CN106011096A - 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法 - Google Patents

工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106011096A
CN106011096A CN201610597311.XA CN201610597311A CN106011096A CN 106011096 A CN106011096 A CN 106011096A CN 201610597311 A CN201610597311 A CN 201610597311A CN 106011096 A CN106011096 A CN 106011096A
Authority
CN
China
Prior art keywords
thiophene
dimethylamino
propanol
base
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610597311.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106011096B (zh
Inventor
付敏杰
张涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Original Assignee
SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU ENZYMEWORKS Inc filed Critical SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Priority to CN201610597311.XA priority Critical patent/CN106011096B/zh
Publication of CN106011096A publication Critical patent/CN106011096A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106011096B publication Critical patent/CN106011096B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)‑3‑(二甲胺基)‑1‑(噻吩‑2‑基)‑1‑丙醇的方法，与现有技术相比，在制备(S)‑3‑(二甲胺基)‑1‑(噻吩‑2‑基)‑1‑丙醇的过程中采用了本发明的工程化酮还原酶多肽，使得整个反应过程酶量用量低、反应时间短、底物浓度高，更加适合产业化应用。

Description

工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1- 丙醇的方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法。
背景技术
度洛西汀(Duloxetine)是一种低副作用的，能够有效治疗精神紊乱和代谢紊乱的药物(US patent 5,023,269)。合成度洛西汀的关键是获得含有手性中心的中间体(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇(DMAA)。不对称还原3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮(DMAK)得到该中间体是目前最有效、研究最多的方法，其反应过程如下所示：
化学方法还原的经济性、安全性和环境友好性较低。生物酶法还原得如美国专利US patent 2010/0151534等报道，公开了一种利用酮还原酶(KRED)生产(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，该方法酶量较高(0.6％)，反应时间长(30h)，底物浓度低(15％)。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种能够将底物3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮还原成产物(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的工程化酮还原酶多肽，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90％的同源性。其中，序列2为来自Candida magnoliae的野生型酮还原酶，其他的序列通过易错PCR等随机突变和活性位点盒式突变(CASTing)等定点突变方法获得，突变体获得增强的活性和稳定性，可以通过高通量筛选(HTS)等方法探知，上述的改变氨基酸序列和筛选突变体库方法，均为本领域内的常规技术。
本发明提供了一种编码多肽的多核苷酸。优选地，所述的多核苷酸选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的所述的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列为SEQ ID NO：43。该表达载体为pET30a。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述酮还原酶多肽生物催化制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，所述方法以3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮为底物，在适于将其不对称还原为(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的反应条件下与上述酮还原酶多肽接触。
优选地，所述反应是在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0～8.0、温度为25℃～35℃的缓冲溶液中进行的，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学等方法。
优选地，所述葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：在制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的过程中，采用了本发明的工程化酮还原酶多肽，与现有技术相比，其酶量用量低(0.3％)，反应时间短(12h)，底物浓度高(20％)，更加适合产业化应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1(酮还原酶的制备)
采用常规方法制备获得了酮还原酶催化剂：序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43的基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司合成，与pET30a(Novagen)质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到含有抗性的液体LB培养基中，于37℃培养至OD600至0.8，加入诱导剂IPTG，继续培养16小时，离心收集沉淀，加入磷酸盐缓冲液悬浮，冰水浴中超声波破碎10分钟，离心取上清，冷冻得到酮还原酶酶粉。
实施例2(酮还原酶的筛选)
由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43在大肠杆菌中表达获得的酮还原酶2mg，GDH(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)2mg，NADP 1mg，底物DMAK 50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL 0.05M三乙醇胺缓冲液的5mL反应器中，30℃1000rpm搅拌，1h后取样HPLC检测，序列43的转化率和ee均为>99％，因此采用序列43作为进一步研究对象。
实施例3(酶催化反应)
向50mL反应三口瓶中依次加入2.0g底物DMAK，3g葡萄糖，9mL 0.05M pH 7.0三乙醇胺缓冲液，温度调节至30℃，900r/min搅拌，以浓度为15％的Na2CO3溶液维持反应体系pH至7.0，向反应瓶中加入含有6mg酮还原酶(由序列43在大肠杆菌中表达获得)，6mg葡萄糖脱氢酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)和0.5mg NADP的三乙醇胺缓冲液，反应12h，HPLC检测转化率99％，加热浓缩至体积10mL，过滤取滤液，采用浓度为25％的NaOH溶液调节pH至12.0-12.5之间，冰水浴降温至0℃，保温12h，过滤得到产品1.7g，含量95％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种能够将底物3-（二甲胺基）-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮还原成产物(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的工程化酮还原酶多肽，其特征在于，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。
2.编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。
4.一种表达载体，包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的权利要求3所述的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其为pET30a。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。
8.一种使用权利要求1中所述的酮还原酶多肽生物催化制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，其特征在于，所述方法以3-（二甲胺基）-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮为底物，在适于将其不对称还原为(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的反应条件下与权利要求1所述的酮还原酶多肽接触。
9.根据权利要求8所述的制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，其特征在于，所述反应是在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0~8.0、温度为25℃~35℃的缓冲溶液中进行的，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
10.根据权利要求8所述的制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
CN201610597311.XA 2016-07-27 2016-07-27 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法 Active CN106011096B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610597311.XA CN106011096B (zh) 2016-07-27 2016-07-27 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610597311.XA CN106011096B (zh) 2016-07-27 2016-07-27 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106011096A true CN106011096A (zh) 2016-10-12
CN106011096B CN106011096B (zh) 2020-11-03

