CN111621574B - 用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物、性别鉴定方法及试剂盒 - Google Patents

用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物、性别鉴定方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物、性别鉴定方法及试剂盒，涉及生物学检测与人工繁育技术领域。本发明的用于鉴定鹤鸵目动物的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明的性别鉴定方法，包括以下步骤：S1、提取鹤鸵目动物的血液或羽毛的DNA；S2、以步骤S1中提取的DNA为模板，使用上述的引物RASEF‑F1和RASEF‑R1进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖检测；S3、对PCR扩增产物进行测序，根据所得序列的连锁的单核苷酸差异判断鹤目动物的性别。本发明的引物和鉴定方法，能高效、快速、准确地鉴别鹤鸵目动物的性别。

Description

用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物、性别鉴定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物学检测与人工繁育技术领域，特别是涉及一种用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物、性别鉴定方法及试剂盒。
背景技术
鹤鸵(Causeries sp.)俗称食火鸡，有“杀人鸟”之称，2007年被吉尼斯世界纪录收录进“世界上最危险的鸟类”，属于平胸总目鸟类，鹤鸵目，鹤鸵科，分布于新几内亚南部及澳大利亚北部的热带雨林中，善于奔跑跳跃，性情机敏凶猛，主要以果实为食，偶尔捕捉一些蜗牛、昆虫、小鱼、鸟及鼠类。处于幼雏的鹤鸵至亚成体时期的雌雄个体之间的体型外貌差别不大，性别鉴别存在极大的困难。当前国内圈养条件下的鹤鸵数量较少，能够成功繁殖的个体也是屈指可数。
鸸鹋生活在澳大利亚和塔斯马尼亚岛的开阔草原疏散丛林和半沙漠地区。全身披着褐色的羽毛，擅长奔跑。鸸鹋虽有双翅，但同鸵鸟一样已完全退化，无法飞翔。躯干、翼被覆纤细的粗发状羽毛，呈灰褐色。以野草、种子、果实等植物及昆虫、蜥蜴等小动物为食。它能泅水，可以从容渡过宽阔湍急的河流。科学研究表明，数十万年的地质和气候变迁，仍无法改变它们最初形成的原始型态，这种神奇的适应能力在自然界的进化史中是极为罕见的。鸸鹋在中国很多动物园中都能见到，具有重要的展示价值和科研价值。但这种鸟类与鹤鸵一样，雌雄个体较难区分，而幼雏更是难以鉴定其性别，这对于饲养管理和种群发展来说是极为不利的。
自从陈武等开展鸟类性别的分子鉴定后，孙志明等对白枕鹤和丹顶鹤CHD基因和EE0.6基因的序列进行了特异性扩增，成功地对鹤类的性别进行了鉴定。Griffiths等利用CHD基因对金刚鹦鹉等28种非平胸鸟类进行了性别鉴定，但是并不适合平胸鸟类。2010年付晶等利用已报道的大量通用引物，进行18种组合，筛选出一对验证引物和一对有效引物，成功对鉴定了鸸鹋和非洲鸵鸟的性别，但是没有关于鹤鸵性别鉴定的方法描述，对于鸸鹋这处物种，这种方法的误诊率仍然较高。
至今为止，还没有关于鹤鸵的非保定状态下的简易性别鉴定方法，除非保定状态下进行性别形态学鉴定，很难从外观来分辨鹤鸵幼雏甚至成年个体的性别，给鹤鸵的饲养、配对和繁育造成了极大的困难。因此，本专利基于RASEF基因对鹤鸵进行性别鉴定分析，建立一种鉴定鹤鸵性别的快速、准确、可靠和安全的分子生物学方法，为鹤鸵的饲养管理提供可靠的理论依据，且本方法同样适用于鸸鹋的性别鉴定。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物，采用该引物可以高效、快速、准确地对鹤鸵目动物进行性别鉴定。
一种用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物，其特征在于，所述引物序列如下所示：
RASEF-F1：5'-TCAGACAAGAGCAAGTCAGTG-3'(SEQ ID No.1)；
RASEF-R1：5'-TATCTAACCAAGTGTGATGG-3'(SEQ ID No.2)。
上述引物序列，是针对鹤鸵目动物(如鹤鸵或鸸鹋)的RASEF基因的同源序列进行设计，雄性鹤鸵目动物的RASEF基因序列如SEQ ID No.3所示，雌性鹤鸵目动物的RASEF基因序列如SEQ ID No.4所示，RASEF基因序列为鹤鸵目动物性染色体上的同源序列，存在三个SNP连锁变异位点，雄性个体RASEF基因序列的第119位点、157位点和162位点分别为G/G、T/T、C/C，而雌性个体在这三个位点均为杂合子A/G、T/G、C/T，利用鹤鸵目动物性别间序列变异鉴定鹤鸵性别；使用该引物序列能精确、高效、快速地鉴别鹤鸵或鸸鹋的性别。
