，接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的5mL的2xYT培养基，在30℃振荡培养28小时。在所得到的培养液500μL中加入含有1mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.5)500μL，通过超声波破碎得到无细胞提取液。将该无细胞提取液100μL添加至具有下述组成的底物溶液305μL中，在30℃反应1小时后，加入6N的盐酸50μL使反应停止。用下述条件的HPLC测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度。其结果，表2所示的修饰型酶的立体选择性与野生型相比，得到提高。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 21mM

磷酸钾(pH7.5) 0.1M

7-甲氧基-2-萘满酮 14mM

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

色谱柱：Crownpak CR(＋)(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15(体积比)

流速：1mL/分钟

检测：220nm

柱温：47℃

[表2]

实施例4

(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘耐受性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(2)(6%)

利用与实施例3同样的方法得到各变异株的培养液。离心分离培养液5mL，在所得到的菌体中加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。

在试管中，加入该无细胞提取液50μL、(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的10%水溶液600μL、0.46M丙酮酸钠水溶液(pH7.5)100μL、1M MOPS缓冲液(pH7.5)50μL、50mM PLP水溶液(pH7.5)10μL、水190μL，注入氩气后塞紧塞子在30℃用搅拌器(stirrer)搅拌4小时。取样200μL，添加0.6N的盐酸50μL使反应停止，利用下述条件的HPLC测定生成的7-甲氧基-2-萘满酮的浓度，确定活性。其结果，表3中所示的修饰型酶的残余活性高于野生型酶，对于(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的耐受性与野生型相比，得到提高。[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

＜定量分析＞

色谱柱：Cosmosil 5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

[表3]

实施例5

(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘抗性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选 (3)(0.9%)

用与实施例2同样的方法得到各变异株的培养液。离心分离培养液8mL，在所得到的菌体中加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的30mM的磷酸钾缓冲液(pH6.1)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。在该无细胞提取液100μL中加入含有1%的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.3)900μL，在35℃温育。在反应0小时和20小时各取样100μL，将其用0.1M的磷酸钾水溶液(pH7.5)稀释至200倍。将各个稀释液200μL添加到具有下述组成的底物溶液800μL中，在30℃反应1小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用与实施例4相同条件的HPLC测定生成的苯乙酮的浓度。将反应0小时作为100%时的反应20小时的残余活性表示于下表。表4所示的修饰型酶的对于(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的抗性与野生型相比，得到提高。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 25mM

丙酮酸钠 25mM

磷酸吡哆醛 2.5mM

Tris(pH8.5) 0.1M

[表4]

实施例6

活性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(1)(30℃、PEA法)

用与实施例2同样的方法得到各变异株的无细胞提取液。在试管中，加入该无细胞提取液50μL、含有1mM的磷酸吡哆醛的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)150μL、含有42mM的(S)-1-苯乙胺的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)200μL、含有20%的7-甲氧基-2-萘满酮的DMSO溶液5μL，注入氩气后塞紧塞子，在30℃用搅拌器搅拌1小时。添加6N的盐酸50μL使反应停止，以与实施例4同样的方法用高效液相色谱测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的浓度，确定活性。其结果，表5所示的修饰型酶的活性与野生型相比，得到提高。

[表5]

实施例7

产物(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的竞争性抑制得到改善的修饰型氨基转移酶的筛选(1)(30℃、PEA法)

用与实施例2同样的方法得到各变异株的培养液。离心分离培养液5mL，在所得到的菌体中加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。在试管中，加入该无细胞提取液100μL、(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的10%水溶液600μL、1.13M(S)-1-苯乙胺水溶液(pH7.5)100μL、1M MOPS缓冲液(pH7.5)50μL、50mM PLP水溶液(pH7.5)10μL、7-甲氧基-2-萘满酮10mg、水130μL，注入氩气后塞紧塞子，在30℃用搅拌器搅拌1小时。取样200μL，添加0.6N的盐酸50μL使反应停止，用与实施例4相同条件的HPLC测定生成的苯乙酮的浓度，确定活性。其结果，表6所示的修饰型酶与野生型酶相比，由产物(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘导致的竞争性抑制得到缓解。

