CN105586428B - 一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的引物组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的引物组合物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定转基因甘蔗红糖的引物组合物、试剂盒及检测方法，其引物组合物包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组为扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对，所述第二引物组选自扩增甘蔗外源基因35S的引物对、扩增甘蔗外源基因tNOS的引物对、扩增甘蔗外源基因CP4‑EPSPS的引物对、扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对、扩增甘蔗外源基因Bar的引物对中的一种或多种。本发明的鉴定方法操作简单，成本低，能稳定的从甘蔗红糖中提取高质量的模板DNA用于荧光定量PCR检测，且准确性和灵敏度高。

Description

一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的引物组合物、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的引物组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
甘蔗既是我国最为重要的糖料作物，也是一种重要的能源作物。干旱，黑穗病，螟虫，杂草是制约甘蔗生产的主要问题。由于现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种，割手密和印度种等物种的种间杂交种，在长期的高贵化育种过程中，减数分裂的异常使得现代甘蔗栽培种形成大量的非整倍体，其染色体数量多、基因组结构复杂、在同株中染色体倍数不同，同时由于甘蔗对光周期反应敏感，许多重要亲本在亚热带和温带地区很难开花，即使开花花粉数量也不足，而且经常与近缘植物的花期不遇，这给常规的抗逆育种带来许多困难。基因工程转基因技术成了甘蔗品种遗传改良的重要途径。
与转基因大豆大部分用来压榨花生油一样，甘蔗主要用来压榨红糖和白糖，人们可不必直接食用转基因甘蔗，转而食用转基因甘蔗红糖或白糖。因此转基因甘蔗很有可能像转基因大豆一样，很快得到推广应用，而转基因甘蔗红糖和白糖可能很快就进入食品市场。然而转基因作物及其食品对生态环境及人类健康是否安全，始终是公众关切的大问题。国际和国内先后出台了转基因农产品标示管理政策，以保证消费者的知情权和选择权。按照2002年中国农业部出台的相关规定，我国市场上的转基因食用油必须进行明确标识。那么，当转基因甘蔗红糖或白糖进入食品市场后，也必然被要求进行明确标识。为此就需要建立与之相配的转基因甘蔗红糖或白糖的检测方法。
但是甘蔗红糖是新鲜甘蔗压榨成蔗汁后经过高温蒸煮浓缩而成的，因此甘蔗红糖中DNA的成分极少，基因组遭破坏严重，片段短，大小在80-120bp左右，且大部分小于100bp，而且甘蔗红糖杂质及糖含量多，难以使用通用的DNA检测技术。因此必须提高甘蔗红糖DNA提取效率与质量，并采用灵敏度较高的DNA检测技术，此外还必须设计扩增效果极佳的特异性引物，以保证荧光定量PCR检测的准确性和灵敏度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，为转基因甘蔗红糖DNA的提取与检测提供一种稳定有效的方法。
本发明的第一个方面是提供一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的引物组合物，所述引物组合物包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组为扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对，所述第二引物组选自扩增甘蔗外源基因35S的引物对、扩增甘蔗外源基因tNOS的引物对、扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对、扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对、扩增甘蔗外源基因Bar的引物对中的一种或多种，其中，
扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：1所示，反向引物的序列如SEQIDNO：2所示；
扩增甘蔗外源基因35S的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：3所示，反向引物的序列如SEQIDNO：4所示；
扩增甘蔗外源基因tNOS的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：5所示，反向引物的序列如SEQIDNO：6所示；
扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：7所示，反向引物的序列如SEQIDNO：8所示；
扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：9所示，反向引物的序列如SEQIDNO：10所示；
扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：11所示，反向引物的序列如SEQIDNO：12所示；
扩增甘蔗外源基因Bar的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：13所示，反向引物的序列如SEQIDNO：14所示。
