CN106497803A - 一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌及其应用 - Google Patents

一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于镰刀菌属轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)NSH‑5株，在实验室传代20代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明真菌菌株，作为治疗血管性痴呆及老年痴呆症的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。

Description

一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌及其应用
技术领域
本发明属于药学微生物技术领域，具体涉及一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，本发明还涉及该真菌菌株的应用。
背景技术
阿尔茨海默病又称老年痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性痴呆为主要特征的神经元退变性疾病，主要表现为进行性认知功能障碍、性格和行为改变、记忆力衰退等，导致患者在患病后7-10年间死亡。据国际阿尔茨海默病协会估算，2010年全世界约有3600万痴呆患者，预计到2050年AD患病人数将达到1.15亿。血管性痴呆(Vasculardementia，VD)是由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的一种获得性智能损害综合症，主要以脑缺血缺氧性或出血性脑损伤造成的病理组织学损伤为主，临床表现为智能障碍包括认知能力、记忆力、判断和思维能力、计算能力和社会生活能力的减退，伴随着情感、性格的改变。VD是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的第二大痴呆疾病。我国是脑血管病高发区，VD发病率也相对较高。
目前乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在AD和VD药物市场上处于主导地位。石杉碱甲为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱，是一种强效的可逆性的胆碱酯酶抑制剂，具有多靶点作用，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍，而且外周不良反应低，是治疗AD和VD临床优选药物之一。
源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力，植物提取获得石杉碱甲为最简便方式，但天然蛇足石杉资源稀缺、生长周期长，且石杉碱甲在植株中含量甚微，仅靠天然植株提取远远满足不了临床需求；化学合成生产石杉碱甲仍是研发重要途径之一，但化学合成工艺繁琐、成本高，加之副产物多、纯化困难，在临床应用中具有潜在毒性。因此利用从野生蛇足石杉内生真菌中筛选分离具有产石杉碱甲能力的菌株对于治疗AD和VD及保护植物资源意义重大。
虽然目前国内外已有对产石杉碱甲菌株进行开发和研究，但轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)具备产石杉碱甲功能却鲜有报道。对已获得的轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)NSH-5株可通过生物技术改造菌株为石杉碱甲工业化生产提供新的菌种资源。同时，通过对其菌株产石杉碱甲机理的研究，构建新的转基因生物，使其获得更优良稳定的产石杉碱甲性状和能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，解决植物提取获得石杉碱甲面临植物资源匮乏瓶颈；以及化学合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物的问题。
本发明的另一个目的是提供该具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌菌株的应用。
本发明所采用的技术方案是，一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于镰刀菌属轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)NSH-5株，在实验室传代20代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的特点还在于，
该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；
(2)培养条件：27℃，220r/min；
(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml；
(4)培养时间：6-8天。
该真菌菌株高效稳定表达石杉碱甲时，该菌株的实验室保存条件为：(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后，生长时间为60h；(2)保存菌种条件为4℃，12h后在将其放置-25℃冰箱中进行保存。
本发明所采用的另一个技术方案是，一株具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌在用于治疗阿尔茨海默病和血管性痴呆的生物合成制药方面的应用。
本发明所采用的第三个技术方案是，一株具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌菌株的应用，通过转基因、诱变育种对真菌菌株进行基因改造，以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株；但基因改造的技术手段并不限于此，也可以采用其他的生物技术进行基因改造方面的应用。
本发明的有益效果是，本发明具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，作为治疗AD和VD的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗AD和VD医药费用有着巨大意义。
