CN103140580B

CN103140580B - 氨基转移酶、编码该酶的基因和它们的利用法

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Publication number: CN103140580B
Application number: CN201180046993.0A
Authority: CN
Inventors: 长泽透; 吉田丰和; 石田浩一; 伊藤纪幸; 川野茂; 八十原良彦
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2031-09-28
Also published as: CN103140580A; JPWO2012043622A1; EP2623593B1; EP2623593A4; WO2012043622A1; US20130210092A1; US9481870B2; EP2623593A1; JP5878871B2

Abstract

本发明提供用于从酮化合物高效地制造作为医药品或农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。本发明涉及对于水溶性有机溶剂具有高耐性，且具有以93%以上的高光学纯度生成(S)-1-苄基-3-吡咯烷酮的新型氨基转移酶活性的多肽、编码该多肽的基因、高度表达该基因的转化体。

Description

氨基转移酶、编码该酶的基因和它们的利用法

技术领域

本发明涉及能够通过氨基转移反应将酮化合物高效地转换为光学活性氨基化合物的酶和使用了该酶的光学活性氨基化合物的制造方法。所得到的光学活性氨基化合物能够作为医药品或农药等的中间体利用。

背景技术

关于使用了氨基转移酶的光学活性氨基化合物的制造方法，到目前为止对于α-氨基酸的制造方法已有很多报告，但关于α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物的制造方法的报告例很少。近年来，发现了生成α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物的氨基转移酶，期待利用作为一般的光学活性氨基化合物的有效的制造方法。

但是，到目前为止已知的生成α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物的氨基转移酶存在很多问题(非专利文献1)。

例如，对于水溶性有机溶剂的耐性低，通过添加10％v/v的甲醇、THF、DMF，酶活性的半衰期从约5小时下降到3.5小时以下。

另外，在α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物之中，尚未发现特别是以93％e.e.以上的高光学纯度生成作为医药中间体有用的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的氨基转移酶(专利文献1,2、非专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-185133

专利文献2：WO2006/126498

非专利文献

非专利文献1：Org.Biomol.Chem.,8,1280-1283(2010)

非专利文献2：Adv.Synth.Catal.350,807-812(2008)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供用于从酮化合物高效地制造医药品或农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。

解决问题的方法

本发明的发明人等进行了以各种土壤分离菌为对象的筛选，结果发现了具有对水溶性有机溶剂的高耐性，且以93％以上的高光学纯度生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的微生物。另外，成功地从该微生物中分离纯化出具有该活性的多肽。另外，对于该多肽的反应特性进行详细研究的结果，发现，对于广泛的酮化合物显示高的活性，以高光学纯度生成光学活性氨基化合物，在水溶性有机溶剂中也具有高的稳定性。另外，用后述的基因工程的方法取得编码该多肽的基因，明确了其碱基序列，并且取得使用该基因高度生产该多肽的转化体。另外，通过研究育种条件，确立了能够在工业上制造更高活性的光学活性氨基化合物的方法。

即，本发明为具有下述的理化学性质(1)至(6)的多肽：

(1)作用：催化如下的氨基转移反应：与氨基供体和1-苄基-3-吡咯烷酮作用，生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷。

(2)底物特异性：

(a)氨基供体：对于(S)-1-苯乙胺、苯甲胺和±2-丁基胺显示活性，对于β-丙氨酸和4-氨基丁酸实质上不显示活性。

(b)氨基受体：对于丙酮酸和乙醛酸分别显示活性。

(3)水溶性有机溶剂耐性：在终浓度80％v/v的1-丙醇、2-丙醇、丙酮中的任意中处理2小时后的残留活性保持为处理前的总活性的10％以上。

(4)最适pH：6.0～8.5、

(5)作用最适温度：60℃、

(6)热稳定性：在30～60℃进行30分钟热处理时的残留活性保持为处理前的总活性的90％以上。

另外，本发明为如下的多肽，其包括与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性。

或者为如下的多肽，其包括在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性。

另外，本发明还为编码上述多肽的DNA、含有该DNA的载体、以及由该载体转化得到的转化体。

另外，本发明为一种光学活性氨基化合物的制造方法，其包括：在氨基供体的存在下，使上述多肽或上述转化体的培养物与酮化合物作用。

另外，为一种光学活性氨基化合物的制造方法，其包括：在氨基受体的存在下，使上述多肽或上述转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用。

本说明书包含作为本申请的优选权基础的日本特许出愿2010-216547号所记载的全部内容。

发明的效果

通过分离对于广泛的酮化合物显示高活性、以高光学纯度生成光学活性氨基化合物、在水溶性有机溶剂中也保持高活性的多肽，以及通过取得该多肽产生能力高的转化体，能够高效地制造目标的光学活性氨基化合物。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。此外，本说明书中记述的DNA的分离、载体的制备、转化等基因操作只要没有特别说明，就能够通过“MolecμLarCloning2ndEdition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)、CurrentProtocolsinMolecμLarBiology(GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience)”等教科书中记载的方法进行。另外，酶活性的单位只要没有特别说明，就将1分钟得到1μmol产物的酶量设为1U。

1.本发明的多肽的理化学各项性质

本发明中利用后述的方法所分离的多肽为具有以下的理化学性质的多肽。

(1)作用：催化如下氨基转移反应：在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷。

(2)底物特异性：

(b)氨基受体：对于丙酮酸和乙醛酸分别显示活性。

(3)水溶性有机溶剂耐性：在终浓度80％v/v的1-丙醇、2-丙醇、丙酮的任意中处理2小时后的残留活性保持为处理前的总活性的10％以上。

(4)最适pH：6.0～8.5、

(5)作用最适温度：60℃、

(6)热稳定性：在30～60℃热处理30分钟时的残留活性保持为处理前的总活性的90％以上。

(对于1-苄基-3-吡咯烷酮的立体选择性的测定方法)

本发明的多肽，催化在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上、优选95％e.e.以上、更优选97％e.e.以上、最优选98％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的氨基转移反应。

上述的性质能够利用以下的方法测定。即，在具有下述组成的底物溶液中添加纯化多肽使其终浓度为0.1mg/mL～1mg/mL，在30℃使其反应。另外，通过下述定量分析，使反应持续直到生成0.6mM以上的1-苄基-3-氨基吡咯烷，反应结束后，能够通过用下述条件的HPLC进行分析来测定反应液中生成的1-苄基-3-氨基吡咯烷的光学纯度。随着酶使用量、反应时间，生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的光学纯度变化时，采用最高的光学纯度的值。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

<定量分析>

色谱柱：FinepakSILC18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水1260mL/乙腈740mL/KH₂PO₄10g/SDS2.88g(pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

<光学纯度分析>

利用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯衍生物化。然后，根据需要利用硅胶柱色谱等纯化，用以下的条件进行分析。

色谱柱：ChiralpakIA(大赛璐化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(底物特异性1：对于各种胺的活性)

本发明的多肽对于(S)-1-苯乙胺、苯甲胺和±2-丁基胺显示活性，对于β-丙氨酸和4-氨基丁酸实质上不显示活性。其中，对于(S)-1-苯乙胺显示活性是指用以下的方法测定氨基转移活性时，1分钟生成的苯乙酮的量相对于纯化多肽1mg为0.1μmol以上，优选为1μmol以上，更优选为10μmol以上。

