CN113718043B - 一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记、引物及其方法和应用 - Google Patents

一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记、引物及其方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记，该分子标记为两条在多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。本发明首次从多纹钱蝶鱼基因组信息中筛选到两条在多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体上部分同源DNA片段，并建立多纹钱蝶鱼遗传性别鉴定方法，可以快速、准确的区分多纹钱蝶鱼遗传性别。本发明提供的检测和鉴定方法可用于多纹钱蝶鱼性别鉴定和筛选，适用于实验室或水产养殖企业准确鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别。对研究多纹钱蝶鱼性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

Description

一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记、引物及其 方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记、引物及其方法和应用。
背景技术
多纹钱蝶鱼(Selenotoca multifasciata)又称银鼓鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)，金钱鱼科(Scatophagidae)，钱蝶鱼属，原产于东南亚的泰国、菲律宾、印度尼西亚等国家沿海地区，在我国东海和南海也有分布。已突破人工繁殖已技术，是杂食性鱼类，养殖性能优良，是一种兼具观赏和食用价值的重要经济鱼类，能带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。
由于许多养殖鱼类都具有性别二态性，在雌体和雄体的形态结构上存在明显的性别差异，性别控制是水产养殖重要的育种技术，单性养殖可提高养殖产量和经济效益。如日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、南方大口鲇(Silurus meridionalis)和鳜鱼(Siniperca chuatsi)(Michio et al.,2010；Chen etal.,2007；Zeng et al.,2020；Han et al.,2020)等都是雌鱼比雄鱼生长快，全雌化养殖可提高养殖效益；相反，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、斑鳢(Channa argus)和兰州鲇鱼(Silurus lanzhouensis)(Wang et al.,2009；Sun et al.,2014；Ou et al.,2017；Wang et al.,2021)等，均是雄鱼比雌鱼生长快，全雄化养殖有助于提高其养殖产量。单性养殖技术目前已在部分养殖鱼类中通过遗传性别控制的手段实现了单性苗种的培育，并显著提高了经济效益，能促进水产养殖的发展。而多纹钱蝶鱼的一龄鱼苗雌鱼比雄鱼生长快，如果采用全雌化养殖可以提高多纹钱蝶鱼的养殖效率，目前国内外关于多纹钱蝶鱼的研究主要集中于胚胎发育、线粒体基因组以及病原菌的研究上，对其遗传性别的研究鲜有报道。多纹钱蝶鱼的染色体2n＝48，无明显分化的性染色体，目前还不清楚其性别决定的类型，开展多纹钱蝶鱼遗传性别鉴定和性别控制技术对多纹钱蝶鱼的单性养殖技术提供基础具有良好的应用前景。
性别控制育种是鱼类育种的重要课题，性别控制育种的关键在于开发性别特异或连锁的分子标记，用于遗传性别的快速鉴定。如专利文件CN 101429557B公开了一种圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别检测方法，通过对性别特异AFLP标记引物筛选和遗传性别鉴定方法的建立，在圆斑星鲽性别控制和全雌苗种生产中产生重要应用价值。而目前在多纹钱蝶鱼中尚未发现相关遗传性别的特异分子标记，所以对多纹钱蝶鱼的特异性分子标记的开发与筛选，在性别控制育种中起重要作用，在多纹钱蝶鱼的遗传性别鉴定以及单性养殖技术有良好的应用价值。
发明内容
本发明的目的在通过对多纹钱蝶鱼的特异性分子标记的开发与筛选，提供一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记、引物及其方法和应用。
本发明的第一个目的在于提供一种多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记。
本发明的第二个目的是提供所述多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记在制备鉴定多纹钱蝶鱼性别引物或在制备鉴定多纹钱蝶鱼性别的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一对能扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异分子标记的引物。
本发明的第四个目的在于提供多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记或扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异分子标记的引物在鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别或在制备鉴定多纹钱蝶鱼性别的试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种多纹钱蝶鱼遗传性别的鉴定方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明通过分子生物学和生物信息学方法分析多纹钱蝶鱼性别决定与分化相关基因的序列信息，找到了一条特异在雄鱼存在的序列和它的同源序列，推测他们分别来自多纹钱蝶鱼的Y染色体和X染色体，即确立多纹钱蝶鱼具有雄性异型的XY性别决定系统。X染色体上DNA片段为373bp，序列如SEQ ID NO：1所示，命名为SEQ chrX；Y染色体上DNA片段为294bp，序列如SEQ ID NO：2所示，命名为SEQ chrY。
因此，本发明首先提供一种多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记，所述分子标记为两条在多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，其核苷酸序列依次如SEQID NO：1～2所示。
本发明还提供多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记在设计、制备鉴定多纹钱蝶鱼性别引物或在制备鉴定多纹钱蝶鱼性别的试剂盒中的应用。
通过基于所述多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记设计的引物可用于鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别。因此，本发明还提供检测所述特异性分子标记的引物在鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别或在制备鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的试剂盒中的应用。
具体地，本发明基于上述多纹钱蝶鱼特异性分子标记的两条DNA片段序列设计了一对性别鉴定的引物，以扩增多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体同源差异DNA片段，再通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰分辩XX个体和XY个体特异DNA片段，准确鉴定多纹钱蝶鱼的遗传性别。
因此，本发明还提供一对能扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异分子标记的引物，其引物核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～4所示。
本发明还提供一种多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记或扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异分子标记的引物在鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别或在制备鉴定多纹钱蝶鱼性别的试剂盒中的应用。
本发明可以判定多纹钱蝶鱼的性别决定系统为雄性异配的XX/XY型，其中雌性为XX染色体类型，雄性为XY染色体类型；本发明提供的扩增引物在XX雌性个体能扩增出单一的电泳条带，在XY雄性个体能扩增出两条电泳条带，它们分子量大小相差79bp，通过琼脂糖凝胶电泳可以准确判断多纹钱蝶鱼的遗传性别。
因此，本发明提供一种多纹钱蝶鱼遗传性别的鉴定方法，包括如下步骤：
S1.提取多纹钱蝶鱼样本基因组DNA；
S2.以步骤S1提取基因组DNA为模板，设计引物PCR扩增权利要求1所述特异分子标记或其部分片段；
S3.将步骤S2的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
S4.分析S3步骤电泳结果，根据电泳结果判断多纹钱蝶鱼遗传性别，判断标准为：
如果PCR扩增产物只有一条清晰的条带，则待测样本为XX雌鱼；
如果PCR扩增产物有两条清晰的条带，则待测样本为XY雄鱼。
优选地，所述S2步骤中采用能扩增多纹钱蝶鱼遗传性别的特异分子标记的引物，其引物核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～4所示。
更优选地，所述S2步骤中PCR扩增的体系为：2×PCR mix 12.5μL，终浓度为10μmol/L的引物各0.5μL，基因组DNA1μL，ddH2O 10.5μL，共25μL。
更优选地，所述S2步骤中PCR扩增的程序为：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃20s，37个循环；72℃10min延伸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从多纹钱蝶鱼基因组信息中筛选到两条在X染色体和Y染色体上部分同源DNA片段，并设计特异性引物进行多纹钱蝶鱼遗传性别鉴定。本发明建立的鉴别方法能对多纹鲽鱼雌性和雄性个体通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳法，可以快速、准确的区分多纹钱蝶鱼遗传性别。适用于实验室或水产养殖企业准确鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别。对多纹钱蝶鱼的遗传性别鉴定在性别控制育种中起重要作用，在多纹钱蝶鱼的遗传性别鉴定以及单性养殖技术有良好的应用价值。
附图说明
图1为3尾雌性和3尾雄性多纹钱蝶鱼的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图(1～3为雌鱼；4～6为雄鱼)。
图2为多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体同源DNA片段序列比对图(引物位置用箭头标出；方框：本专利鉴定遗传性别的Y染色体相对于X染色体缺失的DNA片段序列；黑色背景X染色体和Y染色体DNA片段一致序列，白色表示序列差异)。
图3为在30尾雌性和30尾雄性多纹钱蝶鱼PCR产物琼脂糖凝胶电泳图(X和Y：质粒阳性对照；-：水，阴性对照)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1多纹钱蝶鱼性别特异标记的获得
1、性别特异分子标记的开发
本发明人课题组利用一尾雄性多纹钱蝶鱼Illumina基因组测序数据，通过同科的金钱鱼(Scatophagus argus)性别决定候选基因dmrt1在多纹钱蝶鱼上进行比对，分离出多纹钱蝶鱼dmrt1基因序列。通过比对分析，分离出的多纹钱蝶鱼dmrt1部分基因组序列，发现除正常dmrt1之外，dmrt1还存在另外一种拷贝，并获得了其部分序列。根据多纹钱蝶鱼dmrt1和其同源基因的序列比对分析，通过设计引物验证是否与性别连锁。
