CN110358687A - 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 - Google Patents

一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110358687A
CN110358687A CN201811595882.5A CN201811595882A CN110358687A CN 110358687 A CN110358687 A CN 110358687A CN 201811595882 A CN201811595882 A CN 201811595882A CN 110358687 A CN110358687 A CN 110358687A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gibberella
lactone
culture medium
pantoic acid
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811595882.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110358687B (zh
Inventor
余继刚
史实
陈雷
汤伟强
王淯
汪晓东
廖志刚
杨靖昌
王娜娜
王保如
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Ruida Health Industry Co ltd
Original Assignee
Anhui Ruida Health Industry Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Ruida Health Industry Co ltd filed Critical Anhui Ruida Health Industry Co ltd
Priority to CN201811595882.5A priority Critical patent/CN110358687B/zh
Publication of CN110358687A publication Critical patent/CN110358687A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110358687B publication Critical patent/CN110358687B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

针对现有生产D‑泛解酸内酯的菌株发酵过程中生物量偏低的问题，本发明公开了赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016保藏号为CGMCC No.16374，属于微生物领域。本发明的赤霉菌(Gibberella sp.)发酵过程中生物量干重高达35g/L。同时本发明还提供一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL‑泛解酸内酯中的应用、赤霉菌(Gibberella sp.)RD016的发酵方法和赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在制备D‑泛解酸内酯中的应用。

Description

一株产D泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一株产D泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法。
背景技术
D-泛酸钙为维生素类药物，广泛应用于医药、食品、饲料工业。D-泛解酸内酯是合成D-泛酸钙及D-泛醇的重要前体物，因此从80年代起人们便对DL-泛解酸内酯进行拆分。现在对DL-泛解酸内酯拆分的方法主要有化学法、生物法。由于化学法存在试剂用量大、环境污染严重等缺点，因此人们对生物法进行了一系列的研究。生物法制备D泛解酸内酯主要有酶法，微生物法，已报道的研究有多种酶及微生物的技术路线。
如今比较成熟的且已经应用到商业化的酶法为用微生物选择性水解D-泛解酸内酯，即利用微生物D-立体专一性内酯水解酶选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，D-泛解酸再经过内酯化反应生成D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯并不被水解，未水解部分经过消旋化可反复使用。该方法不要求水解彻底，反应时间短，得到产品泛解酸内酯的光学纯度高，反应容易控制，底物的浓度可以很高。该方法的路线如下：
国内江南大学孙志浩教授与浙江鑫富生化股份有限公司合作，其选育了一株高产量且立体专一性水解泛解酸内酯的微生物菌株串珠镰孢霉Fusadum.moniliforme SW-902(中国微生物菌种保藏号CGMCCNo.0536)，此菌株已经做为鑫富公司的生产菌株用于工业生产数十年，此菌株经过各种工艺优化后，专利报道的最终发酵生物量为干重6～8g/L，酶活力0.87-0.92U/g干菌体。得到的酶解产物D泛解酸光学纯度达到99％e.e.。此专利法的微生物活力及微生物产量都还有很大的提升空间。
