CN107586752A - 一种工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四酶共表达的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：它导入了L‑氨基酸氧化酶基因、α‑酮酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和可将NAD(P)还成NAD(P)H的酶基因。本发明还公开了上述重组大肠杆菌的构建方法和应用。本发明方法应用于生物合成苯乙醇类化合物，具有操作简单，成本低，产物合成效率高，光学纯度高的特点，具有良好的产业化前景。

Description

一种工程菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种共表达四酶的大肠杆菌基因工程菌的构建，以及该工程菌在生产2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇的应用。
背景技术
苯乙醇类化合物(Phenylethanoids)，主要有三种结构类似物：2-苯乙醇(2-Phenylethanol，β-Phenylethanol)、酪醇(对羟基苯乙醇，Tyrosol，4-hydroxyphenylethanol，2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol)、羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，3,4-Dihydroxyphenylethanol，2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)，均为L-α-芳香族氨基酸衍生物。2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰香味的芳香醇，在食品、药品、化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且具有协合及增效作用，是多种香型配方所需的组分。酪醇是红景天苷分子的核心，具有较好的抗氧化性，也是重要的医药中间体，主要用作合成心血管药美多心安，倍它素洛尔等。羟基酪醇被视为最强大的抗氧化剂之一，可消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，防止脑衰，延缓衰老。
目前有植物提取、化学合成、微生物等方法生产这些化合物。化学方法已能成功合成2-苯乙醇、酪醇和羟基酪醇(中国专利200880002426.3、201310183569.1、200910098983.6)，由于这些化合物都是重要的食品或保健品原料，因此化学合成的产品不受人们喜欢。当前市场上的这些产品主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利201510625623.2公开了一种从玫瑰花瓣中提取高纯度2-苯乙醇的方法；中国发专利201410743409.2公开了一种从大花红景天中制备高纯度酪醇的方法；中国专利201710195462.7从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。受植物资源及其含量的限制，这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。
L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴经过脱氨、脱羧、醛基还原可以应生成2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇。基于此代谢原理，数种微生物生产的方法已经被开发。
酵母具有从头合成2-苯乙醇的代谢途径,也可通过氨基酸分解代谢途径将L-苯丙氨酸直接转化为2-苯乙醇，早在1907年Ehrlich过在酵母培养基中添加L-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量得到大幅提高(Ber Dtsch Chem Ges,1907.40:1027-1047)。中国专利02137575.5、200710066884.0、200810071807.9、200910049170.8、200910049565.8、201310243384.5、201410661174.2和201610256845.6均匀公开了采用酵母转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的菌种和方法。Romagnoli开发了一种删除酵母芳香族氨基酸转氨酶，以葡萄糖为底物生产2-苯乙醇，产量约为3mM，同时也会产少量的酪醇(Deletion of theSaccharomyces Cerevisiae Aro8Gene,Encoding an Aromatic Amino AcidTransaminase,Enhances Phenylethanol Production from Glucose.Yeast,2015,32(1):29-45)。由于酵母生长较慢，且在转化过程中会消耗部份L-苯丙氨酸，因此2-苯乙醇的产率较低，成本较高。
其它也有采用Enterobacter sp.菌(De-Novo Synthesis of 2-Phenylethanolby Enterobacter Sp Cgmcc 5087.BMC Biotechnology,2014,14)或采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法(中国发明专利201410041209.2)，但均匀其它效率比酵母更低。
大肠杆菌生长速度较快，是基因工程菌的较好选择。中国专利201210276491.3在L-苯丙氨酸高产大肠杆菌中过表达苯丙酮酸脱羧酶以及乙醇脱氢酶实现2-苯乙醇的高产，但过表达的2个酶会扰乱由葡萄糖从头合成生长的大肠杆菌的代谢，因此其产量仅可达到130mg/L。中国发明专利201510650028.4则在大肠杆菌中共表达4种酶，分别为：芳香族氨基酸氨基转移酶以及外源的苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶，用于全细胞转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇，由于菌体内部的α-酮戊二酸浓度较低，很难提供充足的氨的受体，当转化体系中添加α-酮戊二酸时能获得最高的产量，添加谷氨酸也可较大地提高产量，很显然共它化合物的添加会增加转化成本，也会提高转化及纯化操作的复杂性。中国发明专利201610464256.7公开了一种非细胞生物合成方法，将单独表达的转氨酶，苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定或在溶液体积中转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇，由公开的文件可以发现该系统缺乏充足的氨的受体及NADH，因此该过程很难实现生产。中国发明专利201710256900.6公开了，分别表达苯丙氨酸脱氢酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的三种大肠杆菌湿菌体混合，添加辅酶TPP和NAD，控制温度和pH，用于转化L-苯丙氨酸，该方法中NAD和TPP价格昂贵，而且反应一定时间后会分解失效，同时三种酶需要分别培养得到，极大地增加了反应成本，独立的细胞也会影响NAD在细胞间穿梭实现辅酶再生，因此该转化反应很难持续进行。
