CN101255457B - 鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列和方法，属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域。本发明提供了用于鉴定蜂头虫草的来自蜂头虫草核糖体rRNA内转录间隔区的特征性核苷酸序列及在其基础上设计的核酸分子探针和包含该探针的蜂头虫草鉴定试剂盒，以及利用该序列、探针或试剂盒通过PCR或核酸杂交的方式鉴别蜂头虫草的方法。利用本发明，可以方便、快速、准确的进行蜂头虫草(包括菌丝体、子实体以及相关的制品)的鉴定，本发明使用分子生物学手段排除了鉴定中的人为影响、鉴定结果客观准确，鉴定时间短，半天即可完成。

Description

鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列和方法

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域。具体的说，是用于鉴别蜂头虫草[Cordyceps sphecocphala(Klotzsch)Sacc]的特征性核苷酸序列以及核酸分子探针和鉴别蜂头虫草的方法。

背景技术

蜂头虫草[Cordyceps sphecocephala(Klotzsch)Sacc]是属于虫草属(Cordyceps)的一种虫生真菌，该属真菌还包括冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc]以及蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]。野生冬虫夏草用于中药已有两千年的历史，普通民众俗称的虫草即为冬虫夏草，具有保肺肾、补精髓、化痰止劳咳的作用，常食可促进消化、调节免疫功能，增强人体抵抗力。冬虫夏草产于青藏高原，产量相对较大，但随着逐年的疯狂采挖，导致生态环境遭到破坏，引起国家重视，现已禁止采挖，引起价格的大幅上涨。但由于人工发酵菌丝生产冬虫夏草菌粉周期长达40天以上，且条件苛刻，成本很高，同时子实体至今仍然无法人工栽种，故寻找和开发冬虫夏草的替代品成为虫草资源开发与应用的重要方向。蛹虫草又称北虫草或北冬虫夏草，具有益肺肾，补精髓，止血化痰的功能，与冬虫夏草具有相似的温补特性，同时含有冬虫夏草中含量极低的虫草素。由于蛹虫草菌丝的发酵生产以及子实体的栽培均比冬虫夏草容易，故蛹虫草的生产与栽培已形成相当的规模，市场销售有了突破性的增长。蜂头虫草与前面两者具有相似的功能，而且菌丝发酵与子实体栽培都很容易，完全具有开发为虫草新产品的价值。因此可以快速而准确的鉴别蜂头虫草菌丝、子实体以及相关制品真伪的方法和技术将对于蜂头虫草生产相关企业以及相关检验机构具有重要的意义。

DNA是生物储存遗传信息的物质，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，可以作为该生物物种或个体区别与其他物种或个体的标志。DNA是细胞生物的基本组成部分，作为遗传信息的载体，具有一定的稳定性，不会受表形的影响而改变，是用来鉴别物种、个体的可靠依据。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核苷酸序列，利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、准确的对物种或个体进行鉴别。目前，已有用于鉴别冬虫夏草的核苷酸特征性序列获得专利，但并未见与蜂头虫草鉴别相关的核苷酸特征性序列的专利。

发明内容

本发明提供利用分子生物学手段鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列以及方法，它可以直接从遗传本质上鉴别蜂头虫草菌丝、子实体以及相关制品的真伪。具体包括：1、用于分子鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列；2、来源于上述特征性序列的蜂头虫草专一性核苷酸分子探针；3、包含上述分子探针的用于鉴别蜂头虫草的试剂盒；4、利用上述特征性核苷酸序列、核苷酸分子探针以及试剂盒鉴别蜂头虫草的方法。

本发明提供的用于分子鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列来源于蜂头虫草核糖体rRNA内转录间隔区(以下简称ITS)以及5.8S rRNA基因(核糖体rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因合并简称ITS区)，其序列(SEQ ID NO.1)所在位置以及特征见图1、图2及序列表，该序列包含蜂头虫草的ITS1、5.8S rDNA以及ITS2的序列。该序列(SEQ ID NO.1)可通过实施例1所述方法获得，亦可通过人工合成的方法在商业化的DNA合成仪器上按照发明人提供的核苷酸顺序合成。