针对dmrt1和其同源基因序列设计一对引物，如下SEQ ID NO：3～4所示：
正向引物SEQ ID NO.3：5′-AGAGCTTGTTTCTCTGATAACTTAAG-3′；
反应引物SEQ ID NO.4：5′-GTCACCATCGATGATGGAGCT-3′。
并利用这对引物分别对3尾雌性多纹钱蝶鱼和3尾雄性多纹钱蝶鱼基因组DNA进行PCR扩增。多纹钱蝶鱼基因组DNA的提取，采用基因组DNA提取试剂盒(海洋动物组织基因组提取试剂盒，广州东盛生物科技有限公司，货号N1173)，方法步骤按照说明书所示。
PCR扩增结果如图1所示，在XX雌性和XY雄性个体中均能扩增出一条大小为350bp左右的条带，此外，在XY雄性个体中还扩增出一条大小为300bp左右的条带。
2、性别特异分子标记的克隆与序列分析
利用上述对3尾雌性多纹钱蝶鱼和3尾雄性多纹钱蝶鱼基因组DNA，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，把XX雌性个体中扩增出的单一条带和XY雄性个体中扩增出的两条带分别进行切胶回收(回收试剂盒来自广州东盛生物科技有限公司，货号N1073)并将它们分别连接到pEasy-T3载体上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞，用LB液体培养基培养1小时后，吸取75μL菌液涂布在LB固体培养基，过夜培养，挑取单菌落，用PCR法鉴定阳性克隆，再进行测序。
把来自不同多纹钱蝶鱼的5～10个阳性克隆的测序结果用DNAMAN 4.0软件进行多重比对分析，结果发现：来自XX雌性个体的单一扩增条带大小为373bp，该序列在不同XX雌性个体之间的同源性高达99.5％～100％，可能是来自X染色体条带，因此将该序列命名为SEQ chrX；来自XY雄性个体的扩增条带为两条，其中与XX雌性个体扩增条带等长的片段长度也为373bp，在不同XY雄性个体之间的同源性高达99.5％～100.0％，所以该片段即是SEQchrX；而来自雄性个体的另一条带片段长度为294bp，在不同XY雄性个体之间序列同源性高达99.7％～100.0％，可能是来自Y染色体条带，故将该XY雄性特异的片段命名为SEQ chrY。在XY雄性个体中的SEQ chrX序列和SEQ chrY序列的同源性为93.5％；在XY雄性个体的SEQchrX和SEQ chrY与XX雌性个体的SEQ chrX序列的同源性平均分别为99.8％和93.5％。
以上结果表明SEQ chrX在雌雄个体都存在，SEQ chrY仅存在雄性个体，即SEQchrX和SEQ chrY分别来自X和Y染色体的同源序列。对测序获得的X染色体特异序列SEQchrX和Y染色体特异序列SEQ chrY进行序列比对分析。结果如图2所示，SEQ chrX和SEQchrY序列差异主要在1处：与X染色体特异分子标记相比，Y染色体特异分子标记有一段79bp的序列缺失。通过测序核对多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。
实施例2多纹钱蝶鱼遗传性别鉴定引物序列的应用
1、快速鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别
(1)多纹钱蝶鱼的采集和表型性别鉴定
采集来自湛江市水产品批发市场购买的84尾多纹钱蝶鱼(32尾表型雌鱼和52尾表型雄鱼)，多纹钱蝶鱼的表型性别通过性腺组织切片观确定，雌鱼卵巢具有II、III或IV时相的卵母细胞，雄鱼精巢具有各级生精细胞。
(2)多纹钱蝶鱼基因组DNA提取
剪取待测的多纹钱蝶鱼的尾鳍，采用基因组DNA提取试剂盒(海洋动物组织基因组提取试剂盒，广州东盛生物科技有限公司，货号N1173)，按步骤提取多纹钱蝶鱼基因组DNA。
(3)待测样本DNA的测序检测
采用实施例1的多纹钱蝶鱼同源引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对所提取的基因组DNA进行PCR扩增。
PCR反应体系：2×PCR mix Buffer 12.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 10.5μL，混匀后离心。
PCR扩增程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，37个循环；72℃10min，4℃保存。
PCR产物用1.5％琼脂糖电泳，150V，20分钟，采用凝胶呈像系统拍照观察。
结果显示为32尾XX雌鱼和52尾XY雄鱼，与表型鉴定结果进行匹配分析，发现基因型性别和表型性别鉴定结果完全吻合，遗传性别与表型性别的吻合率为100％，图3为其中30尾雌鱼和30尾雄鱼的电泳图，根据电泳结果在显示单一条带，则为雌鱼；如果显示清晰的两条带，则为雄鱼。
由上述结果可知，本申请开发的性别特异分子标记适用于多纹钱蝶鱼遗传性别鉴定，标记快速、可靠能准确区分多纹鲽鱼雌性和雄性个体。
实施例3一种快速鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的试剂盒
一种用于鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含有用于鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的引物，所述引物序列如下所示：
上游引物F：5′-AGAGCTTGTTTCTCTGATAACTTAAG-3′(SEQ ID NO：3)
下游引物R：5′-GTCACCATCGATGATGGAGCT-3′(SEQ ID NO：4)
同时，所述试剂盒中还包含有PCR扩增反应所需的试剂：2×PCR mix Buffer和ddH2O。
所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
S1.提取多纹钱鲽鱼样本基因组DNA；
S2.以上述引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增；
S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果，如果在S2样品显示单一条带，则为雌鱼；如果显示清晰的两条带，则为雄鱼。