中国发明专利201310133238.7公开了一种大肠杆菌中过表达来源于酿酒酵母的4-羟苯基脱羧酶，并敲除了苯乙醛脱氢酶基因，实现了从酪氨酸或葡萄糖生产酪醇的方法；但以酪氨酸为底物时，该菌缺乏有效的脱氨系统；以葡萄糖重头合成时，酪醇对菌体有毒性，影响菌体生长及产物合成；因此该菌很难实现酪醇的有效生产。201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC，以葡萄糖重头合成羟基酪醇；该方案的主要缺点在于羟基酪醇对菌体有毒性，HpaBC表达量较低；因此生产羟基酪醇的效率较难提高。中国发明专利201710091999.9公开了一种过表达来源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶和芳香氨基酸氧基转移酶的大肠杆菌，并用该菌全细胞转化L-酪氨酸生产酪醇，很显然该菌缺乏足够的受氨体及良好的醛还原体系，因此产率较低。Chung等人通过在大肠杆菌过表达来源于植物的芳香醛合成酶(aromatic aldehyde synthases)，将L-酪氨酸一步变成对羟基苯乙醛，再由大肠杆菌内部的还原系统生成酪醇，另外过表达HpaBC实现了羟基酪醇，但植物基因的在大肠杆菌内的低表达效率影响了全细胞转化效果(Production of Three Phenylethanoids,Tyrosol,Hydroxytyrosol,and Salidroside,Using Plant Genes Expressing in Escherichia Coli.Scientific Reports,2017,)。
当前多酶串联的全细胞催化简单前体生成高副加值产物已经被广泛应用(Constructing Biocatalytic Cascades:In Vitro and in Vivo Approaches to deNovo Multi-Enzyme Pathways,ACS Catal.,2017,7(1),710–724)，全细胞实现对廉价底物的高效转化，有时会比以葡萄糖的从头合成更加经济有效。
基于目前各种方法的缺陷，本发明构建了一种多酶共表达的大肠杆菌，实现了对芳香族L-α-氨基酸的全细胞催化转化，可分别催化L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴生成2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产苯乙醇类(Phenylethanoids)类化合物的大肠杆菌重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
上述大肠杆菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为L-氨基酸氧化酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和可将NAD(P)还成NAD(P)H的酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-氨基酸氧化酶将L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴氧化成对应的苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、3,4-二羟基苯丙酮酸；随后经由α-酮酸脱羧酶作用生成苯乙醛、对羟基苯乙醛、3,4-二羟基苯乙醛；醇脱氢酶和可将NAD(P)还成NAD(P)H的酶构成NAD辅酶循环再生体系，由醇脱氢酶将醛还原；实现了全细胞四酶串联一步法分别将L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴转化为2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1.本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaeamyxofaciens ATCC 19692、Lactococcus lactis ATCC 19435、Komagataella phaffiiATCC 76273、Bacillus subtilis ATCC 13952和Pseudomonas abietaniphilaATCC700689。购自Novagen公司的pRSFDuet-1质粒、pETDuet-1质粒、Escherichia coliBL21(DE3)、Escherichia coli BL21DH5α。
2.酶的选择
(1)L-氨基酸氧化酶的选择
L-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far？Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:9323-41)。L-氨基酸氧化酶将α氨基和Cα上的氢转移到FAD上，绝大部份利用分子氧直接氧化还原型FAD，再生氧化型FAD，同时生成过氧化氢，在此过程中另外必须添加过氧化氢酶以消除过氧化氢的毒性。另外还有一类L-氨基酸氧化酶与细胞膜上电子传递链相关，电子经过呼吸链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，从而不生成过氧化氢，这种酶类主要存在于变形杆菌属(Proteus sp.)、普罗威登菌属(Providencia sp.)、摩根菌属(Morganella sp.)等细菌中(Crystal structure of a membrane-bound l-amino aciddeaminase from Proteus vulgaris.J.Struct.Biol.2016,195:306-15)。本发明选择了两种不产过氧化氢的L-氧基酸氧化酶，从Proteus mirabilis ATCC 29906和Cosenzaeamyxofaciens ATCC 19692中分别克隆得到L-氨基酸氧化酶基因pmaao和cmaao，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，这些酶都具有底物广泛和活性强的特点。
