CN105670940B - 一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用 - Google Patents

一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科,石杉属)内生真菌中分离获得,属于毛霉属总状毛霉(Mucor racemosus)种NSH‑D株,在实验室传代15代后具有遗传稳定性,其氨基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明高效表达石杉碱甲的真菌菌株,作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株,将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中,通过基因改造获得更多的优良性状,此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲,保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。

Description

一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,本发明还涉及该真菌菌株的应用。
背景技术
目前乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在阿尔茨海默病药物市场上处于主导地位。石杉碱甲为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱,是一种强效的可逆性的胆碱酯酶抑制剂,具有多靶点作用,对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍,而且外周不良反应低,是治疗阿尔茨海默病临床优选药物之一。
源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力,植物提取获得石杉碱甲为最简便方式,但植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈;化学合成生产石杉碱甲仍是研发重要途径之一,但合成步骤繁琐、代价昂贵,很难获得纯光学活性的合成物。
因此利用从野生蛇足石杉内生真菌中筛选分离具有产石杉碱甲能力的菌株对于治疗阿尔茨海默病和保护植物资源意义重大。虽然目前国内外已有对产石杉碱甲菌株进行开发和研究,但总状毛霉(Mucor racemosus)具备产石杉碱甲功能却鲜有报道。对已获得的总状毛霉(Mucor racemosus)NSH-D株可通过生物技术改造菌株为获得石杉碱甲工业化生产提供新的菌种资源。同时,通过对其菌株产石杉碱甲机理的研究,构建新的转基因生物,使其获得更优良稳定的产石杉碱甲性状和能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,解决植物提取获得石杉碱甲面临植物资源匮乏瓶颈;以及化学合成步骤繁琐、代价昂贵,很难获得纯光学活性的合成物的问题。
本发明的另一个目的是提供一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株的应用。
本发明所采用的技术方案是,一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科,石杉属)内生真菌中分离获得,属于毛霉属总状毛霉(Mucor racemosus)种NSH-D株,在实验室传代15代后具有遗传稳定性,其氨基序列如SEQID NO:1所示。
本发明的特点还在于,
该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为:
(1)培养基:采用PDA液体培养基,具体配方为:马铃薯300g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml;
(2)培养条件:26.5℃,220r/min;
(3)装液量:250ml锥形瓶,装液量为100ml;
(4)培养时间:6天。
该真菌菌株高效稳定性表达石杉碱甲时,该菌株的实验室保存条件为:(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后,生长时间为60h;(2)保存菌种条件为4℃,12h后在将其放置-25℃冰箱中进行保存。
本发明所采用的另一个技术方案是,一种高效表达石杉碱甲并作为治疗阿尔茨海默病的功能菌株在生物合成制药方面的应用。
本发明所采用的第三个技术方案是,一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株的应用,通过转基因、诱变育种对真菌菌株进行基因改造,以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株;但基因改造的技术手段并不限于此,也可以采用其他的生物技术进行基因改造方面的应用。