上述氨基转移活性能够通过以下的方法测定。即首先在下述组成的底物溶液中添加纯化多肽，将总容量设为1mL，在30℃反应5分钟后，添加6当量的盐酸0.05mL，使反应停止。然后，用下述条件的HPLC分析，对生成的苯乙酮进行定量(以下，称为活性测定法A)。

活性测定法A

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Wakosil-II5C18RS(和光纯药株式会社制)

洗脱液：10mM磷酸钾缓冲液(pH5.3):乙腈＝3:2

流速：1mL/分钟

检测：241nm

另外，对于苯甲胺和±2-丁基胺显示活性是指在用以下的方法测定氨基转移活性的情况下，使用上述氨基化合物作为氨基供体时的活性是使用了(S)-1-苯乙胺时的1/10以上、优选为1/5以上、更优选为1/2以上。另外，对于β-丙氨酸和4-氨基丁酸实质上不显示活性是指在用以下的方法测定氨基转移活性的情况下，使用了上述氨基化合物作为氨基供体时的活性是使用了(S)-1-苯乙胺时的1/50以下、优选为1/100以下、更优选为1/1000以下。

使用了上述的氨基供体时的氨基转移活性能够用以下的方法测定。即首先在下述组成的底物溶液中添加纯化多肽形成为400μL，在30℃、反应1小时后，加入3当量的盐酸20μL使反应停止。接着，在所得到的反应液20μL中分别加入0.2M碳酸钠水溶液80μL、3.3mg/mL丹酰氯(ダブシルクロリド)的丙酮溶液200μL，在70℃使其反应10分钟。在其中加入乙酸20μL进行搅拌，用下述条件的HPLC分析该反应液，对丹酰化(ダブシル化)的丙氨酸进行定量。其中，在本测定方法中，调整使用的纯化多肽的浓度使生成丙氨酸量为2.8mM以下(以下，称为活性测定法B)。

活性测定法B

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：DeverosilODS-HG-3(NOMURACHEMICAL制)

洗脱液：乙腈/0.045M乙酸缓冲液(pH4.1)＝35/65(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

(底物特异性2：对于乙醛酸的活性)

代替丙酮酸，本发明的多肽以乙醛酸作为氨基受体也显示活性。即在上述活性测定法A中，将以丙酮酸作为氨基受体测定的活性视为100％，代替丙酮酸以乙醛酸作为氨基受体测定了氨基转移活性的相对活性显示10％以上、优选显示20％以上、更优选显示30％以上的活性。

(对于水溶性有机溶剂的耐性)

本发明的多肽对于水溶性有机溶剂显示高耐性。即在终浓度80％v/v的1-丙醇、2-丙醇、丙酮的任意中处理2小时后的残留活性保持为处理前的总活性的10％以上。

使用的水溶性有机溶剂的浓度为10％v/v，优选为30％v/v，更优选为50％v/v，最优选为80％v/v。水溶性溶剂处理后的残留活性保持为10％以上，优选保持为20％以上，更优选保持为30％以上，更加优选保持为50％，最优选保持为80％以上。

其中，水溶性有机溶剂是指与水以任意比例混合的溶剂。例如，可以列举乙酸、丙酮、乙腈、DMF、DMSO、乙醇、甲醇、2-丙醇、1-丙醇、THF等。优选为1-丙醇、2-丙醇、丙酮。

由于水溶性有机溶剂耐性高，可以期待例如对于水溶性低的底物也能够提高反应性。

水溶性有机溶剂耐性能够利用以下的方法测定。即首先在含有纯化多肽的添加有0.5mM的PLP的0.1M磷酸钾水溶液(pH7.5)200μL中，添加各水溶性有机溶剂800μL，在30℃使其接触2hr。然后，用添加有0.5mM的PLP的0.1M磷酸钾水溶液稀释。使用上述活性测定法A比较该稀释液和添加溶剂前的纯化多肽溶液的活性。

(最适pH)

氨基转移反应的最适pH使用上述的活性测定法A，由以下记载的缓冲液和pH的组合来测定。最适pH是指将本测定中最高活性值视为100时，显示80以上的活性的pH。在同一pH根据缓冲液的种类而导致活性值不同的情况下，采用较高的活性值。

pH4.0、4.5、5.0、5.5时：0.1M乙酸钠缓冲液

pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时：0.1M磷酸钾缓冲液

pH7.5、8.0、8.5、9.0时：0.1MTris盐酸缓冲液

(最适温度)

氨基转移反应的最适温度设为在使用上述的活性测定法A的测定中，反应温度在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃之中显示最大的活性值的温度。

(热稳定性)

多肽的热稳定性为在将纯化多肽在含有0.5mM的吡哆醛磷酸的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)中，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃热处理30分钟后，在使用上述的活性测定法A的测定中，将热处理前的活性视为100％时，具有热处理后90％以上的残留活性的范围。

(分子量)

本发明的多肽的分子量约为50,000，能够通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据相对于标准蛋白质的相对迁移率来确定。

2.本发明的多肽的分离

本发明的多肽只要是显示上述性质的多肽，则包含任何多肽，例如能够从假单胞菌属(Pseudomonas)的微生物获得。作为本发明实施方式的多肽的来源的微生物，优选列举本领域技术人员能够容易从公众保藏机构(例如NBRC等)得到的假单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)，更优选列举假单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)MV37。该假单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)MV37于2010年6月11日作为保藏号NITEP-953保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(〒292-0818日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8)。

(培养基成分)

作为用于具有本发明的多肽的微生物培养的培养基，只要该微生物增殖，就能够使用含有通常的碳源、氮源、无机盐类、有机营养素等的液体营养培养基。

此外，在培养上述微生物时，作为本发明的多肽的诱导物质，也能够在培养基中添加丙基胺、1-丁基胺、2-丁基胺、2-戊基胺、异丙基胺、异丁基胺、7-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、1-苯乙胺、1-苄基-3-氨基吡咯烷等氨基化合物进行培养。上述诱导物质既可以单独或者也可以混合2种类以上使用。上述诱导物质的添加量没有特别限制，但从菌的生长抑制等观点考虑，优选为在通常培养基组成中1重量％以下。另外，上述诱导物质的添加时间没有特别限制，可以在培养开始时，或者也可以在培养过程中的任何时间。另外，为了提高上述诱导物质的效果，有时减少上述诱导物质以外的通常的碳源、氮源、无机盐类、有机营养素是有效的。

(多肽的纯化)

为了从生产本发明的多肽的微生物中纯化该多肽，能够利用本领域技术人员所公知的蛋白质纯化法。例如，通过从该微生物的培养液中离心分离、或者过滤收集菌体，将所得到的菌体利用超声波破碎机或使用玻璃珠等物理方法破碎后，用离心分离除去菌体残余物，制备无细胞提取液，将该无细胞提取液供给分级沉淀、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、超滤等，能够分离目标多肽。

3.本发明的多肽的氨基酸序列

作为本发明的多肽能够列举以下的多肽(a)～(c)。

(a)包括序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的多肽；

(b)包括在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性的多肽；

(c)包括与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同一性的氨基酸序列、具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性的多肽。