[表6]

实施例8

耐热性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(1)

使用实施例1中制得的质粒混合物，转化大肠杆菌HB101，涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板培养基。使繁殖的菌落吸附于灭菌后的滤纸。将该滤纸在75℃的温水中加热5分钟后，冷却至室温。在该滤纸中浸渍具有下述组成的反应溶液，在37℃使其反应5小时，从对应初始的LB平板的菌落中取得观察到着色的菌株。用LB培养基培养这些菌株，通过调查提取的质粒的DNA序列，确定修饰型的氨基酸序列。其结果，表7所示的具有变异的修饰型酶的耐热性与野生型酶相比，得到提高。

[底物溶液组成]

(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘 56mM

丙酮酸钠 84mM

磷酸钾(pH7.5) 0.1M

[表7]

实施例9

耐热性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(2)

将实施例8得到的重组大肠杆菌接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的5mL的2xYT培养基，在30℃振荡培养28小时。通过离心分离从所得到的培养液1mL中得到菌体。在该菌体中加入含有0.5mM磷酸吡哆醛的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。将该无细胞提取液500μL在75℃温育30分钟后，冷却至4℃。用与实施例5同样的方法测定该加热处理后的无细胞提取液和没有进行加热处理的无细胞提取液的活性，确定酶的通过加热处理的活性残存率。其结果，表8中所示的修饰型酶的耐热性与野生型相比，得到提高。

[表8]

实施例10

多重变异修饰型氨基转移酶的制作(1)

以实施例2中取得的质粒pNTMTAm04为模板，使用引物2：5’-TGGTCAGCGAATTCTTACCAGGGGTTGGCAACG-3’(序列表的序列编号4)和引物3：5’-GAAGAGCTGGCGTACTGTTCGTTGTTTCCCGGC-3’(序列表的序列编号5)以及、引物1：5’-TGGAGTGGCCATATGAACAGCAACAACAAAGC-3’(序列表的序列编号3)和引物4：5’-GCCGGGAAACAACGAACAGTACGCCAGCTCTTC-3’(序列表的序列编号6)，分别进行PCR，得到DNA扩增片段。混合所得到的DNA扩增片段，以其为模板，使用引物1、引物2进行PCR，序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，得到编码具有Y84C以及T420S的氨基酸取代的多肽的双链DNA。将该扩增片段用限制酶NdeI以及EcoRI消化后，组入用同样酶处理过的质粒载体pUCNT(WO94/03613)，转化E.coli HB101感受态细胞(Competent cell)(TakaraBio公司制)，制作表达具有Y84C/T420S的氨基酸取代的修饰型酶的重组大肠杆菌。

实施例11

活性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(2)多重变异

用与实施例6同样的方法测定实施例10中得到的重组大肠杆菌的活性。其结果，如表9所示，Y84C和T420S的双突变(double mutation)酶显示出高于单独变异酶的活性。

[表9]

实施例12

第420位残基修饰酶的制作

以包含来自WO2006/126498A1记载的Pseudomonas fluorescensKNK08-18株的MTA基因的质粒pNTMTA为模板，用与实施例10同样的方法，得到包含编码修饰了MTA的第420位残基的酶的DNA的质粒。使用的引物中，在制作各质粒时，共通使用的引物1、引物2以外的引物如下所示。

T420F 引物5

5’-CGGAGTGATGATTCGTTTTATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号7)

引物6

5’-CAGCTTGTTGACGATAAAACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号8)

T420L 引物7

5’-CGGAGTGATGATTCGTCTGATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号9)

引物8

5’-CAGCTTGTTGACGATCAGACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号10)

T420I 引物9

5’-CGGAGTGATGATTCGTATTATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号11)

引物10 5’-CAGCTTGTTGACGATAATACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号12)

T420M 引物11

5’-CGGAGTGATGATTCGTATGATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号13)

引物12

5’-CAGCTTGTTGACGATCATACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号14)

T420V 引物13

5’-CGGAGTGATGATTCGTGTGATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号15)

引物14

5’-CAGCTTGTTGACGATCACACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号16)