雄性鹤鸵目动物的RASEF基因序列：
CGAACATGTCATTAAGAACTTCATCCGAGAGATCAAACTTCAAAGCACGGAGATGGAAACCTTAGCCATTGCTGTGAAAAGGTATATTAAGCGATGTTTCTAGTTCAGTTACGCAGTTACTT(SEQ ID No.3)。
雌性鹤鸵目动物的RASEF基因序列：
CGAACATGTCATTAAGAACTTCATCCGAGAGATCAAACTTCAAAGCACNGAGATGGAAACCTTAGCCATTGCTGTGAAAAGGTATANTAAGNGATGTTTCTAGTTCAGTTACGCAGTTACTT(SEQ ID No.4)。
本发明一方面还提供一种鹤鸵目动物的性别鉴定方法，包括以下步骤：
S1、提取鹤鸵目动物的血液或羽毛的DNA；
S2、以步骤S1中提取的DNA为模板，使用上述的引物RASEF-F1和RASEF-R1进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖检测；
S3、对PCR扩增产物进行测序，测序所得片段为300bp，根据所得序列的连锁的单核苷酸差异判断鹤鸵目动物的性别；当第119、157和162位点的基因型分别为纯合子G/G、T/T和C/C时，则判定为雄性；当第119、157和162位点的基因型呈现杂合位点G/A、T/G和C/T时，则判定为雌性。
上述鉴定方法，能高效、快速、准确地鉴别鹤鸵目动物的性别，检测取样过程对动物的应激伤害小，且不受年龄限制，即使是刚出生的雏鸟，也能做性别鉴定。利用这种方法可以在雏鸟期即做好配对，减少成年配对时造成的打斗受伤或死亡现象，降低饲养成本，提高经济效益。
在其中一个实施例中，所述鹤鸵目动物为鹤鸵或鸸鹋。
在其中一个实施例中，所述血液的取样量为5～10μL，所述羽毛的取样量为3～4根。
在其中一个实施例中，所述步骤S1中，采用E.Z.N.A.
Figure BDA0002516213230000021
Tissue DNA Kit试剂盒提取血液中的DNA，使用Forensic Tissue DNA Kit试剂盒提取羽毛中的DNA。
在其中一个实施例中，所述步骤S2中，所述PCR扩增的反应程序为：
95℃5min；
95℃30s；
49℃1min；
72℃1min，35个循环；
72℃10min。
在其中一个实施例中，所述的PCR扩增体系中包括：2×Dream Taq Green PCRMaster Mix、ddH2O、引物RASEF-F1、引物RASEF-R1、DNA模板。
在其中一个实施例中，所述的PCR扩增体系为50μL体系，具体如下：
Figure BDA0002516213230000031
本发明一方面还提供一种鉴定鹤鸵目动物性别的试剂盒，包括以下组分：2×Dream Taq Green PCR Master Mix、ddH2O、引物RASEF-F1、引物RASEF-R1、DNA模板。该试剂盒能精确、高效、快速地鉴别鹤鸵或鸸鹋的性别，鉴别准确率达到100％。
本发明另一方面还提供一种上述试剂盒在鉴别鹤鸵目动物性别中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物序列，是针对鹤鸵目动物RASEF基因的同源序列进行设计，使用该引物序列能高效、快速、准确地鉴别鹤鸵目动物的性别。
本发明的性别鉴定方法，采用上述引物序列进行PCR和测序，并根据RASEF基因在性染色体上的3个位点(119、157和162)单核苷酸的差异判断鹤鸵目动物的性别，雄性所有位点的碱基均为单一峰值，碱基为G/G、T/T和C/C，雌性个体中均为杂合子，3个连锁的核苷酸呈现杂合位点G/A、T/G、C/T，该方法能高效、快速、准确地鉴别性别。而且利用这种方法可以在雏鸟期即做好配对，减少成年配对时造成的打斗受伤或死亡现象，降低饲养成本，提高经济效益。
附图说明
图1为实施1中鹤鸵RASEF基因的PCR检测结果图；其中：M：2000bp DNA Maker；2-7：鹤鸵RASEF基因PCR产物；1：阴性对照。
图2为实施1中RASEF基因分析鉴定鹤鸵性别的单核苷酸差异位点图；其中：119、157和162位点是雌雄个体中的单碱基差异
图3为实施3中鸸鹋RASEF基因的PCR检测结果图；其中：M：2000bp DNA Maker；2-6：鸸鹋RASEF基因PCR产物；1：阴性对照。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合较佳的实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例中，E.Z.N.A.
Figure BDA0002516213230000041
Tissue DNA Kit和Forensic Tissue DNA Kit试剂盒购置于Omega Bio-Tek公司，核酸染料GoodView、DNA Marker DL2000、2×Dream TaqGreen PCR Master Mix、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液、无水乙醇购置于广州维宁生物科技有限公司。
实施例1
已知性别鹤鸵羽毛DNA的提取及性别检测
(1)材料
3只已知性别的鹤鸵，采集于广州动物园，样品为羽毛；编号分别为2、3与4；
(2)鹤鸵羽毛DNA的提取
将羽毛的基部剪碎放入1.5ml Eppendorf离心管中，使用Forensic Tissue DNAKit试剂盒，按照试剂盒的提取方法和步骤完成基因组DNA的提取。
(3)鹤鸵羽毛DNA的检测：
取1μL的总DNA，使用7415Nano超微量分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度，确认DNA提出的DNA为有效DNA，然后将DNA保存于-20℃冰箱，备用；
(4)引物的设计与合成
抽取双垂鹤鸵的血液，进行三代测序，从头组装，获得双垂鹤鸵RASEF基因序列，将其序列与Genbank上已公布的平胸目鸟类南非鸵鸟(Struthio camelus austrails)和褐几维鸟北岛亚种(Apteryx australismantelli)的RASEF基因在NCBI中blast，获得平胸目鸟类的源RASEF基因序列，以该序列设计一对引物：RASEF-F1/RASEF-R1，具体引物序列如下：
RASEF-F1：5'-TCAGACAAGAGCAAGTCAGTG-3'；
RASEF-R1：5'-TATCTAACCAAGTGTGATGG-3'；
(5)PCR扩增与PCR扩增体系
以羽毛中提取的DNA为模板，以RASEF-F1/RASEF-R1为引物进行PCR反应，扩增反应在BIO-RAD T100TMPCR仪上进行。引物PCR扩增体系：扩增总体积为50μL，其中Premix Ex Taq20μL、ddH2O 15μL、RASEF-F1 5μL、RASEF-R1 5μL、DNA模板5μL。阴性对照中加5μL的ddH2O，其余试剂不变。反应程序为：95℃5min；95℃30s；49℃1min；72℃1min，35个循环；72℃10min。
(6)琼脂糖凝胶电泳
取10μL的PCR扩增产物，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，20min结束后，用紫外线投射分析仪凝胶成像系统检测扩增结果，拍照留档，使用DNA Marker DL2000进行标记，PCR检测结果如图1所示；PCR产物送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
(7)序列分析
利用Chromas 2.6.5软件对测序结果的原始序列进行校对和编辑，然后将处理后的序列在MEGA 7.0软件中进行多重比对，分析序列中的单核苷酸差异位点。
(8)结果分析
RASEF-F1/RASEF-R1引物经过对3只鹤鸵的RASEF基因都能准确地扩增；RASEF基因测序序列显示，雄性个体中，3个位点(119、157和162)的碱基均为单一峰值，显示为G/G、T/T和C/C；雌性个体中，3个位点(119、157和162)均为杂合子，呈现为G/A、T/G和C/T(如图2所示)。
实施例2
已知性别鹤鸵血液DNA的提取及性别检测
(1)材料
3只已知性别的鹤鸵，采集于来自华东某动物园，样品为血液；编号分别为5、6与7；
(2)鹤鸵血液DNA的提取
取10μL鹤鸵血液放入1.5ml Eppendorf离心管中，使用E.Z.N.A.
Figure BDA0002516213230000051
TissueDNA Kit试剂盒，按照试剂盒的提取方法和步骤完成基因组DNA的提取。
(3)鹤鸵血液DNA的检测、引物的设计与合成、PCR扩增与PCR扩增体系、琼脂糖凝胶电泳及序列分析以实施例1的第(3)～(7)步骤进行。
(4)结果分析
3只鹤鸵血液样品中，雄性个体中，3个位点(119、157和162)的碱基均为单一峰值；雌性个体中，3个位点(119、157和162)均为杂合子，与预期相符合。
实施例3
鸸鹋羽毛DNA的提取及性别检测
(1)材料
5只鸸鹋样品，采集于来自广东某动物园，样品均为羽毛；编号分别为1-E、2-E、3-E、4-E、5-E；
(2)鸸鹋羽毛DNA的提取
将羽毛的基部剪碎放入1.5ml Eppendorf离心管中，使用Forensic Tissue DNAKit试剂盒，按照试剂盒的提取方法和步骤完成基因组DNA的提取。
(3)鸸鹋羽毛DNA的检测、引物的设计与合成、PCR扩增与PCR扩增体系、琼脂糖凝胶电泳及序列分析以实施例1的第(3)～(7)步骤进行。PCR检测结果如图3所示。
(4)结果分析
5只鸸鹋羽毛样品中，雄性个体中，3个位点(119、157和162)的碱基均为单一峰值；雌性个体中，3个位点(119、157和162)均为杂合子，与预期相符合，此鉴定方法适用于鸸鹋的性别鉴定。
实施例4
采用传统方法检测6只鹤鸵性别
(1)材料
实施例1和实施例2中Forensic Tissue DNA Kit和Blood Tissue DNA Kit试剂盒提取的鹤鸵DNA(2、3、4、5、6和7)；
(2)引物的设计与合成
根据已发表文献所报道引物，找到三对能够对鸸鹋和鸵鸟进行鉴定的引物：EE0.6/1272、片段大小为750bp；P9/P14和2550F/2718，片段大小是560bp；
EE0.6f：5'-CACCCTGGATTGGACAACCTATTTC-3
1272H：5'-TCCAGAATATCTTCTGCTCC-3；
P9：5'-TAAGGTCTGTCTCAGAYTTRTCNAC-3
P14：5'-ACTTTTCCAATATGGATGAAGA-3；
2550F：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3
2718R：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3；
(3)PCR扩增与PCR扩增体系
以羽毛和血液中提取的DNA为模板，分别以EE0.6/1272、P9/P14和2550F/2718R为引物进行PCR反应，扩增反应在BIO-RAD T100TMPCR仪上进行。引物PCR扩增体系：扩增总体积为50μL，其中Premix Ex Taq 20μL、ddH2O 15μL、RASEF-F1 5μL、RASEF-R1 5μL、DNA模板5μL。阴性对照中加5μL的ddH2O，其余试剂不变。
EE0.6/1272反应程序为：94℃5min；94℃30s；46.4℃30s；72℃1min，33个循环；72℃，10min；
P9/P14反应程序为：94℃5min；94℃30s；47.0℃40s；72℃1min，33个循环；72℃，10min；
2550F/2718R反应程序为：94℃5min；94℃30s；59.5℃40s；72℃40s，30个循环；72℃，8min。
(4)琼脂糖凝胶电泳
根据实施例1的第(6)步骤进行
(5)结果分析
琼脂糖凝胶检测均呈现无条带或呈现多条电泳条带，无法有效判断鹤鸵与鸸鹋的性别；结果表明，利用这三对引物，传统的根据PCR条带鉴定鸟类性别的方法不适合鹤鸵的性别鉴定。
实验例1
利用RASEF基因在性染色体中3个连锁的单核苷酸差异对鹤鸵性别鉴定的结果如下表所示：
表1.实施例性别鉴定结果
Figure BDA0002516213230000071
利用传统方法鉴别6只鹤鸵性别结果如下表所示：
表2.传统方法应用效果评价
Figure BDA0002516213230000072
