CN114657263A - 一种用于建鲤2号鉴定的分子标记、鉴定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于建鲤2号鉴定的分子标记、鉴定方法及应用。本发明所述分子标记组合包括13个SNP分子标记,依次为第1‑13SNP分子标记,待测建鲤含有13个SNP分子标记中7个及以上SNP分子标记即为建鲤2号。本发明通过鉴定建鲤2号特异性分子标记,能准确鉴定出建鲤2号,具有简单易行、操作方便、鉴定成功率高等优点,建鲤2号特异性分子标记的开发,对建鲤2号种源可控、养殖推广、育种方案的制定和育种计划的有效管理具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,特别涉及一种用于建鲤2号鉴定的分子标记、鉴定方法及应用。
背景技术
建鲤是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心选育的一个鲤新品种,也是我国养殖鱼类杂交选育成功的第一个品种。它以荷包红鲤和元江鲤为亲本,通过多系杂交、选育和雌核发育技术相结合,再经横交固定而育成的遗传性状稳定的鲤品种,1996年通过了全国水产原种和良种审定委员会审定。与其它鲤品种相比,建鲤体型偏长,生长快、易起捕、抗逆性强,可在不同地区、不同养殖模式下进行养殖,被农业农村部审核为适宜推广的水产优良品种,已在我国多地养殖并取得了巨大的经济效益和社会效益。
建鲤2号是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心联合深圳华大海洋科技有限公司培育的水产新品种(GS-01-004-2021),具有生长速度快、体型优的特点,适宜在我国建鲤养殖主产区人工可控的水体中养殖。与建鲤相比,12月龄鱼生长速度平均提高17.7%;体长/体高平均值3.11,保持了建鲤的长体型。与配套的养殖良法相结合,建鲤2号推广养殖面积1万余亩,良种增产贡献率达到20%,为我国鲤产业发展提供了重要的养殖品种。
从外形上看,建鲤2号与建鲤相近,两者很难区分,生产中如管理不善,极易引起建鲤2号与建鲤之间杂交,导致种质混杂,建鲤2号新品种优良性状退化。另外,建鲤2号亲本多代繁殖后,子代性状也会出现变异,如何进行提纯复壮?如何进行种源可控?这些问题都集中到一个焦点上,那就是如何准确鉴定建鲤2号。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种用于建鲤2号鉴定的分子标记、鉴定方法及应用。本发明通过建立分子标记,可准确的鉴定出建鲤2号,所述鉴定方法可用于建鲤2号的种源可控、养殖推广、育种方案的制定和育种计划研究中。
本发明的技术方案如下:
一种建鲤2号鉴定的分子标记组合,所述分子标记组合包括13个SNP分子标记,依次为第1-13SNP分子标记,待测建鲤含有13个SNP分子标记中7个以上SNP分子标记即为建鲤2号。
进一步地,所述第1SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第30位,所述第1SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述第2SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第386位,所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列;
所述第3SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第450位,所述核酸具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列;
所述第4SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第159位,所述核酸具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列;
所述第5SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第30位,所述核酸具有如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列;
所述第6SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第511位,所述核酸具有如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列;
所述第7SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第43位,所述核酸具有如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列;
所述第8SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第361位,所述核酸具有如SEQ ID NO:8所示核苷酸序列;
所述第9SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第212位,所述核酸具有如SEQ ID NO:9所示核苷酸序列;
所述第10SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第19位,所述核酸具有如SEQ ID NO:10所示核苷酸序列;
所述第11SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第126位,所述核酸具有如SEQ ID NO:11所示核苷酸序列;
所述第12SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第99位,所述核酸具有如SEQ ID NO:12所示核苷酸序列;
所述第13SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第487位,所述核酸具有如SEQ ID NO:13所示核苷酸序列。
进一步地,所述13个SNP分子标记的引物序列依次为:第1-13SNP分子标记的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14~26所示;第1-13SNP分子标记的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27~39所示。
进一步地,第1SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:GGTATTATGCGCACAGAGCACA
R:GAGGTTTCCCTTTATTCCGCC;
