CN102159702A

CN102159702A - 生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法

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Publication number: CN102159702A
Application number: CN2009801361767A
Authority: CN
Inventors: 和田光史; 高桥克幸; 森重敬; 宫泽大辅; 高桥均; 望月大资; 安乐城正
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2009-09-11
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2029-09-11
Also published as: EP2338979A1; BRPI0919219A2; WO2010032697A1; TWI486453B; US8614076B2; JPWO2010032697A1; CA2737428C; CN102159702B; TW201016855A; JP5210391B2; US20110171703A1; EP2338979A4; CA2737428A1

Abstract

本发明提供一种生产乳酸的大肠杆菌和使用所述大肠杆菌生产乳酸的方法，所述大肠杆菌的1种以上的NAD依赖性乳酸脱氢酶及1种以上的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的各酶活性均被增强，从而分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生产另一方。

Description

生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法

技术领域

本发明涉及生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法。

背景技术

乳酸有L-乳酸和D-乳酸，L-乳酸为工业生产的聚乳酸的原料，另一方面，D-乳酸作为聚合物原料或农药、药物的中间体近年来也备受关注。但事实上在上述任一用途中都要求作为原料的乳酸具有高光学纯度。

自然界中存在有效生产乳酸的微生物，在一些情况下进行使用它们的乳酸制造法，但也产生副产物例如乙酸、乙醇、乙偶姻、丙酮酸等化合物，有时导致作为最终产物的乳酸的品质下降。另外由于光学异构体的混入导致光学纯度下降，也成为严重的问题。

为了避免如上所述的乳酸纯度下降，已经开发了下述方法，即利用近年来发展起来的基因重组技术破坏微生物的特定基因，特异性地阻碍目标副产物的生产。特别是正在尝试利用大肠杆菌、酵母等进行光学纯度高的乳酸生产技术的开发，所述大肠杆菌、酵母等与乳酸菌或丝状菌等本身能高产率生产乳酸的微生物相比，基因组信息丰富，作为基因重组宿主的实际成果充分。

例如，根据Biotechnol Lett.2006 Oct；28(19)：1527-1535(Grabar等的文献)通过下述方法成功生产了光学纯度高的L-乳酸：对作为由大肠杆菌的丙酮酸到D-乳酸的代谢途径的基因的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)、及作为由丙酮醛到D-乳酸的代谢途径的基因的msgA基因进行破坏，在由含有1mM甜菜碱的矿物构成的合成培养基中对来自乳酸片球菌的生产L-乳酸脱氢酶的大肠杆菌进行培养。

该文献显示，不破坏msgA基因的大肠杆菌在甜菜碱存在下，即使破坏D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)，由于可生产来自大肠杆菌生物合成的丙酮醛的D-乳酸，所以即使原料中未混入D-乳酸也只能得到96％e.e.左右的光学纯度。

另外，虽然该文献中的大肠杆菌中存在用于分解D-乳酸的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶基因(dld)，但只要不破坏msgA基因，则在甜菜碱存在下光学纯度也变为95～96％左右。即，只以大肠杆菌内在的dld基因的表达尚不能充分分解大肠杆菌合成的少量的D-乳酸，更不能得到高光学纯度。另外，使用不存在甜菜碱的培养基，虽然只要原料中不含有D-乳酸就能生产99％以上的高光学纯度的乳酸，但所期望的乳酸的生产速度降低到一半左右。

如上所述，如果不进行msgA基因的破坏和甜菜碱的添加，则难以同时实现L-乳酸的高生产率和高光学纯度。

另外，该文献记载了抑制大肠杆菌生产的D-乳酸的生产，使用不含D-乳酸的培养基来生产高光学纯度的L-乳酸，没有记载培养基成分中含有D-乳酸时提高光学纯度的方法。

日本特开2004-187643号公报中公开了为了得到高光学纯度而使乳酸消旋酶的活性降低的方法。该方法在乳酸产生菌自身制造DL-乳酸时是有效的，但培养基中含有DL-乳酸时没有效果。

另外，Biotech.Bioeng.，Vol.73(1)，pp80-82(2001)中公开了使用L-乳酸脱氢酶将DL-乳酸混合液制成D-乳酸溶液的方法，但报告中的实验是1mL的小规模，乳酸的浓度较低为10mM左右，通常认为在1000mM以上的使用乳酸产生菌的工业生产中是无效的。

另一方面，根据WO2005/033324号说明书，使用破坏了dld基因的大肠杆菌由含有玉米浆的培养基成功生产了高光学纯度的D-乳酸。玉米浆中含有DL-乳酸，破坏了dld基因的大肠杆菌在微好氧条件下抑制D-乳酸的分解，一边分解L-乳酸一边生产D-乳酸，由此成功生产了高光学纯度的D-乳酸。该文献显示，通气对糖的代谢速度、光学异构体的分解速度、杂质的生产速度造成影响，如果过量通气，由于糖的代谢速度下降，所以乳酸的生产速度下降。因此，以生产乳酸为目的时，通气量有上限，需要求出最适的通气量。即，可用于供给作为好氧的代谢反应的L-乳酸的分解的氧气量为至使D-乳酸的生产速度不下降的量。

另外，在工业上希望乳酸的生产速度高，也希望造成光学纯度下降的光学异构体尽量快速分解。将L-乳酸或D-乳酸分解为丙酮酸的酶利用FMN(黄素单核苷酸)或FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)等辅酶、或者直接利用氧将乳酸转换为丙酮酸。利用辅酶的酶的呼吸即利用氧气对该辅酶的再生是有效的，结果各酶的酶活性受到可供给的氧量的限制。

但是，如果增加氧供给量，可以使光学纯度下降的乳酸快速分解，然而糖的代谢速度也下降，所以所期望的乳酸的生产速度大幅下降。因此，在不受氧量限制的前提下提高来自细胞外的原料的乳酸的分解速度、以更短的时间提高所期望的乳酸的光学纯度是极其困难的。

发明内容

因此，本发明提供一种以更短的时间生产高光学纯度的乳酸的生产乳酸的大肠杆菌及生产乳酸的方法。

本发明如下所示。

[1]一种生产乳酸的大肠杆菌，所述大肠杆菌的1种以上的NAD依赖性乳酸脱氢酶及1种以上的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的各酶活性均被增强，从而分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生产另一方。

[2]如[1]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强使丙酮酸生成D-乳酸和L-乳酸中的任一方，并且，上述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强使上述D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方作为基质进行分解。

[3]如[1]或[2]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强，是LdhA的活性增强，能够生产上述D-乳酸。

[4]如[3]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强是LldD的活性增强、L-乳酸氧化酶的活性增强、LldR的失活或活性降低、或它们的一种以上的组合，能够生产上述D-乳酸。

[5]如[4]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述L-乳酸氧化酶为Lox及LctO中的至少一方。

[6]如[4]或[5]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述非DNA依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强是通过在编码LldD的基因的ORF中的33位上具有沉默突变的突变体lldD基因产生的。

[7]如[6]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述突变体LldD是以序列号41的碱基序列表示的。

[8]如[3]～[7]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，选自由Dld活性及Pfl活性组成的组中的至少一种活性失活或活性降低。

[9]如[1]或[2]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强是NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的活性增强，能够生产上述L-乳酸。

[10]如[9]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强是Dld的活性增强，能够生产上述L-乳酸。

[11]如[9]或[10]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中上述L-乳酸脱氢酶来自双歧杆菌属菌。

[12]如[10]或[11]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述Dld具有Lact deh memb结构域。

[13]如[10]～[12]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述Dld来自选自由大肠杆菌、发酵单胞菌及棒状菌组成的组中的至少一种。

[14]如[9]～[13]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，LdhA活性、LldD活性、Pfl活性中的至少一种以上失活或活性降低。

[15]如[1]～[14]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，选自由Mdh及AspA活性组成的组中的至少一种活性失活或活性降低。

[16]如[1]～[15]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，选自由蔗糖非PTS基因组及FruK组成的组中的至少一种被增强。

[17]如[1]～[16]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，FruR活性失活或降低。

[18]一种生产乳酸的方法，使用[1]～[17]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌生产乳酸。

[19]一种生产D-乳酸的方法，使用[3]～[8]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌生产D-乳酸。

[20]一种生产L-乳酸的方法，使用[9]～[14]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌生产L-乳酸。

具体实施方式

本发明的生产乳酸的大肠杆菌是1种以上的NAD依赖性乳酸脱氢酶及1种以上的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的各酶活性均被增强的大肠杆菌，以分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生产另一方。

本发明的大肠杆菌的乳酸代谢系统中的1种以上的NAD依赖性乳酸脱氢酶及1种以上的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的各酶活性均被增强，能够分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方以生产D-乳酸及L-乳酸中的另一方，所以能够使D-乳酸及L-乳酸中的任一方的生产和仅使光学纯度下降的光学异构体的快速分解同时进行。

因此能够提供一种以更短的时间生产高光学纯度的乳酸的生产乳酸的大肠杆菌及生产乳酸的方法。

本发明中所谓酶活性的“增强”，是指除了将编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内之外，还包括通过增强宿主细菌基因组上具有的酶基因的启动子活性或取代为其他的启动子而使酶基因强表达，或者通过使该酶基因的阻抑蛋白活性降低或失活而使该酶活性增强。