Family

ID=57114462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610597311.XA Active CN106011096B (zh) 2016-07-27 2016-07-27 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106011096B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852593A (zh) * 2019-03-28 2019-06-07 洛阳华荣生物技术有限公司 一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用
CN110387359A (zh) * 2018-04-17 2019-10-29 湖州颐辉生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其应用
CN112126663A (zh) * 2020-11-04 2020-12-25 浙江拓普药业股份有限公司 一种度洛西汀的生产工艺

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014088A (zh) * 2012-12-19 2013-04-03 苏州汉酶生物技术有限公司 (s)-3-甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的生物制备方法
US8455223B2 (en) * 2005-09-19 2013-06-04 Basf Se Dehydrogenases, the derivatives thereof, and method for the production of optically active alkanols
CN103421854A (zh) * 2013-07-30 2013-12-04 苏州汉酶生物技术有限公司 一种(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的生物制备方法
CN106011092A (zh) * 2016-06-20 2016-10-12 苏州汉酶生物技术有限公司 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8455223B2 (en) * 2005-09-19 2013-06-04 Basf Se Dehydrogenases, the derivatives thereof, and method for the production of optically active alkanols
CN103014088A (zh) * 2012-12-19 2013-04-03 苏州汉酶生物技术有限公司 (s)-3-甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的生物制备方法
CN103421854A (zh) * 2013-07-30 2013-12-04 苏州汉酶生物技术有限公司 一种(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的生物制备方法
CN106011092A (zh) * 2016-06-20 2016-10-12 苏州汉酶生物技术有限公司 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110387359A (zh) * 2018-04-17 2019-10-29 湖州颐辉生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其应用
CN110387359B (zh) * 2018-04-17 2021-04-20 湖州颐盛生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其应用
CN109852593A (zh) * 2019-03-28 2019-06-07 洛阳华荣生物技术有限公司 一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用
CN112126663A (zh) * 2020-11-04 2020-12-25 浙江拓普药业股份有限公司 一种度洛西汀的生产工艺

Also Published As

Publication number Publication date
CN106011096B (zh) 2020-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Min et al. Overview on the biotechnological production of L-DOPA
CN106011095A (zh) 工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法
Rother et al. S‐Selective Mixed Carboligation by Structure‐Based Design of the Pyruvate Decarboxylase from Acetobacter pasteurianus
CN107586752A (zh) 一种工程菌及其应用
Celińska Klebsiella spp as a 1, 3-propanediol producer–the metabolic engineering approach
Mitsui et al. Construction of lactic acid-tolerant Saccharomyces cerevisiae by using CRISPR-Cas-mediated genome evolution for efficient d-lactic acid production
CN108103081B (zh) 一种乙醛脱氢酶及其在解酒保健品方面的应用
CN104152506B (zh) 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法
Zhang et al. Characterization of the sugar alcohol-producing yeast Pichia anomala
Liu et al. Sorbitol production using recombinant Zymomonas mobilis strain
CN105936895A (zh) 一种醇脱氢酶突变体及其基因和在制备手性双芳基醇中的应用
CN106011096A (zh) 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法
Qi et al. Improved xylitol production by expressing a novel D-arabitol dehydrogenase from isolated Gluconobacter sp. JX-05 and co-biotransformation of whole cells
CN105936909A (zh) 一种醇脱氢酶及其基因、重组酶和合成手性双芳基仲醇的应用
CN101857887B (zh) 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法
Yao et al. Gene cloning, expression, and characterization of a novel acetaldehyde dehydrogenase from Issatchenkia terricola strain XJ-2
CN104263742A (zh) 羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用
Weber et al. Exploiting cell metabolism for biocatalytic whole-cell transamination by recombinant Saccharomyces cerevisiae
Su et al. 3-Hydroxypropionaldehyde-specific aldehyde dehydrogenase from Bacillus subtilis catalyzes 3-hydroxypropionic acid production in Klebsiella pneumoniae
CN105734092A (zh) 一种酶法制备d-塔格糖的方法
CN111763662A (zh) 酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用
CN107312766A (zh) 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体
CN103013898A (zh) 一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用
Li et al. Discovery of a novel ortho-haloacetophenones-specific carbonyl reductase from Bacillus aryabhattai and insight into the molecular basis for its catalytic performance
Rivaldi et al. Metabolism of biodiesel-derived glycerol in probiotic Lactobacillus strains

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant