CN102086471B

CN102086471B - 冬虫夏草的鉴别及检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102086471B
Application number: CN200910213616.6A
Authority: CN
Inventors: 马骏; 谢力; 刘海军; 胡学难; 区卫民; 钟国强; 高东微; 高军; 陈源树; 顾渝娟; 张隽
Original assignee: GUANGZHOU ZHENYE BIO-TECH Co Ltd; Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: GUANGZHOU ZHENYE BIO-TECH Co Ltd; Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2029-12-07
Also published as: CN102086471A

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草的鉴别及检测方法，其包括以下步骤：(a)从待测样品中提取出核糖体DNA；(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光PCR反应，得到扩增产物；(c)根据扩增产物的荧光的有无和强度来判断是否为冬虫夏草及其含量。本发明另一方面提供包括所述引物对和探针的试剂盒。本发明除了能定性鉴别冬虫夏草的真伪外，还能检测样品中冬虫夏草的含量，其检测限量可低至0.0001ng/μl，比现有技术更加灵敏，并且本发明能有效检测冬虫夏草加工后核酸降解严重的样品，检测结果比现有技术更加准确有效。

Description

冬虫夏草的鉴别及检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种定性及定量检测冬虫夏草的方法以及用于该方法的试剂盒。

背景技术

冬虫夏草是麦角菌科中华虫草菌(Cordyceps sinensis(Berk.)Saccardo(1878))寄生在鳞翅目、蝙蝠蛾科、蝠蛾属(Hepialus)昆虫幼虫体产生的子座及幼虫尸体的复合体。在中药材市场上，利用其人工发酵培养的无性型菌丝体以及与冬虫夏草形态相似的近缘种(如亚香棒虫草(又名霍克斯虫草)C.hawkesii Gray、戴氏虫草C.taii Z.Q.Liang & A.Y.Liu、古尼虫草C.gunnii(Berk.)Berk.、凉山虫草C.liangshanensis Zhang & Liu)等假冒伪劣品充斥市场，甚至出现地蚕、白僵蚕、压模“虫草”等伪劣产品，造成冬虫夏草药材及其加工成药市场混乱，严重损害消费者、产地及加工企业的利益。

另一方面，全世界目前已报道发现由虫草属真菌(Cordyceps)寄生于昆虫、蜘蛛和其他生物长出子实体的虫草种类达400多种，其中我国已记录68种。在国内外一些人和学者的概念中，把凡是由虫草属真菌寄生并能产生子实体的菌物结合体都通称为冬虫夏草。然而，中国传统的中医药学和我国绝大部分学者和人们所指的冬虫夏草，是特指仅分布于我国青藏高原及边缘地区高寒草甸中的、具有特殊药用功效的中华虫草菌(C.sinensis)，其他类群仅称为虫草，不是正宗的冬虫夏草。

为解决上述问题，2000年11月12日公开的中国专利申请公开第CN 1274010号公开了一种鉴别冬虫夏草的特征性核苷酸序列和方法，该发明以冬虫夏草rDNA及其间隔区(非编码区)特异性序列为鉴别特征，并以此为基础设计专一性扩增鉴定引物，建立以普通PCR为技术基础的鉴定方法。然而，该方法具有以下局限性：(1)通过PCR扩增之后，必须进一步经过DNA测序(需要2-3天)，或者经过凝胶电泳(1.5小时左右)才能判别结果，不能在PCR扩增的同时即能实现结果的判断，因此，检测速度和效率上受到一定的制约；(2)该方法是一种定性的检测方法，即只能检测冬虫夏草“有”还是“无”，不能在技术上进一步定量检测其含量；(3)由于冬虫夏草rDNA的间隔区序列较短并且引物设计困难，普通PCR扩增鉴定序列长度一般在300bp左右，对于以冬虫夏草为原料的加工处理过的产品，其核酸可能严重降解至300bp以下，此时，采用普通PCR技术无法实现DNA链的扩增，导致检测结果不准确；(4)该方法需对常规PCR产物进一步实施凝胶电泳，其过程涉及核酸染料等有毒物质的操作工序，容易造成污染，对人体具有一定的危害性。

现实需求表明，在冬虫夏草流通和加工过程中，迫切需要建立快速、准确地既能鉴别冬虫夏草真伪，又能明确其含量的分子鉴定技术，这对于对保障消费者利益，保护我国传统中药材的产权利益并促进其市场化发展具有至关重要的意义。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种能快速、准确地鉴别和检测冬虫夏草的方法、以及鉴别和检测冬虫夏草用的试剂盒。

为实现上述本发明的目的，一方面，本发明提供了一种冬虫夏草的鉴别和检测方法，该非法包括如下步骤：

(a)从待测样品中提取出核糖体DNA；

(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光PCR反应，得到扩增产物；

(c)根据扩增产物的荧光的有无和强度来判断是否为冬虫夏草及其含量。

在上述本发明的方法中，其所采用的用于实时荧光PCR扩增的引物对及探针序列如下所示：

SEQ ID NO.1(正义引物)：5’-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’