由此可知，现有生产D-泛解酸内酯的菌株，其发酵过程中生物量偏低。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有生产D-泛解酸内酯的菌株发酵过程中生物量偏低的问题，本发明提供一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016保藏号为CGMCCNo.16374。所述赤霉菌(Gibberella sp.)的发酵过程中生物量干重高达35g/L。同时本发明还提供一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用、赤霉菌(Gibberella sp.)RD016的发酵方法和赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在制备D-泛解酸内酯中的应用。2、技术方案
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，其保藏号为CGMCC No.16374。
赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用。
优选的，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。
优选的，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。
优选的，所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵所用的培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0；
优选的，每升所述培养基中甘油38～40mL，葡萄糖25～30g，玉米浆25～32g，大豆蛋白粉20～30g硫酸镁3～3.4g，磷酸氢二钾2～2.4g，pH调至7.0～8.0；
优选的，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0-8.0。
上述的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵方法，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016先接种至发酵罐中的培养基发酵，接种量为0.1％～1％，发酵温度28～35℃，装液量50～70％，发酵过程中通气量为0.5～2vvm，pH为7.0～8.0，发酵时间96h～120h。
优选的，所述培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0。
优选的，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0-8.0。
赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在制备D-泛解酸内酯中的应用。
优选的，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵过程中的生物量干重达到35g/L，现有技术中，相关生产菌株的发酵过程中生物量为干重6～8g/L。
(2)本发明的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016水解DL-泛解酸内酯后得到的D-泛解酸内酯的光学纯度达到96％e.e.，酶活达到41.1U/L，换算为菌体酶活为1.17U/g，转化率为45％～48％，现有技术中的生产菌株的酶活力为0.87-0.92U/g。
生物保藏说明：
本发明提供的赤霉菌(Gibberella sp.)，菌株名称为RD016，已于2018年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.16374。
附图说明
图1、高密度发酵酶活、生物量变化趋势；
图2、菌体镜检照；
图3、DL-泛解酸内酯的反向HPLC图；
图4、DL泛解酸的反向HPLC图；
图5、DL-泛解酸内酯正向手性柱HPLC图；
图6、DL-泛解酸的正向手性柱HPLC图；
图7、D泛解酸内酯标准品正向手性柱HPLC图；
图8、重结晶后的D-泛解酸内酯正向手性柱HPLC图；
图9a、L泛解酸内酯消旋前正向手性柱HPLC图；
图9b、L泛解酸内酯消旋后正向手性柱HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细描述。
实施例1菌株分离和鉴定
从合肥市大蜀山森林公园土壤里，油脂厂，醋厂，酒厂，污水处理厂等，各采集土壤20g，称取5g加入无菌水500mL，于28℃、150rpm下孵育3h，后离心取上清液涂PDA抗生素平板，于28℃培养箱里培养。将平板上的单菌落进行单独培养支菌株，在PDA培养基基础上添加5g/L花生油继续筛选潜在D-泛解酸内酯水解酶菌株，根据透明圈和菌丝生长圈比例，选取RD01，RD02，RD03，RD04，RD05，RD06进行发酵实验。
PDA培养基(1L)：葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H2O 1.5g，VB1 0.002g，氨苄青霉素50mg，琼脂15g，20％土豆汁。菌株在PDA培养基上生长良好，菌丝旺盛。
实施例2产D-泛解酸内酯水解酶菌株筛选
将RD01，RD02，RD03，RD04，RD05，RD06，Fusarium culmorum CGMCC 3.4283，Fusarium sphaerosporum CGMCC 3.4488，Cylindrocaron sp.CGMCC 3.3591，Fusariumoxysporum AS3.1785共10支菌株进行发酵，从PDA平板上分别接种4块1cm直径的琼脂块至YMG种瓶中，种瓶于28℃、180rpm下培养48h后，以0.1％接种量接种至SF-1培养基中，继续发酵7天后过滤收集菌体。接种量＝种子液的体积/SF-1培养基的体积。
