CN105936895A

CN105936895A - 一种醇脱氢酶突变体及其基因和在制备手性双芳基醇中的应用

Info

Publication number: CN105936895A
Application number: CN201610373757.4A
Authority: CN
Inventors: 许国超; 倪晔; 周婕妤; 韩瑞枝; 董晋军
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2016-09-14

Abstract

本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及其编码基因和应用。该突变体是将克鲁维酵母Kluyveromyces sp.CCTCC M2011385来源的具有如序列SEQ ID No.1所示氨基酸序列的醇脱氢酶在237位的丝氨酸被丙氨酸取代后得到。本发明所述的醇脱氢酶突变体与野生酶相比，酶的还原活性和立体选择性有了大幅度的提高。所述突变体尤其适合不对称还原双芳基酮制备手性双芳基醇，可用于多种抗组胺药物的合成。该醇脱氢酶突变体具有良好的工业应用前景。

Description

一种醇脱氢酶突变体及其基因和在制备手性双芳基醇中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种醇脱氢酶突变体及其编码基因和应用该醇脱氢酶的突变体在不对称还原潜手性双芳基酮制备手性二芳基醇中的应用。

背景技术

手性双芳基仲醇是一类重要的手性化合物，许多药物的分子结构中都存在着双芳基仲醇的砌块结构，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇可用于合成抗过敏药贝他司汀。由潜手性双芳基酮经不对称还原反应合成手性双芳基醇的工艺具有原子经济性高的优点。

化学不对称还原法主要由以下三种技术实现：

1.以(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)为原料，(S)-[Ru(BINAP)Cl₂]₂(NEt₃)为催化剂，加压，通氢气，还原得到(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((S)-CPMA)，ee值为99％。(赵志全等.中国医药工业杂志.2006.37,726-727)

2.以CPMK为原料，采用三步反应，1)先用三氟甲烷磺酸酐等进行保护，2)再用催化剂钯配位体及Me-CBS等还原羰基得到S构型羟基，3)在三苯基膦钯等作用下脱保护，得到(S)-CPMA。

3.以CPMK为原料，以手性BINAL-H为手性还原剂，定向合成单一构型CPMA。(CN103121966A)

虽然上述反应的立体选择性较高，但是上述反应所需的贵金属配位体较难购买，成本较高，反应需要高压条件，操作步骤较多。因而不利于工业化生产。

生物催化剂具有高效、特异的催化活力，其最大的优势在于优越的催化活性，温和的反应条件，这与“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标相符。生物不对称还原法主要由以下四种技术实现：

1.2007年，Truppo等筛选了一系列商品化酮还原酶KRED后，发现虽然有一些酮还原酶对双芳基底物有还原能力，但立体选择性一般，且底物谱较窄，底物中的取代基团对立体选择性的影响较大。仅KRED124可以不对称还原CPMK生成(R)-CPMA，ee值为94％，转化率98％，且需要外源葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环。(Org.Lett.,2007,9,335–338.)

2.2009年，朱敦明等发现来源于Sporobolomyces salmonicolor的重组羰基还原酶SsCR及其突变体可以立体选择性还原不同双芳基酮底物(8–99％ee)。在葡萄糖脱氢酶的协助下，还原CPMK生成(R)-CPMA，转化率62％，对映选择性为88％(R)。(Org.Lett.,2008,10,525–528.)

3.2012年，周婕妤等通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母Kluyveromycessp.CCTCCM2011385，可催化还原CPMK生成(S)-CPMA(87％ee)。然而活性酶在野生菌中的含量低，最高仅能催化2g·L^-1底物，产物浓度较低，分离成本高，因而不能满足应用的需要。(Process Biochem.,2012,47,1042–1048.；CN102559520A)

4.2013年，李哲等研究了一个来源于来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR对10mmol·L^-1的一系列双芳香基甲酮类化合物的不对称还原，转化率最高只有50％。(生物工程学报,2013,29,68-77)

由以上数据可知采用生物不对称还原法制备手性CPMA的产率低，提取困难，并且立体选择性均达不到工业化要求，需要进一步开发高效和高立体选择性醇脱氢酶。本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，可以高效不对称还原CPMK生成(R)-CPMA，该反应具有不需外源添加昂贵辅酶，不需额外添加如葡萄糖脱氢酶等用以辅因子循环的酶，反应条件条件温和，操作简单等优点。