本发明的蜂头虫草专一性核苷酸分子探针是以上述蜂头虫草的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为模板而设计得到的全长序列或不少于16个核苷酸组成的寡核苷酸序列，以及在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上经修饰、加工、变化而获得核苷酸序列，也包括在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上在5’端添加或改变10个核苷酸以下或改变原有核苷酸序列数量小于10％以及3’端6个核苷酸改变不足1个核苷酸的核苷酸序列。上述序列可通过DNA自动合成仪等DNA合成装置按照设计好的顺序合成而获得，并可以通过酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等方式进行标记。

本发明提供了优选的两个蜂头虫草专一性核苷酸分子探针Probe I及Probe II，其序列分别为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3，其具体位置见图2。该序列同样适用于上述修饰、加工与变化、添加酶切位点、改变部分核苷酸序列以及标记等操作。

本发明提供的上述探针具有极高的专一性，可以与蜂头虫草发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。利用上述探针通过PCR的方法或核酸杂交的方法可以快速的对蜂头虫草的菌丝、子实体以及相关的制品进行检测，从而快速鉴别蜂头虫草。

本发明还提供一种有蜂头虫草专一性核酸分子探针和相关PCR引物及试剂组成的蜂头虫草专一性鉴定试剂盒，包括：1、两个优选的蜂头虫草专一性核苷酸分子探针(Probe I及Probe II)；2、两个虫草菌ITS通用引物；3、蜂头虫草DNA提取试剂。其中，两个虫草菌的通用引物是CorF(SEQ ID NO.4)和CorR(SEQ IDNO.5)。所述的蜂头虫草DNA提取试剂为尿素提取液，其成分含有SDS 1.5％，尿素7mol/L，Tris-HCl pH8.0 0.05mol/L，NaCl 0.5mol/L。利用本试剂盒通过常规的PCR方法即可准确、快速的鉴定蜂头虫草。

本发明提供的蜂头虫草鉴定方法包括核酸杂交以及PCR的方法。

核酸分子杂交发：采用前面所述的蜂头虫草专一性的核酸分子探针，通过核酸分子杂交的方式(例如Southern杂交或点杂交)对蜂头虫草及相关制品进行鉴定。具体步骤和过程(包括探针的制备、标记以及待测样品的处理)按照常规的分子生物学方法进行。其中，蜂头虫草的菌丝、子实体以及相关制品可以直接进行检测也可以先进行DNA的提取与扩增后再进行检测。

PCR方法：采用前面所述的蜂头虫草专一性的核酸分子探针Probe I及Probe II作为一组PCR引物，以如前所述虫草菌ITS区通用引物CorF及CorR作为阳性对照组的PCR引物，分别利用上述两组引物按照常规的PCR方法扩增待测样品，两者均能扩增到特异性DNA片段的样品即为蜂头虫草，其中利用ProbeI及Probe II获得的DNA片断长为290bp，利用CorF及CorR获得的DNA片断长为600bp左右。仅虫草菌ITS通用引物CorF及CorR能够得到特异性片段而本发明提供的蜂头虫草专一性的核酸分子探针组成的PCR引物Probe I及Probe II不能扩增到特异性DNA片段的样品则不是蜂头虫草样品。其中，PCR反应可以利用本发明所述的试剂盒中的试剂或按照常规的分子生物学方法提取的蜂头虫草样品总DNA作为模板，也可以直接挑取少量的蜂头虫草样品加入PCR反应体系作为模板。

本发明由于有采用DNA序列作为检测标志，因此可以准确快速检测未知样品是否为或含有蜂头虫草，其中样品可以为菌丝体、子实体及其粉碎加工产品以及包含有蜂头虫草的中成药制剂、保健品。采用PCR方法检测时，所需样品量极少，方法简单，半天内可完成检测。

附图说明

图1是核糖体rRNA基因结构示意图，其中标示为ITS区的范围为本发明涉及的DNA序列，即核糖体rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因；

图2是本发明所述的蜂头虫草特征性核苷酸序列全序列以及优选的两个蜂头虫草专一性核苷酸分子探针Probe I及Probe II的位置图，该图显示ITS区正链序列，左侧为5’端，右侧为3’端，其中加粗及下划线部分分别为Probe I(46bp-64bp，位于正链上)及Probe II(337bp-316bp，位于负链上)；