第2SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:TGGTTTGGGTCTCCAGCATCTTT
R:TGTGGATTTGGAGATCAGGTAACG;
第3SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:CAATTCGCATCCTGCTATATATTCG
R:TTAGTATCCCACGAGTTTGTCCCA;
第4SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:GGCAATAGAGACCATAGATCCTATGCGG
R:CAAACATGTCAGGAGACTGGAGACAC;
第5SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:AGTGACTGCAATATCAGCTGACTGA
R:CAATGTACCAGCATTATTTGCTGACA;
第6SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:ACAGCAGTATTCCTTTTACATAGTAGCAG
R:CACAATACTGTTACTTTAATAGCTGCCTAG;
第7SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:TCAGACTTTGACTTCGCCTTCC
R:GGCTTGCTCCGAACTTGCTTG;
第8SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:TCACGTCCTTAATTTCAAAAGCGATG
R:CTTCATGGGGTCAGGTTTCCCAG;
第9SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:GCGCCACGTTAAAGAGCTGC
R:CTTTGGTCACTTGAAGTTGGCG;
第10SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:GGTCATCATGAAGGAGCAATCGT
R:AGCCATTAAAAGTGGAAGAAGCAG;
第11SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:TCAGACTTTGACTTCGCCTTCC
R:GGCTTGCTCCGAACTTGCTTG;
第12SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:GCACAGGTATAAAAGTCAGACGCG
R:ACGCCTCTGAAATCTGAACGGA;
第13SNP分子标记的正向和反向引物的核苷酸序列为:
F:CCACTTCAAAAGGGACAAATATGTACC
R:CTTGAAAATCCTCTTGGCCTCGACT。
一种利用上述的分子标记组合进行建鲤2号鉴定的方法,包括如下步骤:
(1)筛选、设计引物;
(2)提取待测建鲤样本的基因组DNA;
(3)PCR扩增:运用PCR仪扩增提取的待测建鲤样本的基因组DNA;
(4)酶切、电泳检测:对PCR扩增产物进行酶切,并用电泳分离检测;
(5)根据电泳条带,分析基因型,获得每个待测建鲤样本的多个SNP分子标记位点的基因型,待测建鲤样本含有7个以上权利要求1所述13个SNP分子标记即为建鲤2号。
进一步地,步骤(2)中,取待测建鲤样本尾部鳍条少量,加入到450ul 1×STE的1.5ml离心管中,同时加入10ul 20mg/ml蛋白酶K和12.5ul 20%十二烷基硫酸钠,混匀,置于55℃水浴消化过夜,然后采取酚氯仿法提取DNA,加200ul去离子水溶解后,4℃保存备用。所述1×STE由150mM NaCl,50mM Tris,1mM EDTA组成。
进一步地,步骤(3)中,所述PCR扩增的反应体系为:PCR反应总体积为15μL,其中30ng/μL DNA模板2μL,2×Taq PCR Mix 5μL,10μmol/L正向和反向引物各0.5μL,去离子水7μL。
进一步地,步骤(3)中,所述PCR扩增的反应程序:95℃预变性3min;94℃变性40s,56~60℃退火40s,72℃延伸1min,循环30次;72℃延伸5min;4℃保存。
进一步地,步骤(4)中,13个分子标记用不同限制性内切酶进行酶切,酶切用酶及温度依次为BglI,37℃;HindII,37℃;MvaI,37℃;Mph1103Ⅰ,37℃;AvaⅡ,37℃;Tas I,65℃;BclI,55℃;MvaI,37℃;TailI,65℃;NmuCI
,37℃;BclI,55℃;ApaLⅠ,37℃;FspBⅠ,37℃。
进一步地,步骤(5)中,所述多个SNP分子标记位点包含于权利要求1所述13个SNP分子标记中。
一种上述分子标记组合的应用,所述分子标记组合用于鉴定建鲤2号。
一种上述方法在鉴定建鲤2号中的应用。
本发明有益的技术效果在于:
(1)本发明通过克隆生长相关基因片段,筛选SNP位点,寻找适合酶切的SNP位点,设计引物,PCR扩增,酶切,对酶切产物进行分型,通过判断分型产物中标记基因型的数量判断是否为建鲤2号,即含有13个分子标记中的7个及以上标记基因型标记为建鲤2号新品种。
(2)本发明通过鉴定建鲤2号特异性分子标记,能准确鉴定出建鲤2号,具有简单易行、操作方便、鉴定成功率高等优点。建鲤2号特异性分子标记的开发,对建鲤2号种源可控、养殖推广、育种方案的制定和育种计划的有效管理具有重要的作用。
(3)本发明建鲤2号通过群体选育结合分子标记辅助育种技术选育出来的,具有特异性的分子标记。通过群体选育得到含有13个标记中的7个及以上标记基因型的建鲤生长速度显著快于7个以下标记基因型的建鲤,因此确定了含有13个标记中的7个及以上标记基因型的建鲤为建鲤2号。本发明是对新品种知识产权保护提供强有力的法律保障,也可对新品种推广和产品打假提供重要的技术支撑。
附图说明
图1为本发明实施例1的分子标记FABP3a-I3-C30G(a),GHSR1a-I-C386T(b),GHSR1a-E1-A450C(c),IGFBP3-b-I2G30T(d),IGF1a-I4-A511C(e),GHR1a-I3-A43G(f),ODCb-I3-A126G(g)的PCR-RFLP电泳图谱。
图中:泳道M为DL1000 DNA ladder;1-24:建鲤2号。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。各实施例及对实施例中所用的设备和试剂如无特殊说明,均可从商业途径得到,且所记载的实施例仅用于解释本发明,不用于限制本发明。