在包括序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中取代、插入、缺失和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽能够根据“CurrentProtocolsinMolecμLarBiology(JohnWileyandSons,Inc.,1989)”等中记载的公知的方法制备，只要具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性就包含在上述多肽中。

在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，氨基酸缺失、取代、插入或添加的位置没有特别限制，但优选避开高度保守区域。其中，高度保守区域表示对于来源不同的多种酶(多肽)，将氨基酸序列最优地对齐比较时，多个序列之间氨基酸一致的位置。高度保守区域能够通过使用GENETYX等工具比较序列编号1所示的氨基酸序列与上述的来自其他微生物的氨基转移酶(多肽)的氨基酸序列来确认。

作为由取代、插入、缺失和/或添加所改变的氨基酸序列，既可以仅包含1种类型(例如取代)的改变，也可以包含2种以上的改变(例如取代和插入)。另外，在取代时，进行取代的氨基酸优选为具有与取代前的氨基酸类似性质的氨基酸(同族氨基酸)。其中，在以下列举的各组的同一组内的氨基酸为同族氨基酸。

(第1组：中性非极性氨基酸)Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Pro、Phe

(第2组：中性极性氨基酸)Ser、Thr、Gln、Asn、Trp、Tyr

(第3组：酸性氨基酸)Glu、Asp

(第4组：碱性氨基酸)His、Lys、Arg。

上述记载中多个氨基酸的意思是指例如60个氨基酸，优选20个氨基酸，更优选15个氨基酸，更加优选10个氨基酸，更加优选5个、4个、3个、或2个以下氨基酸。

与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性优选为60％以上，但更优选为70％以上，更加优选为80％以上，更加优选为85％以上，更加优选为90％以上，最优选为95％以上。

氨基酸序列的序列同一性由以下的值表示，该值是通过比较序列表的序列编号1所示的氨基酸序列与待评价的氨基酸序列，将两个序列中氨基酸一致的位置的数目除以进行比较的总氨基酸数，再乘以100得到的。

只要具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93％e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性，就能够在序列编号1中记载的氨基酸序列中结合添加的氨基酸序列。例如，能够添加组氨酸标签或HA标签这样的标签序列。或者也能够制成与其他蛋白质的融合蛋白。另外，只要具有氨基转移的上述活性，也可以为肽片段。

4.编码本发明多肽的DNA的克隆

本发明的DNA为编码上述多肽的DNA，只要为在根据后述的方法所导入的宿主细胞内能够表达上述多肽的DNA任何都可以，也可以包含任意的非翻译区域。本发明的DNA只要是本领域的技术人员就能够根据序列表的序列编号2利用化学合成法容易地获得。作为其他方法，只要能够获得所纯化的上述多肽即可，如为本领域技术人员则能够通过公知的方法，从作为该多肽来源的微生物中获得上述DNA。

以下，作为获得本发明的DNA的方法，记载使用了上述假单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)MV37的例子，但本发明不限定于此。

首先，将从该微生物的无细胞提取液纯化的上述多肽通过适当的内肽酶消化，通过反相HPLC将所切断的片段纯化后，例如，通过ABI492型蛋白质测序仪(AppliedBiosystems公司制)确定氨基酸序列的一部分或全部。基于这样得到的氨基酸序列信息，合成用于扩增编码该多肽的DNA的一部分的PCR(PolymeraseChainReaction)引物。接着，通过通常的DNA分离法，例如，Visser等的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,415(2000))，制备作为该多肽的来源的微生物的染色体DNA。以该染色体DNA作为模板，使用先前所述的PCR引物进行PCR，扩增编码该多肽的DNA的一部分，确定该碱基序列。碱基序列的确定，例如，能够使用ABI373A型DNASequencer(AppliedBiosystems公司制)等进行。只要知道编码该多肽的DNA的一部分的碱基序列，就能够例如通过反向PCR法(Nucl.AcidsRes.,16,8186(1988))确定其全体的序列。

作为这样得到的多肽的DNA，例如，能够列举包含序列表的序列编号2所示的碱基序列的DNA。

以下，说明序列表的序列编号2所示的碱基序列。

5.编码本发明的多肽的DNA的碱基序列

作为编码本发明的多肽的DNA，例如，能够列举以下的DNA(A)～(C)。

(A)包括序列表的序列编号2中记载的碱基序列的DNA；

(B)在严谨条件下，和包括与序列表的序列编号2所记载的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的DNA；

(C)包括在序列表的序列编号2所记载的碱基序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个碱基的碱基序列的DNA。

其中，在严谨的条件下，和包括与序列表的序列编号2中记载的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的DNA是指：以包括与序列表的序列编号2所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA作为探针，在严谨的条件下通过使用菌落-杂交法、噬菌斑-杂交法或者Southern杂交法等得到的DNA。

杂交能够根据“MolecμLarCloning,Alaboratorymanual,secondedition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)”等中记载的方法进行。其中，在严谨条件下进行杂交的DNA能够列举例如使用固定化了来自菌落或者噬菌斑的DNA的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下，在65℃进行杂交后，使用2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠构成)，在65℃的条件下清洗过滤器而获得的DNA。优选为能够通过在65℃用1倍浓度的SSC溶液清洗，更优选在65℃用0.5倍浓度的SSC溶液清洗，更优选在65℃用0.2倍浓度的SSC溶液清洗，最优选在65℃用0.1倍浓度的SSC溶液清洗而获得的DNA。

如上记载了杂交条件，但这些条件没有特别限制。作为影响杂交的严谨性的要素，可以列举温度或盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就能够通过适当选择这些要素而实现最适的严谨性。

作为能够在上述的条件下杂交的DNA，能够列举与序列编号2所示的DNA的序列同一性为70％以上、优选为74％以上、更优选为79％以上、更加优选为85％以上、最优选为90％以上的DNA，只要所编码的多肽具有上述的氨基转移活性，就包含在上述DNA中。

其中，DNA的序列同一性(％)是由将所对比的2条DNA最优地对齐，将核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)在两个序列中一致的位置的数目除以比较的碱基总数，然后在该结果上乘以100而得到的数值所表示的。

DNA的序列同一性，例如使用以下的序列分析用工具算出得到：GCGWisconsinPackage(ProgramManualforTheWisconsinPackage,Version8,1994年9月，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMedison,Wisconsin,USA53711；Rice,P.(1996)ProgramManualforEGCGPackage,PeterRice,TheSangerCentre,HinxtonHall,Cambridge,CB101RQ,England)、以及theExPASyWorldWideWeb分子生物学用服务器(GenevaUniversityHospitalandUniversityofGeneva,Geneva,Switzerland)。

其中，序列表的序列编号2中记载的碱基序列中缺失、取代、插入和/或添加了1个或多个碱基的DNA能够根据“CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWileyandSons,Inc.,1989)”等记载的公知的方法制备。

在序列表的序列编号2所示的碱基序列中，碱基缺失、取代、插入和/或添加的位置没有特别限制，优选避开高度保守区域，不产生移码。其中，高度保守区域表示对于来源不同的多个多肽，将碱基序列最优对齐比较时，多个序列之间碱基一致的位置。高度保守区域能够通过使用GENETYX等工具比较序列编号2所示的碱基序列和来自公知微生物的氨基转移酶基因的碱基序列来确认。