从克鲁维酵母Kluyveromyces sp.CCTCC M2011385中克隆得到的醇脱氢酶KpADH能够催化多种羰基化合物高立体选择性不对称还原制备光学手性醇，该醇脱氢酶已经在大肠杆菌中重组过量表达。该酶对多种羰基化合物具有较高的活力，可以催化还原多种脂肪族或芳基取代的酮底物，尤其是空间位阻较大的双芳基酮底物。为了提高该酶的还原活性使之适应高底物浓度的还原反应，通过随机突变手段对KpADH进行分子改造，提高酶的还原活性和立体选择性，这将使其具有更高的工业应用价值。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是：针对目前已获得的醇脱氢酶的催化活性和立体选择性都较低的问题，提供一种提高醇脱氢酶的突变体蛋白质、编码该突变体蛋白质的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及该醇脱氢酶突变体蛋白质或表达该醇脱氢酶突变体蛋白质的重组转化体作为催化剂在羰基不对称还原、制备光学手性双芳基醇中应用。与野生型醇脱氢酶相比，本发明提供的醇脱氢酶突变体蛋白质具有更高的反应活性和立体选择性。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，所述蛋白质具有如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白质经随机突变且具有氧化还原酶活性的衍生蛋白质。

其中所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。具有序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白质命名为KpADH蛋白。

其中所述蛋白质较佳地为：将具有序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白质的第131为甲硫氨酸替换为苯丙氨酸(M131F)，第196位丝氨酸替换为酪氨酸(S196Y)，第237位丝氨酸替换为丙氨酸(S237A)所得到的蛋白质。

本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸具有编码上述蛋白质的核酸序列。

其中所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码醇脱氢酶的核酸分子，通过基因克隆技术获得编码醇脱氢酶突变体的基因核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码醇脱氢酶突变体的核酸分子。

如本领域技术人员所知，编码SEQ ID No.1的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明所述突变体核酸的具体获得方法为：以来源于克鲁维酵母Kluyveromycessp.CCTCC M2011385中的醇脱氢酶野生型KpADH的基因为模板，通过提高PCR反应体系的Mn²⁺和Mg²⁺浓度构建随机突变库，对所获得的突变基因库进行高通量筛选，得到羰基还原酶活提高的突变体KpADH_M131F、KpADH_S196Y和KpADH_S237A。

所述易错PCR为本领域常规技术，PCR反应体系(25μL)为：模板10-20ng，10×rTaqbuffer，2.5mM dNTP mix，100μM MnSO₄，500μM MgCl₂，1.25U rTaq polymerase(TaKaRa,Japan)，加入无菌蒸馏水至25μL。

所述易错PCR扩增程序为：(1)94℃变性3min；(2)94℃变性30sec；(3)54℃退火30sec；(4)72℃延伸90s，重复步骤(2)～(4)进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏PCR扩增产物。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即将本发明所述的醇脱氢酶突变体基因的核酸分子连接于各种表达载体构建而成。本发明所述载体优选地为质粒pET-28a(+)。分别用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切易错PCR产物和pET28a(+)载体，形成互补的粘性末端，经T₄DNA连接酶连接，形成含有本发明的醇脱氢酶基因的重组表达质粒pET28a-KpADH_M131F、pET28a-KpADH_S196Y、pET28a-KpADH_S237A。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的醇脱氢酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(Escherichia coli)，更佳地为E.coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28-KpADH_M131F、E.coli BL21(DE3)/pET-28-KpADH_S196Y、E.coli BL21(DE3)/pET-28-KpADH_S237A。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地选择热激法进行转化即可。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是：一种醇脱氢酶突变体的制备方法，其中包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物种获得重组醇脱氢酶突变体。

其中所述制备方法较佳地为：将上述大肠杆菌接种至含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，30～40℃，100～150rpm摇床培养，培养液的吸光度OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选0.8)，加入0.05～1.0mM(优选0.2mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～30℃，诱导5～10h即可得到高效表达的重组醇脱氢酶突变体。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六是：上述蛋白质或上述重组表达转化体作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物制备光学纯手性仲醇中的应用。