建鲤2号是2021年国家水产原良种审定委员会审定通过的水产新品种(GS-01-004-2021),具有生长速度快,体型优等特点。建鲤2号是通过群体选育结合分子标记辅助育种技术选育出来的,具有特异性的分子标记。在选育过程中,含有13个标记中的7个及以上标记基因型的建鲤生长速度显著快于7个以下标记基因型的建鲤,以聚合7个及以上标记为目标,对建鲤进行多代选育,因此含有13个标记中的7个及以上标记基因型是建鲤2号新品种的特征。
实施例1:
一种用于鉴定建鲤2号的分子标记组合;所述分子标记组合包括13个SNP分子标记,依次为第1-13SNP分子标记,待测建鲤含有13个SNP分子标记中7个以上SNP分子标记即为建鲤2号。
第1 SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第30位,所述第1SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;标记名称为FABP3a-I3-C30G;
第2 SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第386位,所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列;标记名称为GHSR1a-I-C386T;
第3 SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第450位,所述核酸具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列;标记名称为GHSR1a-E1-A450C;
第4 SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第159位,所述核酸具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列;标记名称为GHSR1b-E1-G159T;
第5 SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第30位,所述核酸具有如SEQID NO:5所示核苷酸序列;标记名称为IGFBP3-b-I2G30T;
第6 SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第511位,所述核酸具有如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列;标记名称为IGF1a-I4-A511C;
第7 SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第43位,所述核酸具有如SEQID NO:7所示核苷酸序列;标记名称为GHR1a-I3-A43G;
第8 SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第361位,所述核酸具有如SEQ ID NO:8所示核苷酸序列;标记名称为GHR1a-E8-A361G;
第9 SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第212位,所述核酸具有如SEQ ID NO:9所示核苷酸序列;标记名称为ODCa-E6-A212G;
第10 SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第19位,所述核酸具有如SEQ ID NO:10所示核苷酸序列;标记名称为ODCa-E9-G19A;
第11 SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第126位,所述核酸具有如SEQ ID NO:11所示核苷酸序列;标记名称为ODCb-I3-A126G;
第12 SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第99位,所述核酸具有如SEQ ID NO:12所示核苷酸序列;标记名称为FABP2a-I1-A99G;
第13 SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第487位,所述核酸具有如SEQ ID NO:13所示核苷酸序列;标记名称为FABP2a-I2-C487T。
上述13个分子标记的引物对由正向引物F和反向引物R组成,其中正向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14~30所示,反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:31~47所示。
通过上述引物对分别扩增出具有SEQ ID NO:1-13所示核苷酸序列,待测建鲤样本含有13个SNP分子标记中7个及以上SNP分子标记即为建鲤2号。
实施例2
本实施例提供了上述所述的分子标记组合中分子标记的分型及用其鉴定建鲤2号的方法,包括如下步骤:
1.筛选、设计引物:
首先通过文件检索,筛选生长相关的SNPs标记,使用primer3设计引物,PCR扩增所用引物如表1所示。
2.提取DNA:
取待鉴定建鲤尾部鳍条少量,加入到450ul 1×STE(150mM NaCl,50mM Tris,1mMEDTA)的1.5ml离心管中,同时加入10ul蛋白酶K(20mg/ml)和12.5ul SDS(20%),轻轻混匀,置于55℃水浴锅内消化过夜,然后采取酚-仿常规方法提取DNA,加200ul去离子水溶解后,4℃保存备用。
3.PCR扩增:
运用PCR仪同时扩增步骤2提取的DNA。
PCR扩增的反应体系为:PCR反应总体积为15μL,其中DNA模板(约30ng/μL)2μL,2×Taq PCR Mix 5μL,正向和反向引物(10μmol/L)各0.5μL,去离子水7μL。
PCR反应程序:95℃预变性3min;94℃变性40s,56~60℃退火40s,72℃延伸1min,循环30次;72℃延伸5min;4℃保存。
4.酶切、电泳检测:
对步骤3的PCR扩增产物进行酶切,并用电泳分离检测;选取的酶及所得SNP分型如表1所示,反应体系参考NEB公司的产品说明书。
5.SNP分型及鉴定:
建鲤2号鉴定方法:对表1所示的13对引物PCR扩增产物进行酶切、每对引物对应的SNP标记进行分型,统计符合的建鲤2号特征的标记数量,通过对900尾建鲤样本进行统计可知,当有7个及以上标记均为建鲤2号,因此认为具有上述13个SNP标记中7个及以上标记的即为建鲤2号。所述建鲤2号13个标记名称、引物及其内切酶如表1所示。
表1
表1展示了建鲤2号13个标记的基因型,内切酶等信息。
图1为本发明标记IGFBP3-b-I2G30T(d),IGF1a-I4-A511C(e),GHR1a-I3-A43G(f),ODCb-I3-A126G(g)PCR-RFLP的电泳图谱。
