CN112553348B - 一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记及其应用。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；其中，含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为雌性，含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为雄性。本发明还相应设计了分子标记引物组，包括雌性特异性引物组SEQ ID NO：3～4和雄性特异性引物组SEQ ID NO：3～5，其中雌、雄样本只有相应的雌、雄性特异性引物才能扩增得到特异条带。本发明中提供的分子标记和引物组可以对未知性别的草地贪夜蛾，如幼虫或鳞羽掉落的草地贪夜蛾成虫进行性别鉴定，准确率高，为研究草地贪夜蛾的雌雄个体差异提供了一种工具。

Description

一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记及其应用。

背景技术

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是属于鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属的一种昆虫，该虫源于北美，2019年1月入侵我国云南省，并迅速扩展到全国26个省份^[1-3]。草地贪夜蛾作为联合国粮农组织全球预警的跨国界迁飞性重大害虫^[4]，具有寄主范围宽、适生区域广、增殖潜能强、扩散速度快、突发危害重等特点^[5]。

草地贪夜蛾与其他鳞翅目昆虫一样，危害主要发生在幼虫时期，而目前针对草地贪夜蛾幼虫时期的雌雄为害行为特点差异的研究较少，其原因在于没有快速简便的针对幼虫的性别鉴定手段。草地贪夜蛾与许多鳞翅目昆虫一样，在蛹和成虫时期便不再取食，故而幼虫时期的取食量对其之后化蛹、羽化、产卵、迁飞等行为具有重要影响，那么不同性别的幼虫取食量之间是否具有差异呢？林玉英等(2017)发现叶子织蛾幼虫在幼虫1龄时期，雌虫的取食量显著大于雄虫^[6]。覃吕高(2012)研究发现雄蚕比雌蚕有可能有更高的ATP合成能力，从而使得雄蚕更健壮,生长速度也比雌蚕更快^[7]。另外，许多研究表明，昆虫幼虫时期在抵抗高温、抗核型多角病毒等方面有性别差异^[8～9]。同时，许多研究表明，昆虫在幼虫时期的取食量、应对高温等方面有性别差异，成虫时期在感光、触角结构等方面也存在显著差异^[11]。更重要的是，草地贪夜蛾入侵中国后，全国开展了统防通治措施，预测预报显得尤为重要。灯诱、性诱和食诱捕获的成虫，通常难以判断性别。

目前草地贪夜蛾的性别主要是通过形态差异进行判断，具体是通过蛹期和成虫时期的外露生殖器及翅上的斑纹^[10]，缺乏对幼虫有效的形态学判断标准。田间捕捉的草地贪夜蛾成虫由于其活跃性强，鳞羽容易掉落，给性别的鉴定带来困难。对于鳞羽掉落的草地贪夜蛾样本和未经过性别鉴定的DNA样本，也缺乏有效的性别鉴定手段。因此，开发简便、准确的分子标记，用于鉴定幼虫期的草地贪夜蛾的性别具有理论和实际应用意义。

性信息素结合蛋白PBP在草地贪夜蛾的信息素识别过程中发挥重要作用，雄虫通过触角感受雌虫性腺释放的性信息素，寻找合适的交配对象，因此在功能上，雌雄虫的性信息素结合蛋白必然存在差异。牛小慧(2011)对甜菜夜蛾的不同PBP蛋白进行RT-PCR检测发现，PBP蛋白在雌雄虫之间的表达量存在显著差异^[12]；刘苏等(2020)等则通过对草地贪夜蛾4个性信息素结合蛋白基因的克隆及表达模式分析发现，定位于雌雄成虫触角上的SfruPBP1和SfruPBP2蛋白在雄虫中具有更高的表达量^[13]。而草地贪夜蛾性信息素结合蛋白PBP在雌雄虫中存在的这些差异说明，根据雌雄虫PBP差异来开发草地贪夜蛾性别鉴定的分子标记是可行。本发明提供了一种用于草地贪夜蛾性别鉴定的分子标记，为研究草地贪夜蛾某些形状可能存在的性别差异提供了快速有效的手段。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种草地贪夜蛾性别差异性分子标记。

本发明的另一目的在于提供一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物。

本发明的又一目的在于提供所述鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴别草地贪夜蛾性别的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种草地贪夜蛾性别差异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

所述的草地贪夜蛾性别差异性分子标记，含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为雌性，含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为雄性。

所述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列采用PCR引物检测，根据PCR检测结果鉴定草地贪夜蛾的性别。

所述的PCR引物如下(SEQ ID NO：3～5)所示：

Sf-sex-F:5’-TAGCCGTGAGTTTGAATAGGGT-3’(SEQ ID NO：3)；

Sf-female-R-2：5’-CTCAGAGGTTTTTGATATGGTTT-3’(SEQ ID NO：4)；

Sf-male-R-2：5’-TGTATTCTTCTCAGTGCGAAGAC-3’(SEQ ID NO：5)。

一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～5所示。

所述的分子标记引物组包括雌性特异性引物组和雄性特异性引物组，其中雌性特异性引物组由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成，雌性样本只有雌性特异性引物扩增得到特异条带(SEQ ID NO：1)；雄性特异性引物组由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5组成，雄性样本只有雄性特异性引物扩增得到特异条带(SEQ ID NO：2)。

一种鉴别草地贪夜蛾性别的试剂盒，含有上述鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组。

所述的试剂盒还可以含有PCR扩增所需要的其他成分，如Primer STAR Max、ddH2O等

所述的草地贪夜蛾性别差异性分子标记，所述的鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组以及所述的鉴别草地贪夜蛾性别的试剂盒中的至少一种在草地贪夜蛾的性别鉴定中的应用。

一种鉴别草地贪夜蛾性别的方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组DNA

提取待测草地贪夜蛾的基因组DNA；

(2)PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板，利用上述鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组中的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5分别进行扩增，得到PCR扩增产物；

(3)结果判断

①采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测：若用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物扩增得到452bp的电泳条带，则为雌性草地贪夜蛾；若用SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5所示的引物扩增得到456bp的电泳条带，则为雄性草地贪夜蛾；

和/或：

②对PCR扩增产物进行测序：若用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物扩增得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，则为雌性草地贪夜蛾；若用SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5所示的引物扩增得到如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，则为雄性草地贪夜蛾。

步骤(1)中所述的DNA提取优选为采用微量样品基因组DNA提取试剂盒进行提取。

步骤(1)中所述的草地贪夜蛾为性别已知或未知的草地贪夜蛾，包括草地贪夜蛾的虫蛹、幼虫和成虫；优选为性别未知的草地贪夜蛾幼虫或鳞羽掉落的草地贪夜蛾成虫。

步骤(1)中所述的基因组DNA的浓度优选为10ng/μL。

步骤(2)中所述的PCR扩增的体系为15μL扩增体系：Primer STAR Max 6.25uL，10μM的上述分子标记引物组的引物各0.5μL，基因组DNA0.5μL，加ddH2O至15μL。

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10S，58℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)草地贪夜蛾虫蛹及成虫时期的外部形态标记简单直观，主要通过外露生殖器及翅上的斑纹等外部形态特征进行分辨，草地贪夜蛾在幼虫时期应对高温、取食量存在性别差异，但目前缺少对草地贪夜蛾幼虫、鳞羽掉落成虫(成虫时期易出现鳞羽掉落等情况导致特征缺失)和未经过鉴定性别的DNA样本的性别方法。基于此，本发明提供了一段草地贪夜蛾雌雄信息素受体sf-PBP4基因的差异序列，并根据该差异序列设计了特异性扩增雌雄虫PBP4差异基因片段的引物，进而对2020年采集自广东阳江和台山两地的草地贪夜蛾幼虫提DNA，测序鉴定雌雄后，使用开发的雌雄标记引物再次鉴定以上DNA样本，随后对经过形态学鉴定雌雄样本进行了PCR检测，并验证了标记的准确性。

(2)本发明利用标记引物扩增草地贪夜蛾的雌、雄DNA样本；其中雄性样本只有雄性特异性引物扩增得到特异条带，而雌性样本只有雌性特异性引物扩增得到特异条带。

(3)本发明的分子标记操作简便，在草地贪夜蛾各个发育时期及未进行性别鉴定的DNA样品，均可检测，通过本发明提供的性别鉴别标记引物，可以快速有效地对各个时期的草地贪夜蛾进行性别鉴定，为研究草地贪夜蛾雌雄个体差异提供了一种工具。

附图说明

图1是雌雄虫PBP基因的序列差异示意图。

图2是实施例1中利用本发明提供的3对性别鉴定引物对已经经过测序鉴定的雌雄虫进行性别鉴定的示意图(M：2000DNA Marker；male 1:雄虫1；male 2:雄虫2；female 1:雌虫1；female 2:雌虫2；m1:Sf-male-R-1；m2:Sf-male-R-2；m3:Sf-male-R-3；f1:Sf-female-R-1；m2:Sf-female-R-2；m3:Sf-female-R-3)。

图3是草地贪蛹期雌雄虫腹部末端差异对比图(图中：a：臀刺；b：肛门；c：第10腹节；d：第9腹节；e：半圆形瘤状突起；f：第8腹节；g：产卵孔；h：生殖孔)。

图4是实施例2中经过性别鉴定的草地贪夜蛾雌虫蛹图(图中，♀1、♀2、♀3、♀4和♀5分别代表5个不同的雌虫蛹)。

图5是实施例2中经过性别鉴定的草地贪夜蛾雄虫蛹图(图中，♂1、♂2、♂3、♂4和♂5分别代表5个不同的雄虫蛹)。

图6是实施例2中利用本发明提供的性别鉴定引物对雌虫蛹进行性别鉴定示意图(图中，DL2000marker左边为用雌虫引物Sf-sex-F和sf-female-R扩出的条带，右边为用雄虫引物Sf-sex-F和sf-male-R扩出的条带；♀1、♀2、♀3、♀4和♀5分别代表5个不同的雌虫蛹)。

图7是实施例2中利用本发明提供的性别鉴定引物对雄虫蛹进行性别鉴定示意图(图中，DL2000marker左边为用雌虫引物Sf-sex-F和sf-female-R扩出的条带，右边为用雄虫引物Sf-sex-F和sf-male-R扩出的条带；♂1、♂2、♂3、♂4和♂5分别代表5个不同的雄虫蛹)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售或公开渠道获得。本发明实施例中涉及的草地贪夜蛾样本为实验室饲养种群。本发明实施例中涉及的引物均委托华大基因合成。

实施例1草地贪夜蛾雌雄差异基因序列的获得

由于草地贪夜蛾虫蛹及成虫时期的外部形态标记简单直观，但在成虫时期易出现鳞羽掉落等情况导致特征缺失，且无法对幼虫进行鉴定。本发明在对草地贪夜蛾嗅觉相关基因进行研究的过程中，通过在线网站寻找并下载PBP蛋白隐马尔科夫模型(https://pfam.xfam.org)，使用Bio-Linux软件进行生物信息学分析得到草地贪夜蛾PBP蛋白家族，经过在线网站手动确认每个蛋白的结构域(http://www.omicsclass.com/article/681)，确认之后总共得到筛选得到21个PBP蛋白，使用Bio-Linux软件进行生物信息学分析获得对应蛋白的CDS序列等相关信息。在对获得的各基因进行PCR测序检测时，发现Sf-10911基因序列在雌雄个体中存在较大差异。通过多个已知雌雄的样本检测之后，确认为雌雄差异基因(图1)。

Sf-10911基因CDS序列为：

ATGTATAAAATAATCTCTTTGGTTTTCTGCATAGCCGTGAGTTTGAATAGGGTTCATGGAAATGCAGAAGACAAAATAGCTATCATGAGTGCCGTGAAACCATTTGTAGAGGAGTGTGCGAAGAAGCATGGCGTCACCTTTGAAGCACTCCTAGGTGCCAAAGCATCAGGCAAAATAGACGGCATTGAGCCTTGTTTCTATAGTTGTGTTTATAAGAAAACAGAATTTTTGAATAGTAAGGGCGAATACGATGTAGATACTGCTTTAGCCAAGCTCAAGAAGTACATTAGCAACGATGACGATTATGCCAAACTCTCACAAGTTGGAAAAGATTGTGCATCAGTAAACTCCAAGCCTGTCGGAGACGGAGACGCTGGATGCGAGAGAGGCGTGCTGCTAACCCAATGCTTCTTGGATCATAAGGGCGCGGTAACTATTTTTGATATTTTGATTTTAGACAAACGTAACGTAAACGAGATAACGTATTTTGGAAACAATGTTGAAGCTTCGAAGGATCAGGAGTCCAAAGTTTTATTGTCCAACATGTCTAAGTTCGCTTGTTTGGTTTTGTGTGTTGTGGCTGTGAGCCTGAGTGGGGTTCATGCAACTGCCGAGGAGAAAGCAGCTTTCATAGAAGCTGTGAAGCCCCATATACAGGAGTGCTCAAAGGAGCATGGAGTCACTCCTGAAGAAATTAAATCTGCCAAGGCTGCAGGCAATGCAGATGGCATCAACTCTTGTTTCCTGAGCTGTGTTTATAAGAAAGCTGAAGTTATTAATGACAAAGGAGAATACGATGCCGATAAAGCCCTGGAGAAACTCAAGAAATTCGTGAGCAACGAAGATGATTATGCTAAATTCGCAGAAATTGGAAAGAAATGCGCTTCAGTTAACGAGAAGTCAGTAAGCGACGGAGATGCTGGTTGCGAAAGAGCTGCACTGTTGACCACATGCTTTTTGGAACACAAGAGCGAGATATCAGCACAGCCAACTGTGAATCCGGTGGTGGAACAAAGATCGGGTCCACGAGTATTATCGCGTCTTCTAGAAGCAGCACAGGGTATCGAGCAAGCTCGAGCTTCTGTGCAAAGACTCTCGTTGCTCCGTGACTTTTCACCTTTTTCTAACCTTGGCCGTCCTTAG。

本实施例针对草地贪夜蛾雌雄Sf-10911基因的雌雄差异区段设计了3对引物，开发雌雄性别鉴定的特异标记。利用设计合成的引物，对鉴别过已知性别的草地贪夜蛾幼虫样本进行PCR扩增，筛选得到分子标记，针对其设计的引物分别为：

Sf-sex-F(Sf-F):5’-TAGCCGTGAGTTTGAATAGGGT-3’；

(1)雌雄引物1：

Sf-female-R-1：5’-CCTGCCAGTGCCTTATTAATTAA-3’；

Sf-male-R-1：5’-TTTTGGCAGTGCCTTATTGATTA-3’；

(2)雌雄引物2：

Sf-female-R-2：5’-CTCAGAGGTTTTTGATATGGTTT-3’；

Sf-male-R-2：5’-TGTATTCTTCTCAGTGCGAAGAC-3’；

(3)雌雄引物3：

Sf-female-R-3：5’-TTAACAACGCTCCATAATAACCT-3’；

Sf-male-R-3：5’-TAAGAACCAGTTCTTATAAACAC-3’。

具体通过如下步骤实现：

(1)DNA提取：采用微量样品基因组DNA提取试剂盒提取经过测序鉴定已知性别的草地贪夜蛾幼虫(本实验选择雌虫和雄虫各2条，编号为雄虫1(male 1)、雄虫2(male 2)，雌虫1(female 1)、雌虫2(female 2))的基因组DNA(样本采自台山、阳江)，作为PCR扩增模板(浓度为10ng/μL)；

(2)采用上述设计的性别鉴定引物进行PCR扩增，得到扩增产物；其中，

①PCR扩增的体系为15μL扩增体系：Primer STAR Max(Takara)6.25μL，上游和下游引物(10μM)各0.5μL(即针对雄性样本，以Sf-sex-F为上游引物，以Sf-female-R-1或Sf-female-R-2或Sf-female-R-3为下游引物；针对雌性样本，以Sf-sex-F为上游引物，以Sf-male-R-1或Sf-male-R-2或Sf-male-R-3为下游引物)，模板0.5μL，加ddH2O至15μL。

②PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10S，58℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测：扩增的PCR产物，加入2μL 10×Lorrding buffer(Takara)后使用Biorad电泳仪和凝胶成像系统，检测扩增条带。

(4)根据电泳结果进行草地贪夜蛾性别鉴定。

(5)结果如图2所示：利用标记引物扩增中草地贪夜蛾的雌、雄DNA样本；雌雄引物1、3搭配Sf-sex-F扩增均不能扩增出特异条带；Sf-sex-F搭配雌雄引物2进行扩增时，其中雄性样本可以用雄性特异性引物Sf-male-R-2扩增得到特异条带(450bp左右)，而雌性样本只有雌性特异性引物Sf-female-R-2可以扩增得到特异条带。因此，选择Sf-male-R-2和Sf-female-R-2作为草地贪夜蛾雌雄虫特异性标记引物。

(6)将Sf-female-R-2和Sf-male-R-2对应的PCR扩增产物进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示：

Sf-10911-female(SEQ ID NO：1)：

cttttggcttattcttctgatattattataagtttaattctcatccaaaaatattcatcatcattttgttatctctttttagggaaatgcagaagacaaaatagccatcatgagtgctgtgaaaccatttgtagaggagtgtgcgaagaaacatggtgtcacgttcgaagcactcctaggtgctaaagcatcaggcaaaatagatggcattgagccttgtttctatagttgtgtttataagaaaacagagtttgtaagtactggttattatggagcgttgttaattaataaggcactggcaggcaggaaggtggagttcttccactgagaaaaacaaaaaccatatcaaaaacctctgagatcaatgggcttcctctaataagagaggtctgccataatcaggtttatcaaaggatgaagctgctgcccagtctcggtaatacatacgccca。

Sf-10911-male(SEQ ID NO：2)：

acgtgactgactgccatgtgctaatattattataagtttaattctaatcctaaaaatatttgttatcattttgttatatctttttagggaaatgcagaagacaaaatagctatcatgagtgccgtgaaaccatttgtagaagagtgtgcgaagaaacatggcgtcacctttgaagcactcctaggtgctaaagcatcaggcaaaatagatggcattgagccttgtttctatagctgtgtttataagaaaacagaatttgtaagtactggttcttaatcaataaggcactgccaaaattctttgatgggtaactgtcgtgtttgggaaggttaagtcttcgcactgagaagaatacaaattatattaaaatgggcttcctctaataagaaaggtctgccataataaggtttatcaaaggatgaagctgctgcccagtctcggtaatcaatacgccca。

实施例2已知性别的草地贪夜蛾雌雄蛹的鉴定

(1)应用目前常规的草地贪夜蛾雌雄鉴定方法，即雌雄蛹腹部末端形态的差异辨别雌雄蛹；草地贪蛹期雌雄虫腹部末端差异对比如图3所示。

(2)DNA提取：采用微量样品基因组DNA提取试剂盒提取草地贪夜蛾蛹的基因组DNA，本发明随机各选择5个雌虫蛹(将其编号为：♀1、♀2、♀3、♀4、♀5；图4)和雄虫蛹(将其编号为：♂1、♂2、♂3、♂4、♂5；图5)，作为PCR扩增模板(浓度为10ng/μL)；

(3)采用实施例1中设计的性别鉴定引物Sf-sex-F、Sf-male-R-2和Sf-female-R-2进行PCR扩增(针对雌雄共10个样本，每个样本均分别采用Sf-sex-F为上游引物，以Sf-female-R-2或Sf-male-R-2为下游引物进行扩增)，得到扩增产物；其中，

PCR扩增的体系为15μL扩增体系：Primer STAR Max 6.25μL，上游和下游引物(10μM)各0.5μL，模板0.5μL，加ddH2O至15μL；

PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10S，58℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

(4)琼脂糖凝胶电泳检测：扩增的PCR产物，加入2μL 10×Lorrding buffer后使用Biorad电泳仪和凝胶成像系统，检测扩增条带。

(5)根据电泳结果进行草地贪夜蛾性别鉴定。

结果如图6和图7所示：利用标记引物扩增中草地贪夜蛾的雌、雄DNA样本；其中雌性样本只有雌性特异性引物扩增得到特异条带(图6)，而雄性样本只有雄性特异性引物扩增得到特异条带(图7)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 452

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-10911-female

<400> 1

cttttggctt attcttctga tattattata agtttaattc tcatccaaaa atattcatca 60

tcattttgtt atctcttttt agggaaatgc agaagacaaa atagccatca tgagtgctgt 120

gaaaccattt gtagaggagt gtgcgaagaa acatggtgtc acgttcgaag cactcctagg 180

tgctaaagca tcaggcaaaa tagatggcat tgagccttgt ttctatagtt gtgtttataa 240

gaaaacagag tttgtaagta ctggttatta tggagcgttg ttaattaata aggcactggc 300

aggcaggaag gtggagttct tccactgaga aaaacaaaaa ccatatcaaa aacctctgag 360

atcaatgggc ttcctctaat aagagaggtc tgccataatc aggtttatca aaggatgaag 420

ctgctgccca gtctcggtaa tacatacgcc ca 452

<210> 2

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-10911-male

<400> 2

acgtgactga ctgccatgtg ctaatattat tataagttta attctaatcc taaaaatatt 60

tgttatcatt ttgttatatc tttttaggga aatgcagaag acaaaatagc tatcatgagt 120

gccgtgaaac catttgtaga agagtgtgcg aagaaacatg gcgtcacctt tgaagcactc 180

ctaggtgcta aagcatcagg caaaatagat ggcattgagc cttgtttcta tagctgtgtt 240

tataagaaaa cagaatttgt aagtactggt tcttaatcaa taaggcactg ccaaaattct 300

ttgatgggta actgtcgtgt ttgggaaggt taagtcttcg cactgagaag aatacaaatt 360

atattaaaat gggcttcctc taataagaaa ggtctgccat aataaggttt atcaaaggat 420

gaagctgctg cccagtctcg gtaatcaata cgccca 456

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-sex-F

<400> 3

tagccgtgag tttgaatagg gt 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-female-R-2

<400> 4

ctcagaggtt tttgatatgg ttt 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-male-R-2

<400> 5

tgtattcttc tcagtgcgaa gac 23

<210> 6

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-10911基因CDS序列

<400> 6

atgtataaaa taatctcttt ggttttctgc atagccgtga gtttgaatag ggttcatgga 60

aatgcagaag acaaaatagc tatcatgagt gccgtgaaac catttgtaga ggagtgtgcg 120

aagaagcatg gcgtcacctt tgaagcactc ctaggtgcca aagcatcagg caaaatagac 180

ggcattgagc cttgtttcta tagttgtgtt tataagaaaa cagaattttt gaatagtaag 240

ggcgaatacg atgtagatac tgctttagcc aagctcaaga agtacattag caacgatgac 300

gattatgcca aactctcaca agttggaaaa gattgtgcat cagtaaactc caagcctgtc 360

ggagacggag acgctggatg cgagagaggc gtgctgctaa cccaatgctt cttggatcat 420

aagggcgcgg taactatttt tgatattttg attttagaca aacgtaacgt aaacgagata 480

acgtattttg gaaacaatgt tgaagcttcg aaggatcagg agtccaaagt tttattgtcc 540

aacatgtcta agttcgcttg tttggttttg tgtgttgtgg ctgtgagcct gagtggggtt 600

catgcaactg ccgaggagaa agcagctttc atagaagctg tgaagcccca tatacaggag 660

tgctcaaagg agcatggagt cactcctgaa gaaattaaat ctgccaaggc tgcaggcaat 720

gcagatggca tcaactcttg tttcctgagc tgtgtttata agaaagctga agttattaat 780

gacaaaggag aatacgatgc cgataaagcc ctggagaaac tcaagaaatt cgtgagcaac 840

gaagatgatt atgctaaatt cgcagaaatt ggaaagaaat gcgcttcagt taacgagaag 900

tcagtaagcg acggagatgc tggttgcgaa agagctgcac tgttgaccac atgctttttg 960

gaacacaaga gcgagatatc agcacagcca actgtgaatc cggtggtgga acaaagatcg 1020

ggtccacgag tattatcgcg tcttctagaa gcagcacagg gtatcgagca agctcgagct 1080

tctgtgcaaa gactctcgtt gctccgtgac ttttcacctt tttctaacct tggccgtcct 1140

tag 1143

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-female-R-1

<400> 7

cctgccagtg ccttattaat taa 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-male-R-1

<400> 8

ttttggcagt gccttattga tta 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-female-R-3

<400> 9

ttaacaacgc tccataataa cct 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sf-male-R-3

<400> 10

taagaaccag ttcttataaa cac 23

Claims (10)

1.一种草地贪夜蛾性别差异性分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；其中，含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为雌性，含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为雄性。

2.根据权利要求1所述的草地贪夜蛾性别差异性分子标记，其特征在于：所述的SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列采用PCR引物检测，根据PCR检测结果鉴定草地贪夜蛾的性别。

3.根据权利要求2所述的草地贪夜蛾性别差异性分子标记，其特征在于：

所述的PCR引物如SEQ ID NO：3～5所示。

4.一种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组，其特征在于：所述的分子标记引物组包括雌性特异性引物组和雄性特异性引物组；其中，

雌性特异性引物组由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成；

雄性特异性引物组由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5组成。

5.一种鉴别草地贪夜蛾性别的试剂盒，其特征在于：含有权利要求4鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组。

6.权利要求1～3任一项所述的草地贪夜蛾性别差异性分子标记，权利要求4所述的鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组以及权利要求5所述的鉴别草地贪夜蛾性别的试剂盒中的至少一种在草地贪夜蛾的性别鉴定中的应用。

7.一种鉴别草地贪夜蛾性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取基因组DNA

提取待测草地贪夜蛾的基因组DNA；

(2)PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求4所述的鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物组中的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5分别进行扩增，得到PCR扩增产物；

(3)结果判断

①采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测：若用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物扩增得到452bp的电泳条带，则为雌性草地贪夜蛾；若用SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5所示的引物扩增得到456bp的电泳条带，则为雄性草地贪夜蛾；

和/或：

②对PCR扩增产物进行测序：若用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物扩增得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，则为雌性草地贪夜蛾；若用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的引物扩增得到如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，则为雄性草地贪夜蛾。

8.根据权利要求7所述的鉴别草地贪夜蛾性别的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的草地贪夜蛾为性别已知或未知的草地贪夜蛾的虫蛹、幼虫或成虫。

9.根据权利要求8所述的鉴别草地贪夜蛾性别的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的草地贪夜蛾为性别未知的草地贪夜蛾幼虫或鳞羽掉落的草地贪夜蛾成虫。

10.根据权利要求8所述的鉴别草地贪夜蛾性别的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的PCR扩增的体系为15μL扩增体系：Primer STAR Max 6.25uL，10μM的分子标记引物组的引物各0.5μL，基因组DNA 0.5μL，加ddH2O至15μL；

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10S，58℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

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