图3是实施例3中的PCR反应结果示意图，其中1为蚁虫草，2为古尼虫草，3为蛹虫草，4为尖头虫草，5为蜂头虫草，M为1Kb+100bp DNA分子量标准，-为空白对照；

图4是实施例4中的PCR反应结果示意图，其中1为蚁虫草，2为古尼虫草，3为蛹虫草，4为尖头虫草，5为蜂头虫草，M为1Kb+100bp DNA分子量标准，-为空白对照。

具体实施方式

实施例1蜂头虫草rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因的制备

取蜂头虫草样品0.1-0.5g，液氮中研磨成粉，加入300μl尿素提取液(SDS 1.5％，尿素7mol/L，Tris-HClpH8.0 0.05mol/L，NaCl 0.5mol/L)，移入1.5ml微型离心管中，在液氮中冷却，迅速移到65℃融化。反复冻融3～5次后，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，13000r/min离心10min，上清移入新管中加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，13000r/min离心10min，上清移入新管中加入微量RnaseA，37℃保温30min，加入3倍体积无水乙醇，3M NaAc(pH5.2)，-20℃放置至少30min后，13000rpm离心15min，回收DNA沉淀，用70％乙醇和无水乙醇洗涤，抽干或风干，每管加入50ulTE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，pH8.0)回溶，获得总DNA。取0.2ml PCR管一支，加入20ul PCR反应液(包括10xPCR缓冲液2ul，引物CorF、CorR各40ng，2mmol/L dNTP 1ul，Taq酶1个单位，加超纯水至20ul)，加入0.5ul蜂头虫草总DNA提取液，闭紧管盖，置于PCR仪上按以下程序进行PCR反应：94℃预变性3min，然后93℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应完成后利用商业化的纯化试剂盒进行产物的纯化并直接在DNA测序仪上测序。获得核苷酸序列除去18S rRNA基因以及28S rRNA基因序列后所得到的序列即为蜂头虫草rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因的序列如序列表1所示。

实施例2蜂头虫草专一性探针(引物)Probe I及Probe II的制备

将蜂头虫草的ITS区序列与其他虫草菌的同源序列进行比较，获得最适于鉴别蜂头虫草寡核苷酸片段组成与排列顺序，即Probe I及Probe II(如图2所示Probe I位置是46bp-64bp，位于正链上，Probe II位置是337bp-316bp，位于负链上)。根据Probe I及Probe II的核苷酸排列和组成可以在商业化的DNA合成仪上通过化学合成的方法合成如序列表2、序列表3所载序列，即可用作专一性PCR引物。再此基础上，可以利用常规的分子生物学方法利用酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等对Probe I及Probe II进行标记，即可用做杂交用探针。

实施例3鉴定蜂头虫草的正对照试验

本试验用以确定DNA样品符合PCR要求可获得特异性PCR产物。

方法1：总DNA提取以及PCR反应皆参照实施例1进行，对不同的样品分别提取DNA，并在同一条件下进行PCR扩增，其中包括不添加模板的空白实验，扩增的产物在2％的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的光源下查看以及拍照。

方法2：用牙签直接挑取适量样品(菌丝、粉碎子实体、粉碎的相关制品)在装20ul超纯水的0.2ml PCR管种搅动，并取少量分别稀至0.1倍以及0.01倍，取2ul上述三个浓度的样品悬浊液加入含有20ul PCR反应液(包括10xPCR缓冲液2ul，引物CorF、CorR各40ng，2mmol/L dNTP 1ul，Taq酶1个单位，加超纯水至20ul)的0.2ml PCR管中，充分混匀闭紧管盖，其中包括不添加样品的空白实验，全部PCR管置于PCR仪上进行如下PCR反应：94℃预变性3min，然后93℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增的产物在2％的含有DNA着色剂的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的光源下查看以及拍照。

图3为按方法1进行的实验结果，显示五种虫草(1为蚁虫草，2为古尼虫草，3为蛹虫草，4为尖头虫草，5为蜂头虫草)均可正常的扩增得到ITS区DNA特异性片段，该结果表明五种待测虫草提取的总DNA符合PCR扩增的要求，可以用作专一性检测的待测样品，空白实验结果排除了假阳性的可能。