T420A 引物15

5’-CGGAGTGATGATTCGTGCGATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号17)

引物16

5’-CAGCTTGTTGACGATCGCACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号18)

T420Y 引物17

5’-CGGAGTGATGATTCGTTATATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号19)

引物18 5’-CAGCTTGTTGACGATATAACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号20)

T420H 引物19

5’-CGGAGTGATGATTCGTCATATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号21)

引物20 5’-CAGCTTGTTGACGATATGACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号22)

T420Q 引物21

5’-CGGAGTGATGATTCGTCAGATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号23)

引物22 5’-CAGCTTGTTGACGATCTGACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号24)

T420N 引物23

5’-CGGAGTGATGATTCGTAACATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号25)

引物24 5’-CAGCTTGTTGACGATGTTACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号26)

T420K 引物25

5’-CGGAGTGATGATTCGTAAAATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号27)

引物26 5’-CAGCTTGTTGACGATTTTACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号28)

T420D 引物27

5’-CGGAGTGATGATTCGTGATATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号29)

引物28 5’-CAGCTTGTTGACGATATCACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号30)

T420E 引物29

5’-CGGAGTGATGATTCGTGAAATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号31)

引物30 5’-CAGCTTGTTGACGATTTCACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号32)

T420W 引物31

5’-CGGAGTGATGATTCGTTGGATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号33)

引物32 5’-CAGCTTGTTGACGATCCAACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号34)

T420R 引物33

5’-CGGAGTGATGATTCGTCGCATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号35)

引物34 5’-CAGCTTGTTGACGATGCGACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号36)

T420S 引物35

5’-CGGAGTGATGATTCGTAGCATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号37)

引物36 5’-CAGCTTGTTGACGATGCTACGAATCATCACTCCG-3’(序列表的序列编号38)

通过将WO2007/139255中记载的pNTTAPAG用限制酶SacI以及SphI消化而得到的来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)JCM8797株的L-乳酸脱氢酶PALDH、以及、来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IAM1030株的葡萄糖脱氢酶GDH这两结构基因连接得到的双链DNA，插入至表达本研究中得到的修饰了第420位残基的酶的各质粒的SacI切断点和SphI切断点之间，得到pNTTAm04-01～pNTTAm04-17。使用所得到的质粒转化E.coliHB101感受态细胞(TakaraBio公司制)，获得共表达修饰了第420位残基的酶、PALDH以及GDH的各重组大肠杆菌。

实施例13

立体选择性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(2)：第420位残基修饰酶的评价(35℃、丙氨酸法)

将共表达实施例12中得到的修饰了第420位残基的酶和PALDH以及GDH的各重组大肠杆菌，接种于含有200μg/mL的氨苄青霉素的5mL的2xYT培养基，在30℃振荡培养28小时。离心分离培养液2mL，在所得到的菌体中加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的100mM的磷酸钾缓冲液(pH6.8)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。在该无细胞提取液250μL中添加具有下述组成的底物溶液250μL，在35℃反应1.5小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用与实施例2相同条件的HPLC测定生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度。其结果，表10所示的修饰型酶的立体选择性与野生型相比，得到提高。

[底物溶液组成]

[表10]

实施例14

多重变异修饰型氨基转移酶的制作(2)(3酶菌)

以表达实施例2中得到的修饰酶的质粒pNTMTAm12(M17I)以及pNTMTAm19(M161T)为模板，构建以与实施例10同样的方法导入了多重变异的质粒。在所得到的质粒中以与实施例12同样的方法插入PALDH基因以及GDH基因，构建表11所示的质粒。使用所得到的质粒转化E.coli HB101感受态细胞(TakaraBio公司制)，获得共表达修饰酶、PALDH以及GDH的各重组大肠杆菌。

[表11]

制作修饰酶中使用的引物中，制作各质粒时共通使用的引物1、引物2以外的引物如下所示。

T420H 引物19

5’-CGGAGTGATGATTCGTCATATCGTCAACAAGCTG-3’(序列表的序列编号21)

M17I 引物37 5’-GCACAACACGGTGCACATTATGCATCCGATGC-3’(序列表的序列编号39)