作为通过缺失、取代、插入和/或添加所改变的碱基序列，既可以仅包含1种类型(例如取代)的改变，也可以包含2种类以上的改变(例如、取代和插入)。

上述记载的多个碱基的意思是指例如150个、优选100个、更优选50个、更加优选20个、10个、5个、4个、3个或2个以下的碱基。

6.载体

作为用于将本发明实施方式的DNA导入宿主微生物内使其表达的载体DNA，只要是能够在适当的宿主微生物内表达该DNA所编码的基因的载体即可。作为这样的载体DNA，例如，可以列举质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体等。另外，也可以使用与其他宿主菌株之间能够交换基因的穿梭载体。

这样的载体能够优选使用包含可操作连接的启动子(lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子等)控制因子，包含与本发明DNA可操作连接的表达单元的载体。例如可以列举pUC18(东洋纺织株式会社制)、pUC19(东洋纺织株式会社制)、pUCNT(国际公开第WO94/03613号公报)等。

控制因子是指功能性启动子和具有任意的相关的转录要素(例如增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等)的碱基序列。

另外，可操作连接是指调节基因表达的启动子、增强子等各种调节因子和基因在宿主细胞中以能够操作的状态连接。控制因子的类型和种类可以根据宿主而改变是本领域技术人员所公知的事项。

关于在各种生物中能够利用的载体、启动子等，在“微生物学基础讲座8基因工学(共立出版、1987)”等中有详细记述。

7.宿主和转化体

用于使本发明实施方式的DNA表达的宿主生物，只要是能够由含有编码各多肽的DNA的表达载体转化、表达导入了DNA的多肽的生物，就没有特别限制。作为能够利用的微生物，例如可以列举埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)等开发有宿主载体系统的细菌，红球菌属(Rhodococcus)和链霉菌属(Streptomyces)等开发有宿主载体系统的放线菌，酿酒酵母菌属(Saccharomyces)、克吕沃尔氏酵母菌属(Kluyveromyces)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、接合酵母菌属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母菌属(Yarrowia)、丝孢酵母菌属(Trichosporon)、拮抗酵母菌属(Rhodosporidium)、毕赤酵母菌属(Pichia)、和假丝酵母菌属(Candida)等开发有宿主载体系统的酵母，脉孢菌属(Neurospora)、曲霉菌属(Aspergillus)、头孢菌属(Cephalosporium)、和木霉菌属(Trichoderma)等开发有宿主载体系统的霉菌等。另外，除微生物之外，在植物、动物中也开发有各种宿主-载体系统，特别是开发使用了蚕的昆虫(Nature315,592-594(1985))或菜籽、玉米、马铃薯等植物中使异源蛋白质大量表达的系统，能够合适地利用。这些之中，从导入和表达效率考虑优选细菌，特别优选大肠杆菌。

含有本发明DNA的多肽表达载体，能够通过公知的方法导入至宿主微生物。例如，作为宿主微生物使用大肠杆菌时，能够通过使用市售的E.coliHB101感受态细胞(TakaraBio株式会社制)将该载体导入宿主细胞。

8.光学活性氨基化合物的制造方法

接着，说明使用本发明实施方式的多肽或使用具有该多肽的生产能力的微生物制造光学活性氨基化合物的方法。

作为具有本发明实施方式的多肽的生产能力的微生物，例如，可以列举上述假单胞菌属细菌(Pseudomonassp.)MV37和导入了包含实施方式的DNA的载体的转化体。

作为本发明的光学活性氨基化合物的制造方法，可以列举从氨基供体使氨基转移至与作为目的的氨基化合物骨架相同的酮化合物，获取生成的光学活性氨基化合物的方法(以下，称为制造方法I)；以及在氨基化合物的对映体混合物中，使一方对映体的氨基选择性地转移至氨基受体，获取残存的对映体(光学活性氨基化合物)的方法(以下，称为制造方法II)。

首先，说明制造方法I。

(制造方法I)

制造方法I为在氨基供体的存在下，使本发明的多肽或者具有该多肽生产能力的转化体的培养物与酮化合物作用，制造光学活性氨基化合物的方法。

本制造方法，例如为通过在氨基供体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的微生物的培养物与通式(1)所示的酮化合物作用来制造通式(2)所示的光学活性氨基化合物的方法：

[化学式1]

[化学式2]

在上述式(1)和(2)中，R¹和R²表示任选被取代的烷基、任选被取代的芳烷基或任选被取代的芳基，R¹和R²两者任选互相结合形成环。其中，R¹和R²结构不同。

R¹和R²优选为碳原子数1至20的任选被取代的烷基、任选被取代的芳烷基或任选被取代的芳基，更优选为碳原子数1至10的任选被取代的烷基、任选被取代的芳烷基或任选被取代的芳基。

作为芳基，可以列举苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、二唑基、咪唑基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶基氧基、噻吩基氧基、二唑基氧基、咪唑基氧基、噻唑基氧基、呋喃基氧基、吡咯基氧基等。

作为烷基，可以列举甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基、环己基、环庚基等。作为芳烷基，可以列举苄基等。

这些基团还可以被进一步被取代，作为其取代基，可以列举卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基等。另外，环的形成也可以经由取代基。

作为上述酮化合物的具体的化合物，例如，可以列举1-四氢萘酮、2-四氢萘酮、5-甲氧基-2-四氢萘酮、6-甲氧基-2-四氢萘酮、7-甲氧基-2-四氢萘酮、8-甲氧基-2-四氢萘酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、1-Boc-3-吡咯烷酮、1-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、1-Boc-3-哌啶酮、1-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3,4-二甲氧基苯基丙酮等。

(氨基供体)

作为氨基供体，只要是本发明多肽作用的胺化合物能够使用任何胺化合物。作为具体例，可以列举1-苯乙胺、2-丁基胺、2-戊基胺、2-庚基胺、3-庚基胺、正乙基胺、正丙基胺、正丁基胺、正戊基胺、异丙基胺、异丁基胺、甘氨酸、丙氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β-苯乙胺、环己胺和它们的光学活性体。其中，优选1-苯乙胺、丙氨酸。

(多肽的形态)

在制造方法I中，在氨基供体的存在下，使上述本发明的多肽或具有该多肽的生产能力的微生物的培养物与上述酮化合物作用。

其中，培养物是指含有菌体的培养液、培养菌体或其处理物。其中其处理物的意思例如为无细胞提取液、冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体或这些菌体的磨碎物等。另外，这些多肽和培养物也能够作为固定化酶或固定化菌体使用。其中，固定化能够用对于本领域技术人员公知的方法(例如交联法、物理吸附法、包埋法等)进行。

(反应平衡、由产物抑制的消除带来的反应性的改善)

