CN105647819B - 一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉内生真菌中分离获得，属于木霉属哈茨木霉菌种(Trichoderma harzianum)NSW‑V株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。

Description

一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，本发明还涉及该真菌菌株的应用。
背景技术
目前乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在阿尔茨海默病药物市场上处于主导地位。石杉碱甲为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱，是一种强效的可逆性的胆碱酯酶抑制剂，具有多靶点作用，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍，而且外周不良反应低，是治疗阿尔茨海默病临床优选药物之一。
源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力，植物提取获得石杉碱甲为最简便方式，但植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈；化学合成生产石杉碱甲仍是研发重要途径之一，但合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物。
因此利用从野生蛇足石杉内生真菌中筛选分离具有产石杉碱甲能力的菌株对于治疗阿尔茨海默病和保护植物资源意义重大。虽然目前国内外已有对产石杉碱甲菌株进行开发和研究，但哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)具备产石杉碱甲功能却鲜有报道。对已获得的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)NSW-V株可通过生物技术改造菌株为获得石杉碱甲工业化生产提供新的菌种资源。同时，通过对其菌株产石杉碱甲机理的研究，构建新的 转基因生物，使其获得更优良稳定的产石杉碱甲性状和能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，解决植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈；及化学合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物的问题。
本发明的另一个目的是提供一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株的应用。
本发明所采用的技术方案是，一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于木霉属哈茨木霉菌种(Trichoderma harzianum)NSW-V株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的特点还在于，
该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；
(2)培养条件：28℃，220r/min；
(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml；
(4)培养时间：5天。
该真菌菌株高效稳定性表达石杉碱甲时，该菌株的实验室保存条件为：(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后，生长时间为72h；(2)保存菌种条件为4℃，12h后在将其放置-25℃冰箱中进行保存。
本发明所采用的另一个技术方案是，一种高效表达石杉碱甲并作为治疗阿尔茨海默病的功能菌株在生物合成制药方面的应用。
本发明所采用的第三个技术方案是，一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株的应用，通过转基因、诱变育种对真菌菌株进行基因改造，以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株；但基因改造的技术手段并不限于此，也可以采用其他的生物技术进行基因改造方面的应用。
本发明的有益效果是，本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，属于哈茨木霉菌种(Trichoderma harzianum)NSW-V株，可以作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。
附图说明
图1是本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株产石杉碱甲能力与标准品高效液相检测对照图，图中，a为石杉碱甲标准品高效液相色谱，b为本发明菌株高效液相色谱；
图2为琼脂糖凝胶电泳检测NSW-V菌株中所抽提DNA的PCR产物电泳图，图中，a为电泳PCR产物结果，其中a图中第一条带为菌株NSW-V检测区，第二条带为Marker检测区；b为Marker大小标示图；
图3为本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株光学显微镜图，图中，a为光学显微镜下菌丝形态图，b为光学显微镜下孢子形态图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于木霉 属哈茨木霉菌种(Trichoderma harzianum)NSW-V株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。
该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中心保藏。
生物材料保藏信息：
名称：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)NSW-V株
保藏编号：CGMCC No.12076
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏时间：2016年01月15日
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
(一)本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株的分离方法如下：
将从四川省旺苍县采集的新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗后，先用75％酒精进行表面消毒30s，无菌水冲洗4次，接着用10％NaClO浸泡5min，无菌水冲洗4次，最后再用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗4次后，用无菌刀片将茎切成0.5cm大小，叶片切成0.3cm×0.3cm小块，接种到含有15μg/ml链霉素和1mg/ml脱氧胆酸钠的PDA固体培养基上，倒置于28℃培养箱中进行暗培养。为了检验上述表面消毒是否彻底，同时把在消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌水涂布在培养基上进行培养。2～3d后，无菌操作法挑取在茎段和叶片切口上所长出的菌丝，平板划线法转接到新鲜的PDA平板上，重复上述操作直到得到纯化的内生真菌为止。
(二)具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株发酵液制备
将分离得到的纯化内生菌分别接入装有100ml PDA培养基的250ml锥形瓶(每个菌株接3瓶)，置于摇床上，28℃、220r/min振荡培养5d。设置 3个重复。内生真菌在振荡培养5d后，发酵液于10000r/min离心15min。
(三)具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株产物分析测定