引物38 5’-GCATCGGATGCATAATGTGCACCGTGTTGTGC-3’(序列表的序列编号40)

M161T 引物39 5’-GAACTTCGGTGGCACGTCCGCCTGTGGCG-3’(序列表的序列编号41)

引物40 5’-CGCCACAGGCGGACGTGCCACCGAAGTTC-3’(序列表的序列编号42)

实施例15

(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘耐受性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(3)(多重变异0.9%、45℃)

对于实施例14中得到的重组大肠杆菌，用与实施例13同样的方法得到培养液。离心分离培养液8mL，在所得到的菌体中加入含有0.5mM的磷酸吡哆醛的30mM的磷酸钾缓冲液(pH6.1)1mL，利用超声波破碎得到无细胞提取液。在该无细胞提取液100μL中加入含有1%的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘盐酸盐的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.3)900μL，在45℃温育。在反应0小时和20小时各取样100μL，将其用0.1M的磷酸钾水溶液(pH7.5)稀释至200倍。将各个稀释液200μL添加入具有下述组成的底物溶液800μL，在30℃使其反应1小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用与实施例4相同条件的HPLC测定生成的苯乙酮的浓度。以反应0小时为100%时的的反应20小时的残余活性表示于表12。下表的修饰型酶的对于(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的耐受性与野生型相比，得到提高。

[底物溶液组成]

(S)-1-苯乙胺 25mM

丙酮酸钠 25mM

磷酸吡哆醛 2.5mM

Tris(pH8.5) 0.1M

[表12]

实施例16

立体选择性得到提高的修饰型氨基转移酶的筛选(3)：(多重变异、45℃、 ALA法)

对于实施例14得到的重组大肠杆菌，用与实施例13相同的条件调查修饰型酶的立体选择性。其结果，表13所示的修饰型酶的立体选择性与野生型相比，得到提高。

[表13]

实施例17

对于N-苄基-3-吡咯烷酮的立体选择性(30℃、丙氨酸法)

对于实施例14中得到的重组大肠杆菌，调查其对于N-苄基-3-吡咯烷酮的立体选择性。在以与实施例13同样的方法得到的无细胞提取液250μL中添加具有下述组成的底物溶液250μL，在30℃反应1.5小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。用以下的分析条件测定生成的(S)-N-苄基-3-氨基吡咯烷的光学纯度。其结果，表14所示的变异型酶与野生型酶相比，对于N-苄基-3-吡咯烷酮的立体选择性得到提高。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的光学纯度测定条件]

用适量的碳酸钠将反应液调为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物化后，用以下的条件进行分析。

色谱柱：Chiralcel IA(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

[表14]

实施例18

对于(S)-N-苄基-3-氨基吡咯烷的稳定性(30℃、丙氨酸法)

对于实施例14中得到的重组大肠杆菌，调查其对于(S)-N-苄基-3-氨基吡咯烷酮的抗性。以与实施例13同样的方法得到多重变异株的无细胞提取液。在该无细胞提取液100μL中，加入含有0.83%的(S)-N-苄基-3-氨基吡咯烷酮的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.3)900μL，在35℃温育。在反应0小时和2.5小时各取样100μL，将其用0.1M的磷酸钾水溶液(pH7.5)稀释至200倍。将各个稀释液200μL加入到具有下述组成的底物溶液800μL，在30℃反应1小时后，添加6N的盐酸50μL使反应停止。以与实施例4相同条件的HPLC测定生成的苯乙酮的浓度。以反应0小时为100%时的反应2.5小时的残余活性表示于表15。其结果，表15所示的变异型酶与野生型酶相比，对于(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的耐受性得到提高。

[表15]

实施例19

35℃、WT(野生型)和M161T

在预先加入作为底物的7-甲氧基-2-萘满酮1.6g、L-丙氨酸4.85g、D-葡萄糖2.45g、NAD6.5mg和磷酸吡哆醛60.2mg的100mL容积的3口烧瓶中，加入实施例18中得到的野生型酶或M161T的培养液(broth)40mL，边以3N的NaOH调节至pH5.7，在氩置换下、35℃，边搅拌46小时边进行反应。反应结束后，用以下的HPLC分析在反应液中生成的7-甲氧基-2-四氢萘。其结果，野生型酶在转换率35%反应停止，但M161T中，转换率达到90%。此时生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度，前者为96.7%ee，后者为97.4%e.e.。另外，残存的氨基转移酶的活性，相对于前者的11%，后者为35%。