SEQ ID NO.2(反义引物)：5’-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3’

SEQ ID NO.3(荧光探针)：

5’-Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3’

上述引物可在冬虫夏草核糖体DNA上特异性地扩增出80bp的产物，利用上述探针可判断待测样品的真伪以及检测样品中冬虫夏草的含量。

在本发明的一个实施方式中，步骤(a)中提取出的核糖体DNA的浓度至少为0.0001ng/μl。在本发明的一个实施方式中，所述引物对位于核糖体DNA的18S rDNA和5.8S rDNA之间的间隔区内。在本发明的一个实施方式中，步骤(b)中得到的扩增产物的核苷酸长度为80bp。

利用本发明提供的引物对扩增出的核苷酸序列来源于冬虫夏草的rDNA间隔区(即冬虫夏草核糖体rRNA基因转录间隔区)序列。研究表明冬虫夏草在rDNA间隔区(非编码区)具有与其它虫草和相关真菌完全不同的核苷酸序列，可以作为冬虫夏草特征性标记序列，用于鉴别冬虫夏草的真伪。依据该核苷酸标记序列可以设计并制备出冬虫夏草rDNA间隔区的专一性核酸分子引物和探针，从而建立起快速、准确鉴别冬虫夏草的实时荧光检测方法。

本发明提供的冬虫夏草专一性核酸分子探针，具有极高的冬虫夏草专一性，只能与正宗冬虫夏草种C.sinensis产生专一性标记反应，而不与其它虫草或相关真菌的DNA产生荧光指示反应。其荧光信号的强弱可以反应被测本底冬虫夏草的含量。因此，利用本发明提供的核酸荧光探针，通过实时荧光PCR不但可以快速、准确地鉴别冬虫夏草的真伪，而且可以定量检测冬虫夏草的含量。

另一方面，为实现上述本发明的目的，本发明还提供了一种鉴别及检测冬虫夏草用的试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针，其中，所采用的引物对及探针序列为：

SEQ ID NO.1(正义引物)：5’-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’

SEQ ID NO.2(反义引物)：5’-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3’

SEQ ID NO.3(荧光探针)：

5’-Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3’

本发明提供的鉴别及检测方法具有如下优点：(1)在冬虫夏草的基因鉴别过程中，所需样品量少，通过PCR扩增即能评判其真伪，毋需进一步凝胶电泳，比现有技术更简便、快捷；(2)本发明除了能定性鉴别冬虫夏草的真伪外，还能检测样品中冬虫夏草的含量，其检测限量可低至0.0001ng/μl，比现有技术更加灵敏；(3)本发明能有效检测冬虫夏草加工后核酸降解严重的样品，检测结果比现有技术更加准确有效；(4)本发明由于未涉及使用凝胶电泳工序，比现有鉴别技术更环保安全。

下面结合附图，通过具体实施方式来进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1显示利用本发明的引物对和探针对天然冬虫夏草样本和非冬虫夏草样本的实时荧光PCR的扩增结果；

图2显示利用本发明的引物对和探针对不同浓度梯度的天然冬虫夏草核糖体DNA模板的实时荧光PCR的扩增结果。

具体实施方式

1.准确性试验-天然冬虫夏草的特异性扩增

试验步骤：采用本领域技术人员熟知的方法分别提取天然冬虫夏草(本实验中使用从西藏林芝地区不同乡镇采集的7个天然冬虫夏草样品)、蛹虫草、古尼虫草、云南虫草1和2(cordyceps spp.)的核糖体DNA(rDNA)，再以本发明提供的引物对及荧光探针(正义引物为SEQ ID NO.1：5’-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’、反义引物为SEQ ID NO.2：5’-AACTGCTGTGGTGTTC C-3’、荧光探针为SEQ ID NO.3：5’-Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3’)进行实时荧光PCR，得到如图1所示的结果图。

1.待测样品核糖体DNA的提取

作为举例，本发明提取核糖体DNA的方法如下：采用Promega试剂盒(货号：A1120)，按照说明书，取一段双蒸水洗净的虫草子实体，干样5-10mg，鲜样10-30mg置于1.5ml离心管中，加100μl核酸裂解液用研杵棒将虫草组织磨碎，补加500μl核酸裂解液，振荡1-3秒钟混匀，置65℃水浴中温浴40-90分钟；温浴后往离心管中加入3μl RNA酶颠倒离心管2-5次，然后置37℃水浴上15-30分钟；温浴后取出离心管加入200μl蛋白质沉淀液，剧烈振荡20秒，13800rpm离心5分钟；离心后小心吸取上清液(约600μl)置于一只干净1.5ml离心管中，加等量异丙醇轻轻颠倒3-5次，置-20℃冰箱中放置40分钟；然后取出离心5分钟，弃上清液，保留管底沉淀，再加600μl 70％乙醇轻轻颠倒几次后，离心1分钟，弃上清液，用干净吸水纸巾吸干流出的残留液；将离心管真空干燥15分钟；干燥后的离心管往管底加入50μl TE(4号液)，置65℃水浴40分钟充分溶解管底DNA，室温下测定DNA含量。纯化后的DNA溶液稀释为100ng/μl，作为PCR工作液浓度。