进一步地，所述第二引物组由扩增甘蔗外源基因35S的引物对、扩增甘蔗外源基因tNOS的引物对、扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对、扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对和扩增甘蔗外源基因Bar的引物对组成。
本发明的第二个方面是提供一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的试剂盒，含有本发明第一个方面所述的引物组合物。
本发明的第三个方面是提供一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的引物组合物或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组合物进行PCR扩增的步骤。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
步骤1，从样品中提取DNA；
步骤2，用权利要求1或2所述的引物组合物或者权利要求3所述的试剂盒中的引物组合物进行PCR扩增，得到扩增产物；
步骤3，检测扩增产物，并作出判断。
进一步地，步骤1中DNA提取方法为：
(1)以CTAB为裂解液，氯仿抽提1-3次；
(2)用异丙醇进行第一次沉淀，然后用水溶解后再沉淀，如此反复2-3次。
进一步地，步骤2中采用荧光定量PCR扩增。
进一步地，步骤3具体为：根据第一引物组扩增的Ct值，扩增曲线，溶解曲线，判断是否从红糖中提取出了可供荧光定量PCR检测的DNA；再根据第二引物组的扩增曲线Ct大小，溶解曲线是否与阳性对照一致，判断是否为转基因甘蔗红糖；其中，在检测过程中均须设置阳性对照和阴性对照。
更进一步地，待检测的红糖样品的Ct值在37以内，且扩增产物的溶解曲线与正对照的溶解曲线一致时，则判断该检测样品为转基因甘蔗红糖。
进一步地，引物的退火温度为60±2℃，且扩增产物为短片段80-120bp。
本发明的有益效果如下：
本发明针对甘蔗红糖制作过程中DNA破坏严重，片段短的特点，设计了一系列扩增短片段的内源和外源基因的引物，筛选到了扩增效果极佳的特异性引物，进行检测，在转基因红糖DNA稀释到200倍时，CT值仍然在37以内，保证了检测的准确性和灵敏度。
本发明还对甘蔗红糖DNA的提取方法进行适当改进，操作简单，成本低，能稳定的从甘蔗红糖中提取高质量的模板DNA用于荧光定量PCR检测。
附图说明
图1为转基因甘蔗内源基因ShSAP1荧光定量PCR检测扩增曲线图；
图2为转基因甘蔗内源基因ShSAP1荧光定量PCR检测溶解曲线；
图3为转基因甘蔗外源基因Cry1Ab荧光定量PCR检测扩增曲线；
图4为转基因甘蔗外源基因Cry1Ab荧光定量PCR检测溶解曲线；
图5为红糖内源基因ShSAP1荧光定量PCR检测扩增曲线；
图6为红糖内源基因ShSAP1荧光定量PCR检测溶解曲线；
图7为红糖外源基因Cry1Ab荧光定量PCR检测扩增曲线；
图8为红糖外源基因Cry1Ab荧光定量PCR检测溶解曲线；
图9为红糖外源基因35S荧光定量PCR检测扩增曲线；
图10为红糖外源基因35S荧光定量PCR检测溶解曲线；
图11为红糖外源基因tNOS荧光定量PCR检测扩增曲线；
图12为红糖外源基因tNOS荧光定量PCR检测溶解曲线；
图13为红糖外源基因EPSPS荧光定量PCR检测扩增曲线；
图14为红糖外源基因EPSPS荧光定量PCR检测溶解曲线；
图15为红糖外源基因Vip3Aa荧光定量PCR检测扩增曲线；
图16为红糖外源基因Vip3Aa荧光定量PCR检测溶解曲线；
图17为红糖外源基因bar荧光定量PCR检测扩增曲线；
图18为红糖外源基因bar荧光定量PCR检测溶解曲线。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步的说明，以更好地理解本发明。
一、实验材料：
转抗虫基因Cry1Ab的甘蔗叶片组织；由转基因甘蔗压榨熬制的红糖；由非转基因甘蔗压榨熬制的红糖。
二、引物筛选
1、ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测引物筛选
针对甘蔗的内源基因ShSAP1基因设计多对扩增片段在100bp左右的引物。按照常规的CTAB法提取转基因甘蔗叶片的基因组DNA，初始浓度为0.2μg/μl，并进行50倍，100倍，200倍的梯度稀释，然后向各个稀释液中加入各ShSAP1引物进行扩增。
扩增体系如下：
最后进行分离。
扩增后，分析扩增曲线，溶解曲线，筛选到扩增效果最好的ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测的引物一对，引物为：
ShSAP1-F:TTTTCGCCTCTGCATCTGGT
ShSAP1-R:TGCGAAGCCAAATACCGTCT
其中，该对引物的扩增曲线和溶解曲线分别如图1和图2所示，“50×”为稀释50倍，“100×”为稀释100倍，“200×”为稀释200倍。由图1可知，在转基因甘蔗叶片DNA稀释到1ng/μl时，CT值仍然达到25.85。图2中扩增产物全部呈现出整齐单一的溶解峰。说明该对引物适合作为甘蔗基因组DNA的荧光定量PCR检测。
2、转基因甘蔗外源基因荧光定量PCR检测引物筛选
针对转基因甘蔗的外源基因Cry1Ab基因设计多对扩增片段在100bp左右的引物。按照常规的CTAB法提取转基因甘蔗叶片的基因组DNA，初始浓度为0.2μg/μl，并进行50倍，100倍，200倍的梯度稀释，然后向各个稀释液中加入各Cry1Ab引物进行扩增，扩增体系与扩增条件同“ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测引物筛选”。
扩增后，分析扩增曲线，溶解曲线，筛选到扩增效果最好的Cry1Ab外源基因荧光定量PCR检测的引物一对，引物为：
Cry1Ab-F:TGATCGGCAACTACACCGAC