[通过高效液相色谱的测定条件]

＜定量分析＞

色谱柱：Cosmosil 5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

＜光学纯度分析＞

色谱柱：Crownpak CR(＋)(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：220nm

柱温：47℃

实施例20

45℃、5%添加、WT和M161T

在预先加入作为底物的7-甲氧基-2-萘满酮2.0g、L-丙氨酸6.07g、D-葡萄糖3.07g、NAD8.14mg和磷酸吡哆醛75.2mg的100mL容积的3口烧瓶中，加入实施例18中得到的野生型酶或M161T的培养液40mL，边用3当量的NaOH调节至pH6.2，在氩置换下、45℃边搅拌边进行反应。反应24小时后，用以下的HPLC分析反应液。其结果，野生型在转换率85%反应停止，但在M161T中转换率达到96%。此时生成的(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的光学纯度为94.2%e.e.以及96.2%ee。另外，残存的氨基转移酶的活性，相对于前者的20%，后者为40%。

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

＜定量分析＞

色谱柱：Cosmosil 5C8-MS(Nacalai Tesque公司制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

＜光学纯度分析＞

色谱柱：Crownpak CR(＋)(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：220nm

柱温：47℃

Claims

1.一种多肽，其显示出以下(i)至(iii)的性质：

(i)与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，

(iii)与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高。

2.以下的(A)至(C)中任一项所述的多肽：

(A)由如下序列构成的多肽，所述序列为序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及151位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列，

(B)多肽，其为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及151位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，所述氨基酸部位以外的氨基酸的1个或多个被取代、添加、插入或缺失，并且，该多肽在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高，

(C)多肽，其为在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中的选自第161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及151位中的1个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，除去了所述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，并且，在氨基供体的存在下，该多肽能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号1所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，

在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代群组中的1个或多个氨基酸取代：

第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸，

第17位被取代为非极性氨基酸，

第84位被取代为不带电氨基酸，

第171位被取代为碱性氨基酸，

第176位被取代为不带电氨基酸，

第262位被取代为非极性氨基酸，

第302位被取代为非极性氨基酸，

第421位被取代为不带电氨基酸，

第435位被取代为非极性氨基酸，

第29位被取代为碱性氨基酸，

第42位被取代为不带电氨基酸，

第116位被取代为非极性氨基酸，

第153位被取代为非极性氨基酸，

第190位被取代为非极性氨基酸，

第284位被取代为不带电氨基酸，

第209位被取代为非极性氨基酸，

第235位被取代为非极性氨基酸，

第236位被取代为非极性氨基酸，

第408位被取代为不带电氨基酸，

第418位被取代为不带电氨基酸，

第434位被取代为非极性氨基酸，

第442位被取代为非极性氨基酸，

第3位被取代为碱性氨基酸，

第11位被取代为不带电氨基酸，以及

第151位被取代为碱性氨基酸。

4.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，

第161位被取代为苏氨酸或缬氨酸，

第17位被取代为异亮氨酸或亮氨酸，

第84位被取代为半胱氨酸，

第171位被取代为精氨酸，

第176位被取代为丝氨酸，

第262位被取代为缬氨酸，

第302位被取代为异亮氨酸，

第421位被取代为苏氨酸，

第435位被取代为丙氨酸，

第29位被取代为赖氨酸，

第42位被取代为酪氨酸，

第116位被取代为亮氨酸，

第153位被取代为苯丙氨酸，

第190位被取代为酪氨酸，

第284位被取代为异亮氨酸，

第209位被取代为丙氨酸，

第235位被取代为缬氨酸，

第236位被取代为异亮氨酸，

第408位被取代为苏氨酸，

第418位被取代为亮氨酸，

第434位被取代为丙氨酸，

第442位被取代为缬氨酸，

第3位被取代为精氨酸，

第11位被取代为甘氨酸，以及

第151位被取代为组氨酸。

5.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，

在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(1)～(15)中的任意氨基酸取代：

(5)第11位被取代为不带电氨基酸；第151位被取代为碱性氨基酸；第161位被取代为不带电氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸，