本发明的有益效果是,本发明一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株,将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中,通过基因改造获得更多的优良性状,此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲,保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。
附图说明
图1是本发明高效表达石杉碱甲的真菌菌株产石杉碱甲能力与石杉碱甲标准品高效液相检测对照图,图中,a为石杉碱甲标准品高效液相色谱,b为本发明真菌菌株高效液相色谱;
图2为琼脂糖凝胶电泳检测本发明真菌菌株中所抽提DNA的PCR产物电泳图,图中,a为菌株检测区,b为Marker对照区;
图3为本发明高效表达石杉碱甲的真菌菌株光学显微镜图,图中,a为光学显微镜下球形孢子囊,b为光学显微镜下有隔菌丝,c为光学显微镜下球形、短椭圆形孢子。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,该菌株为从野生蛇足石杉(Huperziaserrata石杉科,石杉属)内生真菌中分离获得,属于毛霉属总状毛霉(Mucor racemosus)种NSH-D株,在实验室传代15代后具有遗传稳定性,其氨基序列如SEQ ID NO:1所示。
该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中心保藏。
生物材料保藏信息:
名称:总状毛霉(Mucor racemosus)NSH-D株
保藏编号:CGMCC No.12077
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏时间:2016年01月15日
地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
(一)本发明高效表达石杉碱甲菌株的分离方法如下:
将新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗后,先用75%酒精进行表面消毒30s,无菌水冲洗4次,接着用10%NaClO浸泡5min,无菌水冲洗4次,最后再用75%乙醇表面消毒30s,无菌水冲洗4次后,用无菌刀片将茎切成0.5cm大小,叶片切成0.3cm×0.3cm小块,接种到含有15μg/ml链霉素和1mg/ml脱氧胆酸钠的PDA固体培养基上,倒置于28℃培养箱中进行暗培养。为了检验上述表面消毒是否彻底,同时把在消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌水涂布在培养基上进行培养。2~3d后,无菌操作法挑取在茎段和叶片切口上所长出的菌丝,平板划线法转接到新鲜的PDA平板上,重复上述操作直到得到纯化的内生真菌为止。
(二)高效表达石杉碱甲菌株发酵液制备:将分离得到的纯化内生菌分别接入装有100ml PDA培养基的250ml锥形瓶(每个菌株接3瓶),置于摇床上,26.5℃、220r/min振荡培养6d。设置3个重复。内生真菌在振荡培养6d后,发酵液于10000r/min离心15min。
(三)高效表达石杉碱甲菌株产物分析测定:取发酵液离心后的上清液50ml,采用氯仿和乙醚提取方法提取石杉碱甲,用甲醇定容到5ml,用高效液相法测定发酵上清液产石杉碱甲的含量。高效液相(HPLC)色谱柱为Agilent Cl8柱(4.60mm×250mm,5μm);色谱条件为:流动相为甲醇-0.1%甲酸(75:25);流量1.0ml/min;柱温25℃,进样量20μl;检测波长310nm。以石杉碱甲标准品作对照。
精密称取石杉碱甲标准品20mg,溶于20mL蒸馏水中,再依次制备成0.05,0.025,0.0125,0.006,0.003mg/ml质量浓度,分别进样20μl。每次5次重复,以确定精密度良好。以峰面积与对应石杉碱甲标准品质量绘制标准曲线,得线性回归方程。通过线性回归方程计算分离获得产石杉碱甲菌株代谢产物含量。结果表明石杉碱甲标准品出峰时8.805min(图1,a),线性回归方程为y=-16.40713+1059.60431x,R=0.99758。菌株NSH-D发酵液提取物出峰时间8.803min(图1,b),二者出峰时间接近,当向菌株NSH-D发酵液提取物中添加标准品后HPLC出峰时间重叠,结果表明NSH-D发酵液提取液中存在石杉碱甲,发酵液中产石杉碱甲含量为10.6mg/100ml。
(四)高效表达石杉碱甲菌株分子生物学鉴定:
1.基因组DNA提取
1)在酒精灯火焰旁取培养基上的菌株于研钵,液氮研磨。
2)将研磨好的菌加至1.5ml离心管中,标记菌株名称,加入0.6ml TE(pH 8.0),用枪头吸打均匀,使菌体充分悬浮。
3)加入250μL 10%SDS,轻轻倒转混匀。
4)加入3μL蛋白酶K(20ng/μL),轻轻混匀,37℃水浴1h。
5)加入150μL 5mol/L NaCl,轻轻混匀。
6)加入150μL 2%CTAB,轻轻混匀,65℃水浴20min。
7)12000rpm常温离心20min。