使用氨基转移反应的氨基化反应一般为可逆反应，因此一般在平衡点表观上反应停止。通过组合消除这些反应平衡的公知的方法能够改善使用本发明的多肽的反应。例如，有效的方法为如WO2007/139055所记载，使用丙氨酸作为氨基供体，使乳酸脱氢酶和辅酶再生用的葡萄糖脱氢酶共同作用于副生成的丙酮酸，由此转换为乳酸，从而消除反应平衡。同样地使用丙氨酸作为氨基供体，用丙酮酸脱羧酶将副生成的丙酮酸除去的方法(WO2007/093372A1)、使用丙氨酸脱氢酶的方法(US2009/0117627A1,EvonikDegussaGmbH)、用过氧化氢除去的方法(US2008/0213845A1)、使用乙酰丁酸合成酶的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11),3030-3033(2008))等也是有效的。

(底物浓度)

作为反应中使用的底物的浓度，酮化合物在反应液组成中为0.1～80重量％，优选为1～50重量％，另外，氨基供体在手性胺时，优选相对于酮化合物，以80～1200摩尔％、优选为100～600摩尔％的浓度的方式使用。此外，作为上述氨基供体为外消旋体的氨基化合物时，也能够以一种立体构象为上述浓度的方式使用。

(反应pH)

本发明的多肽的最适pH，下限优选为pH5.0以上，更优选为pH6.0以上。上限优选为pH10.0以下，更优选为pH9.0以下。

使多种多肽共同作用时，优选选择使用的全部多肽稳定且高活性地作用的pH。

(反应温度)

本发明的多肽的反应温度，从最适温度和热稳定性的观点考虑，优选为25℃以上，更优选为30℃以上，优选为60℃以下，更优选为50℃以下。

使多种多肽共同作用时，优选选择使用的全部多肽稳定且高活性地作用的反应温度。

(溶剂)

反应溶剂，通常使用离子交换水、缓冲液等水性介质，但在含有有机溶剂的体系中也能够进行反应。作为有机溶剂，例如，能够适合使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇等醇类溶剂，戊烷、己烷等脂肪族烃类溶剂，苯、甲苯等芳香族烃类溶剂，二氯甲烷、氯仿等卤化烃类溶剂，二乙醚、二异丙醚等醚类溶剂，乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂，丙酮、甲乙酮等酮类溶剂，其他、乙腈等。

(二相系)

根据需要，也能够以在水中的溶解度以上加入上述的有机溶剂在二相系中进行反应。通过使有机溶剂在反应体系中共存，提高选择率、转换率、收率等的情况较多。

(反应时间)

反应通常为1小时～1周，优选为1～72小时，优选选择以上述这样的时间反应结束的反应条件。

(提取纯化)

通过上述的反应，生成光学活性氨基化合物。生成的光学活性氨基化合物能够通过提取、蒸馏、重结晶、色谱柱分离等公知的方法从反应混合液中分离。

例如，将pH调节为酸性后，通过二乙醚、二异丙醚等醚类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类；己烷、辛烷、苯等烃类；二氯甲烷等卤化烃类溶剂等一般的溶剂，能够使生成的光学活性氨基化合物保持残留在水相，将未反应的底物和由氨基转移反应生成的与氨基供体对应的酮化合物选择性地除去。

生成的光学活性氨基化合物和未反应的氨基供体，例如，能够将pH调节碱性，同样地用一般的有机溶剂提取。生成的光学活性氨基化合物和未反应的氨基供体，例如能够通过蒸馏进行分离。

(制造方法II)

接着，说明本发明的制造方法II。

本制造方法为在氨基受体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用的光学活性氨基化合物的制造方法。

本制造方法，例如为能够通过在氨基受体的存在下，使本发明的多肽或具有该多肽生产能力的微生物的培养物与通式(3)所示的氨基化合物的对映体混合物作用，得到通式(4)所示的光学活性氨基化合物，

[化学式3]

[化学式4]

上述式(3)和(4)中的R¹、R²与上述式(1)和(2)中的R¹、R²相同。

作为上述光学活性氨基化合物的具体的化合物，例如，可以列举1-氨基1,2,3,4-四氢化萘、2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、1-苄基-3-氨基吡咯烷、1-Boc-3-氨基吡咯烷、1-Cbz-3-氨基吡咯烷、1-苄基-3-氨基哌啶、1-Boc-3-氨基哌啶、1-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3,4-二甲氧基苯异丙胺等。

(氨基受体)

在本方法中，使用酮化合物作为氨基受体。

作为该酮化合物，只要是具有作为氨基受体的活性则任何酮化合物都可以，但优选为丙酮酸或乙醛酸。

在制造方法II中，在上述氨基受体的存在下，使上述本发明的多肽或具有该多肽的生成能力的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用。

其中，氨基化合物的对映体混合物表示对映体和其镜像体的混合物。通常，外消旋体廉价且易于获得，优选使用外消旋体。但是，不限于外消旋体，例如，能够优选进行使用对映体比其镜像体略微过剩包含的混合物，通过制造方法II，提高其光学纯度的方法。

此外，培养物的意思与上述的制造方法I的情况相同。

另外，氨基化合物的浓度，在反应液组成中为0.1～80重量％，优选为1～50重量％。氨基受体的浓度，相对于氨基化合物，以30～100摩尔％使用，优选以50～60摩尔％使用。反应pH、反应温度、反应溶剂能够使用与制造方法I相同的条件。

通过上述的反应，生成光学活性氨基化合物。生成的光学活性氨基化合物能够用与制造方法I相同的方法从反应混合液中分离。

实施例

以下，通过实施例更加详细的说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限定。

(实施例1)土壤分离菌的获取、解析

分别将从土壤分离的MV37株、MV38株、MV45株、MV48株，用N培养基(组成：50g/L多聚蛋白胨(日本制药株式会社制)、30g/LD-葡萄糖、20g/LNaCl、2g/L酵母浸膏(Difco公司制)、1g/L(RS)-1-苯乙胺(pH7.0))在28℃通气培养62小时。然后，将培养液2mL离心分离在所得到的菌体中添加下述底物溶液400μL，在30℃搅拌2小时使其反应。生成的苄基氨基吡咯烷用下述条件进行定量分析和光学纯度分析。

其结果，MV37株的转换率为2.0％、光学纯度为98.0％e.e.(S体)，MV38株的转换率为1.3％、光学纯度为97.4％e.e.(S体)，MV45株的转换率为1.8％、光学纯度为97.9％e.e.(S体)，MV48株的转换率为2.5％、光学纯度为97.6％e.e.(S体)。

另外，解析MV38株、MV45株、MV48株的16SrDNA的部分序列(约500bp)，结果判断任何一株都为假单胞菌属。对于MV37株，解析16SrDNA1492bp的结果，判断为与蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfluva)、栖稻假单胞菌(Pseudomonasoryzihabitans)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)近缘的假单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的定量条件]

<定量分析>

色谱柱：FinepakSILC18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水1260mL/乙腈740mL/KH₂PO₄10g/SDS2.88g(pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

[通过高效液相色谱(HPLC)的光学纯度分析条件]

利用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物化，由以下的条件分析。

色谱柱：ChiralpakIA(大赛璐化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

(实施例2)纯化TPM的制备1

将实施例1中解析的假单胞菌MV37(NITEP-953)使用5mL的Npre培养基(组成：50g/L多聚蛋白胨(日本制药株式会社制)、30g/LD-葡萄糖、20g/LNaCl、2g/L酵母浸膏(Difco公司制)(pH7.0))在30℃培养1天，得到第一种母培养液。