本发明基于建鲤和建鲤2号在表型上的相近,通过基因型来判断区分建鲤2号。本发明通过对引物筛选,PCR扩增、酶切等操作得到13个SNP分子标记,通过选育可知含有13个SNP标记中7个及以上标记的即为建鲤2号。所述鉴定方法简单,可成功区分建鲤和建鲤2号,有利于建鲤品种的优化和选育。
以上结果描述了本发明的原理和主要特征和本发明的优点。本发明不受上述实施例的限制,上述描述仅为说明本发明的原理和优点。在不脱离本发明原理的基础上,本发明还会有各种改进和变化,这些改进和变化应包括在本发明专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种用于建鲤2号鉴定的分子标记、鉴定方法及应用
<130> 1
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 692
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 1
ggtattatgc gcacagagca cacattagtc ccactttcag tagtcctgtg ctttgaggtt 60
gctaaaggca tgcagaattt catgcctgac acattgtgaa ttgggtgaaa gatgtttaac 120
acaatagggt tttgttggtg ggatacaagg gtttcttaga aggcccaatg ggagcttgac 180
ctatcccgtg acattcctcg ggtcaatcat taattgtaga catagaaaca ccactcatcg 240
ctgctcccgg gtagcaagag aaaaaattag acagttttcc aagtaagaac tgtttgtctt 300
attaccttta ccctgttgtt tctgtttgtc catcagtcca tggtaacttt agatggagga 360
aaaatggttc atgttcagaa atgggacggt aaagagacga ccctggtccg agaagtcaat 420
gacaacagcc taactctggt tagtattgtg tgcacttaga gtaagtgcct ctttggctgg 480
gaacagaatt ataagaacag tcagcaaaag caaaacatgt tctgctgccc atttagtaat 540
tacttaaaag gaccaatatt caatatttat gggtgtttga ctgaatgaat atatatcaac 600
aggccaacct ctctctttta tcaacagaca ttgacacttg gcgacgttgt ctccacacga 660
cactatataa aggcggaata aagggaaacc tc 692
<210> 2
<211> 909
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 2
tggtttgggt ctccagcatc tttttcttct tgccggtgtt ctgcttaact gttctgtata 60
gtctcatcgg gcgaaagctc tggaaaagaa agagggagac gattggggaa aacgcttcga 120
gtcgtgaaaa aaacaataga cagacagtga aaatgctggg taagtgcccg gtttcaccac 180
agtatcaggt aaccgcgatt aagttgttta tcatttgcgc actttacgca caagcgcacc 240
tattacgcac gggatgtgct tggcacaaaa caacagtaca gtcctgcata cactaaaatt 300
gtgttggtag ggaagctaaa aagataagag aaggagaaca gaatgctgat atatccagtt 360
tttgtgaagt atttctttat tgtacaaaat tgagcaggtg cgaataatta taattatact 420
ttaagaacaa agataagtga ttaaaaagag gagacacttg tcattttgtg ttctataaag 480
aaagatgtta tgcttttttt attattaatg aaaatgttca ttttaataag ggagaaacag 540
ttgacacaaa acttttataa aatacgtcca ataaaatcta caaaaataca tatttttatt 600
acttaaacat tatttaaaat aaaattcact ttaaatttac aaaatcgtat gttaagaaaa 660
acgcgggaag tcacgggaaa attgtgagct ttctgttaag tcatagttta cacgcgtgtt 720
ttgatgtttc ttaatgtggc atttgtgcat gactaataat gttttttctt gctgcaacaa 780
ggtgaggaaa ctgctacttc accactcagt tactttcact ccctctctct aacagctgtg 840
gtggtgtttg ccttcgtgct ctgctggctt ccctttcatg ttggacgtta cctgatctcc 900
aaatccaca 909
<210> 3
<211> 722
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 3
caattcgcat cctgctatat attcgcaggc tgtataagtt aaattataaa tgtcgggcag 60
ccccgcgcgc agcacgatgg ggagtcggtg gggagactgt cctccccgag ctctctctca 120
caggagaatc tagacgctcc atgatctctc agcatgccta cctggacgaa ccggtccaac 180
tgttccttca actgcagttg ggatgggaac gcgacatact ggggattcga gcacccggtc 240
aacattttcc ccattccagt gctaaccggg gtcaccgtca cctgcgtgct cttcttcttt 300
gtaggtgtaa cggggaatct catgaccatt ttggtggtga caaaatacaa ggacatgcga 360
accaccacta acttgtacct gtccagcatg gccttttcgg atttactcat ttttctctgc 420
atgcctttgg acttgtacag aatctggagg taccgacctt ggaatttcgg caacatactt 480