所述蛋白质优选本发明所述的醇脱氢酶或者醇脱氢酶突变体。所述的前手性羰基化合物较佳地为烷基或芳基取代的酮，通式如式1所示。

式中：R₁为苯基、对氯苯基、苯甲基、萘基；R₂为2-吡啶、苯基、甲基、乙基、临氯苯基、间氯苯基、对氯苯基、乙酰基、丙酰基、丁酰基。

较佳的，所述的应用按下述方法进行：CPMK的浓度为10～500mmol/L；所述的重组醇脱氢酶的用量为1～10kU/L(酶活定义见实施例1)；异丙醇的用量为20～1000mmol/L；所述的NADP⁺的用量为0.1～1.0mmol/L；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH 6～8；所述的不对称还原反应的温度为20～35℃；所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准，一般为1～12小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(R)-CPMA产物。

反应过程中取样检测：取100μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，待有机相自然会发完全，加入500μL分析纯的乙醇，进行液相分析转化率和ee值，具体条件如：Daicel Chiralcel OB-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01，V/V/V)，流速1mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μL，保留时间：(S)-(4’-氯苯基)-(吡啶-2’-基)-甲醇8.67min，(R)-(4’-氯苯基)-(吡啶-2’-基)-甲醇9.37min。

产物光学纯度通过对映体过量值(ee)来评价:

A_R：液相色谱分析获得的(R)-CPMA摩尔浓度；A_S：液相色谱分析获得的(S)-CPMA的摩尔浓度。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂盒原料均市售可得。

本发明的积极进步成果在于：与野生型醇脱氢酶KpADH相比，本发明所述醇脱氢酶突变体KpADH_S237A具有更高的催化活性和对映选择性，对CPMK的k_cat/K_m由野生型的16.8L·s^–1·mmol^–1提高至79.2L·s^–1·mmol^–1，立体选择性由野生型的82.0％提高至96.1％。本发明所获得醇脱氢酶突变体特别适用于双芳基酮的不对称还原，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为醇脱氢酶突变体表达及纯化结果的SDS-PAGE电泳图。其中:

(A)为野生型醇脱氢酶KpADH梯度洗脱蛋白电泳图；

(B)为醇脱氢酶突变体KpADH_M131F梯度洗脱蛋白电泳图；

(C)为醇脱氢酶突变体KpADH_S196Y梯度洗脱蛋白电泳图；

(D)为醇脱氢酶突变体KpADH_S237A梯度洗脱蛋白电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中未注明具体实验条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1醇脱氢酶KpADH随机突变库的构建和筛选

首先设计用于随机突变的引物，如表1和序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

表1醇脱氢酶KpADH随机突变引物

PCR反应体系(25μL)为：模板10-20ng，10×rTaq buffer，2.5mM dNTP mix，100μMMnSO₄，500μM MgCl₂，1.25U rTaq polymerase(TaKaRa,Japan)，加入无菌蒸馏水至25μL。

易错PCR扩增程序为：(1)94℃变性3min；(2)94℃变性30sec；(3)54℃退火30sec；(4)72℃延伸90s，重复步骤(2)～(4)进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏PCR扩增产物。

扩增产物和pET28a(+)载体分别用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切，形成互补的粘性末端，经T₄DNA连接酶连接，形成含有本发明的醇脱氢酶基因随机突变库的重组质粒。所得连接液转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养后，挑取单菌落，即得到醇脱氢酶的随机突变库。

将单菌落接种至含400μL LB培养基的96孔深孔板中，于37℃下，120rpm的摇床中培养12h，然后转接至新的含有培养基的深孔板中，于37℃下，120rpm的摇床中培养2h，加入终浓度为0.2mM IPTG(异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷)，于30℃，120rpm的摇床中继续培养5h；将在4℃和8000rpm离心10min后去除上清液，收集细胞，并置于-80℃冰箱中冻融2h以上；取出深孔板并融化后，每孔加入200μL新鲜配制的溶菌酶(100mg/L)和核酸酶(100ng/L)溶液于37℃破壁处理1h；在4℃和8000rpm离心10min上清即为突变体酶液。

采用检测340nm下吸光值变化的方法进行高通量筛选。总反应体系为200μL，包括：0.5mmol·L^-1NADPH，5mmol·L^-1酮类底物，磷酸钠缓冲液(PBS，100mmol·L^-1，pH 5.5)，充分混匀，30℃保温2min，加入适量的酶液，检测340nm下吸收值的变化。吸光值变化显著高于母本的即为催化活性提高的突变体。