接着，在500mL容积的Sakaguchi烧瓶中，在N培养基(组成：50g/L多聚蛋白胨(日本制药株式会社制)、30g/LD-葡萄糖、20g/LNaCl、2g/L酵母浸膏(Difco公司制)、1g/L(RS)-1-苯乙胺(pH7.0))60mL接种第一种母培养液500μL，在28℃培养7小时，得到第二种母培养液。

接着，在5升容积的小罐(minijar)中在N培养基3.0L中接种第二种母培养液30mL，以0.3vvm、450rpm、28℃培养14小时。

然后，通过离心分离从培养液中收集菌体，悬浊于N缓冲液(0.01％2-巯基乙醇、0.1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、0.5mM吡哆醛磷酸、0.01M磷酸钾(pH8.0))中，进行超声波破碎。再将该破碎物中的固体通过离心分离除去，制得无细胞提取液。

所得到的无细胞提取液，在50℃搅拌30分钟后，通过离心分离回收上清，添加硫酸铵使其溶解从而使其达到30％饱和，将产生的沉淀通过离心分离除去。再在该上清中以达到75％饱和的方式添加硫酸铵使其溶解，将产生的沉淀通过离心分离除去。

使该沉淀溶解于N缓冲液，再对该缓冲液进行透析。将其供给用相同缓冲液平衡化的DEAE-TOYOPEARL650M(东曹株式会社制)色谱柱(300mL)，吸附活性组分。用相同缓冲液清洗色谱柱后，通过氯化钠的线性梯度(从0M至0.45M)使活性组分洗脱。

收集所洗脱的活性组分，在其中溶解硫酸钠使得终浓度为0.8M，供给至预先用含有0.8M的硫酸钠的N缓冲液平衡化的Butyl-TOYOPEARL650S(东曹株式会社制)色谱柱(120mL)，使活性组分吸附。用相同缓冲液清洗色谱柱后，通过硫酸钠的线性梯度(从0.8M至0.24M)使活性组分洗脱。收集活性组分，通过超滤(CentriplusYM-10)浓缩。

将浓缩的粗多肽溶液供给至用添加有0.15M氯化钠的N缓冲液预先平衡化的HiLOAD16/60Superdex200p/g色谱柱(AmershamBiosciences公司制)，得到电泳上单一的纯化多肽标准品。另外，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定所得到的纯化多肽的分子量，结果约为50,000。以下，将本多肽记载为TPM。

(实施例3)TPM基因的克隆

(PCR引物的制作)

通过PPSQ-33A型蛋白质测序仪(岛津制作所制)确定实施例2中得到的纯化TPM的N末端氨基酸序列。另外，使纯化TPM在8M尿素存在下变性后，用来自无色杆菌的赖氨酸内肽酶(和光纯药工业株式会社制)消化，所得到的肽片段的N末端氨基酸序列也同样地确定。从该氨基酸序列预测碱基序列，合成用于由PCR扩增TPM基因的一部分的引物1(序列表的序列编号3)和引物2(序列表的序列编号4)。

(利用PCR的TPM基因的扩增)

根据Murray等的方法(Nucl.AcidsRes.,8,4321,1980)从假单胞菌属菌种MV37的培养液中提取染色体DNA。以所得到的染色体DNA为模板，使用上述合成的引物进行PCR。其结果，获得了被认为是TPM基因的一部分的约830bp的DNA片段。PCR如下进行：使用PrimeStar(TakaraBio株式会社制)作为DNA聚合酶，反应条件按照其操作说明书。通过直接测序碱基序列确定该DNA片段。该碱基序列表示于序列表的序列编号5。

(利用inverse-PCR法的TPM基因的全长序列的确定)

将假单胞菌属菌种MV37的染色体DNA使用限制酶FbaI、PstI、XhoI或SphI完全消化，使用T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制)使所得到的消化物分别进行分子内环化。将其用作模板，根据在上述明确的TPM基因的部分碱基序列信息，通过inverse-PCR法(Nucl.AcidsRes.,16,8186(1988))确定染色体DNA上的TPM基因的全部碱基序列。PCR使用TaKaRaLATaqwithGCbuffer(宝酒造株式会社制)进行，反应条件按照其操作说明书。确定得到的碱基序列表示于序列表的序列编号2。另外，该碱基序列编码的氨基酸序列表示于序列表的序列编号1。

(实施例4)含有TPM基因的重组质粒的制作

基于实施例3中确定的碱基序列，合成在TPM基因的起始密码子部分添加有NdeI位点的引物3(序列表的序列编号6)和在紧接着TPM基因的终始密码子的后面添加有SacI位点的引物4(序列表的序列编号7)。以实施例3中得到的假单胞菌属菌种MV37的染色体DNA作为模板，使用这些引物进行PCR，获得在TPM基因的起始密码子部分添加有NdeI位点且在紧接着终始密码子的后面添加有SacI位点的双链DNA。PCR使用PrimeStar(TakaraBio株式会社制)进行，反应条件按照其操作说明书。用NdeI和SacI消化该DNA，插入到质粒pUCNT(WO94/03613)的lac启动子的下游的NdeI识别位点和SacI识别位点之间，得到重组载体pNTTPM。

(实施例5)重组大肠杆菌的制作

使用实施例4中得到的重组载体pNTTPM，转化大肠杆菌E.coliHB101(TakaraBio株式会社制)，得到重组大肠杆菌E.coliHB101(pNTTPM)。

(实施例6)使用了重组大肠杆菌的TPM基因的表达

将实施例5中得到的E.coliHB101(pNTTPM)用含有200μg/ml的氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母浸膏1.0％、NaCl0.5％、pH7.0)培养，收集菌体后，悬浊于N缓冲液，通过超声波破碎得到无细胞提取液。将该无细胞提取液添加在下述组成的底物溶液中，在30℃反应1小时后，对于反应液1mL添加50μL的6当量盐酸，离心分离后，通过HPLC定量其上清的苯乙酮浓度，测定氨基转移活性。其结果，在E.coliHB101(pNTTPM)的无细胞提取液中，观察到在每1mL培养基(broth)中1分钟生成9μmol的苯乙酮的活性。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(NACALAITESQUE株式会社制)

洗脱液：30mM磷酸钾缓冲液(pH2.5)/乙腈/甲醇＝4/1/1(体积比)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

(实施例7)纯化TPM的制备2

用与实施例6同样的方法从所得到的重组大肠杆菌的培养液通过离心分离收集菌体，在标准缓冲液(0.5mM吡哆醛磷酸、0.1M磷酸钾(pH7.5))中悬浊进行超声波破碎。接着，通过离心分离除去破碎物中的固体，制备无细胞提取液。边搅拌所得到的无细胞提取液30分钟，边在50℃处理，通过离心分离回收上清。

将其供给至用标准缓冲液平衡化的DEAE-Sephacel色谱柱(GEHealthcareBio-Sciences公司制)，使活性组分吸附。用含有氯化钠0.1M的标准缓冲液清洗色谱柱后，用含有0.2M氯化钠的N缓冲液使活性组分洗脱。

