CN108949654A - 一种工程菌及其在生产α-酮戊二酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程菌及其在生产α‑酮戊二酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的能低成本生产纯α‑酮戊二酸的重组大肠杆菌，同时表达了外源L‑谷氨酸脱氢酶和NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了α‑酮戊二酸吸收基因；进一步地，还强化表达了谷氨酸转运基因、α‑酮戊二酸转运基因、NAD合成基因的一种或者多种。本发明的重组菌用于生产α‑酮戊二酸，过程简单、杂质少，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其在生产α-酮戊二酸中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)，是一种酸性较弱的有机酸。α-酮戊二酸在化工、食品、医药等领域有着广泛的应用。
目前α-酮戊二酸的生产主要有化学法和生物法。化学法生产α-酮戊二酸，成本较高污染严重。生物法主要有L-谷氨酸转化法和直接发酵法。以葡萄糖为原料发酵产α-酮戊二酸(CN201210056106.4、CN201110329273.7等)通常发酵时间较长，并且从杂质发酵液系统中提取α-酮戊二酸成本较高。以含有L-谷氨酸氧化酶的工程菌(CN201410146961.3、CN201210563671.X等)，可产α-酮戊二酸，但此过程中有的会产生过氧化氢，即使共表达过氢化氢酶或外部添加过氢化氢酶也无法避免α-酮戊二酸被氧化产生丁二酸，从而影响收率及纯化效果。
本发明以过对大肠杆菌的改造，改变其对底物和产物的转运及辅酶的效合成，并利用廉价的底物L-谷氨酸在不产过氧化氢的情况下转化生产α-酮戊二酸。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了不产过氧化氢的转化L-谷氨酸产α-酮戊二酸的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了双酶共表达的工程菌，实现了α-酮戊二酸的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能生产α-酮戊二酸并减少杂质生成的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明的第一个目的是提供能低成本生产纯α-酮戊二酸的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-谷氨酸脱氢酶和NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了α-酮戊二酸吸收基因。
在一种实施方式中，所述L-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451、Lactobacillus brevis ATCC 14869。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1、WP_056958268.1、ERK43827.1序列。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000002 REGION:complement(39571..40911)、NZ_AYYM01000013 REGION:complement(15875..17233)、AWVK01000048 REGION:complement(50022..51416)的序列。
在一种实施方式中，所述L-谷氨酸脱氢酶和NADH氧化酶是通过pCOLADuet-1共表达的。
在一种实施方式中，所述α-酮戊二酸吸收基因(将α-酮戊二酸转运至细胞内的基因)为kgtP。
在一种实施方式中，所述α-酮戊二酸吸收基因为NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(2591042..2592340)。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因(把乳酸转运至细胞内的基因)、α-酮戊二酸转运基因(增强α-酮戊二酸往细胞外的转运蛋白基因)、NAD合成基因(大肠杆菌NAD合成途径的关键酶)的一种或者多种。
在一种实施方式中，所述强化表达的基因为gltS(L-谷氨酸转运基因)、pykF(α-酮戊二酸向外转运基因)、icsA(NAD合成基因)、nadA(NAD合成基因)中的任意一种或多种。
在一种实施方式中，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
在一种实施方式中，所述gltS在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(3694931..3696136)；pykF为NC_012892 REGION:1700961..1702373；icsA为NC_012892 REGION:complement(2526116..2527330)；nadA为NC_012892 REGION:740487..741530。
本发明的第二个目的是提供一种生产光学纯α-酮戊二酸的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。
在一种实施方式中，所述生产α-酮戊二酸，是进行全细胞转化生产。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/L，L-谷氨酸1-100g/L，pH 4.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。
本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种新型的双酶共表达基因工程菌，该菌可应用于α-酮戊二酸的生产。本发明选择方案不产过氧化氢，细胞不易分解α-酮戊二酸，并且细胞内有较高的NAD含量。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方案
本发明的大肠杆菌工程菌的功能核心是可以共表达2种酶，分别为L-谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase)、NADH氧化酶(NADH oxidase)。其原理为：在工程菌全细胞内，L-谷氨酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-谷氨酸脱氢生成α-酮戊二酸和NADH；NADH氧化酶将NADH氧化生成NAD，实现了辅酶NAD的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相关基因促进L-谷氨酸的转运和防止α-酮戊二酸的分解。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1、本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus brevis ATCC 14869购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ。pCasRed、pCRISPR-gDNA购自镇江爱必梦生物科技有限公司。
2、大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达