Cry1Ab-R:GCGGAACTGGTTGTACCTGA
其中，该对引物的扩增曲线和溶解曲线分别如图3和图4所示，“50×”为稀释50倍，“100×”为稀释100倍，“200×”为稀释200倍。由图3可知，在转基因甘蔗叶片DNA稀释到1ng/ul时，CT值仍然达到26.57。图4中扩增产物全部呈现出整齐单一的溶解峰。说明该对引物适合作为甘蔗基因组DNA的荧光定量PCR检测。
以同样的方式获得其他外源基因35S、tNOS、CP4-EPSPS、Cry1Ab、Vip3Aa及Bar的扩增效果最好的引物对，分别为：
外源基因CP4-EPSPS：
EPSPS-F:CATGTCGTTCCTCGTGAT
EPSPS-R:CCATCAGGTCCATGAACTC
外源基因Vip3Aa：
Vip3Aa-F:ACCAGCATCATGAACGAGCA
Vip3Aa-R:CCCTTCACCTTGGCGTAGTT
外源基因Bar：
Bar-F:AACTGGCATGACGTGGGTTT
Bar-R:CATCAGATCTCGGTGACGGG
外源基因35S：
35S-F:CCGACAGTGGTCCCAAAGAT
35S-R:AGACGTGGTTGGAACGTCTT
外源基因tNOS：
tNOS-F:TGCCGGTCTTGCGATGATTA
tNOS-R:ACCCATCTCATAAATAACGTCATGC
三、转基因甘蔗红糖的鉴定
1、转基因甘蔗红糖与对照非转基因甘蔗红糖的提取
称取转基因和非转基因的红糖各5g，置于50ml的离心管中，加入20ml的CTAB裂解液，65℃温浴溶解1小时，期间进行两到三次的漩涡震荡处理。冷切后，加入20ml氯仿/异戊醇(24:1)，摇晃震荡均匀后，12000rpm离心10min，用5ml的移液枪头深入离心管底部，吸弃底层液相，再加入20ml氯仿/异戊醇(24:1)进行抽提，如此反复2-3次。最后吸取上层水相至另一干净的离心管内，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，12000rpm离心10min，倒掉上清后，沉淀加20ml水再次溶解，加1/10体积的NaAc，再次加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，沉淀再次用900ul的水进行溶解，并转移至2ml的离心管内，加1/10体积的NaAc及等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，沉淀吹干后溶解于50-100ul的水或TE中。
2、甘蔗红糖DNA提取质量的检测
转基因甘蔗红糖DNA(初始浓度为0.1ng/μl)进行10倍，100倍，200倍的梯度进行稀释，以甘蔗叶片1ng/ul的DNA模板作为阳性对照，进行内源基因ShSAP1荧光定量PCR检测，扩增体系与扩增条件同“ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测引物筛选”。
扩增后，检测，得到扩增曲线和溶解曲线，分别如图5和图6所示，“10×”为稀释10倍，“100×”为稀释100倍，“200×”为稀释200倍，“CK+”为阳性对照。由图5知，阳性对照(甘蔗叶片1ng/μl的DNA模板)的Ct值为26.14，而转基因甘蔗红糖DNA在稀释10倍、100倍、200倍后，扩增的Ct值分别为32.12、34.65、35.90，均在37以内。图6显示不同稀释倍数的红糖内源基因ShSAP1荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线与阳性对照是一致的。结合图5及图6的结果说明，通过改良的CTAB法所提取的红糖DNA质量可靠，可以用于外源基因的荧光定量PCR检测。
3、转基因甘蔗红糖DNA外源基因Cry1Ab的检测
转基因甘蔗红糖DNA(初始浓度为0.1ng/μl)进行10倍，100倍，200倍的梯度进行稀释，以转基因甘蔗叶片1ng/μl的DNA模板作为阳性对照，以非转基因甘蔗红糖DNA(浓度为0.1ng/μl)作为负对照，进行外源基因Cry1Ab荧光定量PCR检测，扩增体系与扩增条件同“ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测引物筛选”。
扩增后，检测，得到扩增曲线和溶解曲线，分别如图7和图8所示，“10×”为稀释10倍，“100×”为稀释100倍，“200×”为稀释200倍，“CK+”为阳性对照。由图7知，阳性对照(转基因甘蔗叶片1ng/ul的DNA模板)的Ct值为26.62，而转基因甘蔗红糖DNA在稀释10倍、100倍、200倍后，扩增的Ct值分别为29.49、32.63、34.52，均在37以内，而非转基因甘蔗红糖DNA则没有Ct值。图8显示不同稀释倍数的红糖外源基因Cry1Ab荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线与阳性对照是一致的。结合图7和图8的结果说明，通过荧光定量PCR法可以准确检测到转基因甘蔗红糖的外源基因Cry1Ab。
4、转基因甘蔗红糖DNA外源基因35S的检测
以“转基因甘蔗红糖DNA外源基因Cry1Ab的检测”相同的方式检测转基因甘蔗红糖DNA中的外源基因35S。扩增曲线和溶解曲线分别如图9和图10所示，“10×”为稀释10倍，“100×”为稀释100倍，“200×”为稀释200倍，“CK+”为阳性对照。由图9知，转基因甘蔗红糖DNA(初始浓度为0.1ng/μl)在稀释10倍、100倍、200倍后，扩增的Ct值分别为28.82、31.33、33.34，均在37以内。图1显示不同稀释倍数的红糖外源基因35S荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线与阳性对照是一致的。结合图9和图10的结果说明，通过荧光定量PCR法可以准确检测到转基因甘蔗红糖的外源基因35S。
5、转基因甘蔗红糖DNA外源基因tNOS、CP4-EPSPS、Vip3Aa、Bar的检测
以“转基因甘蔗红糖DNA外源基因Cry1Ab的检测”相同的方式检测转基因甘蔗红糖DNA中的外源基因tNOS、CP4-EPSPS、Vip3Aa、Bar，检测结果如图11-18所示，“10×”为稀释10倍，“100×”为稀释100倍，“200×”为稀释200倍，“1000×”为稀释1000 倍“CK+”为阳性对照。由图11-18可知，与转基因甘蔗红糖DNA外源基因35S相似，其他转基因甘蔗红糖DNA外源基因tNOS(初始浓度为0.1ng/μl)在稀释10倍、100倍、200倍后，扩增的Ct值均在37以内，其他转基因甘蔗红糖DNA外源基因EPSPS、Vip3Aa、bar(初始浓度均为0.1ng/μl)在稀释10倍、100倍、1000倍后，扩增的Ct值也均在37以内，不同稀释倍数的红糖外源基因荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线与阳性对照是一致的。通过荧光定量PCR法可以准确检测到转基因甘蔗红糖的外源基因tNOS、CP4-EPSPS、Vip3Aa、Bar。
实验结果证明，通过本发明改良的CTAB法，可以有效的提取甘蔗红糖DNA，并通过荧光定量PCR法结合本发明所设计的各个外源基因的引物可以准确的检测到转基因甘蔗红糖内的外源基因，为甘蔗红糖是否来源于转基因甘蔗的检验提供了一种稳定灵敏的方法。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (4)

1.一种用于鉴定转基因甘蔗红糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，从样品中提取DNA，每5g红糖按如下方式提取：
称取红糖5g，置于50ml的离心管中，加入20ml的CTAB裂解液，65℃温浴溶解1小时，期间进行两到三次的漩涡震荡处理；冷却 后，加入20ml氯仿/异戊醇(24:1)，摇晃震荡均匀后，12000rpm离心10min，用5ml的移液枪头深入离心管底部，吸弃底层液相，再加入20ml氯仿/异戊醇(24:1)进行抽提，如此反复2-3次；最后吸取上层水相至另一干净的离心管内，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，12000rpm离心10min，倒掉上清后，沉淀加20ml水再次溶解，加1/10体积的NaAc，再次加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，沉淀再次用900ul的水进行溶解，并转移至2ml的离心管内，加1/10体积的NaAc及等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，沉淀吹干后溶解于50-100ul的水或TE中；
步骤2，用引物组合物进行荧光定量PCR扩增，得到扩增产物；其中，所述引物组合物包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组为扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对，所述第二引物组由扩增甘蔗外源基因35S的引物对、扩增甘蔗外源基因tNOS的引物对、扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对、扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对和扩增甘蔗外源基因Bar的引物对组成，其中，
扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
扩增甘蔗外源基因35S的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
扩增甘蔗外源基因tNOS的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：6所示；
扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：7所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：8所示；
扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：9所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：10所示；
扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：12所示；
扩增甘蔗外源基因Bar的引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：13所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：14所示；
步骤3，检测扩增产物，并作出判断。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3具体为：根据第一引物组扩增的Ct值，扩增曲线，溶解曲线，判断是否从红糖中提取出了可供荧光定量PCR检测的DNA；再根据第二引物组的扩增曲线Ct大小，溶解曲线是否与阳性对照一致，判断是否为转基因甘蔗红糖；其中，在检测过程中均须设置阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，待检测的红糖样品的Ct值在37以内，且扩增产物的溶解曲线与正对照的溶解曲线一致时，则判断该检测样品为转基因甘蔗红糖。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，引物的退火温度为60±2℃，且扩增产物为短片段80-120bp。
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