tgtaaactct ttcagtttgt gagcgagtgt tgcacgtact cgaccatcct gaacatcact 540
gctctcagtg tggagagata ctttgctatt tgttttcctc ctagggcaaa ggtagtcgtg 600
accaggggtc gcgtgcgggg ggtcattttg gtcctctgga tagtatcctt ctttagtgcc 660
ggacctgtat ttgtgctcgt cggggttgag catgaaaatg ggacaaactc gtgggatact 720
aa 722
<210> 4
<211> 565
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 4
tcagaccttc caaagctgcc attattcgca tcctgcggta caggttgtat aagttcaatt 60
gtaaatgctg ggcagccctg agcgcagcac gatggggagt cggtggggag actgtcctcc 120
ccgagctctc tctcacagga gaatctagac gctccatgat ctctcagcat gcctacctgg 180
acgaaccagt ccaactgttc cttcaactgc agttgggatg agaacgcgac atactgggga 240
tttgagcacc cggtcaacat tttccccgtt ccagtgctaa ccggggtcac cgtcacctgc 300
gcgctcttct tctttgtagg tgtaacgggg aatctcatga ccattttggt ggtgaccaaa 360
tacaaggaca tgcgaaccac caccaacttg tacctgtcca gcatggcctt ttcggattta 420
ctcatttttc tctgcatgcc tctggacttg tacagaatct ggagataccg accttggaat 480
ttcggcaacg tactttgtaa actctttcag tttgtgagcg agtgttgcac gtactcgacc 540
attctgaaca tcactgctct cagtg 565
<210> 5
<211> 276
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 5
ggcaatagag accatagatc ctatgcggca catcaaagaa gagataatca aaaaagaaca 60
aaccaggaaa gggcagacct ttaaagggga accagtttcc agtggggttc atacagatat 120
tcacaacttc agtctggagt caaagagaga aactgaatat gtaagcactc actgttcttc 180
caacaacatg catttttaag acaaagcatg tattggagtg gagtacattc tattcccaat 240
ctccttgttt gtgtctccag tctcctgaca tgtttg 276
<210> 6
<211> 798
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 6
agtgactgca atatcagctg actgatttgg ttgacaaaat gtcatatgaa ctttatctcc 60
tgcagaaacc tatatctgga catagccact cttcctgtaa ggtaagtctt ccctcagtct 120
gaaaataatc cataattaac atgatgatgc ttgaatgctt atatgtgcat tttctgacat 180
ggaacttgta ttaaaggaat agttcaccaa cataacaatt cagtcattta ctcatcctta 240
tgtcatttaa aacctatatg actgattttc tggtaaattt ttgagctcaa aaaggacaaa 300
aaatgtacca taaaagtggc ttccacaact catactctat gttaaatggc ttctaaagca 360
aaatttaagc cattatttat ccatccttat atctgtcata tcttcaaata aatccattga 420
tacaattcac aacaccagaa tgattcattc acaaaacaga ctgatccaat tctcaagttt 480
aactcattga ctcaatcatc cagttggaat gggaaacagc tcactaatgg gaaaaaaatc 540
agcgaataat ggcttacatt ttgttctgtt tataacacaa agagttggaa tatagcacac 600
aagttatatg gacaactttt aagatacttt cacatcctct ttgaagcctg aaagctccag 660
tctggtgcaa ttgcatggta aaaactggct gccacaaaat ttctcctttt gtgttccact 720
caagaaagta agtcatatgg gcttgaaacg gatgagtaaa agatgacaga attgtcagca 780
aataatgctg gtacattg 798
<210> 7
<211> 645
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 7
acagcagtat tccttttaca tagtagcagt taaaatattt cttgtaaatc tcaacttata 60
atattaatgt aatcaaatta aatatactgt actgaggtgt ctaatatttg tatacatcta 120
ataatattgt tttctttatt gactggcata tagtttcctc tctgagtggc aggagtgtcc 180
agactacaca cgtactgtga aaaacgagtg ctacttcaac aaaaccttca cacagatctg 240
gacctcgtac tgcattcagc tgcgctcagt gcgtgagaac ataacctatg acgaggcctg 300
ctttacagtg gagaacatag gtgagttaat agctgtgaat ctgctgaatg aaggtttaca 360
cagttacaga atgatctgtg ttggaggtct gacttcaaat gttttgtgac tttccagtgc 420