以上菌株中其中：Fusarium culmorum CGMCC 3.4283；Fusarium sphaerosporumCGMCC3.4488；Cylindrocaron sp.CGMCC 3.3591，Fusarium oxysporum AS 3.1785为购买菌株，购买自北纳生物菌种保藏中心。
取干菌体2g，30mL 0.5M Tris-cl(pH 7.5)溶解10％的DL-泛解酸内酯，28℃震荡反应2h后将菌体过滤，取上清液进行HPLC检测。
酶活定义：在上述条件下，每分钟水解1umol D-泛解酸内酯成D-泛解酸的酶量定义为1个酶活力单位(1U)。
D-泛解酸内酯含量、转化率和光学纯度(％e.e.)通过如下液相方法测定。
HPLC检测条件：使用岛津LC-20A系统，柱子型号：wondasil C18-WR 5μm 4.6×250mm，流动相为乙腈：水＝10：90；流速1mL/min，柱温30℃，检测波长215nm。
转化率％＝(投入底物DL-泛解酸内酯含量-未水解的DL-泛解酸内酯含量)/投入底物DL-泛解酸内酯含量×100；
YMG培养基(1L)：葡萄糖4g，酵母提取物4g，麦芽提取物10g，其余为水。
SF-1培养基(1L)：甘油20mL，葡萄糖20g，玉米浆40g，pH调至7.0，其余为水。
发酵的10支菌株通过上述HPLC检测转化率和光学纯度e.e.见表1。
表1筛选菌株产酶结果
序号 菌株 转化率(％) e.e.值(％)
1 RD01 18 67
2 RD02 12 81
3 RD03 20 96
4 RD04 5 55
5 RD05 7 75
6 RD06 21 71
7 Fusarium sphaerosporum CGMCC 3.4488 20 92
8 Fusarium culmorum CGMCC 3.4283 25 71
9 Cylindrocaron sp.CGMCC 3.3591 24 93
10 Fusarium oxysporum AS 3.1785 29 94
其中RD03催化底物DL-泛解酸内酯得到D-泛解酸内酯的e.e.值较高。
实施例3产D-泛解酸内酯水解酶菌株诱变
将装有RD03的种瓶中制备的菌体打碎，取2～4mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
精确称取NTG(亚硝基胍)2、4、6、8、10mg于小试管中，按10mg NTG加丙酮溶液1mL的比例溶解NTG配成NTG试液。分别将不同浓度的NTG试液移到装有菌体悬浮液的小口试剂瓶中，使用前NTG的终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L，于32℃下振荡，转速130rpm，震荡30～60min，然后以转速为500rpm离心15分钟，取菌体，分别用磷酸缓冲液洗涤菌体3次，取菌体沉淀.用生理盐水稀释后涂PDA平板，将突变后菌株单菌落挑出进行如实施例2中方法进行发酵，在发酵第5天时菌体产酶活力达到最高，在第5天收集菌体。检测转化率和e.e.值。采用实施例2的HPLC条件进行检测。
通过多轮诱变筛选，获得一株D-泛解酸内酯水解酶产酶菌株：Gibberellasp.RD016保藏号为CGMCC No.16374，该菌株转化率相对于诱变前提高了10％～20％，产酶时间由7天缩短至5天，降低了生产成本。
对RD016进行菌种鉴定，包括形态鉴定、生化鉴定、ITS序列测序分析。
ITS鉴定过程如下：
从PDA斜面上挑取4块约1cm直径大小的菌体接种至100mL YMG培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm下振荡培养5天，收集菌体。基因组抽提方法可以参考专利CN201710235246.0。
根据真菌的18S和28S rDNA保守序列设计两个ITS引物P1(5’-TCCGTAGGTGAA-CCTGCGG-3’)和P2(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。以基因组DNA为模版，设置反应体系如下：10ng基因组DNA，1×TransTaq-T buffer，0.2μmol/L P1和P2，0.2mmol/L dNTPs，2.5UTrans Taq-T DNA聚合酶，补水至50μL。扩增程序为：94℃，5min；55℃，2min；72℃，2min；94℃，1min；55℃，50s；72℃，55s；72℃，5min，共30循环。回收目标产物进行测序。
形态学鉴定：
通过微生物镜检，通过显微镜观察可知，菌丝体较发达，大量气生菌丝交织成白色绒毛状。符合霉菌的典型特征。
生化鉴定：
通过发酵培养后进行催化底物DL-泛解酸内酯，发现活性高于大多数霉菌。
将其与已知产水解泛解酸内酯水解酶的菌株比较发现，同样的培养条件下，只有发明的菌株RD016转化DL-泛解酸内酯最多。与CGMCC No.16374基因匹配度较高且亲缘关系很近的Gibberella moniliformis FM24，但是转化DL-泛解酸内酯的活性却不同，CGMCCNo.16374与本属其他菌种相比，应该存在某种(或几种)特定的功能基因不同，从而具备高效转化DL-泛解酸内酯的能力。通过以上鉴定结果，确认CGMCC No.16374为来自Gibberella属的新菌株。
ITS序列为SEQ ID NO：1
实施例4产D-泛解酸内酯水解酶菌株培养基正交优化