6.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，

在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(16)～(30)中的任意氨基酸取代：

(16)第17位被取代为异亮氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸，

(17)第161位被取代为苏氨酸；且第418位被取代为亮氨酸，

(19)第161位被取代为苏氨酸；且第434位被取代为丙氨酸，

(22)第42位被取代为酪氨酸；且第408位被取代为苏氨酸，

(23)第17位被取代为亮氨酸；且第153位被取代为苯丙氨酸，

(24)第29位被取代为赖氨酸；且第262位被取代为缬氨酸，

(25)第161位被取代为苏氨酸；且第284位被取代为异亮氨酸，

(27)第84位被取代为半胱氨酸；且第420位被取代为丝氨酸，

(28)第17位被取代为异亮氨酸；且第161位被取代为苏氨酸，

(29)第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸，以及

(30)第17位被取代为异亮氨酸；且第420位被取代为组氨酸。

7.一种分离得到的DNA，其编码权利要求1～6中任一项所述的多肽。

8.一种载体，其包含权利要求7所述的DNA。

9.一种转化体，其通过权利要求8所述的载体转化宿主细胞而得到。

10.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于：

在氨基供体的存在下，使权利要求1～6中任一项所述的多肽、或权利要求7所述的转化体和/或其处理物与酮化合物作用。

11.根据权利要求8所述的制造方法，

所述酮化合物为下述式(1)所示的非对称酮，

式中，R¹以及R²表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的芳烷基或者任选具有取代基的芳基，R¹和R²的两者任选互相结合形成环，条件是，R¹和R²的结构不同，

其产物为下述式(2)所示的光学活性氨基化合物，

式中，R¹以及R²与上述式(1)相同，＊表示手性碳原子。

12.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于：

在氨基受体的存在下，使权利要求1～6中任一项所述的多肽、或者权利要求7所述的转化体和/或其处理物与氨基化合物的对映体混合物作用。

13.根据权利要求10所述的制造方法，其中，

所述氨基化合物的对映体为下述式(3)所示的对映体混合物，

式中，R¹以及R²表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的芳烷基或任选具有取代基的芳基，R¹和R²的两者任选互相结合形成环，条件是，R¹和R²的结构不同，

其产物为下述式(4)所示的光学活性氨基化合物，

式中，R¹以及R²与上述式(3)相同，＊表示手性碳原子。

14.根据权利要求11所述的制造方法，其中，

上述式(1)所示的酮化合物为选自1-萘满酮、2-萘满酮、5-甲氧基-2-萘满酮、6-甲氧基-2-萘满酮、7-甲氧基-2-萘满酮、8-甲氧基-2-萘满酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、1-Boc-3-吡咯烷酮、1-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、1-Boc-3-哌啶酮、1-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3,4-二甲氧基苯基丙酮所构成的群组中的1种以上的酮化合物。

15.根据权利要求13所述的制造方法，其中，

上述式(3)所示的氨基化合物为选自1-氨基四氢化萘、2-氨基四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基四氢化萘、1-苄基-3-氨基吡咯烷、1-Boc-3-氨基吡咯烷、1-Cbz-3-氨基吡咯烷、1-苄基-3-氨基哌啶、1-Boc-3-氨基哌啶、1-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3,4-二甲氧基苯异丙胺所构成的群组中的1种以上的氨基化合物。

16.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，

氨基供体为选自1-苯乙胺、2-丁胺、2-戊胺、2-庚胺、3-庚胺、正乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、异丙胺、异丁胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β-苯乙胺、环己胺以及它们的光学活性体所构成的群组中的1种以上的化合物。

17.根据权利要求12或13所述的制造方法，其中，

氨基受体为丙酮酸或乙醛酸。

18.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于：

其是权利要求10～17中任一项所述的制造方法，且反应温度保持在35℃以上。