CN111621426A - 一株高产高光学纯度l-乳酸的米根霉变种nc-6及其应用 - Google Patents

一株高产高光学纯度l-乳酸的米根霉变种nc-6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产高光学纯度L‑乳酸的米根霉变种NC‑6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年4月20日，分类命名为米根霉Rhizopus oryzae，保藏编号为CGMCC NO.19620。本发明高产高光学纯度L‑乳酸高产菌株具体为米根霉菌株经形态学、ITS rDNA序列分析、全基因组重测序分析和蛋白编码基因actin、EF‑1α(translation elongation factor 1‑alpha)和RPB2(the largest subunit of the RNA polymerase II)序列相似性Blast比对分析鉴定为米根霉新变种。摇瓶发酵培养该菌株，发现其产L‑乳酸的量达到78.00g/L，糖转化率达到73.58％，光学纯度为100％；后经200L发酵罐放大培养，其产L‑乳酸量达到86.07g/L，糖酸转化率为83.21％，光学纯度为100％，且产率稳定。该菌株具有广阔工业应用前景。

Description

一株高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种微生物变种及其应用，具体涉及高 产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6及其应用。
背景技术
1780年瑞典科学家首次发现了乳酸，乳酸又名α-羟基丙酸(或2-羟基丙 酸)。由于其分子结构的不对称性，乳酸是自然界中存在最小的手性分子。根 据其旋光性可以将乳酸分为左旋型D-乳酸、右旋型L-乳酸和外消旋型DL-乳 酸。乳酸不仅是生物界广泛存在的一种代谢产物，更是一种重要的医药化学 中间体，可以应用于制备乳酸烷基酯、丙二醇、环氧丙烷、丙烯酸以及聚乳 酸等化学品或生物材料。由于具有原料易得、价格低廉和绿色环保等优势， 乳酸产品已经广泛应用在食品、医药、化妆品和化工等领域，且需求量逐年 上升。
乳酸(lactic acid，LA)是世界三大有机酸(乳酸、乙酸和柠檬酸)之一，且已 被美国食品和药品管理局认定为“公认安全物质(GRAS)”。近年来，随着人们 环保意识的不断提升，以聚乳酸为代表的生物可降解塑料的需求急剧增加， 而高光学纯乳酸单体是合成聚乳酸的前体物质。乳酸是一种重要的可降解、 无污染的化工原料，其在医药、食品、石油化工等领域有着广泛的用途，具 有重要的经济价值。因此便捷、高效的乳酸合成或制备方法成为当前的重要 研究方向，同时技术上的突破也具有较广阔的实用价值和前景。
具有良好生物相容性和生物可降解性的脂肪族聚酯材料在医药、医疗、 食品包装、农用地膜和组织工程等领域得到了广泛地应用。目前研究涉及较 多的脂肪族聚酯材料主要包括聚丙乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL) 和聚戊内酯(PVL)等，其中，PLA是其典型的代表。聚乳酸(PLA)是一种合成 的生物聚合物，可由玉米、甘薯和甘蔗等农作物来源制成。淀粉原料经由糖 化得到葡萄糖，再由葡萄糖及一定的菌种发酵制成高纯度的乳酸，再通过化 学合成方法制备成具有一定分子量的聚乳酸，经水解或环境因素影响可分解为二氧化碳和水，具有可再生和可降解的特点，对于可持续性发展和环境保 护意义重大。PLA具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒和可再生性， 使其具有广泛的应用性。例如，PLA表现出良好热塑性，可用它生产食品包 装材料、一次性用品(如餐具、手提袋和农用地膜等)、医疗卫生用品(组织 工程材料、透析膜、药物载体和手术缝合线)等。由于聚乳酸优良的性能和 广阔的应用前景，高性能聚乳酸的合成和对其进行功能化改性的研究工作得到了研究者的密切关注，也取得了一定的研究成果。