将诱变后得到的菌株Gibberella sp.RD016分别接种到4块1cm直径的琼脂块至YMG种瓶中，种瓶于28℃、180rpm下培养48h后，以0.1％接种量接种至培养基中发酵，继续发酵5天后过滤收集菌体，HPLC检测酶活。接种量＝种子液的体积/培养基的体积。
培养基配方
每升培养基中包括以下成分：
甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0，其余为水。
培养基正交设计表如下：
表2：正交优化水平设计
根据表2输出结果如下：
表3：正交优化结果分析
通过表3可以得到优化后的培养基配方，每升优化后的培养基中包括以下成分：甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0，其余为水。
实施例5产D-泛解酸内酯水解酶菌株高密度发酵
将诱变后得到的菌株Gibberella sp.RD016分别接种4块1cm直径的琼脂块至YMG种瓶中，种瓶于28℃、180rpm下培养48h后，以0.1％接种量接种至优化后的培养基中，接种前，先将优化后的培养基加入到发酵罐中，发酵罐总体积为10L，装液量为6L。发酵过程中通气量为0.5vvm，温度为28℃。转速设置为前期设置为200rpm，在DO降至0％时改为500rpm。以1M硫酸和25％氨水维持整个发酵过程pH为7.0，发酵至96小时酶活与生物量已达到平台期，发酵结束下罐。发酵过程中生物量以PCV(％)计量(图1)。
PCV测量方法：量取10mL发酵液，以3000rpm离心10min后，将上清液倒出，测量，测得上清液的体积为V1mL，则PCV(％)＝(10-V1)/10×100。
发酵96小时结束后，此时将菌体取出烘干至恒重测得生物量为干重35g/L，酶活测定最高为41.1U/L，换算为菌体酶活为1.17U/g。如图1、图2所示，在96小时发酵结束后镜检及发酵罐中菌体状态，菌体在发酵时酶活和生物量在80小时接近最高峰值，随后增加速度降慢。
表4本申请与现有生产技术比较：
实施例6产D-泛解酸内酯水解酶菌株高密度发酵
将诱变后得到的菌株Gibberella sp.RD016分别接种4块1cm直径的琼脂块至YMG种瓶中，种瓶于35℃、180rpm下培养48h后，以1.0％接种量接种至优化后的培养基中，接种前，先将优化后的培养基加入到发酵罐中，发酵罐总体积为10L，装液量为7L。发酵过程中通气量为2.0vvm，温度为35℃。转速设置为前期设置为200rpm，在DO降至0％时改为500rpm。以1M硫酸和25％氨水维持整个发酵过程pH为8.0，发酵至120小时酶活与生物量已达到平台期，发酵结束下罐。
实施例7
将比旋度为零的DL-泛解酸内酯，用含50mmol CaCl2的水溶液配制成30％浓度为底物；加按实例5方法制备的湿菌体，加酶量为0.5U/g，置摇床30℃，180r/min反应，每30min取样进行高压液相色谱分析及比旋光测定(比旋光度为采用旋光仪测定，参照国标)，并用浓氨水调节反应液的pH值为7.0。酶解时间为6～18小时。将反应结束后滤出的菌丝体，加入新的底物继续反应，如此反复，重复利用6次。表5结果表明，酶水解后，得到的酶转化率为47％左右，经内酯化后萃取的产品D-泛解酸内酯的比旋光度为[α]D20＝-47°。加酶量为0.5U/g表示相对于底物的加酶量，比如底物DL-泛解酸内酯用量为10g，则加酶量为5U。
表5、检测结果
转化次数 1 2 3 4 5 6
转化率 48.1 47.5 47.6 47.4 47.2 47.2
实施例8
称取比旋度为零的DL-泛解酸内酯300g，用含50mmol CaCl2的水溶液配制成30％浓度为底物，体系为1L，添加按实例5的方法制备的湿菌体，按实施例7的方法酶水解。所得的酶解液1000ml过滤所得的清液，用体积比为1∶(1～3)的乙酸乙酯萃取3次，分离出水相，水相中主要含已转化的D-泛解酸(图4，图6)。水相用HCl调pH为1进行内酯化反应后，再用乙酸乙酯萃取提取，有机相进行蒸发回收溶剂，得到D-泛解酸内酯粗品138.6g，粗品得率46.2％。图4中，在反向条件下D型和L型的泛解酸都在同一位置出峰，该位置的保留时间为2.870。图6中，保留时间22.758的峰为L型的泛解酸，保留时间41.998的峰为D型的泛解酸。
粗品测定比旋光为[α]D20＝-48°，进行液相检测，液相图见图3和图5。粗品用乙酸乙酯重结晶，得D-泛解酸内酯纯品119.2g(图8)，重结晶收率86％，对DL-泛解酸内酯得率39.7％，产品比旋光为[α]D20＝-51°，HPLC测定D-泛解酸内酯光学纯度为96％e.e.。其中，图7为D泛解酸内酯标准品图。图7中，保留时间9.863的峰为D泛解酸内酯。图3中，保留时间9.086的峰为DL-泛解酸内酯，在反向条件下D型和L型的泛解酸内酯都在同一位置出峰。图5中，保留时间28.716的峰为L泛解酸内酯，保留时间34.127的峰为D泛解酸内酯。图8中，保留时间为9.579的峰为D泛解酸内酯，保留时间为8.119的峰为L泛解酸内酯。
收集L-泛解酸内酯及未转化的D-泛解酸内酯，蒸发浓缩回收溶剂后，用NaOH溶液130℃加热2小时，进行消旋化反应。回收得到DL-泛解酸内酯168.2g，直接用于下次酶反应。图9a为L泛解酸内酯消旋前正向手性柱HPLC图，图9b为L泛解酸内酯消旋后正向手性柱HPLC图。
按此计算，得到的D-泛解酸内酯纯品对DL-泛解酸内酯消耗量(酶水解的D-泛解酸内酯)的得率为90.4％。从图9a和图9b中，可以看出，消旋前几乎全为L型，消旋后D型和L型约各占一半。
反向检测条件：使用岛津LC-20A系统，柱子型号：wondasil C18-WR 5μm 4.6×250mm，流动相为乙腈：水＝10：90；流速1mL/min，柱温30℃，检测波长215nm；