实施例4蜂头虫草专一性鉴别

用以从符合PCR要求的样品中专一性的扩增蜂头虫草，从而鉴别蜂头虫草。

方法1：使用实施例3中符合PCR反应要求的样品如实施例1中方法进行PCR扩增(包括不添加模板的空白实验)，其中引物替换为Probe I及Probe II，反应条件为94℃预变性3min，然后93℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增的产物在2％的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的光源下查看以及拍照。

方法2：使用实施例3中符合PCR反应要求的样品悬浊液如实施例3中方法2所述进行PCR反应，其中引物替换为Probe I及Probe II，反应条件为94℃预变性3min，然后93℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增的产物在2％的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的光源下查看以及拍照。

图4为按方法1进行的实验结果，显示五种虫草(1为蚁虫草，2为古尼虫草，3为蛹虫草，4为尖头虫草，5为蜂头虫草)中蜂头虫草被专一性的扩增获得290bp左右的特异性DNA片段，而其他虫草均无A特异性DNA片段被扩增，该结果表明，蜂头虫草专一性探针(引物)Probe I及Probe II可以从多种虫草中准确的鉴别出蜂头虫草，同时根据实施例3排除了假阴性(不符合PCR扩增条件而造成的阴性结果)的可能。

序列表

SEQ ID NO.1

<110>广东省微生物研究所

<120>鉴别蜂头虫草的特征性核苷酸序列和方法

<160>5

<210>1

<211>514

<212>DNA

<213>蜂头虫草(Cordyceps sphecocephala)

<400>1

CAGAGAGTGA AAACTCCCTA ACCCACTGTG AACCATACCT ATAATCTGCC TCGGCGGGTC     60

TTTTAGGCCT GCCAAAGGAA CCCAAACTCG TTTTATACCT AGTCTTCTGA GTTTTTCAAA    120

AATATCAAAA CTTTTAGCAA CGGATCTCTT GGCTCTAGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA    180

ATGCGATAAG TAATGCGAAT TGCAGATTTT AGTGAGTCAT CGAGTTTTTG AACGCATATT    240

GCGCCTGCTG GCTATTCTAG CAGGCATGCC TGTCCGAACG TTATTTACAG TACTAGAGGC    300

TGCTATAGTA GGGTGTTGAT AGTGACGCGC AAAGCTGTGT AGTGTTTTGC ACTAACCTTT    360

GCTCGTTACT CCACCCACTA TATGTCTCTC TGTTGGAGCC TGGCTAAGCG GCCATCTCTT    420

AAATCTAGTG GCGGCGGTTG CTCTTATTTC CCCTGACAAG TAGACTTTTA CTCGCCATGT    480

GGAGGATTAG CAGCCCCCCT GAAAATTCCA TCTA                                514

SEQ ID NO.2

<160>5

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>蜂头虫草(Cordyceps sphecocephala)

<400>2

TGCCTCGGCG GGTCTTTT    18

SEQ ID NO.3

<160>5

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>蜂头虫草(Cordyceps sphecocephala)

<400>3

CAGCTTTGCG CGTCACTATC A      21

SEQ ID NO.4

<160>5

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据虫草属(Cordyceps)rRNA保守序列设计合成

<400>4

CGTTGGTGAA CCAGCGGAGG GAT    23

SEQ ID NO.5

<160>5

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据虫草属(Cordyceps)rRNA保守序列设计合成

<400>5

TTGCCGCTTC ACTCGCCGTT ACT    23

Claims (3)

1.一对用于鉴别蜂头虫草(Cordyceps sphecocephala)的引物，其核苷酸序列分别为：

5’-TGCCTCGGCGGGTCTTTT-3’及5’-CAGCTTTGCGCGTCACTATCA-3’。

2.一种鉴别蜂头虫草的方法，其特征是采用了权利要求1所述引物，利用PCR方法鉴定蜂头虫草，具体步骤按照常规PCR方法进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于还包括利用一对虫草属核糖体rRNA内转录间隔区通用引物CorF和CorR作为PCR引物进行阳性对照实验的方法，所述的虫草属核糖体rRNA内转录间隔区通用引物是：

CorF：5’-CGTTGGTGAACC AGCGGAGGGAT-3’及CorR：5’-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3’。

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