(2)α-酮酸脱羧酶的选择
根据文献报选择来源于细菌的，对芳香族酮酸具有强活性的α-酮酸脱羧酶，与其它专利中选择来源于酵母或植物的酶相比具有更好地在大肠杆菌中表达的特性。本发明分别从Proteus mirabilis ATCC 29906和Lactococcus lactis ATCC19435中分别克隆得到α-酮酸脱羧酶基因pmkdc和llkdc，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
(3)醇脱氢酶的选择
醇脱氢酶广泛存在于各类细菌中，根据报道大肠杆菌本身也含有多种底物广泛的醇脱氢酶(Production of aromatic compounds by metabolically engineeredEscherichia coli with an expanded shikimate pathway,Appl.Environ.Microbiol.201278(17),6203-6216)，因此直接从Escherichia coli BL21(DE3)克隆得到两个醇脱氢酶基因ecadh1和ecadh2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，从而更有利于醇脱氢酶在大肠杆菌中的过表达。
(4)可还原NAD(P)的酶的选择
在生物转化反应中，醇脱氢酶需要以NADH和/或NADPH为辅酶，本发明从Komagataella phaffii ATCC 76273中得到甲酸脱氢酶基因kpfdh(核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示)、从Bacillus subtilis ATCC 13952得到葡萄糖脱氢酶基因bsgdh(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、从Pseudomonas abietaniphila ATCC700689中得到亚磷酸脱氢酶基因papdh(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)。
3.四酶共表达体系的构建
将以上选择的L-氨基酸氧化酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、可还原NAD(P)的酶中每类任选一个酶，进行四酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用pRSFDuet-1和pETDuet-1双质粒共表达四基因，pRSFDuet-1装载L-氨基酸氧化酶基因和α-酮酸脱羧酶基因，pETDuet-1装载醇脱氢酶基因和可还原NAD(P)的酶基因。
得到共表达重组质粒后，将两种质粒转化大肠杆菌Escherichia coli B21，利用氨苄青霉素(Ampicillin)和卡那毒素(kanamycin)平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
4.全细胞转化苯乙醇类化合物
细胞的准备：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
全细胞转化体系为：根据不同底物的溶解性，底物浓度控制在0.5-20g/L，并根据构建的不同质粒的性质加入供氢体浓度为1-20g/L，调节pH在4.0-8.0之间,新鲜湿菌体量为10-200g/L。然后于15-40℃，转化0.5-48小时。转化结束后液相色谱测定产量及旋光性。当构建的四酶共表达质粒中含有葡萄糖脱氢酶时，供氢体为葡萄糖。当构建的四酶共表达质粒中含有甲酸脱氢酶时，供氢体为甲酸钠。当构建的四酶共表达质粒中含有亚磷酸脱氢酶时，供氢体为亚磷酸。
全细胞转化体系中的底物为下列之一：L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴。
这些底物经相应的全细胞转化，可对应生成2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇。
5.样品的检测分析
定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长210nm。
本发明的有益效果是构建了一种新型的四酶共表达大肠杆菌工程菌，该菌可应用于苯乙醇类化合的的生产。本发明选择的L-氨基酸氧化酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶均具有底物专一性差、活性强强的特点，因此同一株工程菌在采用芳香L-α-氨基酸的情况下可生产出多种苯乙醇类产物，也可用生产其它氨基酸的衍生化醇。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
四基因共表达体系的构建。
(1)设计引物
设计引物，引物序列如表1所示
表1扩增基因所用到的引物
(2)PCR扩增
按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara)抽提处于对数生长期的菌株的基因组DNA，用表1中的引物从各自对应的菌株中进行PCR扩增。扩增体系为：PrimeSTARHS DNA Polymerase(2.55U/μL)0.5μL、10×Prime STAR Buffer 10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、模板DNA 1μL、Up引物(20μM)1μL、Down引物(20μM)1μL、ddH2O补足到50μL。扩增程序为：94℃，10min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环；72℃，10min。PCR产物送华大基因测序。
后从Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC分别克隆得到L-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao；从Proteus mirabilis ATCC 29906、Lactococcuslactis ATCC 19435分别得到α-酮酸脱羧酶基因pmkdc、llkdc；从Escherichia colistrain BL21得到乙醇脱氢酶基因ecadh1、ecadh2；从Komagataella phaffii ATCC 7627、Bacillus subtilis ATCC 13952、Pseudomonas abietaniphila ATCC70068分别得到可还原NAD(P)的酶基因kpfdh、bsgdh、papdh。