由上海赛音生物技术有限公司对所得突变体进行序列测定。发现了三个醇脱氢酶突变体KpADH_M131F、KpADH_S196Y和KpADH_S237A表现出了提高的催化活性。

实施例2醇脱氢酶突变体的表达与纯化

将活性提高的突变体按2％转接量转接入新鲜LB培养中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mM IPTG，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中，超声破碎

纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组醇脱氢酶突变体。对纯化后的蛋白进行酶活测定(CPMK为底物，NADPH为辅酶)及SDS-PAGE分析。。镍柱纯化后，在45kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrapDesalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的醇脱氢酶突变体置换到Tris–HCl(100mmol·L^-1，pH 7.0)缓冲液中。

实施例3醇脱氢酶突变体的动力学和选择性分析

测定KpADH在不同底物浓度和辅酶浓度情况下的活力，并根据活力和底物浓度的倒数做出双倒数曲线，计算动力学参数。

由表2可知野生型醇脱氢酶KpADH对CPMK的k_cat/K_m和ee分别为16.8L·s^–1·mmol^–1和82.0％，突变体酶KpADH_M131F、KpADH_S196Y和KpADH_S237A对CPMK的k_cat/K_m和ee分别为17.8L·s^–1·mmol^–1和82.1％，19.3L·s^–1·mmol^–1和74.7％，79.2L·s^–1·mmol^–1和96.1％。突变体酶KpADH_S237A表现出了最高的催化活性和立体选择性，对CPMK的k_cat/K_m是野生型的4.71倍。

表2醇脱氢酶突变体的动力学参数及立体选择性

实施例4醇脱氢酶突变体的底物特异性分析

将实施例2所得到的醇脱氢酶各突变体对广泛潜手性羰基化合物底物谱进行了考察，包括4-氯苯基-吡啶-2-基-甲酮、二苯酮、苯基苯乙酮、4-氯二苯甲酮、2,4’-二氯二苯甲酮、3,4’-二氯二苯甲酮、4,4’-二氯二苯甲酮、苯甲酮、4-氯苯乙酮、4-氨基苯乙酮、2-萘乙酮、2-丁酮、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2,3-己二酮、2,5-己二酮。突变体酶KpADH_S237A对CPMK的比活力是野生型醇脱氢酶的3.64倍，且对多种芳基取代的酮具有较高还原活力。

表3醇脱氢酶突变体的底物特异性

实施例5醇脱氢酶突变体不对称还原CPMK制备(R)-CPMA

于10mL磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH 7.0)中分别加入实施例2所得的突变体酶KpADH_S237A和野生型酶10g/L，100，200和500mmol·L^-1的CPMK(溶解于异丙醇)，在30℃，200rpm反应12h。反应过程中转化率分析结果见表4和表5。

野生型醇脱氢酶可不对称还原100和200mmol·L^-1的CPMK，分别需要6h和8h，CPMK的浓度提高至500mmol·L^-1后，转化率维持在10％左右，立体选择性为82.0％。与野生型相比，在相同酶添加量条件下，突变体酶KpADH_S237A可高效还原100，200和500mmol·L^-1CPMK，分别需要4，6和12h，立体选择性为96.1％。

表4野生型醇脱氢酶KpADH催化CPMK的不对称还原

表5醇脱氢酶突变体KpADH_S237A催化CPMK的不对称还原

由此可知，本发明所述醇脱氢酶突变体酶KpADH_S237A在CPMK的高效、高立体选择性不对称还原方面具有非常好的性能。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列是将序列表中SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的第237位丝氨酸突变为丙氨酸所得的氨基酸序列SEQ ID No.6。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸具有编码如权利要求1所述醇脱氢酶突变体氨基酸序列SEQ ID No.6的核酸序列。

3.一种包含如权利要求2所述的核酸序列的重组表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体。

5.一种如权利要求1所述的醇脱氢酶突变体或如权利要求4所述的重组表达转化体作为催化剂，在催化潜手性羰基化合物的不对称还原，制备光学纯手性双芳基醇中的应用，其中所述潜手性羰基化合物为(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮、二苯酮、苯基苯乙酮、4-氯二苯甲酮、2,4’-二氯二苯甲酮、3,4’-二氯二苯甲酮、4,4’-二氯二苯甲酮等双芳基酮。