8)小心吸取上清至新的1.5ml离心管,加入等体积异丙醇,充分混匀,室温放置30min,12000rpm,4℃离心10min。
9)吸掉上清,在吸水纸上空干液体,加750μL 70%乙醇,轻弹管壁,使沉淀悬浮并反复颠倒几次,12000rpm,4℃离心2min。
10)每管加入30μl纯化水溶解沉淀(水中加Rnase,终浓度10ng/μl),用手轻弹管壁,4℃溶解过夜。
2.DNA电泳检测
3.PCR扩增
3.1真菌鉴定引物
18s引物序列:
ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;
ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
3.2PCR反应体系
3.3PCR循环条件
4.电泳PCR产物结果
电泳条件:3ul样品+1%琼脂糖凝胶,电泳方向从上往下。Marker条带组成:100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp,3000bp,5000bp。电泳PCR产物结果(图2)。图中,a为菌株检测区,b为Marker对照区,750bp条带浓度为60ng/3ul显示为加亮带,其余条带浓度均为30ng/3μl。结果:目的检测NSH-D菌株DNA扩增条带经琼脂糖凝胶电泳测定大小约为500-750bp,且上下无杂带。
5.PCR产物结果鉴定,委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
根据blast结果,菌株NSH-D与Mucor racemosus亲源关系最近。
本发明高效表达石杉碱真菌菌株具有下述特征:
1.镜下形态特征
如图3所示,该菌株菌丝有横隔,单生、直立、总状分枝孢囊梗,孢子囊球形,孢子球形或卵圆形。
2.在真菌用PDA培养基上的特征:
该真菌菌株在PDA培养基上生长迅速,4天后菌落平铺于整个平板,菌丝疏松呈茸毛状,菌落PDA培养正面菌丛成黄褐色,背面成深黄褐色。
3.该真菌菌株高效表达石杉碱甲的培养条件为:
(1)培养基:采用PDA液体培养基。具体配方为:马铃薯300g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml。
(2)培养条件:26.5℃,220r/min。
(3)装液量:250ml锥形瓶,装液量为100ml。
(4)培养时间:6天。
本发明的NSH-D株为总状毛霉(Mucor racemosus)种、毛霉属真菌,经液体发酵培养提取代谢产物,可获得较高产量石杉碱甲。
本发明真菌菌株的ITS与同属的相同种的比对结果如下:
与Mucor racemosus F13J-1的相似度为99%;
与Mucor racemosus xsd08071的相似度为99%;
与Mucor racemosus ATCC1216B的相似度为99%;
与Mucor racemosus CTSP F7的相似度为99%;
与Mucor racemosus R3的相似度为97%。
该属鲜有报道具有产石杉碱甲能力。通过对其机理研究,可以进一步加深菌株产石杉碱甲中高效表达基因的研究,从而构建新的转基因生物,使其获得更高效的表达。总状毛霉(Mucor racemosus)NSH-D株作为一种新的产石杉碱甲菌株,将为生物合成途径合成石杉碱甲提供新的菌种资源。

Claims (4)

1.一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株,其特征在于,该菌株从野生蛇足石杉(Huperziaserrata)内生真菌中分离获得,属于毛霉属、总状毛霉(Mucor racemosus)种NSH-D株,所述真菌菌株的保藏编号:CGMCC No.12077。
2.根据权利要求1所述的高效表达石杉碱甲的真菌菌株,其特征在于,该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为:
(1)培养基:采用PDA液体培养基,具体配方为:马铃薯300g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml;
(2)培养条件:26.5℃,220r/min;
(3)装液量:250ml锥形瓶,装液量为100ml;
(4)培养时间:6天。
3.根据权利要求1所述的高效表达石杉碱甲的真菌菌株,其特征在于,该菌株的实验室保存条件为:(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后,生长时间为60h;(2)保存菌种条件为4℃,12h后再将其放置-25℃冰箱中进行保存。
4.一种高效表达石杉碱甲的功能菌株在生物合成制药方面的应用,其特征在于,该菌株从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌中分离获得,属于毛霉属、总状毛霉(Mucor racemosus)种NSH-D株,所述菌株的保藏编号:CGMCC No.12077。
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