收集使其洗脱得到的活性组分，在其中以终浓度为1.0M的方式溶解硫酸钠，供给至用含有1.0M的硫酸钠的标准缓冲液预先平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M(东曹株式会社制)色谱柱，使活性组分吸附。用含有0.8M的硫酸钠的标准缓冲液清洗色谱柱后，用含有0.5M的硫酸钠的相同缓冲液使活性组分洗脱。收集活性组分用标准缓冲液透析，得到电泳上单一的纯化TPM。使用本纯化TPM研究多肽的理化学性质。

(实施例8)纯化TPM的理化学性质1

对于实施例7中得到的纯化TPM，研究对于1-苄基-3-吡咯烷酮的活性和生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的光学纯度。

将实施例7中得到的纯化TPM添加在下述组成的底物溶液中，在30℃反应2小时后，用下述条件的HPLC分析。其结果，以转换率90％生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷，其光学纯度为98.0％e.e.。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

<定量分析>

色谱柱：FinepakSILC18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水1260mL/乙腈740mL/KH₂PO₄10g/SDS2.88g(pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

[通过高效液相色谱(HPLC)的光学纯度分析条件]

利用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物化(誘導体化)，用以下的条件分析。

色谱柱：ChiralpakIA(大赛璐化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

(实施例9)纯化TPM的理化学性质2

对于实施例7中得到的纯化TPM，研究其对于(S)-1-苯乙胺的活性、最适pH、最适温度、热稳定性、水溶性有机溶剂耐性。

用以下所示的活性测定条件，研究纯化TPM的氨基转移活性。即，将纯化TPM添加在下述组成的底物溶液中使总量为1mL，在30℃反应5分钟后，添加6当量的盐酸0.05mL，使反应停止，用下述条件的HPLC分析。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

色谱柱：Wakosil-II5C18RS(和光纯药株式会社制)

洗脱液：10mM磷酸钾缓冲液(pH5.3):乙腈＝3:2

流速：1mL/分钟

检测：241nm

(1)对于(S)-1-苯乙胺的活性：

用上述的方法测定氨基转移活性，结果纯化TPM的活性为11.8U/mg。

(2)最适pH：

在pH4.0～9.0的范围与上述同样地测定氨基转移活性，研究TPM的最适pH。

对应测定的pH，缓冲液使用了下述缓冲液，其结果在0.1M磷酸钾缓冲液中pH7.0时活性最高，最适pH可以认为是6.0～8.5(将pH7视为100时的相对活性表示在表1中)。

[表1]

[缓冲液]

pH4.0、4.5、5.0、5.5时：0.1M乙酸钠缓冲液

pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时：0.1M磷酸钾缓冲液

pH7.5、8.0、8.5、9.0时：0.1MTris盐酸缓冲液

(3)最适温度：

在与上述相同的条件下，测定10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的氨基转移活性的结果，可以认为60℃是TPM的最适温度(将最高活性的60℃的活性视为100时的相对活性表示于表2)。

[表2]

反应温度(℃)	相对活性
		10	8
20	16
		30	33
40	49
		50	77

60	100
		70	68

(4)热稳定性：

将纯化TPM在含有0.5mM吡哆醛磷酸的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)中，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃反应30分钟后，同样地进行活性测定。其结果，与热处理前相比，在30℃～60℃处理时残留了90％以上的活性(将热处理前的活性视为100时的残留活性表示于表3)。

[表3]

处理温度(℃)	残留活性
		30	108
40	115
		50	120
60	100
		70	12

(5)水溶性有机溶剂耐性：在添加有纯化TPM的含有0.5mM吡哆醛磷酸的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)200μL中添加1-丙醇、2-丙醇、丙酮800μL，在30℃处理2小时。处理后，用含有0.5mM吡哆醛磷酸的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)稀释至20倍，稀释液的活性用与上述同样的条件进行活性测定。其结果，TPM相对于1-丙醇、2-丙醇、丙酮极为稳定(表4)。

[表4]

使用溶剂	活性残留率(％)
		处理前	100
1-丙醇	97
		2-丙醇	100
丙酮	99

(比较例1)市售氨基转移酶的水溶性有机溶剂耐性

用与实施例9(5)水溶性有机溶剂耐性同样的方法，研究来自市售的河流弧菌(Vibriofluvialis)的ω-氨基转移酶(ω-Transaminase)VF(JuLich-Chemicals公司)的水溶性有机溶剂耐性的结果，当添加1-丙醇、2-丙醇、丙酮80％v/v时，2小时活性完全丧失(表5)。

[表5]

使用溶剂	活性残留率(％)
		处理前	100
1-丙醇	0
		2-丙醇	0
丙酮	0

(实施例10)纯化TPM的理化学性质3：氨基供体特异性

对于实施例7中得到的纯化TPM，研究氨基供体的特异性。首先，在下述组成的底物溶液380μL中添加纯化TPM溶液20μL，在30℃反应1小时后，加入3当量的盐酸20μL使反应停止。接着，在所得到的反应液20μL中分别加入0.2M碳酸钠水溶液80μL、3.3mg/mL丹酰氯的丙酮溶液200μL，在70℃使其反应10分钟。在其中加入乙酸20μL进行搅拌，用下述条件的HPLC分析该反应液，对丹酰化的丙氨酸进行定量。其结果明确了TPM对于正丁基胺、苯甲胺、±2-丁基胺也显示活性(将使用正丁基胺作为氨基供体时的活性视为100％的相对活性表示于表6)。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

色谱柱：DeverosilODS-HG-3(NOMURACHEMICAL)

洗脱液：乙腈/0.045M乙酸缓冲液(pH4.1)＝35/65(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

[表6]

氨基供体	相对活性(％)
		正丁基胺	100％
苯甲胺	95％
		±2-丁基胺	67％

(实施例11)纯化TPM的理化学性质4：氨基供体特异性2

对于实施例7中得到的纯化TPM，研究对于代表性的ω-氨基酸转移酶的底物的反应性。首先，在下述组成的底物溶液380μL中添加纯化TPM溶液20μL，在30℃反应1小时后，加入3当量的盐酸20μL使反应停止。接着，在所得到的反应液20μL中分别加入0.2M碳酸钠水溶液80μL、3.3mg/mL丹酰氯的丙酮溶液200μL，在70℃使其反应10分钟。在其中加入乙酸20μL进行搅拌，用下述条件的HPLC分析该反应液，对丹酰化的丙氨酸进行定量。其结果，明确了TPM对于作为ω-氨基酸转移酶的代表性的底物的β-丙氨酸、4-氨基丁酸、L-鸟氨酸、L-赖氨酸、腐胺、牛磺酸不显示活性(使用(S)-1-苯乙胺作为氨基供体时的活性视为100的相对活性表示于表7)。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

色谱柱：DeverosilODS-HG-3(NOMURACHEMICAL)

洗脱液：乙腈/0.045M乙酸缓冲液(pH4.1)＝35/65(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

[表7]