目前全球乳酸的产能不足且价格较高，进而导致聚乳酸的生产成本居高 不下，很难在价格上与传统的聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯材料相竞争。系统 研究乳酸生产菌株的代谢机理，进而选育出能够利用廉价原料高效生产高光 学纯度和化学纯度乳酸的生产菌种，以降低发酵法生产乳酸的成本，这对于 扩大乳酸的应用范围和聚乳酸材料的推广以及环境保护都具有非常重要的意 义。目前L-乳酸的制备较为复杂、且成本较高，L-乳酸的制备技术或方法成 为影响乳酸相关产业发展的瓶颈，因此研究或发展一种低成本、高效、便捷的L-乳酸生产或制备技术成为该领域的重大课题，探寻高产率、高光学纯度 的产L-乳酸的菌株成为极有意义及价值的研究方向。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，L-乳酸单体的光学纯度越高，制备出的聚 乳酸性能越好；L-乳酸产量越高、效率越高，其应用于工业化生产的成本越 低。而现有技术中可用于工业生产的高产高光学纯度L-乳酸的野生型微生物 菌株比较缺乏，L-乳酸单体的产量偏低且糖酸转化率低下。为了解决该技术 问题，本发明提供一种能够高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6 (Rhizopus oryzae var.NC-6)。
一种高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6，保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2020年4月20日，分类命名为米根霉Rhizopus oryzae， 保藏编号为CGMCC NO.19620。
本发明提供了一种L-乳酸单体，采用本发明的米根霉变种NC-6菌株通 过发酵而获得。
本发明还提供了一种聚乳酸制品，采用本发明的米根霉变种NC-6菌株发 酵产生的L-乳酸单体聚合制成。
本发明还涉及本发明的米根霉变种NC-6菌株在制备L-乳酸单体中的应 用。
本发明还涉及本发明的米根霉变种NC-6菌株在制备含有L-乳酸单体聚 合成的聚乳酸的制品中的应用。
所述聚乳酸制品是手术缝合线、药物控释制剂或骨折内固定材料。
所述聚乳酸制品还可以是生物塑料制品。
本发明的高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6菌株通过如下方法 分离筛选得到：取不同来源的土壤样品，加入适当无菌水，混匀，分别接入 产酸筛选培养基中，于28℃、180r/min摇瓶培养24h，取0.1mL富集后的菌 液进行梯度稀释度，取0.1mL稀释液涂布于筛选培养基平板中，稀释液孢子 的浓度以每平皿中长5～10个菌落为宜；30℃静置培养；24h后进行观察，以 后每隔12h左右进行观察，出现单菌落，挑选透明圈大的单孢菌落并镜检， 接种斜面30℃培养7～10d，置4℃冰箱保存；最终筛选分离到一株高产高光 学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6菌株，即米根霉变种NC-6(Rhizopus oryzae var.NC-6)，并与米根霉模式菌株CBS112.07和米根霉参考菌株99-892进行鉴 定区分。
利用本发明提供的米根霉变种NC-6发酵，L-乳酸产率高且稳定，并能利 用玉米淀粉等廉价绿色安全碳源，发酵碳源广，所制备的L-乳酸具有低成本、 高效率、高产率和绿色安全等优点，并且其L-乳酸光学纯度高达100％。用其 可以制备各种需要L-乳酸作为原料的聚乳酸制品，例如应用于医药方面的手 术缝合线，药物控释制剂和骨折内固定材料或者生物塑料原料或具有耐热性 的高强度SC-PLA制品。
附图说明
图1是实施例1中NC-6菌株的菌落外观形态图；
图2是实施例1中NC-6菌株的显微形态图；a.孢子囊(10×20倍)；b. 孢囊梗(10×40倍)；c.囊轴、中轴基和厚垣孢子(10×20倍)；d.分生孢子 (10×40倍)；
图3是实施例1中NC-6菌株ITS rDNAPCR扩增电泳检测图；
图4：是实施例1中NC-6菌株基于ITS rDNA与同属菌株的系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种 NC-6及其筛选方法和应用作进一步的详细说明。