附图说明
图1是为石杉碱甲标准品高效液相色谱图；
图2是为本发明真菌菌株高效液相色谱；
图3为琼脂糖凝胶电泳检测本发明真菌菌株中所抽提DNA的PCR产物电泳图，图中，a为菌株检测区，b为Marker对照区；
图4为本发明具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌菌株光学显微镜图；
图5为本发明真菌菌株与其他菌属成员之间的进化分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于镰刀菌属轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)NSH-5株，在实验室传代20代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。
该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中心保藏。
(一)本发明高效表达石杉碱甲菌株的分离方法如下：
将新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗后，先用75％酒精进行表面消毒30s，无菌水冲洗4次，接着用10％NaClO浸泡5min，无菌水冲洗4次，最后再用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗4次后，用无菌刀片将茎切成0.5cm大小，叶片切成0.3cm×0.3cm小块，接种到含有15μg/ml链霉素和1mg/ml脱氧胆酸钠的PDA固体培养基上，倒置于28℃培养箱中进行暗培养。为了检验上述表面消毒是否彻底，同时把在消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌水涂布在培养基上进行培养。2～3d后，无菌操作法挑取在茎段和叶片切口上所长出的菌丝，平板划线法转接到新鲜的PDA平板上，重复上述操作直到得到纯化的内生真菌为止。
(二)高效表达石杉碱甲菌株发酵液制备：将分离得到的纯化内生菌分别接入装有100ml PDA培养基的250ml锥形瓶(每个菌株接3瓶)，置于摇床上，27℃、220r/min振荡培养7d。设置3个重复。内生真菌在振荡培养7d后，发酵液于10000r/min离心15min。
(三)高效表达石杉碱甲菌株产物分析测定：取发酵液离心后的上清液50ml，采用氯仿和乙醚提取方法提取石杉碱甲，用甲醇定容到5ml，用高效液相法测定发酵上清液产石杉碱甲的含量。高效液相(HPLC)色谱柱为Agilent Cl8柱(4.60mm×250mm，5μm)；色谱条件为：流动相为甲醇-0.1％甲酸(75：25)；流量1.0ml/min；柱温25℃，进样量20μl；检测波长310nm。以石杉碱甲标准品作对照。
精密称取石杉碱甲标准品20mg，溶于20mL蒸馏水中，再依次制备成0.05，0.025，0.0125，0.006，0.003mg/ml质量浓度，分别进样20μl。每次5次重复，以确定精密度良好。以峰面积与对应石杉碱甲标准品质量绘制标准曲线，得线性回归方程。通过线性回归方程计算分离获得产石杉碱甲菌株代谢产物含量。HPLC分析结果表明标准品出峰时间8.805min(图1)，线性回归方程为y＝－16.40713+1059.60431x,R＝0.99758。菌株NSH-5发酵液提取物出峰时间9.020min(图2)，二者出峰时间接近，当向菌株NSH-5发酵液提取物中添加标准品后HPLC出峰时间重叠，结果表明NSH-5发酵液提取物中存在石杉碱甲，产石杉碱甲含量为11.76mg/100mL。
(四)可生物表达石杉碱甲菌株分子生物学鉴定：
1.基因组DNA提取
按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行。
1)取50-100mg新鲜真菌或菌丝用液氮研磨成粉末，加入1.5ml离心管中。加入200μl Buffer Digestion和2μlβ-巯基乙醇，再加入20μl Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h质细胞完全裂解。
2)加入100μl Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
3)室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中。
4)加入200μl Buffer BD，充分颠倒混匀。
5)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。
6)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
7)将吸附柱放回收集管，加入500μl PW Solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
8)将吸附柱放回收集管，加入500μl Wash Solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
9)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm离心2min，离去残留的WashSolution。
10)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μl TE Buffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验。
2.PCR扩增
2.1真菌菌种鉴定通用引物：
2.2 PCR反应体系：
试剂 体积(μl)
Template(基因组DNA 20-50ng/μl) 0.5
10×Buffer(with Mg2+) 2.5
dNTP(各2.5mM) 1.0
酶 0.2
F(10uM) 0.5
R(10uM) 0.5
加双蒸H2O至 25
2.3 PCR循环条件
3.凝胶电泳
电泳条件：1％琼脂糖电泳，150V、100mA、20min，电泳方向从上往下，Marker条带组成：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp，3500bp，4000bp，5000bp，6000bp，8000bp，10000bp，其中500bp，1000bp，3000bp条带加亮。电泳PCR产物结果(图3，a)，Marker条带碱基对大小(图3，b图)，其中，图中a带为菌株NSH-5检测区，b带为Marker检测区。结果显示：目的检测NSH-5菌株DNA扩增条带经琼脂糖凝胶电泳测定大小为500bp左右，且上下无杂带。