本发明中所谓的酶活性的“降低”，是指通过编码该酶的基因的基因重组，与处理前的状态相比，该酶活性明显下降的状态。

本发明中所谓的酶活性的“失活”，是指无论利用现有的任何测定系统，测定对象的该酶的活性在检测限以下的状态。

需要说明的是，本发明中所谓的“宿主”，是指接受从菌体外导入的一个以上的基因，结果成为本发明的生产乳酸的大肠杆菌的该大肠杆菌。

本说明书中所示的数值范围，表示包括分别以所记载的数值为最小值及最大值的范围。

以下详细说明本发明。

为了生成D-乳酸及L-乳酸的任一方，可以在本发明的生产乳酸大肠杆菌中将1种以上的NAD依赖性乳酸脱氢酶及1种以上的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的各酶活性均增强，从而分解D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方而生成D-乳酸及L-乳酸的任一方乳酸。具体而言，优选上述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强使丙酮酸生成D-乳酸及L-乳酸中的任一方，并且，优选上述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶以上述D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方作为基质进行分解。结果由于确实由丙酮酸生成D-乳酸或L-乳酸，并促进了另一方的分解，所以能够更具体高效地得到高光学纯度的乳酸。

上述所谓的NAD依赖性乳酸脱氢酶，是指以基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.1.1.27或酶编号1.1.1.28的NAD为辅酶的乳酸脱氢酶。乳酸代谢系统中，该酶以NAD作为辅酶进行L-乳酸或D-乳酸与丙酮酸之间的氧化还原反应。虽然具有根据基质量及NAD的量等进行氧化还原反应的功能，但是从生产高光学纯度的乳酸的观点考虑，优选为由丙酮酸生成D-乳酸或L-乳酸的NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强。

作为能将NAD依赖性乳酸脱氢酶活性导入宿主细菌的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码NAD依赖性乳酸脱氢酶的基因的碱基序列的DNA，或者利用基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、气杆菌属菌(Aerobacter)、梭状芽孢杆菌属菌(Clostridium)、双歧杆菌(Bifidobacterium)的基因，特别是来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、双歧杆菌(Bifidobacterium)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌MG1655株的基因的碱基序列的DNA、具有来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的基因的碱基序列的DNA。

另外本发明中所谓的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶，是指不以NAD为辅酶的乳酸脱氢酶、或者直接利用氧来氧化乳酸的乳酸氧化酶。在乳酸代谢系统中，上述酶是以FAD或FMN等为辅酶或者直接利用氧进行L-乳酸或D-乳酸与丙酮酸之间的氧化还原反应的酶。是具有根据基质量及辅酶量等进行氧化还原反应的功能的酶，本发明中，优选为对能以D-乳酸及L-乳酸的任一方为基质分解至丙酮酸的功能进行增强的酶。

作为能将非NAD依赖性乳酸氧化还原酶活性导入宿主细菌的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的基因的碱基序列的DNA、或者利用基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、气杆菌属菌(Aerobacter)、梭状芽孢杆菌属菌(Clostridium)、肠道球菌属菌(Enterococcus)、链球菌属菌(Streptococcus)、片球菌属菌(Pediococcus)、乳球菌属菌(Lactococcus)、气球菌(Aerococcus)属菌、棒状菌属菌(Corynebacterium)、发酵单胞菌属菌(Zymomonas)的基因，特别是来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、肠道球菌属菌(Enterococcus)、棒状菌属菌(Corynebacterium)、发酵单胞菌属菌(Zymomonas)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌MG1655株、肠道球菌属ATCC9625株、谷氨酸棒杆菌NBRC12168株、运动发酵单胞菌ATCC31821株的基因的碱基序列的DNA。

如上所述，由于通过组合非NAD依赖性乳酸氧化还原酶及NAD依赖性乳酸脱氢酶，并且分别进行活性增强，可以生成一方的光学异构体，并进行使光学纯度下降的另一方的光学异构体的分解，因此可以以高光学纯度且迅速地生产乳酸。

本发明的生产乳酸的大肠杆菌，可以是对有助于增强上述各酶活性的任一基因进行增强的大肠杆菌，但从D-乳酸或L-乳酸各自的光学纯度及生产效率的观点考虑，优选使用后述的各基因增强了的大肠杆菌。

以下，分别对生产D-乳酸的D-乳酸产生菌和生产L-乳酸的L-乳酸产生菌进行说明。

<D-乳酸产生菌>

本发明中的D-乳酸产生菌中，作为NAD依赖性乳酸脱氢酶活性的增强，优选LdhA的活性被增强。

本发明中所谓的用作NAD依赖性乳酸脱氢酶的、活性被增强的D-乳酸脱氢酶(LdhA)，是指由丙酮酸和NADH生成D-乳酸和NAD的酶。需要说明的是，通常已知既有生产L-乳酸的LdhA也有生产D-乳酸的LdhA，本发明中为了避免混乱只将生产D-乳酸的LdhA记为LdhA。

作为ldhA基因，可以为具有由持有该酶活性的生物得到的基因的碱基序列的DNA或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。

作为优选的ldhA基因的例子，可以举出来自上述关于NAD依赖性乳酸脱氢酶所述的菌的基因，具体而言，可以举出由Bunch等(Microbiologyl，43(Pt 1)，pp.187-195(1997))得到的基因，或具有以大肠杆菌的基因组DNA为模板、利用下述序列号19及序列号20进行PCR扩增的DNA片段所包含的序列的基因。

作为增强本发明中的LdhA活性的方法之一，下述方法是有效的，即，将编码LdhA的基因和控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生物合成系统相关的蛋白质表达的基因的启动子连接，在该状态下组装到表达质粒中，再将表达质粒导入到所希望的细菌中。此种情况下的控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生物合成系统相关的蛋白质表达的基因的启动子是指通常在细菌内、优选在大肠杆菌内发挥作用的强启动子，且即使在葡萄糖存在下，其表达也不易受抑制的启动子，具体而言，可以列举甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶启动子。如上所述得到的大肠杆菌在通气条件下产生D-乳酸时，与ldhA的表达未被增强时相比，能提高D-乳酸的蓄积量，提高D-乳酸的光学纯度。

另外发明中的D-乳酸产生菌中，非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强，优选为LldD的活性增强、L-乳酸氧化酶的活性增强、LldR的失活或活性降低、或它们的1种以上的组合。

由此，可以高效地将L-乳酸分解为丙酮酸，在生产D-乳酸时可以迅速地提高光学纯度。

作为本发明中所谓的作为非NAD依赖性乳酸氧化还原酶、活性被增强的非NAD依赖性L-乳酸脱氢酶(LldD)，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.1.2.3、由L-乳酸和FMN生成丙酮酸和FMNH的酶。作为上述lldD基因，可以为具有由持有该酶活性的生物得到的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成的合成DNA序列。

作为优选例子，可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、志贺属菌(Shigella)、柠檬酸杆菌属菌(Citrobacter)、沙门氏菌属菌(Salmonella)的基因，特别是来自埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌MG1655株的基因的碱基序列的DNA。

另外，从使L-乳酸更迅速的分解的观点考虑，LldD优选为由编码lldD基因的ORF的序列的第33位发生沉默突变的突变体lldD基因表达的LldD，更优选为第33位的碱基由C变为T的突变体lldD(C33T突变体lldD)(序列号41)。使用公知的基因重组技术将C33T突变体lldD基因导入大肠杆菌，由此可以容易地得到高活性大肠杆菌菌株。通过使用该高活性株，能够更快速地分解L-乳酸，能够提高D-乳酸的光学纯度。

另外，所谓用作非NAD依赖性乳酸脱氢酶的、活性被增强的L-乳酸氧化酶，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.13.12.--，在L-乳酸和氧存在下，生成丙酮酸和过氧化氢的酶。作为上述基因lox、lctO，可以为具有由持有该酶活性的生物得到的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成的合成DNA序列。

作为优选例子，可以举出来自肠道球菌属菌(Enterococcus)、链球菌属菌(Streptococcus)、片球菌属菌(Pediococcus)、乳球菌属菌(Lactococcus)、气球菌属菌(Aerococcus)的基因，其中，特别优选从肠道球菌属.ATCC9625及乳酸乳球菌ATCC 19435中分离得到。

作为增强本发明中的LldD、L-乳酸氧化酶活性的方法之一，下述方法是有效的，即，将编码LldD或上述L-乳酸氧化酶的基因和控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生物合成系统相关的蛋白质表达的基因的启动子连接，在该状态下组装到表达质粒中，再将质粒导入所希望的大肠杆菌。此种情况下的控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生物合成系统相关的蛋白质表达的基因的启动子是指通常在细菌内、优选在大肠杆菌内发挥作用的强启动子，且即使在葡萄糖存在下，其表达也不易受抑制的启动子，具体而言，可以列举甘油醛-3磷酸脱氢酶的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶启动子。如上所述得到的大肠杆菌在通气条件下产生D-乳酸时，与LldD或L-乳酸氧化酶的表达未被增强时相比，能提高D-乳酸的蓄积量，提高D-乳酸的光学纯度。

另外，LldD及L-乳酸氧化酶可以分别直接使用公知的序列，另外根据情况也可以分别为不破坏酶活性的突变体。作为上述突变体，可以举出氨基酸的添加、缺失、转化等。上述不破坏活性的突变体可以使用本领域中公知的方法获得。