以上结果显示，传统方法鉴定结果不够准确，而本发明实施例1～3的方法能准确对鹤鸵和鸸鹋的性别进行鉴定。本发明利用分子遗传学的方法，开发出来的一种新的鉴定方法，这一方法打破传统，利用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带的检测方法；相对于现有技术具有操作简单，成本小、省时省力，结果准确、可靠，非伤害险的取样，对鹤鸵目动物的应激、伤害小，不受年龄的限制，即使是刚出生的雏鸟，也能做性别鉴定。有利于科学配对，提高饲养殖繁育水平，扩大种群，提高经济效益。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种鹤鸵目动物的性别鉴定方法，其特征在于，所述鹤鸵目动物为鹤鸵或鸸鹋，所述性别鉴定方法包括以下步骤：
S1、提取鹤鸵目动物的血液或羽毛的DNA；
S2、以步骤S1中提取的DNA为模板，使用引物RASEF-F1和RASEF-R1进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
引物RASEF-F1的序列为：5'- TCAGACAAGAGCAAGTCAGTG- 3'；
引物RASEF-R1的序列为：5'- TATCTAACCAAGTGTGATGG - 3'；
S3、对PCR扩增产物进行测序，测序所得片段的部分序列为AGCACNGAGATGGAAACCTTAGCCATTGCTGTGAAAAGGTATANTAAGNGATG，其中N代表A、G、C或T，根据所得序列的连锁的单核苷酸差异判断鹤鸵目动物的性别；当所述部分序列的第6、44和49个核苷酸位点的基因型分别为纯合子G/G、T/T和C/C时，则判定为雄性；当所述部分序列的第6、44和49个核苷酸位点的基因型呈现杂合位点G/A、T/G和C/T时，则判定为雌性。
2.根据权利要求1所述的性别鉴定方法，其特征在于，所述血液的取样量为5~10μL，所述羽毛的取样量为3~4根。
3.根据权利要求1~2任一项所述的性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用E.Z.N.A. Blood Tissue DNA Kit试剂盒提取血液中的DNA，使用Forensic Tissue DNAKit试剂盒提取羽毛中的DNA。
4.根据权利要求3所述的性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述PCR扩增的反应程序为：
95℃ 5 min；
95℃ 30 s，
49℃ 1 min，
72℃ 1 min，共35个循环；
72℃ 10 min。
5.根据权利要求4所述的性别鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系中包括：2×Dream Taq Green PCR Master Mix、ddH2O、引物RASEF-F1、引物RASEF-R1、DNA模板。
6.根据权利要求5所述的性别鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为50μL体系，具体如下：
2×Dream Taq Green PCR Master Mix 20μL，
ddH2O 15μL，
RASEF-F1 5μL，
RASEF-R1 5μL，
DNA模板 5μL。
7.一种试剂盒在鉴别鹤鸵目动物性别中的应用，其特征在于，所述鹤鸵目动物为鹤鸵或鸸鹋；所述试剂盒包括以下组分：2×Dream Taq Green PCR Master Mix、ddH2O、引物RASEF-F1、引物RASEF-R1、DNA模板；
引物RASEF-F1的序列为：5'- TCAGACAAGAGCAAGTCAGTG- 3'；
引物RASEF-R1的序列为：5'- TATCTAACCAAGTGTGATGG - 3'；
使用引物RASEF-F1和RASEF-R1进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；对PCR扩增产物进行测序，测序所得片段的部分序列为AGCACNGAGATGGAAACCTTAGCCATTGCTGTGAAAAGGTATANTAAGNGATG，其中N代表A、G、C或T，根据所得序列的连锁的单核苷酸差异判断鹤鸵目动物的性别；当所述部分序列的第6、44和49个核苷酸位点的基因型分别为纯合子G/G、T/T和C/C时，则判定为雄性；当所述部分序列的第6、44和49个核苷酸位点的基因型呈现杂合位点G/A、T/G和C/T时，则判定为雌性。
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