4.PCR产物结果鉴定，委托生工生物工程(上海股份有限公司)进行测序。根据blast结果，菌株NSH-5与Fusarium verticillioides亲源关系最近。
本发明高效表达石杉碱真菌菌株具有下述特征：
1.镜下形态特征
如图3所示，有隔菌丝，分生孢子梗从气生菌丝中长出，不分枝或呈轮枝状分枝，单瓶梗产孢，分生孢子排列呈链状或形成假头状(图4，a)。产两种分生孢子，大分生孢子少见，呈镰刀形，细长，中部较直，两端略弯，3-6个分隔；小分生孢子较多，具多形，呈卵圆形至棍棒状，1-2分隔(图4，b)。无厚垣孢子形成。
2.在真菌用PDA培养基上的特征：
生长速度较快，气生菌丝浓密发达呈棉絮状，培养4天后直径约为4.0cm，菌落正表面较松呈苍白色絮状，背面中心成淡黄棕色。
3.该真菌菌株高效表达石杉碱甲的培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基。具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
(2)培养条件：27℃，220r/min。
(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml。
(4)培养时间：7天。
本发明的NSH-5株为轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)种、镰刀菌属真菌，经液体发酵培养提取代谢产物，可获得较高产量石杉碱甲。
本发明真菌菌株的ITS与同属的相同种的比对结果及进化树(如图5)：
经鉴定和进化树分析本发明真菌菌株归属于轮状镰刀菌(Fusariumverticillioides)种，命名为轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)种NSH-5株。
该属鲜有报道具有产石杉碱甲能力。通过对其机理研究，可以进一步加深菌株产石杉碱甲中高效表达基因的研究，从而构建新的转基因生物，使其获得更高效的表达。镰刀菌属轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)种NSH-5株作为一种新的产石杉碱甲菌株，将为生物合成途径合成石杉碱甲提供新的菌种资源。
序 列 表
<110> 西安医学院
<120> 一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌及其应用
<130> 无
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> SEQ ID NO:1
<211> 532
<212> DNA
<213>轮状镰刀菌（Fusarium verticillioides）
<400> 1
cggagggatc attaccgagt ttacaactcc caaacccctg tgaacatacc aattgttgcc 60
tcggcggatc agcccgctcc cggtaaaacg ggacggcccg ccagaggacc cctaaactct 120
gtttctatat gtaacttctg agtaaaacca taaataaatc aaaactttca acaacggatc 180
tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag caaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 240
attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat 300
gcctgttcga gcgtcatttc aaccctcaag ccctcgggtt tggtgttggg gatcggcgag 360
cccttgcggc aagccggccc cgaaatctag tggcggtctc gctgcagctt ccattgcgta 420
gtagtaaaac cctcgcaact ggtacgcggc gcggccaagc cgttaaaccc ccaacttctg 480
aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca at 532

Claims (5)

1.一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，其特征在于，该菌株从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于镰刀菌属、轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)NSH-5株，在实验室传代20代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，其特征在于，该真菌菌株表达石杉碱甲培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；
(2)培养条件：27℃，220r/min；
(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml；
(4)培养时间：6-8天。
3.根据权利要求1所述的具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌，其特征在于，该真菌菌株高效稳定性表达石杉碱甲时，该菌株的实验室保存条件为：(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后，生长时间为60h；(2)保存菌种条件为4℃，12h后在将其放置-25℃冰箱中进行保存。
4.一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌在用于治疗阿尔茨海默病和血管性痴呆的生物合成制药方面的应用。
5.一种具有产石杉碱甲功能的镰刀属内生真菌的应用，其特征在于，通过转基因、诱变育种对真菌菌株进行基因改造，以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株。
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