取发酵液离心后的上清液50ml，采用氯仿和乙醚提取方法提取石杉碱甲，用甲醇定容到5ml，用高效液相法测定发酵上清液产石杉碱甲的含量。高效液相(HPLC)色谱柱为Agilent Cl8柱(4.60mm×250mm，5μm)；色谱条件为：流动相为甲醇-0.1％甲酸(75：25)；流量1.0ml/min；柱温25℃，进样量20μl；检测波长310nm。以石杉碱甲标准品作对照。
精密称取石杉碱甲标准品20mg，溶于20ml蒸馏水中，再依次制备成0.05，0.025，0.0125，0.006，0.003mg/ml质量浓度，分别进样20μl。每次5次重复，以确定精密度良好。以峰面积与对应石杉碱甲标准品质量绘制标准曲线，得线性回归方程。通过线性回归方程计算分离获得产石杉碱甲菌株代谢产物含量。结果表明石杉碱甲标准品出峰时8.805min(图1，a)，线性回归方程为y＝-16.40713+1059.60431x，R＝0.99758。菌株NSW-V发酵液提取物出峰时间8.802min(图1，b)，二者出峰时间接近，当向菌株NSW-V发酵液提取物中添加标准品后HPLC出峰时间重叠，结果表明NSW-V发酵液提取液中存在石杉碱甲，发酵液中产石杉碱甲含量为32mg/100ml。
(四)具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株分子生物学鉴定
1.基因组DNA提取
按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行。
1)取50-100mg新鲜真菌或菌丝用液氮研磨成粉末，加入1.5ml离心管中。加入200μl Buffer Digestion和2μlβ-巯基乙醇，再加入20μl Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h质细胞完全裂解。
2)加入100μl Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
3)室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中。
4)加入200μl Buffer BD，充分颠倒混匀。
5)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。
6)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
7)将吸附柱放回收集管，加入500μl PW Solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
8)将吸附柱放回收集管，加入500μl Wash Solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
9)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm离心2min，离去残留的WashSolution。
10)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μl TE Buffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验。
2.PCR扩增
2.1真菌菌种鉴定通用引物：
2.2PCR反应体系：
试剂 体积(μl)
Template(基因组DNA 20-50ng/μl) 0.5
10×Buffer(with Mg<sup>2+</sup>) 2.5
dNTP(各2.5mM) 1.0
酶 0.2
F(10uM) 0.5
R(10uM) 0.5
加双蒸H<sub>2</sub>O至 25
2.3PCR循环条件
3、凝胶电泳
电泳条件：1％琼脂糖电泳，150V、100mA、20min，电泳方向从上往下。电泳PCR产物结果(图2，a)，Marker条带碱基对大小(图2，b)，其中，左侧图中第一条带为菌株NSW-V检测区，第二条带为Marker检测区。结果显示：目的检测菌株NSW-V菌株DNA扩增条带经琼脂糖凝胶电泳测定大小约为500-600bp，且上下无杂带。
4、PCR产物结果鉴定，委托生工生物工程(上海股份有限公司)进行测序。
根据blast结果，菌株NSW-V与Trichoderma harzianum亲源关系最近。
本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株具有下述特征：
1.镜下形态特征
如图3所示，本发明具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)NSW-V株，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形。分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色。
2.在真菌用PDA培养基上的特征：
该真菌菌株在PDA培养基上菌落初为白絮状，后为暗绿色。
3.该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基。具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
(2)培养条件：28℃，220r/min。
(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml。
(4)培养时间：5天。
本发明真菌菌株，归属于木霉属真菌，经液体发酵培养提取代谢产物，可获得较高产量石杉碱甲。
本发明真菌菌株的ITS与同属的相同种的比对结果(相似度为100％)。
与Trichoderma harzianum strain BHR2P1F3M的相似度为100％；
与Trichoderma harzianum strain BHR1P1F2M的相似度为100％；
与Trichoderma harzianum voucher TriH_JSB301的相似度为100％；
与Trichoderma harzianum voucher TriH_JSB22的相似度为100％。
该属鲜有报道具有产石杉碱甲能力。通过对其机理研究，可以进一步加深菌株产石杉碱甲中高效表达基因的研究，从而构建新的转基因生物，使其获得更高效的表达。本发明真菌菌株NSW-V株作为新的产石杉碱甲菌株，将为生物合成途径合成石杉碱甲提供新的菌种资源。

Claims (4)

1.一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，其特征在于，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌中分离获得，属于木霉属哈茨木霉菌种(Trichodermaharzianum)NSW-V株，所述真菌菌株的保藏编号为：CGMCC No.12076。
2.根据权利要求1所述的具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，其特征在于，该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；
(2)培养条件：28℃，220r/min；
(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml；
(4)培养时间：5天。
3.根据权利要求1所述的具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株，其特征在于，该菌株的实验室保存条件为：(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后，生长时间为72h；(2)保存菌种条件为4℃，12h后再将其放置-25℃冰箱中进行保存。
4.一种高效表达石杉碱甲的功能菌株在生物合成制药方面的应用，其特征在于，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌中分离获得，属于木霉属哈茨木霉菌种(Trichoderma harzianum)NSW-V株，所述菌株的保藏编号为：CGMCC No.12076。
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