另外，为了增强非NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性而被失活或活性降低的LldR是抑制上述L-乳酸脱氢酶(LldD)转录的控制因子。通过使LldR的活性降低或失活，可以阻止LldD活性的抑制，或有效地增强LldD活性。

进而，本发明的D-乳酸产生菌中，优选选自由Dld活性及Pfl活性组成的组中的至少一种失活或活性降低。

本发明中所谓的Dld(FAD依赖性D-乳酸脱氢酶)，是指在作为辅酶的氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下，催化由D-乳酸生成丙酮酸的反应的酶的总称。通过使上述Dld的活性失活或降低，可以抑制作为产物的D-乳酸的分解。

另外本发明中所谓的Pfl(丙酮酸甲酸裂解酶)，是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号2.3.1.54、也被称作甲酸乙酰基转移酶(formate acetyl transferase)的酶。该酶是可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反应的酶的总称。通过使上述Pfl的活性失活或降低，可以抑制作为D-乳酸生成原料的丙酮酸的分解。

作为本发明中LdhA活性被增强并且Dld活性或Pfl活性或它们双方失活或活性降低的微生物，可以举出WO2005/033324号所述的大肠杆菌MT-10994(FERMBP-10058)株。

另外，本发明的D-乳酸产生菌，除上述之外，从抑制副产物的生产量的观点考虑，优选选自Mdh及AspA活性中的至少一种失活或活性降低。

所谓Mdh(苹果酸脱氢酶)，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.1.1.37、在作为辅酶的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可逆地催化由苹果酸生成草酰乙酸的反应的酶的总称。因此，通过使Mdh的活性失活或降低，可以抑制副产物丁二酸的生成。

另外AspA(天冬氨酸氨裂合酶)是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号4.3.1.1.、也被称作天冬氨酸酶的酶。该酶是可逆地催化由L-天冬氨酸生成富马酸的反应的酶的总称。因此，通过使AspA的活性失活或减低，可以抑制副产物富马酸的生成。

本发明的D-乳酸产生菌，可以以葡萄糖等糖为原料生产D-乳酸，但为了能以其他糖为原料生产D-乳酸，可以增强选自由蔗糖非PTS基因组及FruK组成的组中的至少一种，较优选增强蔗糖非PTS基因组及FruK双方，更优选只有蔗糖非PTS基因组中的cscA和FruK被同时增强。

本发明中所谓的蔗糖非PTS基因组，是指微生物的蔗糖同化途径中与非PTS系统有关的基因组。详细而言，是由阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透过酶(cscB)构成的基因组。本发明中选择蔗糖非PTS基因组的基因时，可以选择蔗糖非PTS基因组中的1种或2种以上的基因，例如可以举出cscA单独、cscA及cscK的组合、cscA及cscB的组合、cscA及cscR的组合、cscA和cscB和cscR的组合、cscA和cscK和cscR的组合等。其中，从更有效地生产乳酸的观点考虑，优选只选择cscA基因。需要说明的是，在本发明的某种特定方式中，“蔗糖非PTS基因组中的1种或2种以上的基因”中，优选除阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合之外的基因。

本发明中所谓的蔗糖水解酶(转化酶、CscA)，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号3.2.1.26、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反应的酶的总称。

该酶是K12株等大肠杆菌中本身不具有的酶，是包括质子共转运体、转化酶、果糖激酶及蔗糖特异性阻抑蛋白的非PTS代谢途径的酶的1种(参见Canadian Journal of Microbiology，(1991)vol.45，PP418-422)。本发明中通过只赋予该cscA，菌体外的蔗糖可以在外周胞质分解为葡萄糖及果糖并释放到细胞外，并通过葡萄糖PTS及果糖PTS磷酸化并被引入到细胞质内。结果果糖可以被供给至细菌中的果糖代谢系统，并可以利用糖酵解系统被同化。

作为本发明的被导入宿主细菌的蔗糖水解酶(转化酶、CscA)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖水解酶(转化酶、CscA)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。另外优选在CscA中添加用于将CscA移行至菌体的外周胞质的信号序列。

作为本发明的被导入宿主细菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码阻抑蛋白(CscR)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。

作为本发明的被导入宿主细菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码果糖激酶(CscK)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。

作为本发明的被导入宿主细菌的蔗糖透过酶(CscB)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的、具有编码蔗糖透过酶(CscB)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的果糖-1-磷酸激酶(FruK)，是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号2.7.1.56、也被称作果糖磷酸激酶1的酶。在细菌类例如在大肠杆菌内的果糖吸收通常在葡萄糖的存在下被抑制，相对于此，到目前为止还完全未发现FruK表达的增强即使在葡萄糖的存在下也能促进果糖的吸收，并有助于提高在生产D-乳酸的细菌中D-乳酸的生产率。另外，利用上述CscA由蔗糖得到的果糖被吸收进细胞内并被代谢为果糖-1-磷酸后，在一系列的果糖代谢系统中只有FruK的表达增强能够提高乳酸的生产率，这也是预想之外的。

作为本发明的被导入宿主大肠杆菌的果糖-1-磷酸激酶(FruK)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码果糖-1-磷酸激酶的基因(fruK)的碱基序列的DNA，或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例子，可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、气杆菌属菌(Aerobacter)、梭状芽孢杆菌属菌(Clostridium)的基因，特别可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌MG1655株的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有来自大肠杆菌MG1655株的基因的碱基序列的DNA。

本发明中，较优选蔗糖水解酶(CscA)及果糖磷酸激酶的任一种均通过导入编码来自大肠杆菌O157细菌或大肠杆菌MG1655的各蛋白质的基因而得到。通过使用来自上述细菌的基因，能够确保功能表达。

另外本发明中的D-乳酸产生菌，进一步从能够促进果糖的吸收的观点考虑，优选FruR活性失活或减低。

本发明中作为活性被降低的FruR的基因，只要为宿主细菌本身具有的基因即可，可以为宿主细菌本来具有的具有编码FruR的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因公知的碱基序列被引入的合成DNA序列。

通过在下述生产方法中使用上述的D-乳酸产生菌，可以迅速地生产光学纯度高的D-乳酸。

<L-乳酸产生菌>

本发明中的L-乳酸产生菌中，作为NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强，优选NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的活性被增强。

本发明中所谓用作NAD依赖性乳酸脱氢酶的、活性被增强的L-乳酸脱氢酶，是指由丙酮酸和NADH生成L-乳酸和NAD的酶。作为NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的基因，可以为具有由持有该酶活性的生物得到的基因的碱基序列的DNA或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。

作为优选的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶基因，只要为在大肠杆菌中可表达的编码能生产L-乳酸的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的基因即可，没有特殊限定，例如可以举出来自双歧杆菌属、肠杆菌属、乳球菌属、乳杆菌属的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶，特别是从乳酸的生产率的观点考虑，优选为来自长双歧杆菌的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶(Ldh2)。

另外，作为增强NAD依赖性L-乳酸脱氢酶活性的方法之一，可以举出生产D-乳酸的大肠杆菌中对ldhA进行了说明的启动子的使用等，上述解释可以直接适用上述事项。上述L-乳酸脱氢酶活性被增强的细菌在通气条件下生产L-乳酸时，与L-乳酸脱氢酶的表达不被增强时相比，能提高L-乳酸的蓄积量、提高L-乳酸的光学纯度。

本发明中的L-乳酸产生菌中，作为非NAD依赖性乳酸氧化还原酶，从提高光学纯度的观点考虑，优选Dld的活性被增强。

本发明中所谓的Dld(FAD依赖性D-乳酸脱氢酶)，是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.1.2.4、在作为辅酶的氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下催化由D-乳酸生成丙酮酸的反应的酶的总称。

为了增强Dld的活性而能够被导入宿主细菌的Dld基因，可以为来自任何微生物的基因，可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、棒杆菌属菌(Corynebacterium)、发酵单胞菌属菌(Zymomonas)的基因。

其中，从提高光学纯度的观点考虑，dld基因较优选选自均具有Lact deh memb结构域的大肠杆菌、发酵单胞菌及棒杆菌组成的组中的至少一种的dld基因，特别优选分别来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、运动发酵单胞菌的dld基因。需要说明的是发酵单胞菌属及棒状菌属的dld基因还进一步均具有FAD氧化酶结构域。所谓的上述Lact deh memb结构域，是配位在细胞膜上的乳酸脱氢酶所共有的类似性高的氨基酸序列。

有无Lact deh memb结构域或FAD氧化酶结构域的序列的信息，可以通过使用Pfam database(Nucleic Acids Research(2008)Database Issue 36：D281-D288)等输入酶的氨基酸序列、进行检索而得到。例如在http://pfam.sanger.ac.uk/search中输入氨基酸序列，通过在初期状态下进行检索可以得知在期望的氨基酸序列中是否存在Lact deh memb结构域或FAD氧化酶结构域的序列。

作为非NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强，存在抑制该酶基因转录的控制因子时，也可以使其活性降低或失活。

另外，作为增强Dld活性的方法之一，可以举出在生产D-乳酸的大肠杆菌中对ldhA进行说明的启动子的使用等，可以直接适用上述事项。

另外，本发明中的L-乳酸产生菌中，优选选自由LdhA活性、LldD活性及Pfl活性组成的组中的至少一种失活或活性降低。

此处有关于作为活性失活或降低的对象的LdhA、LldD及Pfl的事项，可以直接使用上述的事项。

通过LdhA活性的失活或降低，可以抑制作为生成L-乳酸原料的丙酮酸的分解。

通过LldD活性的失活或减低，可以抑制作为产物的L-乳酸的消耗。

另外本发明中的L-乳酸产生菌中，与上述的D-乳酸产生菌相同，除上述之外，从抑制副产物的生产量的观点考虑，优选选自由Mdh及AspA活性组成的组中的至少一种失活或活性降低。

进而本发明中的L-乳酸产生菌中，与上述的D-乳酸产生菌相同，为了能够以其他的糖为原料生产L-乳酸，可以增强选自由CscA及FruK组成的组中的至少一种，更优选增强CscA及FruK双方。另外，从促进果糖的吸收的观点考虑，本发明的L-乳酸产生菌中，优选FruR活性失活或降低。

关于作为失活或活性降低、或增强对象的Mdh及AspA，以及蔗糖非PTS基因组、FruK及FruR的事项，可以直接适用上述内容。

<生产乳酸的方法>

以下说明本发明的生产乳酸的方法。

本发明的生产乳酸的方法，是使用上述的乳酸产生菌生产乳酸的方法。

特别是使用上述的D-乳酸产生菌进行培养，可以高效地生产高光学纯度的D-乳酸。同样地通过使用上述的L-乳酸产生菌进行培养，可以高效地生产高光学纯度的L-乳酸。

本发明的上述的生产乳酸的方法，具体而言包括：在培养液中培养上述的各乳酸产生菌；由通过上述培养得到的培养物回收乳酸产生菌生成的特定乳酸。

本发明的生产乳酸的方法中，可以使用作为乳酸制造原料通常被使用的来自植物的原料。作为来自植物的原料，只要为从植物得到的碳源即可。具体而言，是指根、茎、干、枝、叶、花或种子等器官、含有它们的植物体、上述植物器官的分解产物，进而在植物体、植物器官、或由它们的分解产物得到的碳源中，能在微生物的培养中用作碳源的也包括在来自植物的原料中。

包含在上述的来自植物的原料中的碳源中，作为一般物质可以举出：淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类，或大量含有上述成分的草木质分解产物或纤维素水解物等，或它们的组合，进而来自植物油的甘油或脂肪酸也包含在本发明中的碳源中。

特别是本发明中的生产乳酸的大肠杆菌具有CscA活性时，具有蔗糖同化能力，因此，即使为含有蔗糖的植物原料也能良好地同化生产乳酸。

本发明中作为来自植物的原料的示例，可以优选举出粮食等农作物，例如玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它们的组合，作为该原料的使用形式，可以为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以为只为上述碳源的形式。

来自植物的原料和生产乳酸的细菌的混合，根据生产乳酸的细菌的活性而不同，但通常情况下，作为培养基中的来自植物的原料的浓度，相对于混合物的总质量，以葡萄糖换算可以使初始的糖浓度为20质量％以下，从细菌的耐糖性的观点考虑，初始的糖浓度可以优选为15质量％以下。其他的各成分只要以通常被添加的量添加到微生物的培养基中即可，没有特殊限制。

另外，作为培养基中的生产乳酸的细菌的含量，根据细菌的种类及活性而不同，但通常相对于培养液，初始的菌浓度可以为0.1质量％～30质量％，从控制培养条件的观点考虑，可以优选为1质量％～10质量％。

本发明的所谓培养是使用培养基培养本发明中的微生物。此时，作为使用的培养基，只要包含碳源、氮源、无机离子、及用于生产乳酸的微生物所要求的有机微量元素、核酸、维生素类等的培养基即可，没有特殊限制。

其中，从生产速度的观点考虑，优选在添加有2种以上氨基酸的培养基中进行培养。本发明中所谓的添加有2种以上氨基酸的培养基，是指含有天然存在的各种氨基酸中的至少2种以上的培养基，还包括含有酵母提取物、水解酪蛋白氨基酸、胨、乳清、废糖蜜、玉米浆等天然物质或天然物质提取物的水解产物的培养基。为了得到较优选的结果，优选含有0.5质量％～20质量％、更优选含有2质量％～15质量％的选自酵母提取物、胨、乳清、废糖蜜及玉米浆中的至少1种或它们的混合物的培养基。特别是玉米浆的添加能得到明显的效果，此时不添加硫酸铵等盐反而有时得到更好的结果。培养基为通常的液体培养基。

培养条件根据制备的菌体、培养装置而改变，例如优选在20℃～40℃，较优选在25℃～35℃下的培养温度进行培养，优选利用NaOH、NH₃等将pH调至6.0～8.0、更优选至7.0～7.6进行培养。培养时间没有特别限定，是菌体充分增殖、且乳酸生成所需要的时间。

培养时通常使用能控制温度、pH、通气条件、搅拌速度的培养槽，但本发明的培养并不限于使用培养槽。使用培养槽培养时，根据需要也可以预先进行作为预培养的种培养，然后将其必要量接种到预先配制的培养槽内的培养基中。

本发明中所谓的培养物，是指由上述方法生产的菌体、培养液、及它们的处理物。

从如上所述得到的培养液等培养物中回收乳酸的方法，例如，如果是从培养液中回收，则可以利用通常已知的方法，例如，可以采用酸化后直接蒸馏的方法、形成丙交酯后进行蒸馏的方法、加入醇和催化剂进行酯化后进行蒸馏的方法、在有机溶剂中提取的方法、利用离子交换柱分离的方法、利用电透析浓缩分离的方法等或将上述方法组合的方法。另外，利用本发明的方法生产的菌体由于能产生适合生产乳酸的酶组，所以利用该酶组进一步生产、回收乳酸，也被认为是从培养物中回收乳酸的方法的一部分。

使用本发明的生产乳酸的方法由于能生产光学纯度高的乳酸，所以如果回收培养物中含有的乳酸，则可以得到高纯度的D-乳酸或L-乳酸。

培养本发明中得到的微生物生产乳酸时，可以完全不进行通气，但为了得到较优选结果，进行通气较好。此处所谓的通气条件下，未必是必须将空气通过培养液中，也包括根据培养槽的形状一边适度地搅拌培养液一边将培养液上的空气层进行换气之类的上面通气，所谓的通气条件下是指使含有氧的气体流入培养槽的内部。通气到液中时，由于根据内压、搅拌桨位置、搅拌桨形状、搅拌速度的组合使得溶存的氧浓度发生变化，所以可以以乳酸的生产率及除乳酸之外的有机酸的量等为指标如下求出最适条件。

例如，使用500g的培养液利用ABLE公司制培养装置BMJ-01等较小型的培养槽进行培养时，通过能够达到使空气在常压下0.01vvm～1vvm的通气率和50rpm～500rpm的搅拌速度、较优选能够达到在常压下0.1vvm～0.5vvm的通气率和100rpm～400rpm的搅拌速度的通气条件可以得到合适结果。所述条件如下：使通气搅拌条件为以温度30℃的水为对象时常压下氧转移速度系数kLa为1/h以上400/h以下的条件下可达到的氧供给成为可能。

另外，作为最适通气条件的其他指标，是由使pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株在厌氧培养下生产的甲酸、乙酸、丁二酸或乙醇或它们的组合的总量在5.0g/L以下、更优选在1.0g/L以下并且能够生产乳酸的通气量、搅拌速度达成的通气条件。

另外，作为最适通气条件的其他指标，是在含有0.3％的作为光学异构体的L-乳酸的培养基中培养pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株时，在10～100小时之内使L-乳酸的浓度降低为0.02质量％以下的通气量、搅拌速度。

上述的通气条件不需要从培养初期到结束一直维持，即使在培养工序的一部分维持上述通气条件也能得到优选结果。通过进行如上所述的通气可以达成提高乳酸生产率、减少光学异构体。

根据本发明的生产乳酸的方法，可以以高光学纯度得到L-乳酸或D-乳酸，即使在生产原料中含有使光学纯度下降的其他光学异构体，通过分解不为目标的光学异构体，可以生产作为目标的光学异构体。

使用本发明的生产乳酸的方法，可以使用常规方法HPLC或F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)确认光学纯度。特别是使用上述F-试剂盒测定所得上清液中的L-乳酸量及D-乳酸量，通过代入下式求出的方法进行测定，可以以98％e.e.以上的光学纯度得到作为目标的L-或D-乳酸，可以优选以99.5％e.e.以上的光学纯度得到作为目标的L-或D-乳酸。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)

上式中的乳酸浓度为质量基准。

另外根据本发明的生产乳酸的方法，与使用NAD依赖性乳酸脱氢酶及非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的双方均不被增强的大肠杆菌制造D-乳酸或L-乳酸时相比，可以迅速地生产如上所述的高光学纯度的光学异构体。

[实施例]

以下用实施例详细地说明本发明。但是本发明并不限定于这些。需要说明的是，只要没有特殊说明，则“％”及“份”为质量基准。

--D-乳酸产生菌--

[实施例1]

<大肠杆菌MG1655株dld基因缺失株的制备>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，编码大肠杆菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(以下有时简记为Dld)的基因的碱基序列也被报道(Genbank accession number M10038)。

基于大肠杆菌MG1655株基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息，合成了下述4种寡核苷酸引物：CAACACCAAGCTTTCGCG(序列号1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列号2)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列号3)及TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列号4)。

根据Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)所述的方法制备大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板，使用序列号1和序列号2的引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约1.4kbp的DNA片段(以下也称作dld-L片段)，使用序列号3和序列号4的引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约1.2kbp的DNA片段(以下也称作dld-R片段)。分别利用限制酶HindIII和PstI、PstI和XbaI消化所得的dld-L片段、dld-R片段。将该片段与使用HindIII、XbaI消化温度感受性质粒pTH18cs1(Hashimoto-Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，pp 185-191(2000))所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，从而得到在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。将所得的质粒命名为pTHΔdld。

需要说明的是大肠杆菌MG1655株可以从作为细胞·微生物·基因库的美国模式菌种收集中心获得。

[实施例2]

在30℃下将实施例1中得到的质粒pTHΔdld转化到MG1655株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的转化体涂布到琼脂平板上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述培养菌体，将培养的转化体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。

进而再一次重复得到于42℃下繁殖的单菌落的操作，通过相同重组选择质粒整体被组装到染色体中的克隆体。确认了该克隆体的细胞质中不具有质粒。

然后将上述克隆体涂布在LB琼脂平板上，于30℃下培养一夜后，接种到LB液体培养基(3ml/试管)中，于42℃下振摇培养3～4小时。为得到单菌落，对其进行适当稀释(10^-2～10^-6左右)，涂布在LB琼脂平板上，于42℃培养一夜，得到菌落。在出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在LB琼脂平板上和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，选出只在LB琼脂平板上繁殖的氯霉素感受性克隆体。然后使用上述目标克隆体的染色体DNA利用PCR扩增含有dld的约2.0kb的片段，选择dld基因区域缺失的株，以满足上述条件的克隆体作为dld缺失株，并将所得的株命名为MG1655Δdld株。

[实施例3]

<大肠杆菌MG1655pfl、dld基因缺失株的制备>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，编码大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶(以下也称作Pfl)的基因的碱基序列也被报道(Genbank accession number AE000192)。为了克隆编码Pfl基因的碱基序列的附近区域，合成了下述4种寡核苷酸引物：GCACGAAAGCTTTGATTACG(序列号5)、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(序列号6)TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(序列号7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(序列号8)。

以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号5和序列号6的引物，在通常条件进行PCR，由此扩增约1.8kbp的DNA片段(以下也称作pflB-L片段)，另外，使用序列号7和序列号8的引物，在通常条件进行PCR，由此扩增约1.3kbp的DNA片段(以下也称作pflB-R片段)。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用HindIII及SphI消化pflB-L片段、用SphI及PstI消化pflB-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段和温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession numberAB019610)的HindIII及PstI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含编码PflB的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，命名为pTHΔpfl。

将所得的质粒pTHΔpfl转化到实施例2中所得的MG1655Δdld株中，得到于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的转化体涂布在琼脂平板上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述培养菌体，将培养的转化体涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。

按照与实施例2相同的方法从所得的克隆体中得到pfl基因被破坏的MG1655Δdld株，命名为MG1655ΔpflΔdld株。

[实施例4]

<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdh株的制备>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，大肠杆菌的mdh基因的碱基序列也被报道(Genbank accession number AE000403)。为了克隆编码Mdh的基因(939bp)的碱基序列的附近区域，合成了下述4种寡核苷酸引物：AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(序列号9)、AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(序列号10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG(序列号11)及AAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(序列号12)。

以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用序列号9和序列号10、序列号11和序列号12的组合，在通常条件进行PCR，由此分别扩增约800bp(以下也称作mdh-L片段)的DNA片段、和约1,000bp(以下也称作mdh-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用KpnI及BamHI消化mdh-L片段，用BamHI及XbaI消化mdh-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)的KpnI及XbaI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含编码mdh的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔmdh。

将质粒pTHΔmdh转化到实施例3中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdld株中，按照与实施例2相同的方法获得mdh基因被破坏的MG1655ΔpflΔdld株。将该株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdh株。

[实施例5]

<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株的制备>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，大肠杆菌的aspA基因的碱基序列也被报道(Genbank accession number AE000486)。为了克隆编码AspA的基因(1,482bp)的碱基序列的附近区域，合成了下述4种寡核苷酸引物：TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(序列号13)、CGAACAGTAATCGTACAGGG(序列号14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG(序列号15)及TTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(序列号16)。

以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用序列号13和序列号14、序列号15和序列号16的组合，使用上述引物在通常条件进行PCR，由此扩增约910bp(以下也称作aspA-L片段)的DNA片段、和约1,100bp(以下也称作aspA-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收该DNA片段，利用DNA Blunting Kit(Takara Bio)将aspA-L片段和aspA-R片段的两者的末端平端化后，使用T4多核苷酸激酶，按照常规方法磷酸化5’末端。另外，温度感受性质粒pTH18cs1经SmaI消化后，利用碱性磷酸酶进行脱磷酸化处理。利用T4DNA连接酶使上述磷酸化的2种片段与脱磷酸化的质粒反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含编码AspA的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔasp。

将质粒pTHΔasp转化到实施例4中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdh株中，最终得到aspA基因被破坏的MG1655ΔpflΔdldΔmdh株，命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株。得到该株的详细的方法基于本发明的实施例2中所述的方法。

[实施例6]

<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株的基因组上ldhA启动子对GAPDH启动子的取代>

大肠杆菌的ldhA基因的碱基序列被全部报道(GenBank accession number U36928)。为了获得甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列号17)及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号18)用PCR法进行扩增，利用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段，由此得到约100bp的编码GAPDH启动子的片段。进而为了获得D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(序列号19)、及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列号20)用PCR法进行扩增，利用限制酶EcoRI及HindIII消化所得的DNA片段，由此得到约1.0kbp的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)片段。将上述2个DNA片段与利用限制酶EcoRI及HindIII消化质粒pUC18所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体回收质粒pGAP-ldhA。

进而使用基于大肠杆菌MG1655株的ldhA基因5’附近区域的基因信息制备的、AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列号21)和GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列号22)，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR，由此扩增约1000bp的DNA片段。

另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子的序列信息制备的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列号23)和基于大肠杆菌MG1655株的ldhA基因的序列信息制备的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列号24)，以预先制备的质粒pGAPldhA为模板进行PCR，得到由GAPDH启动子和ldhA基因的起始密码子的附近区域组成的约850bp的DNA片段。

分别利用限制酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI消化如上所述得到的片段。将所得的片段与利用KpnI和PstI消化温度感受性质粒pTH18cs1所得的片段进行混合，使用连接酶连接，然后，于30℃下转化到DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒，命名为pTH-GAPldhA。

将所得的质粒pTH-GAPldhA转化到实施例5中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株中，于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养一夜，得到转化体。将所得的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述培养菌体，将培养的转化体涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。将所得的菌落于30℃下在不含氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，进而涂布在不含氯霉素的LB琼脂平板上得到42℃下繁殖的菌落。

在出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在不含氯霉素的LB琼脂平板上和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，挑选氯霉素感受性克隆体。然后使用上述目标克隆体的染色体DNA利用PCR扩增含有GAPDH启动子和ldhA基因的约800bp的片段，选择ldhA启动子区域被GAPDH启动子取代的株，将满足以上条件的克隆体命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。

<lldR破坏株的制备>

利用以下方法制备破坏lldR基因的质粒。

大肠杆菌的lldR基因的碱基序列全部被报道(GenBank accession number U000963777077～3777853)。

为了克隆编码lldR的基因的碱基序列的附近区域，使用GGGAATTCGACATCATTCGCTCGTCTATTCTTTCGATA(序列号25)、GGGTACCTTAAGGAATCATCCACGTTAAGACAT(序列号26)，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR，由此扩增lldR上游的DNA片段，并利用限制酶EcoRI、KpnI切断。然后，以ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列号27)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列号28)为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR，由此扩增lldR下游的DNA片段，并利用限制酶KpnI、SalI切断。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)的EcoRI及SalI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含编码LldD的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔlldR。

将所得的质粒转化到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株中，于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养一夜，得到转化体。将所得的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述培养菌体，将培养的转化体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，于42℃下得到繁殖的菌落。将所得的菌落于30℃在不含有氯霉素的LB液体培养基上培养一夜，然后涂布在不含氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。

在出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在不含氯霉素的LB琼脂平板上和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，挑选氯霉素感受性克隆体。然后使用上述目标克隆体的染色体DNA利用PCR扩增lldR周边，选择lldR区域缺陷的株，将满足以上条件的克隆体命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA基因组插入株。

[实施例7]

<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株的制备>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，大肠杆菌MG1655的fruR基因的碱基序列已经被报道。即，fruR基因被记载在GenBank accession number U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的88028～89032。

为了克隆编码fruR的基因(1005bp)的碱基序列的附近区域，合成了4种如下所示的寡核苷酸引物：TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG(序列号29)、GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG(序列号30)、TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC(序列号31)及CGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG(序列号32)。

以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用序列号29和序列号30、序列号31和序列号32的组合，使用上述引物，在通常条件进行PCR，由此扩增约950bp(以下也称作fruR-L片段)、及约880bp(以下也称作fruR-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收该DNA片段，用PstI及XbaI消化fruR-L片段，用XbaI及EcoRI消化fruR-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18cs1(GenBan kaccession number AB019610)的PstI及EcoRI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)，得到包括编码FruR的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔfruR。

将质粒pTHΔfruR转化到实施例6中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株中，按照与实施例2相同的方法获得fruR基因被破坏的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。将该株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株。

[实施例8]

<来自大肠杆菌O157的蔗糖水解酶(转化酶)基因的表达载体及该表达载体转化体的构建>

大肠杆菌O157的转化酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码转化酶的基因(cscA)被记载在GenBank accession number AE005174中记载的大肠杆菌O157株基因组序列的3274383～3275816中。作为使上述基因表达所必需的启动子的碱基序列，可以使用在GenBank accession numberX02662的碱基序列信息中记载于397-440的来自大肠杆菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下也称作GAPDH)的启动子序列。

使用用于获得GAPDH启动子的大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号33)、及TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号34)用PCR法进行扩增，利用限制酶NdeI消化所得的DNA片段得到约110bp相当于GAPDH启动子的DNA片段。将所得的DNA片段与利用限制酶NdeI及PvuII消化质粒pBR322(GenBank accession numberJ01749)所得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pBRgapP。

为了获得转化酶基因，使用大肠杆菌O157的基因组DNA(SIGMA-ALDRICH：IRMM449)为模板，利用GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(序列号35)、及ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列号36)用PCR法进行扩增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到约1.4kbp的转化酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶XbaI及PshAI消化预先制成的质粒pBRgapP所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA。

将该质粒pGAP-cscA转化到实施例7中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株。

另外转化到实施例6中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，于37℃在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板下培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株。

[实施例9]

<lox基因的分离>

以日本特开平10-248574中公开的L-乳酸氧化酶的碱基序列为基础，设计、合成2种如下所示的寡核苷酸引物：ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTACAAATG(序列号37)、CAGGTACCTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA(序列号38)。序列号37的引物在5’末端侧具有XbaI识别位点和ldhA的SD序列。序列号38的引物在5’末端具有KpnI识别位点。从Enterococcus sp.ATCC9625(日本特开平10-248574中被记为Lactococcuslactis(subsp.CremorisIFO3427))中分离染色体DNA，将其作为模板进行PCR，分离被扩增的DNA片段。纯化被扩增的DNA片段，用XbaI消化。将被消化的片段与利用限制酶XbaI及PshAI消化实施例8中所得的pBRgapP得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-lox。

通过DNA序列确定分离的lox基因的碱基序列。

[实施例10]

<lldD的分离>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的，编码大肠杆菌的FMN依赖性L-乳酸脱氢酶的基因(lldD)的碱基序列也被报道。(Genbank accession number U00096、3777850～3779040)。为了克隆lldD，设计、合成了如下所示的2种寡核苷酸引物ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列号39)、GATGGTACCCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列号40)。

利用通常方法分离大肠杆菌K12株的基因组DNA，以所得的DNA为模板进行PCR。纯化被扩增的DNA片段，用XbaI消化。混合利用限制酶XbaI及PshAI消化实施例8中所得的pBRgapP得到的片段，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-lldD。通过DNA序列确定分离的lldD的碱基序列。

<突变lldD的制备>

为了制备突变lldD，使用上述使用的序列号39、序列号40表示的寡核苷酸引物以pGAP-lldD为模板按照GeneMorph(注册商标)II Random Mutagenesis Kit(Stratagene)的流程利用PCR制备lldD的突变基因。纯化所扩增的DNA片段，利用XbaI进行消化。混合利用限制酶XbaI及PshAI消化实施例8中所得的pBRgapP得到的片段，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落植入到添加有300μL培养基的容积为1孔2ml的96孔深孔平板上(1％葡萄糖，1.2％胨，2％酵母提取物、(pH7.5))上，于33度下搅拌24小时进行培养。培养结束后，收集细菌细胞，除去上清液后，加入200μl溶菌酶液(0.285mg/ml溶酶菌、1.5U/mlDNaseI、2mM MgCl₂)，通过移液混合35次。在35℃下温育15分钟后，再一次进行35次的移液混合，通过目视确认已溶菌后，取出10μl添加到190μl的反应液(20mg/ml phenazine methosulfate、3mg/ml 3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide0.5MKPB(pH7.0))中。然后添加40μl的100mM L-乳酸钠(pH7.0)，观察570nm的吸光度的增加速度。

从与对照相比显示出1.5倍以上的增加速度的菌落中提取质粒，通过DNA序列确定分离的突变lldD的碱基序列。序列示于序列号41。将所得的质粒作为pGAP-突变lldD。

<Lox，LldD同时增强质粒的构建>

利用限制酶SalI切断将以pGAP-突变lldD为模板、以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列号42)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列号28)为引物、利用PCR得到的lldD片段，将纯化的片段与利用限制酶SalI切断pGAP-lox所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。由所得的转化体得到质粒pGAP-lox-突变lldD。突变lldD的插入方向通过序列确认。

[实施例11]

<lctO的分离>

编码Lactococcus lactis IL1403的L-乳酸氧化酶的基因的碱基序列被公开(Genbank accession number AE006357、4813～3662)。以该碱基序列信息为基础，为了从L.lactissubsp.lactisATCC19435中分离L-乳酸氧化酶基因，设计、合成了2种如下所示的寡核苷酸引物：AATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA(序列号43)、ACAGGTACCTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT(序列号44)。序列号43的引物在5’末端侧具有XbaI识别位点和ldh的SD序列。序列号44的引物在5’末端具有KpnI识别位点。

分离L.lactissubsp.lactisATCC19435的基因组DNA，将其作为模板，使用序列号43、44所示的寡核苷酸引物，在通常条件下进行PCR。纯化被扩增的DNA片段，用XbaI进行消化。混合利用限制酶XbaI及PshAI消化实施例8中所得的pBRgapP得到的片段，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中得到含有lctO的质粒，命名为pGAP-lctO。

通过DNA序列确定分离的lctO的碱基序列。

[实施例12]

<用于生产乳酸的质粒的构建>

利用限制酶KpnI、SalI切断实施例8中所得的pGAP-cscA，得到纯化的片段。利用限制酶KpnI，SalI分别切断以ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTACAAATG(序列号45)、CAGTCGACTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA(序列号46)为引物与实施例9同样地进行PCR得到的lox片段、以ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列号27)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列号28)为引物与实施例10同样地进行PCR得到的lldD片段、及以AATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA(序列号47)、ACAGTCGACTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT(序列号48)为引物与实施例11同样地进行PCR得到的lctO片段，在各自片段中混合上述得到的pGAP-cscA片段，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。由所得的转化体得到pGAP-cscA-lox，pGAP-cscA-lldD，pGAP-cscA-lctO。进而利用限制酶SalI切断以大肠杆菌的基因组DNA为模板以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列号42)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列号28)为引物通过PCR得到的lldD片段，将纯化的片段与利用限制酶切断SalI pGAP-cscA-lox得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。由所得的转化体得到质粒pGAP-cscA-lox-lldD。插入方向通过序列确认。进而利用限制酶SalI切断以大肠杆菌的基因组DNA为模板、以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG(序列号42)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列号28)为引物通过PCR得到的lldD片段，将纯化的片段与利用限制酶SalI切断pGAP-cscA-lctO得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。由所得的转化体得到质粒pGAP-cscA-lctO-lldD。将上述质粒转化到实施例7中得到的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株中，得到pGAP-cscA-lox/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株、pGAP-cscA-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株、pGAP-cscA-lctO/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株、pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株、pGAP-cscA-lctO-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株。

[实施例13]

<LldD增强的效果>

将质粒pBRgapP、及pGAP-lldD转化到实施例6中制备的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株中，制备pBRgapP/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株及pGAP-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。

作为预培养，是在500ml容积的带挡板的锥形瓶中加入100ml含有50μg/ml浓度的氨苄青霉素的LB培养基(Difcocat.244620)，分别植入上述D-乳酸产生菌，于35℃下、以120rpm搅拌培养一夜后，分别将0.5％植入到装有500mL培养基(12％葡萄糖、3％玉米浆：日本食品化工制Lot(190718C)以下相同)的1L容积培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)中。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为35℃、pH7.2下进行48小时的培养。利用HPLC按照常规方法测定所得的培养液中的乳酸。另外所得的乳酸的光学纯度如下求出：使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)测定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)

结果示于表1。如表1所示，判明了通过增强lldD能够提高所得的乳酸的光学纯度。

[表1]

<突变lldD产生的LldD增强效果>

将实施例10中得到的pGAP-突变lldD转化到实施例6中制备的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株中，制备pGAP-突变lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。作为预培养，是在500ml容积的带挡板的锥形瓶中放入100ml含有50μg/ml浓度的氨苄青霉素的LB培养基(Difcocat.244620)，分别植入上述D-乳酸产生菌，于35℃下、以120rpm搅拌培养一夜后，分别将0.5％植入到装有500mL培养基(12％葡萄糖、5％玉米浆)的1L容积培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)中。在大气压下、通气量0.5vvm、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.5下进行30小时的培养。利用HPLC按照常规方法测定所得的培养液中的乳酸。另外所得的乳酸的光学纯度如下求出：使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)，测定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)。

为了进行比较，同样地对上述制备的突变导入前的pGAP-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株进行培养。

结果示于表2。如表2所示，判明了与突变导入前的lldD相比，使用突变体lldD所得的乳酸的光学纯度提高。

[表2]

<lldR破坏的效果>

将实施例10中得到的pGAP-lldD转化到实施例6中得到的lldR破坏株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA基因组插入株中，作为所得的菌落的预培养，在500ml容积的带挡板的锥形瓶中放入100ml含有50μg/ml浓度的氨苄青霉素的培养基(Difcocat.244620)，植入上述D-乳酸产生菌。于35℃下、以120rpm搅拌培养一夜后，分别将0.5％植入到装有500mL培养基(12％葡萄糖、5％玉米浆)的1L容积培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)中。在大气压下、通气量0.5vvm、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.5下进行30小时的培养。利用HPLC按照常规方法测定所得的培养液中的乳酸浓度。另外所得的乳酸的光学纯度如下求出：使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)，测定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)。

为了进行比较，同样地对不破坏lldR的pGAP-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株进行培养。

结果示于表3。如表3所示，判明了与lldR破坏前相比，lldR破坏时，所得的乳酸的光学纯度提高。

[表3]

<Lox增强的效果>

将实施例9中得到的pGAP-lox及实施例10中得到的pGAP-lox-突变lldD转化到实施例6中得到的lldR破坏株，MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA基因组插入株中，作为所得的菌落的预培养，是在500ml容积的带挡板的锥形瓶中装入100ml含有50μg/ml浓度的氨苄青霉素的LB培养基(Difcocat.244620)，分别植入上述D-乳酸产生菌。于35℃下、以120rpm搅拌培养一夜后，分别将0.5％植入到装有500mL培养基(12％葡萄糖、5％玉米浆)的1L容积培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)中。在大气压下、通气量0.5vvm、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.4下进行24小时的培养。利用HPLC按照常规方法测定所得的培养液中的乳酸浓度。另外所得的乳酸的光学纯度如下求出：使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)，测定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)。

为了进行比较，同样地对上述所得的作为突变lldD增强株的pGAP-突变lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔlldR/GAPldhA基因组插入株进行培养。结果示于表4。如表4所示，判明了Lox的增强与突变lldD基因的增强相比进一步提高了光学纯度。判明了Lox与突变lldD的同时增强具有进一步使所得的乳酸的光学纯度提高的效果。

[表4]

<由糖蜜进行的D-乳酸的生产>

作为实施例12中得到的pGAP-cscA-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株、pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株的预培养，是将其分别植入到装有20ml如表5所示的预培养培养基的100ml容积的带挡板的锥形瓶中，于35℃、以120rpm搅拌培养一夜。分别将0.5％植入到装有500mL如表6所示的培养基的1L容积培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)。在大气压下、通气量0.5vvm、搅拌速度350rpm、培养温度35℃、pH7.5下进行48小时的培养。利用HPLC按照常规方法测定所得的培养液中的乳酸浓度。另外所得的乳酸的光学纯度如下求出：使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)，测定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)。

[表5]

预培养培养基组成

糖蜜(非食品用)(大日本明治制糖株式会社制)	2％
		玉米浆(日本食品化工制)	10％
水	余量

高压灭菌后pH7.8(用24％NaOH调节)

[表6]

培养基组成

糖蜜(非食品用)(大日本明治制糖株式会社制)

20％

玉米浆(日本食品化工制)	5％
		水	余量

高压灭菌后pH7.5(用24％NaOH调节)

作为比较，对将实施例8中得到的pGAP-cscA重组到实施例7中得到的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株中得到的pGAP-cscA/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株同样地进行培养。

结果示于表7。如表7所示，判明了以糖蜜作为原料时通过LldD、Lox的增强也能提高所得乳酸的光学纯度。

[表7]

<LctO增强的效果>

作为预培养，将实施例12中得到pGAP-cscA-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株及pGAP-cscA-lctO-lldD/MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株分别植入加入了10g碳酸钙(化学纯1级)、预先进行了杀菌、并装有20ml如表8所示的培养基的100ml容积的带挡板的锥形瓶中，于35℃下、以120rpm进行搅拌培养一夜。然后，将1ml预培养液加入加入了10g碳酸钙(化学纯1级)、预先进行了灭菌、并装有20ml如表8所示的培养基的100ml容积的带挡板的锥形瓶中，于35℃、以100rpm进行24小时的搅拌培养。

[表8]

培养基组成

糖蜜(非食品用)(大日本明治制糖株式会社制)	20％
		玉米浆(日本食品化工制)	5％
水	余量

高压釜后，pH8.0(用24％NaOH调节)

培养结束时，利用HPLC按照常规方法测定所得的培养液中的乳酸。另外所得的乳酸的光学纯度如下求出：使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)测定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)

结果示于表9。如表9所示，确认了通过增强lctO，提高了所得的乳酸的光学纯度。

[表9]

--L-乳酸产生菌--

[实施例14]

<来自双歧杆菌的ldh2基因表达载体及该表达载体转化体MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株的构建>

长双歧杆菌(Bifidobacterium·longum)的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的基因(ldh2)被记载在GenBank accession number M33585中记载的双歧杆菌基因组序列的555～1517中。

作为用于使上述基因表达所必需的启动子的碱基序列，可以使用GenBank accession number X02662的碱基序列信息中记于397-440中的来自大肠杆菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下也称作GAPDH)的启动子序列。

为了获得NAD依赖性L-乳酸脱氢酶基因，使用长双歧杆菌(ATCC15707)为模板，利用AATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(序列号49)、及CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(序列号50)用PCR法进行扩增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到约1.0kbp的L-乳酸脱氢酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶XbaI消化预先制成的质粒pBRgapP所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-ldh2。

将上述质粒pGAP-ldh2转化到使用实施例3中制成的pTHΔpfl、用与实施例2同样地方法使pfl基因缺失的MG1655株(称作MG1655Δpfl株)的感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株。

[实施例15]

<利用MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株生产L-乳酸>

与实施例13相同地研究利用MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株由葡萄糖生产L-乳酸。

在装有475g以下表10所述的培养基的培养槽中，使用与实施例13相同的方法植入25ml预培养的烧瓶内容物。

[表10]

培养基组成

葡萄糖	12％
		酵母提取物(Difco公司制)	3％
水	余量

在大气压下、通气量0.25L/min、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.5(用24％NaOH调节)下进行18小时的培养。

18小时培养后的培养液中的L-乳酸浓度为97.02g/L。

由上述结果确认了使用来自双歧杆菌的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶可以由葡萄糖生产L-乳酸。

[实施例16]

<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株的构建>

将实施例14中制成的pGAP-ldh2质粒导入到实施例6中构建的D-乳酸生产株中制成转化体。具体而言如下进行。

将质粒pGAP-ldh2转化到实施例6中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株的感受态细胞中。于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株。

[实施例17]

<利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株生产L-乳酸>

与实施例13同样地研究利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株由葡萄糖生产L-乳酸。

培养18小时后的培养液中的L-乳酸浓度为116.84g/L。

由上述结果确认了通过将质粒pGAP-ldh2组装到D-乳酸产生大肠杆菌菌株中，可以以葡萄糖为原料生产L-乳酸。可以通过使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)、测定L-乳酸量及D-乳酸量来确认L-乳酸的生产。

[实施例18]

<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株的构建>

将实施例15中使用的D-乳酸生产用大肠杆菌菌株(MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株)的ldhA基因置换为ldh2基因，并且对催化L-乳酸分解的酶的基因lldD进行破坏，由此构建L-乳酸生产用大肠杆菌菌株。具体而言，如下进行。

(ldhA基因破坏株的制成)

基于MG1655基因组DNA的ldhA基因附近区域的基因信息，合成4种如下所述的寡核苷酸引物：AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列号21)、GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列号22)、GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC(序列号51)及AACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC(序列号52)。使用上述引物、用与实施例1相同的方法构建基因破坏用质粒pTHΔldhA。进而，将pTHΔldhA转化到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，使用与实施例2相同的方法挑选ldhA缺失株。将所得的株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入ΔldhA株。

(dld基因回复突变株的制成)

基于大肠杆菌MG1655基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息，合成下述2种寡核苷酸引物：CAACACCAAGCTTTCGCG(序列号1)、TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列号4)。使用上述引物、以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板进行PCR，利用限制酶HindIII、XbaI切断所得的DNA片段。进而利用限制酶HindIII、XbaI切断质粒pTH18cs1，与上述dld片段混合后，用连接酶连接，构建质粒pTHDLD。进而，将pTHDLD转化到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，使用与实施例2相同的方法挑选dld回复突变株。将所得的株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入ΔldhA株。

(lldD基因破坏株的制成)

基于MG1655株基因组DNA的lldD基因附近区域的基因信息，合成了下述4种寡核苷酸引物：GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT(序列号53)、AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG(序列号54)、GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG(序列号55)及CGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG(序列号56)。使用上述引物，利用与实施例1相同的方法构建基因破坏用质粒pTHΔlldD。进而，将pTHΔlldD转化到MG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入ΔldhA株感受态细胞中，使用与实施例2相同的方法挑选lldD缺失株。将所得的株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhA基因组插入ΔldhA株。

(ldh2基因基因组插入株的制成)

长双歧杆菌的NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码NAD依赖性L-乳酸脱氢酶的基因(ldh2)被记载在GenBank accession numberM33585中所记载的双歧杆菌基因组序列的555～1517。