(1)大肠杆菌α-酮戊二酸吸收基因的敲除
α-酮戊二酸是三羧酸代谢途径中的核心化合物，会被多种途径所利用分解，目前α-酮戊二酸基因工程菌通常是敲除或弱化酮戊二酸分解和利用途径的酶实现α-酮戊二酸的累积，但基因的敲除会影响菌株的正常生长，通常需要特殊的培养基或培养方法进行α-酮戊二酸发酵。本发明是以L-谷氨酸为底物，实现全细胞酶转化生产α-酮戊二酸，为了让酶表达过程正常进行，工程菌中α-酮戊二酸相关分解代谢途径酶均不作修改，仅把大肠杆菌中将α-酮戊二酸转运至细胞内的基因敲除，从而让菌株能够生产α-酮戊二酸并快速转运出细胞，但不能再吸收进细胞，从而避免了α-酮戊二酸的分解。所选择的基因为kgtP,NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(2591042..2592340)。
(2)大肠杆菌L-谷氨酸转运基因的组成型强化表达
在全细胞转化过程中，需把L-谷氨酸转运至细胞内才能进行脱氢生产α-酮戊二酸，增强L-谷氨酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内L-谷氨酸的高浓度，有利于脱氢的进行。选择的基因是gltS NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(3694931..3696136)。同时增强α-酮戊二酸往细胞外转运蛋白，目前没有关于大肠杆菌中将α-酮戊二酸的蛋白，考虑到丙酮酸与之结构的相似性，尝试选择可将丙酮酸转运出细胞的蛋白对应的基因pykF,NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:1700961..1702373。
(3)大肠杆菌NAD合成相关基因的过表达
在L-谷氨酸脱氢过程中需要以NAD为辅酶，强化表达大肠杆菌NAD合成途径的关键酶，可以提高菌体内的NAD水平，从而有利于α-酮戊二酸的生成。选择的基因有icsA、nadA。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(2526116..2527330)、NC_012892REGION:740487..741530、
3.L-谷氨酸转化生成α-酮戊二酸相关酶的选择
(1)L-谷氨酸脱氢酶的选择
L-谷氨酸脱氢酶广泛存在于几乎所有的生物中，通常以NADP为辅酶，以NAD为辅酶的较少。有文章报道了来源于Clostridium symbiosum的谷氨酸脱氢酶与NADH氧化酶共表达转化生产α-酮戊二酸的方法(An Enzymatic Process toΑ-Ketoglutarate from L-Glutamate:The Coupled System L-Glutamate Dehydrogenase/NadhOxidase.Tetrahedron:Asymmetry,2004.15(18):2933-37Clostridium difficil和Clostridium symbiosum)，也有文章报导了来源于Clostridium difficil的谷氨酸脱氢酶与人工电子受体构成辅酶再生体系生产α-酮戊二酸的方法(Artificial CofactorRegeneration with an Iron(Iii)Porphyrin as Nadh-Oxidase Mimic in theEnzymatic Oxidation of L-Glutamate to Alpha-Ketoglutarate.Journal ofMolecular Catalysis B-Enzymatic,2014.103:10-15)。但这两种方案产率均不高，无法满足大规模工业化生产。
因此本申请从实验室保藏的菌株中筛选新的能以NAD为辅酶进行高效转化谷氨酸生成α-酮戊二酸的菌株，并从中得到L-谷氨酸脱氢酶基因。
(2)NADH氧化酶的选择
L-谷氨酸脱氢酶从L-谷氨酸上脱氢生成α-酮戊二酸NADH。NADH需要被NADH氧化酶氧化重新生成NAD，从而实现反应的持续进行。NADH氧化酶有产水型和产过氧化氢型两种，产水型的NADH氧化酶不会产生过氧化氢毒性。本发明分别从Lactobacillussanfranciscensis DSM20451、Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus brevisATCC 14869中得到产水型NADH氧化酶基因lsnox(氨基酸序列是WP_056958268.1)、llnox(氨基酸序列是WP_003131075.1)、lbnox(氨基酸序列是ERK43827)，表达产物用于NAD的再生。
4、L-谷氨酸脱氢酶和NADH氧化酶共表达体系的构建及细胞的培养
将L-谷氨酸脱氢酶与NADH氧化酶进行双酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，基因后带有T7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含两个基因，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
5.全细胞转化生产α-酮戊二酸
全细胞转化体系为：细胞湿重1-200g/L，L-谷氨酸1-50g/L，pH 4.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。
6、样品的检测分析
L-谷氨酸和α-酮戊二酸的定量分析根据文献(HPLC法定量分析微生物法制备液中产物γ-氨基丁酸和底物L-谷氨酸.食品科学,2015,36(24):190-194.)所述的液相色谱条件进行。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具体实施方式
实施例1
筛选高活性以NAD为辅酶的L-谷氨酸脱氢酶的产生菌及其L-谷氨酸脱氢酶基因。筛选培养基配方为：氯化钠3g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、NAD0.01g/L、L-谷氨酸1g/L、pH7。培养温度30℃，以此灭菌培养基富集土壤材料中生长迅速的菌株，通过初筛和复筛，最终得到一个株能利用谷氨酸快速生长的菌株。根据L-谷氨酸脱氢酶的保守性，设计简并引物，克隆得到一个基因，命名为gdhCN，如序列表SEQ ID NO:32所示。并于连接到pETDuet-1质粒第一个T7启动子之后，转化到Escherichia coli BL21(DE3)，得到Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN菌株，表达测定粗酶液谷氨酸脱氢酶活性达40.2U/ml，而大肠杆菌空载对照未见明显活性。
诱导表达方法为：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
实施例2
重组大肠杆菌构建：将编码NADH氧化酶的基因，分别连接到质粒pETDuet-1-gdhCN的第二个T7启动子之后。得到各种双基因共表达重组质粒，将质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
根据实施例1所述方法诱导表达后，收集到的细胞进行转化分析，结果如表2所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重100g/L，L-谷氨酸50g/L，pH 8.0，温度为35℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。
表1L-谷氨酸脱酶与NADH氧化酶双基因共表达大肠杆菌生成α-酮戊二酸的效率比较
| 菌株 | α-酮戊二酸浓度g/L |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 6.2 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN-llnox | 5.3 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN-lbnox | 4.8 |
由上表可以看出当gdhCN和lsnox两个基因进行组合时效果最好。
实施例3
根据实施例1所述的菌株构建方法(各类质粒根据说明明书采用不同的抗性平板筛选阳性转化子)及诱导表达方法，收集各类细胞进行转化分析，结果如表2所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重20g/L，L-谷氨酸50g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间10小时。
表2各种表达质粒对于转化生产α-酮戊二酸的比较
| 菌株 | α-酮戊二酸浓度g/L |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 29.8 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-gdhCN-lsnox | 27.2 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pCOLADuet-1-gdhCN-lsnox | 26.6 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-gdhCN-lsnox | 27.8 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-gdhCN-lsnox | 24.1 |
由上表可以看出采用pETDuet-1共表达时效果最好。
实施例4
根据文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法将Escherichia coli BL21(DE3)上的kgtP进行单或双敲除，其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(kgtP sgRNA)与同源臂(btsT donor)一起导入Escherichia coli BL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在btsT基因位点发生双链断裂，重组酶Red将kgtP donor整合到kgtP基因上，实现基因的敲除，并测序验证。kgtPsgRNA、kgtP donor分别如序列表SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示。
kgtP敲除后，把pETDuet-1-gdhCN-lsnox质粒转化入相应的菌株中进行转化比较。根据实例1所述的方法进行诱导表达，收集细胞进行转化分析，结果如表3所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重200g/L，L-谷氨酸为3g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。转化结束后测定转化液中无L-谷氨酸残留，全部被转化。
表3转化结果比较
| 菌株 | α-酮戊二酸浓度g/L |
| Escherichia coli BL21(ΔkgtP,DE3)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 2.7 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 2.2 |
很显然敲除KgtP的菌株的转化效果更好。将敲除了kgtP的菌株Escherichia coliBL21(ΔkgtP,DE3)命名为Escherichia coli KP。
实施例5
采用文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法，将Escherichia coli KP基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:22所示。
强化基因gltS表达时，以Escherichia coli KP基因组为模板，以引物gltS-FF/gltS-FR、gltS-gpdA-F/gltS-gpdA-R、gltS-RF/gltS-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以gltS-FF和gltS-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含lldP sgRNA)一起转入Escherichia coli KP后，Cas9/sgRNA诱发宿主在gltS基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到gltS基因之前，并测序验证。
强化基因pykF表达时，以Escherichia coli KP基因组为模板，以引物pykF-FF/pykF-FR、pykF-gpdA-F/pykF-gpdA-R、pykF-RF/pykF-RR，扩增出上游、启动子、下游序列，并以pykF-FF和pykF-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pykF sgRNA)一起转入Escherichia coli KP后，Cas9/sgRNA诱发宿主在pykF基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到pykF基因之前，并测序验证。
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表4引物名称与序列表序号对照
| 名称 | 序列表中编号 |
| gltS sgRNA | SEQ ID NO:23 |
| pykF sgRNA | SEQ ID NO:1 |
| gltS-FF | SEQ ID NO:24 |
| gltS-FR | SEQ ID NO:25 |
| gltS-gpdA-F | SEQ ID NO:26 |
| gltS-gpdA-R | SEQ ID NO:27 |
| gltS-RF | SEQ ID NO:28 |
| gltS-RR | SEQ ID NO:29 |
| pykF-FF | SEQ ID NO:4 |
| pykF-FR | SEQ ID NO:5 |
| pykF-gpdA-F | SEQ ID NO:6 |
| pykF-gpdA-R | SEQ ID NO:7 |
| pykF-RF | SEQ ID NO:8 |
| pykF-RR | SEQ ID NO:9 |
基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表4所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重200g/L，L-谷氨酸50g/L，pH 8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间2小时。
表5转化结果比较
| 菌株 | α-酮戊二酸浓度g/L |
| Escherichia coli KP(PG-gltS)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 34.2 |
| Escherichia coli KP(PG-pykF)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 33.2 |
| Escherichia coli KP(PG-gltS,PG-pykF)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 37.2 |
| Escherichia coli KP/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 30.4 |
由上可知同时将gltS和pykF基因前的序列改造成组成型启动子的效果最好。将强化表达了gltS和pykF的Escherichia coli KP(PG-gltS,PG-pykF)命名为Escherichiacoli KPGP。
实施例6
根据实施例5方法将Escherichia coli KPGP中icsA和/或nadA基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ IDNO:22所示。然后再将质粒导入。
强化基因icsA表达时，以Escherichia coli KPGP基因组为模板，以引物icsA-FF/icsA-FR、icsA-gpdA-F/icsA-gpdA-R、icsA-RF/icsA-RR，扩增出上游、启动子、下游序列，并以icsA-FF和icsA-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含icsA sgRNA)一起转入Escherichia coli KPGP后，Cas9/sgRNA诱发宿主在icsA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到icsA基因之前，并测序验证。
强化基因nadA表达时，以Escherichia coli KPGP基因组为模板，以引物nadA-FF/nadA-FR、nadA-gpdA-F/nadA-gpdA-R、nadA-RF/nadA-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nadA-FF和nadA-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含nadA sgRNA)一起转入Escherichia coli KPGP后，Cas9/sgRNA诱发宿主在nadA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到nadA基因之前，并测序验证。
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表6引物名称与序列表序号对照
| 名称 | 序列表中编号 |
| icsA sgRNA | SEQ ID NO:2 |
| nadA sgRNA | SEQ ID NO:3 |
| icsA-FF | SEQ ID NO:10 |
| icsA-FR | SEQ ID NO:11 |
| icsA-gpdA-F | SEQ ID NO:12 |
| icsA-gpdA-R | SEQ ID NO:13 |
| icsA-RF | SEQ ID NO:14 |
| icsA-RR | SEQ ID NO:15 |
| nadA-FF | SEQ ID NO:16 |
| nadA-FR | SEQ ID NO:17 |
| nadA-gpdA-F | SEQ ID NO:18 |
| nadA-gpdA-R | SEQ ID NO:19 |
| nadA-RF | SEQ ID NO:20 |
| nadA-RR | SEQ ID NO:21 |
基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例1所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重10g/L，L-谷氨酸50g/L，pH 9.0，温度为25℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。
表7转化结果比较
| 菌株 | α-酮戊二酸浓度g/L |
| Escherichia coli KPGP(PG-icsA、PG-nadA)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 38.1 |
| Escherichia coli KPGP(PG-icsA)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 27.4 |
| Escherichia coli KPGP(PG-nadA)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 40.5 |
| Escherichia coli KPGP/pETDuet-1-gdhCN-lsnox | 27.9 |
由上可知，仅将nadA基因前的序列改造成组成型启动子的效果最好。将Escherichia coli KPGP(PG-nadA)命名为Escherichia coli KPGPN。
实施例7
根据实施例2所述诱导表达方法，将将共表达质粒导入Escherichia coli KPGPN后得到的Escherichia coli KPGPN/pETDuet-1-gdhCN-lsnox诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重100g/L，L-谷氨酸1g/L，pH 6.0，温度为35℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测得α-酮戊二酸浓度为19.6g/L。
实施例8
根据实施例2所述诱导表达方法，将Escherichia coli KPGPN/pETDuet-1-gdhCN-lsnox诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，L-谷氨酸1g/L，pH4.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，α-酮戊二酸浓度为25mg/L。同样条例下Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gdhCN-lsnox的α-酮戊二酸浓度131g/L。
以上所述的酶及其共表达基因工程菌的构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种工程菌及其在生产α-酮戊二酸中的应用
<130> 2018.3.15
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtatcaagc aggatagcgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggctggcag gctgaagaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttaacggcgt cggcttcggg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacaattatt tgtgactttc attgc 25
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcggccactc atcaacatga ttcataaact tgctttctgg gcgcactgcc 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcagtgcgc ccagaaagca agtttatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgcaaacaat tttggtcttt ttcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgaa aaagaccaaa attgtttgca 50
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtttgcaacg tcaccggctt ctgcg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgcgtctta tcaggcctac agtga 25
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcggccactc atcaacatga ttcataatca ggctaccggc tggatgtacg 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgtacatcca gccggtagcc tgattatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agtcgagata aatcggtaat ttcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgaa attaccgatt tatctcgact 50
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aatgttcggc gcaccgtgtt ccagg 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcgaatcctg cacgacccac cacta 25
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcggccactc atcaacatga ttcatcgaca ttagcgtaat attcgctgtt 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacagcgaat attacgctaa tgtcgatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgtctggatc aaacattacg ctcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgag cgtaatgttt gatccagaca 50
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
catccacgga caatgcgcgc agctg 25
<210> 22
<211> 1100
<212> DNA
<213> Escherichia coli BL21(DE3)
<400> 22
atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60
gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120
atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180
ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240
tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300
aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360
tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420
tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480
agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540
agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600
tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660
gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720
gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780
cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840
gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900
aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960
taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020
ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080
gttcctgaca ggagaaaacc 1100
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttatggcttc accaatgcga 20
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
taagggttac gttgacggtt aagca 25
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tcggccactc atcaacatga ttcattgctt aaccgtcaac gtaaccctta 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
taagggttac gttgacggtt aagcaatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ttgctaaagt atcgagatga aacatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgtt tcatctcgat actttagcaa 50
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
agccagctcc cacagtttca gcccc 25
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ccgcatttgg gcgattgtgg 20
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cataatggca tggctgaaag tactgtaacg gcagacagca aactgacaag tagtgataca 60
tcttcaggta atctggtcga gtggttcgat ttctatgtct actcgttctg ttcactctac 120
<210> 32
<211> 1269
<212> DNA
<213> GDH strain
<400> 32
atggaagtta aagagagtaa ggtcgcaggg cattctaact cattcgagtc catgatgtca 60
cgttttgtgg cagcaatcct tggattagac gaagacacct ataacatgtt aaaatcatct 120
gtaaaacagg taatggttaa tcttccggta acgatggata atggaagaat caacgtgtat 180
gaaggttacc gcgtaattca caataacgtg ggtaactata tgggtccggg taaaggcggt 240
atccgtttcg caatggatgt tgaccttgat gaagtaaaag cacttgcagc ctggatgact 300
tggatatgtg cggttgtaaa cgttcctgtt ggtggaccaa aaggaggtgt taaatgtgac 360
cctcgtacaa tgtccaaagg tgaactagag cgcttaactc gtgctttcac ccaggcaatg 420
gcagatgttt tcggtccgga aaaagatatt cctgcacctg atatgggtac tcgccaacaa 480
gaaatggctt ggttaatgga cgaattctca agaaataaag gatttaccaa tgctggtgtt 540
gttactggaa agccattagt tacaggcgga tcaaaaggtc gtgtggggtt aactggccgc 600
ggagtaatgg taacatgccg tgctgctcat agcaaattga tcattaatcc tgcaattgca 660
actgctgctg ttcaaggttt ctgtaacgtg ggttcaatct ccgctaagtt attagagagc 720
cagggaatta aaattgtagc tatttccgat gttaccggag cttattataa tgctaatggt 780
aataatgttt cggaagcaat tgcctattca caagccaaca ataactctta agaaggatat 840
aaatacgcag agacaatcac taatgatcag ctgttaactt tagatggtga tgtattggtt 900
cctgctgcat tgcaagatgt tatgactaaa gacaacgcac ttaatattaa ggctaaatta 960
attgttgaag gcgcaaatgg tccaacatct gctaatgctg atgctattct tcaggaaaaa 1020
ggaatcatga tggttccgga tattttggcg aaggcaggtg gtgtaactgt ttcgcacaaa 1080
ctttgggttc agaaccacga tgggtattat tggacagaag agcgcgtaaa tcgtcgtgct 1140
gatcatacta tgacagaagc tatcgagcaa gtttatcagg catctatcaa gttcaatgtt 1200
gacatgcgta ttgcggctta cattgtagca attgataaag ttgccagcac acgtataagc 1260
gcattctaa 1269
Claims (10)
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-谷氨酸脱氢酶和NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了α-酮戊二酸吸收基因。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述外源L-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；外源的NADH氧化酶为乳酸菌来源的NADH氧化酶。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述α-酮戊二酸吸收基因为kgtP。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还强化表达了谷氨酸转运基因、α-酮戊二酸转运基因、NAD合成基因的一种或者多种。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达的基因为gltS、pykF、icsA、nadA中的任意一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
7.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了L-谷氨酸脱氢酶和NADH氧化酶基因lsnox，敲除了α-酮戊二酸吸收基为kgtP，并且强化表达了谷氨酸转运基因gltS、α-酮戊二酸转运基因pykF、NAD合成基因nadA。
8.一种生产光学纯α-酮戊二酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-7任一所述的重组菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是进行全细胞转化生产；所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/L，L-谷氨酸1-100g/L，pH 4.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。
10.权利要求1-7任一所述的重组菌或者权利要求8-9任一所述的方法在化工、食品、医药等领域的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111088207A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-05-01 | 南京工业大学 | 一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法 |
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Effective date of registration: 20230214 Address after: Floor 20, Unit 2, Building 1, Jinlan West Jingyuan, No. 56, Shinan Road, Science Avenue, High-tech Industrial Development Zone, Zhengzhou City, Henan Province, 450000 Patentee after: Zhuohong Chaoyuan Biotechnology (Zhengzhou) Co.,Ltd. Address before: No. 1800 Lihu Avenue, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee before: Jiangnan University |
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