atcctgaccc accaattggg ctgaactgga ctctattaaa tgtgagtcgc tcggggttgc 480
actttgacgt ccttgtgcgc tgggctcccc ctccgtcagc agatgtgcag atgggctgga 540
tgagcctggt gtaccaggtt cagtaccggg tcagaaacaa ctcccactgg gaaatggtat 600
gtcctaaaaa tgtttctagg cagctattaa agtaacagta ttgtg 645
<210> 8
<211> 748
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 8
tcacgtcctt aatttcaaaa gcgatgacga ttcgggtcgt gctagctgct acgacccaga 60
aatctcaaat cctgaggact tggcttccct tctgcctggc cattctggac ggggagataa 120
ccaccctctg gtttccagaa gcagctcatc catccctgac cttggcgtcc aacagacatc 180
agaaattgag gagacgccca ttcaaacaca acccgctgtg cccagctggg ttaacatgga 240
cttttatgcc caagtaagtg atttcacacc agcaggagga gtggtgcttt cacctggaca 300
actgaacagc tctccggtga aaaagaaggg agaagggaat gagaagaaga tacaatacca 360
gttgctttcc gatggagcct acacctcaga gaacacagcc aggctgcttt ctgccgatgt 420
gccacccagc cctggtcctg agcaggggta ccaagcattc ccaacccaag ccgttgaggg 480
gaacctctgg aatggtgagt acctggtgtc cgccaatgat tcccagacgc cgtgcctggt 540
tcctgaagct cctccagccc ccatactgcc accagtatca gactatactg tagtgcagga 600
agtggatgcc cagcacagcc tcctcctgaa tccttcttcc tcacagcctg cgatatgccc 660
tcacagccca aacaaacatc tccctgtaat cccaaccatg cccatggggt acctcacccc 720
agaccttctg ggaaacctga ccccatga 748
<210> 9
<211> 356
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 9
gcgccacgtt aaagagctgc cggctgttgc tggagcgggc gaaggagctc gggctggacg 60
tgattggagt cagtttccat gtgggcagcg gctgcactga tcctgagacg tacagccagg 120
caatcacaga cgcacgctat gtttttgacg tgggggtgag tggccttata ctataaaaat 180
taaaaatgca ttcattttta gaatatactt atcttgaaaa tgttgttgtc caccaggcgg 240
agctgggata taacatgacc ctgcttgata ttggcggagg ctttccaggc tccgatgaca 300
ccaaactgaa atttgaagag gtatttattt ttaatcgcca acttcaagtg accaaa 356
<210> 10
<211> 616
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 10
ggtcatcatg aaggagcaat cgtcctcaga cggtaaaagc aaacattcaa aaccatgttt 60
gtttctaatg ctcttcaaat gtgtattctc agactttaaa tcagaggact atataatatt 120
atcaacttaa cggcactgtt actgtcctgt ttacacactg ctttgaagcc atctgtagcg 180
tgtaaagcgt tatctaaaaa tgatttgatt taactgactt aatttcttgt taattttaac 240
agaagaagag gatggggcca gtgaccgaac cctgatgtac tacgtgaacg atggtgttta 300
tggttccttc aactgcattc tgtacgatca cgcgcatgtc ctgccaactc tgcacaaggt 360
acggagatga gtccatcaga tccctgtttg tgttcgatgg agtttcttcc ctgagaccaa 420
cctgtaaccc atgatctctt acagaaaccc aagcctgacg agcgcatgta cccatgcagt 480
atttggggcc cgacctgtga tgggctggac cgcattgtgg agcagtgcag cctgcctgac 540
atgcagatgg gcgaatggct gctgtttgag aacatgggtg cctacactgt agctgcttct 600
tccactttta atggct 616
<210> 11
<211> 491
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 11
tcagactttg acttcgcctt cctggaggag ggattctgtg cacgtgacat cgtggagcag 60
aagatcaacg agtcctcact atcagtaagt gagcgcggat tatacctaca tgtctgctta 120
attgttgctt ttttctttat tcgtgtaaat ttagattttg ctattagaat atcataattt 180
tctctaaatg gctctgcact gttctgatcg catcttttct tcttttagga tgacaaagat 240
gccttctatg tggctgacct gggtgacgtc ctgaagaagc acctccgttg gttgcgtgtg 300
ttaccccgtg tcacaccgtt ctacgcagtg aagtgcaatg acagcagtgc cgtcatcatg 360
acactggcgt ctctgggagc cggattcgac tgtgcgagca aggtatgtga aagatcttgt 420
gagttcctta aatcacgaat gtgacttctc catgtgtctc aatgagtgca tgacatcagc 480
accaaactgt g 491
<210> 12
<211> 460
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 12
gcacaggtat aaaagtcaga cgcggggtaa agtcaggcca ccatcaggat cacagcagtc 60
tgtcatcatg accttcaacg ggacctggaa agtcgaccgc aatgagaact acgagaagtt 120
catggagcaa atgggtgagt ggacatgagc gctgctggtt tccagatcag ccgccgcagg 180
aatcttctct ttctgaccct gttgagggat tcagagggtc attgtttata agatgcacat 240
gcatgtcttc aacaggcatc aacatggtta agaggaaact agcgtctcat gacaacctga 300
agatcactct ggaacagacc ggagacaagt tccacgtgaa ggaaaacagc actttccgct 360
cggtggaaat tgactttact ctcggcgtca actttgaata ttctcaggcc gacggcactg 420
agctcacggt aaacacaatc cgttcagatt tcagaggcgt 460
<210> 13
<211> 469
<212> DNA
<213> 建鲤2号
<400> 13
ccacttcaaa agggacaaat atgtaccatt tagatttaga ctttaggtgt taaaatgtac 60
ctttaagggt aaataaggaa caaatatgtg ccttttgaga agattctgcc ctagtgattg 120
cttttggacc tttttttctg agagtgtact gatcagatca actggaccta ttgctgctca 180
gttcaaaatg agtctgacct ttgaccttct gattgcaggg atcctgggtc atggaggaag 240
acatgcttaa ggggacgttc acacgcaagg acaacggaaa gtcgctaata acaaccagga 300
agatcatcgg tggagagctt gtacaggtga gctgctgttc aatcctcaga tctaactttg 360
tagtaaatgc tgtgaacttg tgttgcctta tgcatttttt atttttattt tttcattttg 420
cttccagagc tatacctatg aaggagtcga ggccaagagg attttcaag 469
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggtattatgc gcacagagca ca 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggtttgggt ctccagcatc ttt 23
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caattcgcat cctgctatat attcg 25
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggcaatagag accatagatc ctatgcgg 28
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agtgactgca atatcagctg actga 25
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acagcagtat tccttttaca tagtagcag 29
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcagactttg acttcgcctt cc 22
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcacgtcctt aatttcaaaa gcgatg 26
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gcgccacgtt aaagagctgc 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggtcatcatg aaggagcaat cgt 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcagactttg acttcgcctt cc 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcacaggtat aaaagtcaga cgcg 24
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ccacttcaaa agggacaaat atgtacc 27
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaggtttccc tttattccgc c 21
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tgtggatttg gagatcaggt aacg 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ttagtatccc acgagtttgt ccca 24
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
caaacatgtc aggagactgg agacac 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
caatgtacca gcattatttg ctgaca 26
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cacaatactg ttactttaat agctgcctag 30
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ggcttgctcc gaacttgctt g 21
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cttcatgggg tcaggtttcc cag 23
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctttggtcac ttgaagttgg cg 22
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
agccattaaa agtggaagaa gcag 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ggcttgctcc gaacttgctt g 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acgcctctga aatctgaacg ga 22
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
cttgaaaatc ctcttggcct cgact 25
Claims (10)
1.一种建鲤2号鉴定的分子标记组合,其特征在于,所述分子标记组合包括13个SNP分子标记,依次为第1-13SNP分子标记,待测建鲤含有13个SNP分子标记中7个以上SNP分子标记即为建鲤2号。
2.根据权利要求1所述的分子标记组合,其特征在于,
第1SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第30位,所述第1SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
第2SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第386位,所述核酸具有如SEQ IDNO:2所示核苷酸序列;
第3SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第450位,所述核酸具有如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列;
第4SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第159位,所述核酸具有如SEQ IDNO:4所示核苷酸序列;
第5SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第30位,所述核酸具有如SEQ IDNO:5所示核苷酸序列;
第6SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第511位,所述核酸具有如SEQ IDNO:6所示核苷酸序列;
第7SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第43位,所述核酸具有如SEQ IDNO:7所示核苷酸序列;
第8SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第361位,所述核酸具有如SEQ IDNO:8所示核苷酸序列;
第9SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第212位,所述核酸具有如SEQ IDNO:9所示核苷酸序列;
第10SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第19位,所述核酸具有如SEQ IDNO:10所示核苷酸序列;
第11SNP分子标记为碱基AA,所述SNP标记位于核酸的第126位,所述核酸具有如SEQ IDNO:11所示核苷酸序列;
第12SNP分子标记为碱基GG,所述SNP标记位于核酸的第99位,所述核酸具有如SEQ IDNO:12所示核苷酸序列;
第13SNP分子标记为碱基CC,所述SNP标记位于核酸的第487位,所述核酸具有如SEQ IDNO:13所示核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的分子标记组合,其特征在于,所述13个SNP分子标记的引物序列依次为:第1-13SNP分子标记的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14~26所示;第1-13SNP分子标记的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27~39所示。
4.一种利用权利要求1-3任一项所述的分子标记组合进行建鲤2号鉴定的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)筛选、设计引物;
(2)提取待测建鲤样本的基因组DNA;
(3)PCR扩增:运用PCR仪扩增提取的待测建鲤样本的基因组DNA;
(4)酶切、电泳检测:对PCR扩增产物进行酶切,并用电泳分离检测;
(5)根据电泳条带,分析基因型,获得每个待测建鲤样本的多个SNP分子标记位点的基因型,待测建鲤样本含有7个以上权利要求1所述13个SNP分子标记即为建鲤2号。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,取待测建鲤样本尾部鳍条少量,加入到450ul 1×STE的1.5ml离心管中,同时加入10ul20mg/ml蛋白酶K和12.5ul 20%十二烷基硫酸钠,混匀,置于55℃水浴消化过夜,然后采取酚氯仿法提取DNA,加200ul去离子水溶解后,4℃保存备用。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述PCR扩增的反应体系为:PCR反应总体积为15μL,其中30ng/μL DNA模板2μL,2×Taq PCR Mix 5μL,10μmol/L正向和反向引物各0.5μL,去离子水7μL。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述PCR扩增的反应程序:95℃预变性3min;94℃变性40s,56~60℃退火40s,72℃延伸1min,循环30次;72℃延伸5min;4℃保存。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(5)中,所述多个SNP分子标记位点包含于权利要求1所述13个SNP分子标记中。
9.一种权利要求1-3任一项所述分子标记组合的应用,其特征在于,所述分子标记组合用于鉴定建鲤2号。
10.一种权利要求4-8任一项所述方法在鉴定建鲤2号中的应用。
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