本发明实施例中所应用到的仪器型号参数说明如下：
紫外灯：ZWSZ型30w高硼四通新型高效紫外线杀菌灯；
显微镜：生物显微镜CX41RF，OLYMPUS(奥林巴斯)；
培养箱：生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；
离心机：Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R，Thermo赛默飞世尔 科技有限公司；
PCR仪：Arktik多功能PCR仪，Thermo赛默飞世尔科技有限公司；
电泳仪：DYY-11核酸电泳仪，北京六一仪器厂；
生物电泳图像分析系统：FR-980A，上海复日科技有限公司；
荧光计核酸定量仪：Qubit○R2.0，Life Technologies；
高压液相色谱仪：岛津HPLC-20AD；检测器：RID示差检测器和紫外检 测器；色谱柱：TOSOh TSKgel-OApakP+Oapak A(7.8Φ×300mm)和 SUMICHIRAL OA-5000(4.6Φ×150mm)/Chirex 3126(D)-Penicillamine(替代 品)；
本发明实施例中所用到的试剂说明如下：
PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL。
产酸筛选培养基：淀粉10.0g，蛋白胨1.0g，MgSO4 0.122g，KH2PO4 1.0g， 溴甲酚绿0.2g，Polyoxyethylene(10)OctylpenylEther(Tritonx-100)1.5g，琼脂 20.0g，pH5.5，蒸馏水1000mL。
种子培养基：葡萄糖50.0g，玉米淀粉50.0g，ZnSO4.7H2O 0.04g，(NH4)2SO4 1.35g，KH2PO4 0.3g，MgSO4.7H2O 0.25g，蒸馏水1000mL。
发酵培养基：淀粉120.0g，MgSO4.7H2O 0.15g，KH2PO4 0.25g，ZnSO4.7H2O 0.04g，(NH4)2SO4 1.35g，CaCO3 60.0g，蒸馏水1000mL。
Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)：上海生工工程有限公 司；
真菌ITS rDNA序列扩增通用引物：ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCG G3’，ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’，由生工生物工程(上海) 有限公司合成。
米根霉变种NC-6菌株的鉴定
(1)本发明的米根霉变种NC-6菌株的筛选过程
取不同来源的土壤样品，加入适当无菌水，混匀，分别接入产酸筛选培 养基中，于30℃、200r/min摇瓶培养18h，取0.1mL富集后的菌液进行梯度 稀释度，取0.1mL稀释液涂布于产酸筛选培养基中，稀释液孢子的浓度以每 平皿中长10个菌落为宜；28℃静置培养；24h后进行观察，以后每隔12h左 右进行观察，出现单菌落，挑选黄色透明圈大的单孢菌落并镜检，接种至PDA 培养基中，30℃培养7d，置4℃冰箱保存。将筛选的菌株以1接种环接种至 种子培养基中，置于30℃、200r/min恒温振荡培养18h后，以10％接种至发 酵培养基中，置于35℃、200r/min恒温振荡培养48h，发酵结束后取样进行 高效液相检测L-乳酸含量和光学纯度，紫外分光光度计检测残糖含量，并计 算糖酸转化率。
实验结果：经初步摇瓶发酵和色谱分析，最终筛选到一株高产L-乳酸的 菌株NC-6，其产量达到78.00g/L，糖转化率达到73.58％，光学纯度为100％； 后经200L发酵罐放大培养，其产L-乳酸量达到86.07g/L，糖酸转化率为 83.21％，光学纯度为100％，且产率稳定。
(2)NC-6菌株200L发酵罐发酵放大试验
确定的发酵工艺参数：温度35℃，搅拌速率200rpm。并采用高效液相 检测L-乳酸含量和光学纯度，紫外分光光度计检测残糖含量。
L-乳酸含量测定色谱条件：