(3)pRSFDuet-1和pETDuet-1单基因质粒的构建
将pRSFDuet-1和pETDuet-1载体质粒和步骤(2)中cmaao、pmaao、ecadh1、ecadh2的PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。酶切体系为：10×cut buffer 5μL,DNA10μL，限制性内切酶SacⅠ和限制性内切酶HindⅢ各1μL，无菌水33μL。
然后分别回收酶切产物，并于16℃水浴下连接12h-16h，pRSFDuet-1分别与cmaao、pmaao进行连接，pETDuet-1分别与ecadh1、ecadh2进行连接。连接体系为：10×DNA ligasebuffer 2.5μL，DNA片段8μL，载体DNA 2μL，T4DNA ligase 1μL，无菌水11.5μL共25μL。
随后在连接体系中加入100μL DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将pRSFDuet-1分别与cmaao、pmaao连接菌体均匀涂布在含卡那霉素的LB平板上，将pETDuet-1分别与ecadh1、ecadh2连接菌体均匀涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，挑单菌落培养12h，然后提取质粒，双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性，最后保存正确转化子，得到如下质粒：
含有L-氨基酸氧化酶基因的pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaao；含有乙醇脱氢酶基因的pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2。
(4)L-氨基酸氧化酶基因、α-酮酸脱羧酶基因pRSFDuet-1共表达质粒和乙醇脱氢酶基因、可还原NAD(P)酶基因pETDuet-1共表达质粒的构建。
酶切体系为：10×cut buffer 5μL,DNA 10μL，限制性内切酶1和限制性内切酶2各1μL，无菌水33μL。将步骤(3)中构建的单基因质粒和步骤(2)中pmkdc、llkdc、kpfdh、bsgdh、papdh的PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。
由于各基因的限制性内切酶位置的不同，有如下2种情况。
pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaao、pmkdc、llkdc用EcoRⅤ和KpnⅠ双酶切。
pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2、kpfdh、bsgdh、papdh用BglⅡ和XhoⅠ双酶切。
然后分别回收上述2种情况下的酶切产物，并于16℃水浴下连接12-16h，pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaao分别与pmkdc、llkdc进行连接，pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2分别与kpfdh、bsgdh、papdh进行连接。连接体系为：10×DNA ligasebuffer 2.5μL，DNA片段8μL，载体DNA 2μL，T4DNA ligase 1μL，无菌水11.5μL共25μL。
随后在连接体系中加入100μL E.coli DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaao分别与pmkdc、llkdc进行连接的菌体均匀涂布在含卡那霉素的LB平板上，将pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2分别与kpfdh、bsgdh、papdh进行连接的菌体均匀涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，挑单菌落培养12h，然后进行DNA测序以保证其准确性，最后保存正确转化子，得到如下质粒：
含有L-氨基酸氧化酶基因、α-酮酸脱羧酶基因的pRSFDuet-cmaao-pmkdc、pRSFDuet-cmaao-llkdc、pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pRSFDuet-pmaao-llkdc。
含有乙醇脱氢酶基因、可还原NAD(P)酶基因的pETDuet-ecadh1-kpfdh、pETDuet-ecadh1-bsgdh、pETDuet-ecadh1-papdh、pETDuet-ecadh2-kpfdh、pETDuet-ecadh2-bsgdh、pETDuet-ecadh2-papdh。
(5)pRSFDuet-1和pETDuet-1双质粒四基因共表达体系的构建。
按照生产商提供的使用说明书，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.4.0抽提步骤(4)中得到的pRSFDuet-cmaao-pmkdc、pRSFDuet-cmaao-llkdc、pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pRSFDuet-pmaao-llkdc质粒DNA1和pETDuet-ecadh1-kpfdh、pETDuet-ecadh1-bsgdh、pETDuet-ecadh1-papdh、pETDuet-ecadh2-kpfdh、pETDuet-ecadh2-bsgdh、pETDuet-ecadh2-papdh质粒DNA2，随后分别取上述质粒DNA1和质粒DNA2各1μL加入100μL大肠杆菌E.Coli(BL21)感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将菌体均匀涂布在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上，挑单菌落培养12h，然后进一步PCR验证四个基因已成功转入到E.Coli(BL21)中，同时进行DNA测序以保证其准确性，并保存菌株备用。