图3和图4采用上述液相条件得到。
正向手性柱检测条件：使用岛津LC-15C系统，柱子型号：大赛璐CHIRALPAK 5μm4.6×250mm，流动相为正已烷：丙酮＝40：60；流速1mL/min，柱温30℃，检测波长215nm；
图5、图6、图7、图8、图9a和图9b均采用上述液相条件得到。

Claims (10)

1.一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.16374。
2.权利要求1所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用。
3.根据权利要求2所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。
4.根据权利要求2所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。
5.根据权利要求4所述的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵所用的培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0；
优选的，每升所述培养基中甘油38～40mL，葡萄糖25～30g，玉米浆25～32g，大豆蛋白粉20～30g，硫酸镁3～3.4g，磷酸氢二钾2～2.4g，pH调至7.0～8.0；
优选的，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0-8.0。
6.一种权利要求1所述的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵方法，其特征在于，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016先接种至发酵罐中的培养基发酵，接种量为0.1％～1％，发酵温度28～35℃，装液量50～70％，发酵过程中通气量为0.5～2vvm，pH为7.0～8.0，发酵时间96h～120h。
7.根据权利要求6所述的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵方法，其特征在于，所述培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0。
8.根据权利要求7所述的赤霉菌(Gibberella sp.)RD016发酵方法，其特征在于，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0-8.0。
9.根据权利要求1所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在制备D-泛解酸内酯中的应用。
10.根据权利要求1所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在制备D-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，将所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。
CN201811595882.5A 2018-12-19 2018-12-19 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 Active CN110358687B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811595882.5A CN110358687B (zh) 2018-12-19 2018-12-19 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811595882.5A CN110358687B (zh) 2018-12-19 2018-12-19 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110358687A true CN110358687A (zh) 2019-10-22
CN110358687B CN110358687B (zh) 2020-12-04

Family

ID=68214839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811595882.5A Active CN110358687B (zh) 2018-12-19 2018-12-19 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110358687B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046337A (zh) * 2021-03-18 2021-06-29 赤峰制药股份有限公司 一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60199388A (ja) * 1984-03-22 1985-10-08 Seitetsu Kagaku Co Ltd Ｄ−パント酸塩または／およびｄ−パントラクトンの製造方法
CN1768141A (zh) * 2003-03-28 2006-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 泛酸内酯水解酶