分析柱：TOSOh TSKgel-OApakP+Oapak A(7.8Φ×300mm)；流动相： 0.75mM H2SO4水溶液；流速：0.8mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；检 测器：RID示差折射检测器；定量方法：外标法；
L-乳酸光学纯度测定色谱条件：
色谱柱：SUMICHIRAL OA-5000(4.6Φ×150mm)/Chirex3126(D)-Penicilla mine(替代品)；柱温：40℃；检测器：紫外检测器；波长：254nm；流动相： 1mmoL/L CuSO4水溶液；分析流速：1.0mL/min；进样量：5μL；分析方法： 面积百分率法；检出时间：L-乳酸18min、D-乳酸22min。
分析步骤：将发酵液在12000r/min下离心5min，取1mL发酵液进行10 倍稀释并通过0.45μm滤膜后装入样品瓶中，进样量10μL，进样时间30min。 使用标准曲线法，根据已建立的标准曲线积分计算出待测样品中L-乳酸的含 量。
实验结果：200L发酵罐放大试验，结果表明：L乳酸产量为86.07g/L， 糖酸转化率为83.21％，且产率稳定光学纯度为100％，其光学纯度达到了工 业生产聚乳酸的要求。
(3)菌株NC-6的平板形态和显微形态观察
平板形态观察：将菌株NC-6经斜面培养基活化后，接种至PDA培养基 中，30℃恒温培养7d。参照孔华忠的方法，观察并记录菌株的生长速度、菌 落形态、是否产色素及分生孢子的产生能力。
显微形态观察：采用插片法观察菌株菌丝大小、形状、是否有横隔、分 生孢子梗着生情况以及孢子大小、形态颜色等特征。
实验结果：
平板形态观察：菌落匍匐状，气生菌丝白色较密，基内菌丝呈黑色，表 面可见浓密黑色孢子。
显微形态观察：孢囊梗1～5枝丛生，分枝，常有膨大部分，褐色平滑， 长75～210μm。孢子囊椭圆形，深褐色，直径40～246μm。孢子大小不一， 呈圆形或椭圆形，直径3.2～13.5μm。厚垣孢子在匍匐菌丝中形成，直径2.7～ 81μm。
(4)ITS rDNA基因序列测定
基因组DNA的提取：采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒SK8259 提取基因组DNA。
ITS rDNA PCR扩增：真菌ITS rDNA序列扩增通用引物：ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’，ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’， 并进行ITS
rDNA序列的PCR扩增，1％琼脂糖电泳，检测电压150V、100mA，电 泳时间20min；点样顺序：Marker，NC-6，结果如图。
样品拼接与Blast比对：将上述约600bp左右的条带切胶回收，采用sanger 法测序。
ITS rDNA基因序列Blast比对结果：经样品的拼接和Blast比对得知，菌 株NC-6与米根霉菌株的ITS rDNA序列相似性达到99.9％。因此，结合形态 学观察可将菌株NC-6鉴定为米根霉。
(5)基于全基因组的重测序分析
全基因组重测序实验：采用质检合格的基因组DNA样品用于测序文库的 构建，其中包括基因组DNA片段化、NEB
Figure BDA0002525246400000082
UltraTM DNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002525246400000083
试剂盒进行文库构建(DNA片段末端修复、连接接头、磁珠分 选纯化连接产物、文库扩增和文库纯化)，然后对文库进行质量控制：通过2％ 琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，点样顺序依次为NC-6和Marker；为了得到 均匀的长簇效果和高质量的测序数据，使用Thermo Qubit4.0荧光定量仪进行 文库浓度测定；使用Agilent Technologies 2100DNA 1000Kit进行文库长度分 布检测。对测序数据进行评估和质控，并与参考菌株Rhizopus oryzae 99-892的基因组序列进行比对，依据测序深度覆盖度分析、插入片段长度分析和比 对效率判断与参考基因组序列的比对误差。
全基因组重测序分析实验结果：
G+C含量测定结果：菌株NC-6的G+C含量为36.65％，参考菌株99-892 的G+C含量为35.40％，菌株NC-6与参考菌株99-892的G+C含量相差1.25％， 无明显差异。
表1：G+C含量分析结果
Figure BDA0002525246400000081
Figure BDA0002525246400000091
INDEL和SNP突变分析：首先使用GATK HaplotypeCaller对单个样本的 比对结果进行突变声明；随后使用GATK GenotypeGVCFs对结果进行合并和 质控，以提高突变声明质量，降低发生错误的概率；然后使用SnpEff和 GATKVariantAnnotator等工具，根据Rhizopus oryzae 99-892参考基因组及其 注释信息，对突变进行注释，根据突变注释结果寻找相关功能基因和蛋白编 码基因序列，并将菌株NC-6分别与参考菌株99-892和米根霉模式菌株 CBS112.078基于相关功能基因和蛋白编码基因进行序列相似性比对。
米根霉菌株NC-6与米根霉参考菌株99-892基于蛋白编码基因Actin、EF-1 α和RPB2的Blast序列比对结果可知：米根霉菌株NC-6与米根霉参考菌株 99-892基于Actin(肌动蛋白)基因的相似性均为100％，可见无显著差异； 基于EF-1α基因的序列相似性分别为100％、98.80％、98.92％、100％和100％， 差异不明显；基于RPB2(RNA聚合酶第二大亚基)基因的序列相似性分别 为99.97％、99.97％和100％，无明显差异。
表2：米根霉菌株NC-6与米根霉参考菌株99-892基于蛋白编码基因 Actin、EF-1α和RPB2的Blast序列比对结果
Figure BDA0002525246400000092
米根霉菌株NC-6和米根霉同种菌株与米根霉模式菌株CBS112.07的Blast比对结果可知：米根霉菌株NC-6与模式菌株CBS112.07基于Actin基因、 EF-1α基因和RPB2基因的序列相似性分别为91.73％、96.02％和98.79％，Actin 基因和EF-1基因出现显著差异(Actin基因913个碱基中有76个碱基位点发 生突变；EF-1α基因1231个碱基中有49个碱基位点发生突变；RPB2基因737 个碱基中有9个碱基位点发生突变)。米根霉同种菌株中，参考菌株99-892、 CBS400.95、CBS120806基于Actin基因与模式菌株CBS112.07的序列相似性分别为99.80％、99.60％和99.60％，无明显差异；基于EF-1基因的序列相似 性分别为99.48、99.10％和98.80％，无明显差异；参考菌株99-892基于RPB2 基因的序列相似性分别为98.18％，无明显差异；
表3：米根霉菌株NC-6和米根霉同种菌株与米根霉模式菌株CBS112.07 的Blast比对结果
Figure BDA0002525246400000101
根霉属菌株(外群)与米根霉模式菌株CBS112.07序列Blast比对结果： 根霉属(外群)菌株中，匍枝根霉、少跟根霉、戴尔根霉和单孢根霉基于Actin 基因与米根霉模式菌株CBS112.07的序列相似性分别为87.96％(差异明显)、 99.89％、98.79％和89.01％(差异明显)；匍枝根霉、少跟根霉、戴尔根霉和 单孢根霉基于EF-1α基因与米根霉模式菌株CBS112.07的序列相似性分别为 94.56％(差异明显)、99.35％、98.50％和94.33％(差异明显)；匍枝根霉和戴 尔根霉基于RPB2基因与米根霉模式菌株CBS112.07的序列相似性分别为0％ 和96.07％(差异明显)，少根根霉和单孢根霉中没有找到RPB2基因，可作为 对照。
表4：根霉属菌株(外群)与米根霉模式菌株CBS112.07序列Blast比对 结果
Figure BDA0002525246400000111
米根霉菌株NC-6基于Actin基因与同属菌株的Blast比对结果：米根霉 菌株NC-6与米根霉菌株CBS110.17的Blast比对序列相似性最大，仅为 91.73％。
表5：米根霉菌株NC-6基于Actin基因与同属菌株的Blast比对结果
Figure BDA0002525246400000112
米根霉菌株NC-6基于EF-1α基因与同属菌株的Blast比对结果：米根霉 菌株NC-6与米根霉菌株CBS381.52的Blast比对序列相似性最大，仅为 97.08％。
表6：米根霉菌株NC-6基于EF-1α基因与同属菌株的Blast比对结果
Figure BDA0002525246400000121
米根霉菌株NC-6基于RPB2基因与同属菌株的Blast比对结果：米根霉 菌株NC-6与米根霉菌株voucher Duke 166.02的Blast比对序列相似性最大， 为99.05％。
表7：米根霉菌株NC-6基于RPB2基因与同属菌株的Blast比对结果
Figure BDA0002525246400000122
上面(3)的形态鉴定实验表明，本发明筛选得到的菌株NC-6菌落呈匍 匐状，气生菌丝白色较密，基内菌丝呈黑色，表面可见浓密黑色孢子。孢囊 梗1～5枝丛生，分枝，常有膨大部分，褐色平滑，长75～210μm。孢子囊椭 圆形。深褐色，直径40～246μm。孢子大小不一，呈圆形或椭圆形，直径3.2～13.5μm。厚垣孢子在匍匐菌丝中形成，直径2.7～81μm。根据《真菌鉴定手 册》(魏景超，1979版)，可鉴定其属于根霉属菌株(Rhizopus sp.)。(4)的 ITSrDNA序列Blast比对结果、(5)的G+C含量分析结果表明，菌株NC-6 为米根霉(Rhizopusoryzae)。
根据米根霉菌株NC-6基于蛋白编码基因Actin与米根霉模式菌株 CBS112.07的序列相似性为91.73％，差异明显，米根霉参考菌株99-892、 CBS400.95、CBS120806基于蛋白编码基因Actin与米根霉模式菌株CBS112.07 的序列相似性为99.80％、99.60％和99.60％，均无明显差异。基于蛋白编码基 因EF-1α与米根霉模式菌株CBS112.07的序列相似性为96.02％，差异明显； 米根霉参考菌株99-892、CBS400.95、CBS120806基于蛋白编码基因EF-1α 与米根霉模式菌株CBS112.07的序列相似性分别为99.48、99.10％和98.80％，均无明显差异。因此可得米根霉菌株NC-6与米根霉模式菌株CBS112.07不相 符，参考菌株99-892、CBS400.95、CBS120806与米根霉模式菌株CBS112.07 相符。
上面米根霉菌株NC-6基于Actin基因与同属菌株的Blast比对结果：米 根霉菌株NC-6与米根霉菌株CBS110.17的Blast比对序列相似性最大，仅为 91.73％。米根霉菌株NC-6基于EF-1α基因与同属菌株的Blast比对结果：米 根霉菌株NC-6与米根霉菌株CBS381.52的Blast比对序列相似性最大，仅为 97.08％。因此可得米根霉菌株NC-6与米根霉模式菌株CBS112.07差异明显。
目前米根霉菌种分类下无亚种或变种。综合分离筛选得到的菌株NC-6的 形态学特征、显微特征、ITS rDNA基因、全基因组重测序分析、蛋白编码基 因Actin、EF-1α和RPB2的Blast比对序列相似性以及在NCBI数据库与同属 菌株的Blast比对鉴定结果表明，将该菌株鉴定为米根霉(Rhizopus oryzae) 新变种，命名为米根霉变种NC-6(Rhizopus oryzaeva.NC-6)
关于以往米根霉的产酸性能说明
《真菌鉴定手册》(魏景超，1979版)米根霉的描述中，米根霉具有很强 的糖化力和产生乳酸的能力，主要的工业用途是生产L-乳酸。
Elias Seif等报道了产高效的聚合物级L-乳酸米根霉菌株99-892(参考菌 株)的全基因组序列(Seif E,Leigh J,Liu Y,et al.Comparative mitochondrial genomics inzygomycetes:bacteria-like RNase P RNAs,mobile elements and a close source ofthe group I intron invasion in angiosperms[J].Nucleic Acids Research,2005,33(2):734-744.)
C.Ruengruglikit等报道了米根霉菌株NRRL395以玉米芯为底物生产L- 乳酸，在0.2g/100mL CaCO3、0.5mL/100mL果胶酶和5g/100mL玉米芯培养 基中，30℃条件下发酵48h后，每公斤玉米芯干物质L-乳酸产量达到299.4g (Ruengruglikit C,Hang Y D.L(+)-lactic acid production from corncobs by Rhizopus oryzae NRRL-395[J].LWT-FoodScience and Technology,2003,36(6): 573-575.)
RHW Maas等报道了米根霉菌株CBS112.07以稻草水解液(木糖10.3g/L 和葡萄糖19.2g/L)为发酵碳源，糖消耗速率为2.2g/glucose.h和0.5g/xylose.h， 最终乳酸产量为6.8g/L(Maas R H W,Bakker R R,Eggink G,et al.Lactic acid production fromxylose by the fungus Rhizopus oryzae[J].Applied microbiology andbiotechnology,2006,72(5):861-868.)
CR Soccol等报道了在含有葡萄糖和CaCO3的甘蔗蔗渣培养基中，对比研 究米根霉菌株NRRL395分别在液体培养基和固体培养基中对L-乳酸产量的 影响，液体培养中葡萄糖浓度为120g/L，固态发酵培养基葡萄糖浓度为 180g/L，L-乳酸的最佳浓度分别为93.8g/L和137.0g/L；液体培养基中L-乳 酸产率为1.38g/h，固体培养基中L-乳酸产率为1.43g/h；发酵产率均为77％ (Soccol C R,Marin B,Raimbault M,et al.Potential of solidstate fermentation for production of L(+)-lactic acid by Rhizopus oryzae[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1994,41(3):286-290.)
K Saito等报道了56株米根霉以木糖为底物进行产L-乳酸发酵，结果米 根霉菌株NBRC53787为是由木糖生产乳酸的的最佳菌株，其产量为0.23g/小 麦秸秆(Saito K,HasaY,Abe H.Production of lactic acid from xylose and wheat straw by Rhizopusoryzae[J].Journal of bioscience and bioengineering,2012, 114(2):166-169.)
CD Skory等报道了一株在限氧条件下乙醇脱氢酶表达量仅为5％的米根 霉突变株，其在70h时L-乳酸产量为40g/L，与亲本米根霉菌株相比其乳酸产 量提高了10倍(SkoryC D,Freer S N,Bothast R J.Production of L-lactic acid by Rhizopus oryzaeunder oxygen limiting conditions[J].Biotechnology Letters,1998, 20(2):191-194.)
由上可知，米根霉菌株是研究L-乳酸的重要的一种工业化生产菌株，而 本发明的米根霉菌株NC-6为米根霉种的一个新变种，其L-乳酸产量高、光 学纯度100％、发酵碳源谱广，满足工业生产条件。此外，综合上述说明，可 知米根霉菌株NC-6不同于米根霉模式菌株CBS112.07，可将其分类学地位定 为米根霉新变种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或 替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以 权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年4月20日，分类命名为米根霉Rhizopus oryzae，保藏编号为CGMCC NO.19620。
2.一种L-乳酸单体，其特征在于，由权利要求1所述的高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6通过发酵制得。
3.一种聚乳酸制品，其特征在于，由权利要求2所述的L-乳酸单体聚合制成。
4.根据权利要求1所述的高产高光学纯度L-乳酸的米根霉变种NC-6在制备L-乳酸单体、聚乳酸制品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述聚乳酸制品是手术缝合线、药物控释制剂、骨折内固定材料或生物塑料制品。
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