综上所述，采用多纹钱蝶鱼基因组信息中筛选到两条在X染色体和Y染色体上部分同源DNA片段及扩增引物，和多纹钱蝶鱼遗传性别的鉴定方法，可以快速、准确的区分多纹钱蝶鱼遗传性别，方法简单易操作适用于实验室或水产养殖企业准确鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别；用于对多纹钱蝶鱼性别鉴定和筛选，对研究多纹钱蝶鱼性别控制育种具有重要意义。
序列表
<120> 一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记、引物及其方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagcttgtt tctctgataa cttaagatat gactaagatc tttcatccag ttcaaagact 60
aagttaaaga caagcaagat ccaagaatct gatagaaagc aggtgtttta atgttttaat 120
gttagaccat catgccaacc ttggatgctt agggaaaacc ctgctgtttc attgtttact 180
ttgaaaagtt aaaagtaaat tcggactcta tgtgtgtctc atttctgcag ctttctcccc 240
cagtaccatc tccattgttc acaactccac ctgcaggtcc atcaactccc ttcttaactc 300
tgaggtccat gttgaatgtg aggccagcag tgagacgcca aacttcactg tcagctccat 360
catcgatggt gac 373
<210> 2
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagcttgtt tctctgataa cttaagatat aacttaggtc tttcatccaa ttcaaagaca 60
aggttaaaga caagcaagat ccaagagtct tatacaaagt aggtgtttta atgttttaat 120
gtttgactct gtttgtatct catttctgca gctttctccc ccagtaccat gtccgttgtt 180
cacgactcca cctgcaggtc catcaattcc cttcttaact ctgaggtcca tgttaaatgt 240
gaggccagca gtgagacacc aaacttcact gtcagctcca tcatcgatgg tgac 294
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagcttgtt tctctgataa cttaag 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcaccatcg atgatggagc t 21

Claims (7)

1.检测多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记的引物在鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别或在制备鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的试剂盒中的应用，其特征在于，所述特异性分子标记为两条在多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：1～2所示；所述引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～4所示。
2.一对能扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异性分子标记的引物，其特征在于，正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～4所示。
3.权利要求2所述能扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异性分子标记的引物在鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别或在制备鉴定多纹钱蝶鱼性别的试剂盒中的应用。
4.一种多纹钱蝶鱼遗传性别的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 提取多纹钱蝶鱼样本基因组DNA；
S2. 以步骤S1提取基因组DNA为模板，设计引物PCR扩增多纹钱蝶鱼遗传性别的特异性分子标记；所述特异性分子标记为两条在多纹钱蝶鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示；
S3. 将步骤S2的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
S4. 分析S3步骤电泳结果，根据电泳结果判断多纹钱蝶鱼遗传性别，判断标准为：
如果PCR扩增产物只有一条清晰的条带，则待测样本为XX雌鱼；
如果PCR扩增产物有两条清晰的条带，则待测样本为XY雄鱼；
在S2步骤中采用权利要求2所述能扩增多纹钱蝶鱼遗传性别特异性分子标记的引物。
5.根据权利要求4所述多纹钱蝶鱼遗传性别的鉴定方法，其特征在于，在S2步骤中PCR扩增的体系为：2×PCR mix 12.5 μL，终浓度为10 μmol/L的引物各0.5μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 10.5μL。
6.根据权利要求4所述多纹钱蝶鱼遗传性别的鉴定方法，其特征在于，在S2步骤中PCR扩增的程序为：95℃ 3min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 20s，37个循环；72℃ 10min延伸。
7.一种鉴定多纹钱蝶鱼遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述引物。
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