2.实时荧光PCR反应体系的建立及反应条件

(1)反应体系：采用大连宝生物(TaKaRa Ex Taq)提供的试剂，按下表建立反应体系：

组分	含量
		10×ExTaq Buffer(Mg²⁺plus)	2.5μl
dNTP(各2.5mM)	2.0μl
		引物1(SEQ ID NO.1)(20μM)	0.25μl
引物2(SEQ ID NO.2)(20μM)	0.25μl
		荧光探针(CS-taqman)(20μM)	0.25μl
Taq酶(5U/μl)	0.125μl
		DNA模板(100ng/μl)	1.25μl
ddH₂O	18.375μl
		总计	25μl

(2)反应条件：(1)50℃2分钟，(2)95℃10分钟，(3)95℃15秒，(4)60℃1分钟；(3)～(4)循环40次。

3.扩增结果的示意图如图1所示，在图1中，扩增曲线超过CT阈值线305以上为天然冬虫夏草样本，在CT阈值线以下的为对照或非冬虫夏草样本(蛹虫草、古尼虫草和云南虫草1和2(cordyceps spp.))。因此可看出，只有从西藏林芝地区不同乡镇采集的7个天然冬虫夏草样品的扩增曲线超过CT阈值线305以上，而其余的样品扩增曲线都在CT阈值线以下，因而本发明的方法使用的引物对和探针具有高度的特异性，从而保证了检测结果的高准确性。

2.灵敏度实验-对不同浓度梯度的冬虫夏草rDNA的扩增

实验步骤：将按上述方法提取出的冬虫夏草rDNA(100ng/μl)按10倍梯度稀释，共7个浓度梯度，最低为0.0001ng/μl，每一浓度梯度重复3次。以各稀释后浓度为模板，按上述方法建立反应体系并按所述反应条件进行实时荧光PCR。扩增结果如图2所示，在图2中，扩增曲线自左至右依次表示冬虫夏草DNA模板最大浓度为100ng/μl和其他6个浓度梯度。因此，可看出本发明的方法灵敏度非常高，即使为0.0001ng/μl的浓度亦能准确检测出，大大方便了实际应用。而且，本发明方法具有很好的重复性，平行的3次重复试验得到的扩增曲线几乎重合在一起，因而具有很高的应用可靠性。

在制作本发明的用于冬虫夏草鉴别及检测的试剂盒时，可采用本领域的常规技术(如通过酚-氯仿或CTAB法提取核糖体DNA)。本发明的试剂盒包括如下的引物对和荧光探针：

正义引物SEQ ID NO.1：5’-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’

反义引物SEQ ID NO.2：5’-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3’

荧光探针SEQ ID NO.3：5’-Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3’

进一步地，上述本发明的试剂盒还可包括实时荧光定量PCR所需的各种常规试剂，例如，Ex Taq酶及其缓冲液、dNTPs等。

本发明提供的冬虫夏草特异性引物及专一性核酸分子探针，具有极高的冬虫夏草专一性，只能与正宗冬虫夏草种C.sinensis产生专一性标记反应，而不与其它虫草或相关真菌的DNA产生荧光指示反应。其荧光信号的有无可以指示待测样品是否为冬虫夏草；如有荧光信号，则其强弱可以反应被测本底冬虫夏草的含量。因此，利用该核酸荧光探针，通过实时荧光PCR不但可以快速、准确地鉴别冬虫夏草的真伪，而且可以定量检测冬虫夏草的含量。

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州市振烨生物科技有限公司

<120>冬虫夏草的鉴别及检测方法和试剂盒

<160>3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

caaggtctcc gttggtga 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aactgctgtg gtgttcgc 18

<210>3

<211>27

<212>荧光探针

<213>人工序列

<400>3

Fam-cggagggatc attatcgagt yaccact-Tamra 27

Claims

1.一种冬虫夏草的检测方法，其包括以下步骤：

（a）从待测样品中提取出核糖体DNA；

（b）以步骤（a）中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光PCR反应，得到扩增产物；

（c）根据扩增产物的荧光的有无和强度来判断是否为冬虫夏草及其含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a）中提取出的核糖体DNA的浓度至少为0.0001ng/μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物对位于核糖体DNA的18S rDNA和5.8S rDNA之间的间隔区内。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）中得到的扩增产物的核苷酸长度为80bp。

5.一种用于冬虫夏草检测的试剂盒，其包括SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒进一步包括ExTaq酶和/或dNTPs。