为了获得编码L-乳酸脱氢酶的基因(ldh2)，使用长双歧杆菌(ATCC15707)的基因组DNA为模板，合成下述2种寡核苷酸引物AAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(序列号57)、CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(序列号50)。使用上述引物实施PCR，利用限制酶EcoRI及XbaI切断所得的DNA片段。

为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号58)、CGGAATTCCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAG(序列号59)。利用限制酶EcoRI及XbaI切断所得的DNA片段。

将利用XbaI切断实施例15中得到的pTHΔldhA所得的质粒、上述得到的来自长双歧杆菌的ldh2的EcoRI-XbaI片段、及来自大肠杆菌的GAPDH启动子的EcoRI-XbaI片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pTHΔldhA：：GAPldh2。将所得的质粒转化到MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhA基因组插入ΔldhA株中，使用与实施例2相同的方法通过利用PCR扩增ldh2选择ldh2基因组插入株。

将所得的株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株。

[实施例19]

<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株的构建>

在实施例16中构建的L-乳酸生产用大肠杆菌菌株中导入蔗糖水解酶(转化酶)基因表达载体，构建由蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌菌株。具体而言如下进行。

将实施例8中构建的质粒pGAP-cscA转化到实施例16中制成的MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株。

[实施例20]

<表达来自大肠杆菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌的构建>

基于MG1655株基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息，合成了下述2种寡核苷酸引物：CGGGTACCTTCGCCACCACAAGGAGTGGA(序列号60)、GGTCTAGAGTCGACTTACTCCACTTCCTGCCAGTT(序列号61)。使用上述引物实施PCR，利用限制酶KpnI、及SalI切断所得的DNA片段。将上述片段与利用KpnI、SalI切断实施例8中制备的pGAP-cscA得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA-dld(EC)。

[实施例21]

<表达来自谷氨酸棒杆菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌的构建>

来自谷氨酸棒杆菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列被记载在GenBank accession number BX927150中所记载的谷氨酸棒杆菌基因组序列的261009～259294。

为了获得编码FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的基因(dld)，使用谷氨酸棒杆菌(NBRC12168)的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：GCGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGACGCAACCAGGACAG(序列号62)、TGGGTACCTTAGGCCCAGTCCTTGTGCGGCGACGTGC(序列号63)。谷氨酸棒杆菌(NBRC12168)可以从NITE生物资源中心获得。使用上述引物实施PCR，利用限制酶KpnI切断所得的DNA片段。将上述片段与利用KpnI切断实施例8中制备的pGAP-cscA所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA-dld(CG)。

[实施例22]

<表达来自运动发酵单胞菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌的构建>

来自运动发酵单胞菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列被记载在GenBank accession number AE008692中所记载的运动发酵单胞菌基因组序列的256658～258382。

为了获得编码FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的基因(dld)，使用运动发酵单胞菌(ATCC31821)的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：GCGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGTGCAGCTTCCTTC(序列号64)、GTGGTACCCTATCTCCAATAAGCGGCCTTGCTGGTATG(序列号65)，实施PCR。利用限制酶KpnI切断所得的DNA片段。将上述片段与利用KpnI切断实施例8中制备的pGAP-cscA所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA-dld(ZM)。

[实施例23]

<表达来自野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶大肠杆菌的构建>

来自野油菜黄单胞菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列被记载在GenBank accession number AE012169中所记载的野油菜黄单胞菌基因组序列的10284～8890。

为了获得编码FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的基因(dld)，使用野油菜黄单胞菌(ATCC33913)的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：AACCCGGGCGGAGAAAGTCTTATGACTGATGGACTTCCCACCGC(序列号66)、ATCCCGGGTCACTCTGCGGGCGATGTGGGCAGCACCTTGCCCGGATTC(序列号67)，实施PCR。利用限制酶SmaI切断所得的DNA片段。将上述片段与利用KpnI切断实施例8中制备的pGAP-cscA、并使用DNA Blunting Kit(TAKARACat.6025)将限制酶切断部位平端化得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA-dld(XC)。

[实施例24]

<表达来自水稻黄单胞菌(xanthomonas oryzae)的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌的构建>

来自水稻黄单胞菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列被记载在GenBank accession number AE013598中所记载的水稻黄单胞菌基因组序列的4098235～4099662。

为了获得编码FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的基因(dld)，使用水稻黄单胞菌(JCM20241)的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：TTGGTACCGGAGAAAGTCTTATGACCGATGTACTTCCCACCGCAC(序列号68)、TTGGTACCTAGGCGGGCGGCAACACCTTGCCAGGATTCAAGATCCCA(序列号69)，实施PCR。利用限制酶KpnI切断所得的DNA片段。将该片段与利用KpnI切断实施例8中制备的pGAP-cscA所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA-dld(XO)。

JCM20241可以从日本微生物保藏中心获得。

[实施例25]

<由表达具有/不具有D-乳酸脱氢酶的膜结构域的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌生产的L-乳酸的光学纯度>

将以下的各质粒转化到实施例18中构建的MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔfruRΔldhA/GAPldh2基因组插入株中，制备表达来源不同的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌。

(A)：实施例8中得到的pGAP-cscA

(B)：实施例20中得到的pGAP-cscA-dld(EC)

(C)：实施例21中得到的pGAP-cscA-dld(CG)

(D)：实施例22中得到的pGAP-cscA-dld(ZM)

(E)：实施例23中得到的pGAP-cscA-dld(XC)

(F)：实施例24中得到的pGAP-cscA-dld(XO)

作为预培养，在装有20ml如表11所示的预培养培养基的100ml容积带挡板的锥形瓶中植入各种FAD依赖性D-乳酸脱氢酶表达株，于35℃下以120rpm进行一夜的搅拌培养。然后，将1ml预培养液加入到装有10g碳酸钙(化学纯1级)、预先进行了杀菌、并装有20ml如表12所示的培养基的100ml容积的带挡板的锥形瓶中，于35℃下、以100rpm进行24小时的搅拌培养。

[表11]

预培养培养基组成

高压灭菌后pH7.8(用24％NaOH调节)

[表12]

高压灭菌后pH8.0(用24％NaOH调节)

培养结束后，通过离心分离得到上清液。光学纯度通过使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)、测定所得的上清液中的L-乳酸量及D-乳酸量并带入下式中求出。

光学纯度(％e.e.)

＝100×(L乳酸浓度-D乳酸浓度)/(L乳酸浓度+D乳酸浓度)。

结果示于表13。如表13所示，表达具有Lact-deh-memb结构域的、来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、运动发酵单胞菌的dld的大肠杆菌在短时间内达成了特别高的光学纯度。

[表13]

2008年9月16日申请的日本国申请号第2008-237177号、2009年2月13日申请的日本国申请号第2009-32042号及2009年2月13日申请的日本国申请号第2009-32043号公开的全部内容通过参照被引入本说明书中。

本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准通过参照被引入本说明书中，每个文献、专利申请及技术标准通过参照被引入的情况与具体且单独记载的情况为相同程度。

Claims

1.一种生产乳酸的大肠杆菌，所述大肠杆菌的1种以上的NAD依赖性乳酸脱氢酶及1种以上的非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的各酶活性均被增强，从而分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生产另一方。

2.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强使丙酮酸生成D-乳酸和L-乳酸中的任一方，并且，所述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强使所述D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方作为基质进行分解。

3.如权利要求2所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强是LdhA的活性增强，能够生产所述D-乳酸。

4.如权利要求3所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强是LldD的活性增强、L-乳酸氧化酶的活性增强、LldR的失活或活性降低、或它们中的一种以上的组合，能够生产所述D-乳酸。

5.如权利要求4所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述L-乳酸氧化酶是Lox及LctO中的至少一方。

6.如权利要求4所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶的活性增强是通过在编码LldD的基因的ORF中的33位上具有沉默突变的突变体lldD基因产生的。

7.如权利要求6所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述突变体LldD是以序列号41的碱基序列表示的。

8.如权利要求3所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，选自由Dld活性及Pfl活性组成的组中的至少一种活性失活或活性降低。

9.如权利要求2所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述NAD依赖性乳酸脱氢酶的活性增强是NAD依赖性L-乳酸脱氢酶活性的增强，能够生产所述L-乳酸。

10.如权利要求9所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述非NAD依赖性乳酸氧化还原酶活性增强是Dld的活性增强，能够生产所述L-乳酸。

11.如权利要求9所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中所述L-乳酸脱氢酶来自双歧杆菌属菌。

12.如权利要求10所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述Dld具有Lact deh memb结构域。

13.如权利要求10所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述Dld来自选自由大肠杆菌、发酵单胞菌及棒状菌组成的组中的至少一种。

14.如权利要求9所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，LdhA活性、LldD活性及Pfl活性中的至少一种失活或活性降低。

15.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，选自由Mdh及AspA活性组成的组中的至少一种活性失活或活性降低。

16.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，选自由蔗糖非PTS基因组及FruK组成的组中的至少一种被增强。

17.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，FruR活性失活或降低。

18.一种生产乳酸的方法，使用权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌生产乳酸。

19.一种生产D-乳酸的方法，使用权利要求3所述的生产乳酸的大肠杆菌生产D-乳酸。

20.一种生产L-乳酸的方法，使用权利要求9所述的生产乳酸的大肠杆菌生产L-乳酸。