氨基供体	相对活性(％)
		(S)-α-苯乙胺	100
β-丙氨酸	0
		4-氨基丁酸	0
L-鸟氨酸	0
		L-赖氨酸	0
腐胺	0
		牛磺酸	0

(实施例12)纯化TPM的理化学性质5：氨基受体特异性

对于实施例7中得到的纯化TPM，研究对于氨基受体的底物特异性。在纯化TPM溶液中添加终浓度为下述组成的底物溶液，在30℃使其反应5分钟后，每1mL反应液添加6当量的盐酸50μL，使反应停止。用下述条件的HPLC分析该反应液的结果，明确了TPM对于广泛的底物显示活性(表8)。

[底物溶液组成]

多肽溶液

[通过高效液相色谱(HPLC)的测定条件]

色谱柱：Wakosil-II5C18RS(和光纯药株式会社制)

洗脱液：10mM磷酸钾缓冲液(pH5.3):乙腈＝3:2

流速：1mL/分钟

检测：241nm

[表8]

氨基供体	底物浓度	相对活性(％)
			丙酮酸	25mM	100
2-氧代戊二酸	25mM	0
			乙醛酸	25mM	40
丁醛	2.5mM	7
			苯甲醛	2.5mM	149
2-庚酮	2.5mM	4.6
			苄基苯基酮	2.5mM	3.8
2-乙酰基吡啶	2.5mM	16
			乙酰基吡嗪	2.5mM	23
苄基丙酮	2.5mM	12
			苯甲酰基乙酸乙酯	2.5mM	13
2-四氢萘酮	2.5mM	17
			1-苄基-3-吡咯烷酮	2.5mM	4.7

(实施例13)利用制造方法I的光学活性1-苄基-3-氨基吡咯烷的制造

将用与实施例6同样的方法得到的重组大肠杆菌的培养液通过离心分离收集菌体。另外，将WO2007/139055公报的实施例13中记载的共表达来自乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)JCM8797株的L-乳酸脱氢酶PALDH和来自巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)IAM1030的葡萄糖脱氢酶GDH的重组大肠杆菌用含有200μg/ml的氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母浸膏1.0％、NaCl0.5％、pH7.0)培养，通过离心分离收集菌体。

混合上述培养液使得TPM15.8U/mL、PALDH380U/mL、GDH41U/mL，在预先加入有作为底物的1-苄基-3-吡咯烷酮900mg和L丙氨酸3730mg、D-葡萄糖1390mg、NAD+4mg的烧瓶中加入上述菌体悬浊液3ml、吡哆醛磷酸4mg、1M磷酸钾缓冲液(pH6.8)3mL，加入去离子水将总体积设为30mL。将其在30℃边用氢氧化钠调整为pH6.8边搅拌5小时，使其反应。反应结束后，用下述条件的HPLC分析该反应液。其结果，1-苄基-3-氨基吡咯烷以转换率100％生成，立体构象为(S)体，光学纯度为98.3％e.e.。

[通过高效液相色谱(HPLC)的定量分析条件]

<定量分析>

色谱柱：FinepakSILC18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水1260mL/乙腈740mL/KH₂PO₄10g/SDS2.88g(pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

[通过高效液相色谱(HPLC)的光学纯度测定条件]

利用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物化，然后用以下的条件分析。

色谱柱：ChiralcelIA(大赛璐化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(实施例14)利用制造方法I的光学活性2-氨基庚烷的制造

混合上述培养液，使得与实施例13同样的方法得到的TPM、PALDH和GDH分别为TPM16.7U/mL、PALDH297U/mL、GDH30U/mL，在预先加入有作为底物的2-庚酮300mg和L丙氨酸15900mg、D-葡萄糖710mg、NAD+4mg的烧瓶中加入上述菌体悬浊液3ml、吡哆醛磷酸1.3mg、1M磷酸钾缓冲液(pH6.8)1mL，加入去离子水将总体积为10mL。将其在30℃边用氢氧化钠调整为pH6.8边搅拌5小时，使其反应。反应结束后，用下述条件的HPLC分析该反应液。其结果，2-氨基庚烷以转换率99％生成，立体构象为(S)体，光学纯度为99.2％e.e.。

[通过气相色谱(GC)的定量分析条件]

色谱柱：Rtx-5Amine(30m,0.25mmID)(RESTEK公司制)

柱温：50℃

注入口温度：250℃

检测器温度：220℃

检测：FID

载气：He、150kPa

[通过高效液相色谱(HPLC)的光学纯度测定条件]

色谱柱：ChiralpakAD-H(大赛璐化学工业株式会社制)

洗脱液：正己烷/乙醇/二乙胺＝90/10/0.1(体积比)

流速：1.0mL/分钟

检测：240nm

柱温：35℃

在本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请均直接作为参考编入本说明书。

Claims

1.以下(a)记载的多肽：

(a)序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的多肽。

2.由编码权利要求1所述的多肽的碱基序列构成的DNA。

3.根据权利要求2所述的DNA，其为下述(A)所述的DNA：

(A)由序列表的序列编号2所记载的碱基序列构成的DNA。

4.一种载体，其包含权利要求2或3所述的DNA。

5.一种转化体，其通过权利要求4所述的载体转化宿主细胞而得到。

6.一种通式(2)所示的光学活性氨基化合物的制造方法，其包括：

在氨基供体的存在下，使权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的转化体的培养物与酮化合物作用，

上式(2)中，R¹和R²表示碳原子数为1～10的任选被取代的烷基、碳原子数为1～10任选被取代的芳烷基或碳原子数为1～10的任选被取代的芳基，R¹和R²两者任选相互结合形成环，其中，R¹和R²结构不同，＊表示不对称碳原子，

其中，所述酮化合物为选自1-四氢萘酮、2-四氢萘酮、5-甲氧基-2-四氢萘酮、6-甲氧基-2-四氢萘酮、7-甲氧基-2-四氢萘酮、8-甲氧基-2-四氢萘酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、1-Boc-3-吡咯烷酮、1-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、1-Boc-3-哌啶酮、1-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3,4-二甲氧基苯基丙酮中的1种以上的酮化合物，

所述氨基供体为选自1-苯乙胺、2-丁基胺、2-戊基胺、2-庚基胺、3-庚基胺、正乙基胺、正丙基胺、正丁基胺、正戊基胺、异丙基胺、异丁基胺、甘氨酸、丙氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β-苯乙胺、环己胺和它们的光学活性体中的1种以上的化合物。

7.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其中，

在氨基受体的存在下，使权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的转化体的培养物与下述氨基化合物的对映体混合物作用，得到通式(4)所示的光学活性氨基化合物，

上式(4)中，R¹和R²表示碳原子数为1～10的任选被取代的烷基、碳原子数为1～10的任选被取代的芳烷基或碳原子数为1～10的任选被取代的芳基，R¹和R²两者任选相互结合形成环，其中，R¹和R²结构不同，＊表示不对称碳原子，

其中，所述氨基化合物为选自1-氨基1,2,3,4-四氢化萘、2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、1-苄基-3-氨基吡咯烷、1-Boc-3-氨基吡咯烷、1-Cbz-3-氨基吡咯烷、1-苄基-3-氨基哌啶、1-Boc-3-氨基哌啶、1-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3,4-二甲氧基苯异丙胺中的1种以上的氨基化合物，

所述氨基受体为丙酮酸或乙醛酸。