本实施例最终构建了如下8株工程菌：E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh1)、E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh2)、E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh2)、E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc,pETDuet-papdh-ecadh1)、E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc,pETDuet-kpfdh-ecadh2)、E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh1)、E.coliBL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc,pETDuet-kpfdh-ecadh2)、E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc,pETDuet-papdh-ecadh1)。
实施例2
实施例1中获得的基因工程菌的诱导表达。
挑取构建好的基因工程菌单菌落接种于10mL LB培养基中(含0.1g/L氨苄青霉素)，37℃培养12小时，2％的体积比接种于LB培养基中(1000mL摇瓶装液200mL，含0.1g/L氨苄青霉素)，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期(OD600达0.6-0.8)，加IPTG到浓度为0.4mM，20℃，200rmp条件下培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。根据转化所需菌体量，可增加摇瓶数量以获得充足的菌体。
实施例3
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh1)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，考察不同底物分别与全细胞混合后的转化情况，底物终浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化24小时后测定结果，各类底物的反应情况如下表所示。
表2 E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh1)对不同底物的转化情况
实施例4
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，考察不同底物分别与全细胞混合后的转化情况，底物终浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为10g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化48小时后测定结果，各类底物的反应情况如下表所示。
表3 E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh2)对不同底物的转化情况
实施例5
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-苯丙氨酸浓度为20g/L，葡萄糖浓度为20g/L，调节pH为8.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度20℃，转化48小时后测定结果，生成2-苯乙醇，浓度为19g/L。
实施例6
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc,pETDuet-papdh-ecadh1)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-多巴浓度为1g/L，亚磷酸浓度为1g/L，调节pH为4.0，添加新鲜全细胞重量为10g(湿重)，温度35℃，转化0.5小时后测定结果，生成羟基酪醇，浓度为52mg/L。
实施例7
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc,pETDuet-kpfdh-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-酪氨酸浓度为0.5g/L，甲酸钠浓度为20g/L，调节pH为6.0，添加新鲜全细胞重量为1g(湿重)，温度30℃，转化12小时后测定结果，生成酪醇，浓度为104mg/L。
实施例8
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc,pETDuet-kpfdh-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-亮氨酸浓度为0.5g/L，甲酸钠浓度为1g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为20g(湿重)，温度30℃，转化48小时后测定结果，生成异戊醇，浓度为320mg/L。
实施例9
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc,pETDuet-bsgdh-ecadh1)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-苯氨酸浓度为0.5g/L，葡萄糖浓度为1g/L，调节pH为8.0，添加新鲜全细胞重量为1g(湿重)，温度40℃，转化36小时后测定结果，生成2-苯乙醇，浓度为155mg/L。
实施例10
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc,pETDuet-kpfdh-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-酪氨酸为0.5g/L，甲酸钠浓度为20g/L，调节pH为5.0，添加新鲜全细胞重量为15g(湿重)，温度30℃，转化48小时后测定结果，生成酪醇，浓度为398mg/L。
实施例11
根据实施例2所述诱导表达方法，将实施例1得到E.coli BL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc,pETDuet-papdh-ecadh1)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，L-酪氨酸浓度为0.5g/L，亚磷酸浓度为5g/L，调节pH为7.0，添加新鲜全细胞重量为5g(湿重)，温度25℃，转化6小时后测定结果，生成酪醇，浓度为210mg/L。