CN1793321A (zh) * 2005-11-22 2006-06-28 浙江杭州鑫富药业股份有限公司 产d－泛解酸内酯水解酶的微生物及其制备d－泛解酸的方法
CN101392278A (zh) * 2008-06-11 2009-03-25 济南大华广济畜牧发展有限公司 微生物混合发酵制备d-泛解酸内酯的方法
CN107523558A (zh) * 2017-10-16 2017-12-29 宁夏金维制药股份有限公司 一种d‑泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
CN108004291A (zh) * 2017-12-21 2018-05-08 浙江新和成股份有限公司 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60199388A (ja) * 1984-03-22 1985-10-08 Seitetsu Kagaku Co Ltd Ｄ−パント酸塩または／およびｄ−パントラクトンの製造方法
CN1768141A (zh) * 2003-03-28 2006-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 泛酸内酯水解酶
CN1793321A (zh) * 2005-11-22 2006-06-28 浙江杭州鑫富药业股份有限公司 产d－泛解酸内酯水解酶的微生物及其制备d－泛解酸的方法
CN101392278A (zh) * 2008-06-11 2009-03-25 济南大华广济畜牧发展有限公司 微生物混合发酵制备d-泛解酸内酯的方法
CN107523558A (zh) * 2017-10-16 2017-12-29 宁夏金维制药股份有限公司 一种d‑泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
CN108004291A (zh) * 2017-12-21 2018-05-08 浙江新和成股份有限公司 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046337A (zh) * 2021-03-18 2021-06-29 赤峰制药股份有限公司 一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110358687B (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104328064A (zh) 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用
CN109294933A (zh) 一株酿酒酵母及其与产酯酵母共培养提高传统发酵食品品质的方法
CN107227273A (zh) 凝结芽孢杆菌及其制备l‑乳酸的应用
CN106834141A (zh) 一种厌氧真菌及用其发酵水稻秸秆生产甲酸的方法
CN106834140A (zh) 一种厌氧真菌及用其发酵小麦秸秆生产乙醇的方法
CN104830712A (zh) 一种产高纯度2-酮基-d-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株
CN101195801A (zh) 灵芝多糖制备设备和制备工艺
CN105695340A (zh) 一种米曲霉及其应用
CN108546660A (zh) 甲壳素脱乙酰基酶高产菌株及其应用
CN103421850A (zh) 一种利用丰富栅藻生产生物乙醇的方法
CN106635920A (zh) 一种高产岩藻多糖酶的海洋交替假单胞菌及其应用
CN104673712A (zh) 一株同步利用葡萄糖与木糖生产醇类燃料的菌株及其应用
CN104762229B (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN103725719A (zh) 生产羧酸和/或醇的方法
CN103146776B (zh) 一种用枯草芽孢杆菌生产靛蓝色素的方法
CN110358687A (zh) 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法
CN102690773B (zh) 一株肠杆菌fy-07及其静态液体深层发酵生产细菌纤维素的方法
CN101988075B (zh) 一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法
CN101531979A (zh) 肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2，3-丁二醇的方法
CN106754486A (zh) 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
CN105462857A (zh) 一种安络小皮伞菌株及其应用
CN105112320B (zh) 一种唐菖蒲伯克霍尔德菌株及其发酵生产碱性脂肪酶的方法
CN107674839A (zh) 一种腐皮镰刀菌及其发酵生产右旋糖酐酶的方法
CN106754829A (zh) 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用
CN107365730A (zh) 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant