CN113604582B - 一种淡足侧沟茧蜂dna条形码序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列及其应用，其序列为淡足侧沟茧蜂的COI基因，具体如序列1所示。本发明利用DNA条形码技术，针对淡足侧沟茧蜂，建立一种相对稳定和准确的分子鉴定方法，可以对残缺样品进行鉴定，对淡足侧沟茧蜂与其近缘种能够很好的区分鉴定，对淡足侧沟茧蜂能够进行准确的鉴定；对提高淡足侧沟茧蜂分类鉴定的准确性、提高利用淡足侧沟茧蜂作为生物防治因子的使用具有重要的促进作用。本发明利用DNA条形码技术，可以对淡足侧沟茧蜂能够进行快速准确的鉴定。

Description

一种淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列及其应用
技术领域
本发明属于生物科技和物种鉴定技术领域，具体涉及一种淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列及其应用。
背景技术
淡足侧沟茧蜂(Microplitis pallidipes)，是膜翅目Hymenoptera、茧蜂科Braconidae的一种单寄生蜂，其主要寄生夜蛾科害虫2-3龄的幼虫，田间寄生率为6％～50％，是重要的生物害虫防治资源，能有效的控制蔬菜上夜蛾科害虫灾害的发生。然而由于部分茧蜂科寄生蜂形态差异不大，尤其是侧沟茧蜂属Microplitis的几种寄生蜂，例如斯氏侧沟茧蜂Microplitis similis、双斑侧沟茧蜂Microplitis bicoloratus、中红侧沟茧蜂Microplitis mediator等物种的形态差异很小，因此通过传统的形态学方法鉴定侧沟茧蜂种类往往很困难。而目前缺少通过分子手段鉴定淡足侧沟茧蜂的相关技术。
COI基因为线粒体DNA(mtDNA)上的细胞色素C氧化酶第I亚基，动物生命中绝大部分阶段都存在明显的COI基因序列；大多数细胞中都有几百个以上的线粒体，但只有一组染色体，因此等量的样品中线粒体的DNA更容易被放大和使用；线粒体的遗传方式属于母性遗传：COI基因位于细胞线粒体中，只能从母体中遗传，基因重组的发生率低，而大部分细胞核的基因是从母体和父体共同遗传下来的，基因重组的发生率较高；因此与细胞核的DNA相比，线粒体DNA的突变速度是核DNA的10倍，使物种分离更准确。更进一步而言，COI基因拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异；而且COI基因在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比对容易操作；目前对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的COI基因序列的比较分析得出：除刺胞动物Cnidaria外，98％的物种遗传距离的差异在种内为0～2％，种间平均可达到11.3％。因此通常选定COI基因中的一个片段作为DNA条形编码基因。
迄今为止，已有诸多研究证明COI基因在鸟类、鱼类、鳞翅目昆虫、蚊类、蚁类和弹尾目等类群的分类鉴定中行之有效。但尚无淡足侧沟茧蜂的相关基因序列的报道，这对不同虫态、形态不完整的淡足侧沟茧蜂标本的鉴定，以及茧蜂昆虫的分子系统发育研究是一个障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列及其应用，建立一种相对稳定和准确的分子鉴定方法，从而实现对淡足侧沟茧蜂与其近缘种很好的区分鉴定。
本发明中淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列为淡足侧沟茧蜂的COI基因，其序列如序列1所示，具体如下：
TCAGGGATATTAGGATTTCAATAAGTTTAATTATTCGTTTAGAATTAGGAAGTAACAGGAAATTTAATTGGTAATGATCAAATTTAAATAGAATTGTTACTTCTCATGCTTTTATTATGATTTTTTTATAGTTATACACCTATTATAATTGGTGGATTTGGAAATGGATTAGTTCCATTAATATTGAGTTCACCGATATGGCTTTTCTCGAATAAATAATAAGAATTTTGATTATTAATTCCTTCATTATTTTATTAGTTTTTAGAGATTTGTTAATGTTGGTGTTGGGACAGATGAACTGTGTATCCACCTCTTATCATTAATTTAGGTCATGGAGGTTTATCAGTTGATATAAGAATTTTTGCTTTACATTTAGCTGGTGCATCTTCAATTATGGGGGCTGTTAATTTTATTACAACGGTTTATAATATAACGAATAAATTTTTTTAATTATAGATAAAATTTCATTATTACGTTTGATCTGTATTAATTAACGCTATT。
本发明中淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列在鉴定淡足侧沟茧蜂中的应用。
所述的淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列鉴定淡足侧沟茧蜂的方法，包括以下步骤：
1)将待测的淡足侧沟茧蜂样本中提取DNA；
2)将步骤1)中提取的DNA进行纯化后，通过正向引物和反向引物，进行PCR扩增，扩增后的产物进行电泳检测，对扩增产物进行测序，测出的序列与淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列的同源性在98％以上，则可判定该检测样本属于淡足侧沟茧蜂。
所述步骤2)中，正向引物的序列如序列2所示，具体为：5’-GATCAGGGATATTAGGATT-3’；反向引物的序列如序列3所示，具体为：5’-AGCTAATACTGGTAATG-3’。
本发明的有益效果：本发明利用DNA条形码技术，针对淡足侧沟茧蜂建立一种相对稳定和准确的分子鉴定方法，可以对残缺样品进行鉴定，对淡足侧沟茧蜂与其近缘种能够很好的区分鉴定，对淡足侧沟茧蜂能够进行准确的鉴定；对提高淡足侧沟茧蜂分类鉴定的准确性、提高利用淡足侧沟茧蜂作为生物防治因子的使用具有重要的促进作用。本发明利用DNA条形码技术，可以对淡足侧沟茧蜂能够进行快速准确的鉴定。
附图说明
图1本发明的鉴定方法流程图；
图2实施例1中样本的凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明中鉴定方法的工艺流程图如图1所示，具体步骤可见实施例。
实施例1
1、淡足侧沟茧蜂标本的采集
淡足侧沟茧蜂标本均采自上海及周边地区菜田中，其中死虫浸泡于无水乙醇中，活虫置于饲养管中。拿回实验室后，置于液氮中冷冻，并保存在-80℃超低温冰箱中，用于后续研究。活虫在实验室通过甜菜夜蛾或斜纹夜蛾进行人工繁育。
2、试验样品的前处理
从上述保存的淡足侧沟茧蜂标本小心用镊子取下少量相应组织，移入EP管中，每管一只，并进行唯一编号(共16组标本，具体的标本信息可见表1)，用于DNA提取。用扩增COI基因的引物(生工生物合成)对所提取的淡足侧沟茧蜂基因组DNA进行PCR扩增。
3、DNA模板制备
用液氮将单头蜂或蛹研磨成粉末状，按照生工试剂盒提取各样本淡足侧沟茧蜂的DNA，纯化的DNA经过1.2％琼脂糖电泳检测，使用752型紫外可见分光光度计测定浓度，置-20℃保存待用。
4、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物5’-GATCAGGGATATTAGGATT-3’
反向引物5’-AGCTAATACTGGTAATG-3’
5、PCR扩增
用北京全式金生物技术有限公司的EasyTaq酶进行PCR扩增，PCR反应体系如下(20mL)：2×EasyTaq Mix 10μL，正反向引物各0.5μL(10μmol/L)，dd H2O 8μL和1μL模板DNA(20ng/μL)。PCR反应程序是：94℃预变性5min，35个循环(94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min 30s)，72℃处理10min。
6、PCR扩增产物检测
PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖电泳检测(150V电压，电泳15min)。凝胶成像系统检测，1～16号样品的扩增产物的电泳图谱参见图2。可以看出实施例1的16个样品均能特异性扩增出501bp左右的产物。
表1
样品序号 虫态 同源性 样品序号 虫态 同源性
1 成虫 99.6％ 9 成虫 99.0％
2 成虫 100％ 10 成虫 99.6％
3 成虫 100％ 11 成虫 100％
4 成虫 99.4％ 12 成虫 100％
5 成虫 100％ 13 蛹 99.2％
6 成虫 99.0％ 14 蛹 100％
7 成虫 100％ 15 蛹 99.4％
8 成虫 100％ 16 蛹 100％
7、基因序列测定
将PCR产物纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。取得基因序列经校正后即为目的基因序列。测序结果显示16个样品与本发明的淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列(序列1所示)的同源性在99.0％～100％，具体可见表1，因而可以确认所述不同虫态的16个样品均属淡足侧沟茧蜂。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 501
<212> DNA
<213> 淡足侧沟茧蜂DNA条形码序列(人工序列)
<400> 1
tcagggatat taggatttca ataagtttaa ttattcgttt agaattagga agtaacagga 60
aatttaattg gtaatgatca aatttaaata gaattgttac ttctcatgct tttattatga 120
tttttttata gttatacacc tattataatt ggtggatttg gaaatggatt agttccatta 180
atattgagtt caccgatatg gcttttctcg aataaataat aagaattttg attattaatt 240
ccttcattat tttattagtt tttagagatt tgttaatgtt ggtgttggga cagatgaact 300
gtgtatccac ctcttatcat taatttaggt catggaggtt tatcagttga tataagaatt 360
tttgctttac atttagctgg tgcatcttca attatggggg ctgttaattt tattacaacg 420
gtttataata taacgaataa atttttttaa ttatagataa aatttcatta ttacgtttga 480
tctgtattaa ttaacgctat t 501
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 正向引物(人工序列)
<400> 2
gatcagggat attaggatt 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 反向引物(人工序列)
<400> 3
agctaatact ggtaatg 17

Claims (1)

1.引物序列在鉴定淡足侧沟茧蜂中的应用，其特征在于，正向引物的序列如序列2所示，具体为：5’- GATCAGGGATATTAGGATT-3’；反向引物的序列如序列3所示，具体为：5’-AGCTAATACTGGTAATG -3’。
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