以上所述的L-氨基酸氧化酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、可还原NAD(P)的酶及其共表达基因工程菌的构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均就包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种工程菌及其应用
<130> 2017.8.7
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> Proteus mirabilis ATCC 29906
<400> 1
atggcaataa gtagaagaaa atttattctt ggtggcacag tggttgctgt tgctgcaggc 60
gctggggttt taacacctat gttaacgcga gaagggcgtt ttgttcctgg tacgccgaga 120
catggttttg ttgagggaac tggcggtcca ttaccgaaac aagatgatgt tgttgtaatt 180
ggtgcgggta ttttaggtat catgaccgcg attaaccttg ctgagcgtgg cttatctgtc 240
acaatcgttg aaaaaggaaa tattgccggc gaacaatcat ctcgattcta tggtcaagct 300
attagctata aaatgccaga tgaaaccttc ttattacatc acctcgggaa gcaccgctgg 360
cgtgagatga acgctaaagt tggtattgat accacttatc gtacacaagg tcgtgtagaa 420
gttcctttag atgaagaaga tttagaaaac gtaagaaaat ggattgatgc taaaagcaaa 480
gatgttggct cagacattcc atttagaaca aaaatgattg aaggcgctga gttaaaacag 540
cgtttacgtg gcgctaccac tgattggaaa attgctggtt tcgaagaaga ctcaggaagt 600
ttcgatcctg aagttgcgac ttttgtgatg gcagaatatg ccaaaaaaat gggtatcaaa 660
attttcacaa actgtgcagc ccgtggttta gaaacgcaag ctggtgttat ttctgatgtt 720
gtaacagaaa aaggaccaat taaaacctct cgtgttgttg tcgccggtgg tgtttggtca 780
cgtttattta tgcagaacct aaatgttgat gtaccaacat tacctgctta tcaatcacag 840
caattaatta gcgcagcacc aaatgcgcca ggtggaaacg ttgctttacc cggcggaatt 900
ttctttcgtg aacaagcgga tggaacgtat gcaacttctc ctcgtgtcat tgttgctccg 960
gtagtaaaag aatcatttac ttacggctat aaatatttac ctctgctggc tttacctgat 1020
ttcccagtac atatttcgtt aaatgagcag ttgattaatt cctttatgca atcaacacat 1080
tgggatctta atgaagagtc gccatttgaa aaatatcgtg atatgaccgc tctgcctgat 1140
ctgccagaat taaatgcctc actggaaaaa ctgaaaaaag agttcccagc atttaaagaa 1200
tcaacgttaa ttgatcagtg gagtggtgcg atggcgattg caccagatga aaacccaatt 1260
atctctgatg ttaaagagta tccaggtcta gttattaata ctgcaacagg ttggggaatg 1320
actgaaagcc ctgtatcagc agaaattaca gcagatttat tattaggcaa aaaaccagta 1380
ttagatgcca aaccatttag tctgtatcgt ttctaa 1416
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692
<400> 2
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ccttggactg ttgctgcttt tgaagaagat tctggttctg tcgatcctga aacgggtaca 600
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ggcacttatg ctgtagcccc acgtatcttc acaagctcca ttgttaaaga tagtttccta 960
ttagggccta aatttatgca cttattaggt ggtggtgagc taccattaga attctctatt 1020
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<212> DNA
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accgcaccac aaaagccaac aagtgataaa gcaacattag aaaaagcagt atcagcaatc 600
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tatatgacag atattctttc tgaattaacc caacgactac caaataaaac ttatcataaa 1020
ataacagcga aaggattagg tgaagcggtt atatctgata atgataaaat tacagcacaa 1080
tatctctatc ctcgtttaga acaattcttt aaacctaatg atattattat tgcagaaaca 1140
ggaacctcat ccatgggatt aggcttcgct ttattacctg aaggtgcaca atttcataat 1200
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atttcactga atatagatga aggaaaaata tttaacgaaa gcatccaaaa ttttgatttt 960
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aatattgata tcgagtccgc cgggccgctg ttgtgcggcg gtatcacggt ctttaaacca 480
ctgttgatgc accatatcac tgctaccagc cgcgttgggg taattggtat tggcgggctg 540
gggcatatcg ctataaaact tctgcacgca atgggatgcg aggtgacagc ctttagttct 600
aatccggcga aagagcagga agtgctggcg atgggtgccg ataaagtggt gaatagccgc 660
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<212> DNA
<213> Escherichia coli BL21
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acccggcgtg aaccgggacc gaatgatgtc aaaatcgaaa tcgcttactg tggcgtttgc 120
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gaagttgtta actcacgcaa tgccgatgag atggcggctc atctgaagag tttcgatttc 720
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gatggcacca tgacgctggt tggtgcgcct gcgacaccgc ataaatcgcc ggaagttttc 840
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<212> DNA
<213> Komagataella phaffii ATCC 76273
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<213> Bacillus subtilis ATCC 13952
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<213> Pseudomonas abietaniphila ATCC 700689
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acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360
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gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720
gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780
gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840
ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900
cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggtattggc aggtgcgcgc 960
ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgttg a 1011

Claims (10)

1.一种四酶共表达的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于该菌采双质粒共表达四种酶，分别为L-氨基酸氧化酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和可将NAD(P)还成NAD(P)H的酶。该工程菌可应用于转化芳香L-α-氨基酸，生成对应的苯乙醇类化合物。
2.如权利要求1所述工程菌株中，L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。
3.如权利要求1所述工程菌株中，α-酮酸脱羧酶的核苷酸序列如序列表中的：SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4。
4.如权利要求1所述工程菌株中，醇脱氢酶的核苷酸序列如序列表中的：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
5.如权利要求1所述工程菌株中，可还原NAD(P)的酶为甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶和亚磷酸脱氢酶，其对应的核苷酸序列如序列表中的：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
6.如权利要求1所述工程菌株应用于生产过程时，底物为L-苯丙氨酸时，产物为苯乙醇。
7.如权利要求1所述工程菌株应用于生产过程时，底物为L-酪氨酸时，产物为酪醇。
8.如权利要求1所述工程菌株应用于生产过程时，底物为L-多巴时，产物为羟基酪醇。
9.如权利要求1所述工程菌株应用于α-羟基羧酸的生产过程特征在：重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基中，当细胞OD600达到0.6～0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。将收集的细胞加水重悬细胞湿重为10-200g/L，然后添加L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴中的任意一个，浓度为0.5-20g/L，并根据构建的不同质粒的性质加入供氢体浓度为1-20g/L，调节pH 4.0-8.0。于15-40℃反应，时间0.5-48小时。
10.如权利要求9所述的供氢体特征在于：当构建的四酶共表达菌株中含有葡萄糖脱氢酶时，供氢体为葡萄糖。当构建的四酶共表达菌株中含有甲酸脱氢酶时，供氢体为甲酸钠。当构建的四酶共表达菌株中含有亚磷酸脱氢酶时，供氢体为亚磷酸。
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