CN110551808B

CN110551808B - 南方鲇性染色体特异分子标记与基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和单性鱼生产方法

Info

Publication number: CN110551808B
Application number: CN201910913638.7A
Authority: CN
Inventors: 王德寿; 郑树清; 王晓双; 张帅; 龙娟
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110551808A

Abstract

本发明涉及南方鲇性别特异分子标记、基于该分子标记的南方鲇遗传性别鉴定方法和单性鱼生产方法。本发明首次筛选到南方鲇X和Y染色体特异分子标记，基于该分子标记建立的南方鲇遗传性别PCR鉴定方法具有高效，准确和稳定的特点，可适用于实验室及不同流域的野生南方鲇，经济、快速、准确地区分正常雌鱼、正常雄鱼、转化雌鱼、转化雄鱼和超雄鱼，实现全雌鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益；此外，还可获得大量单性鱼苗，应用于基础研究。

Description

南方鲇性染色体特异分子标记与基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和单性鱼生产方法

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及南方鲇性别特异分子标记、基于该分子标记的南方鲇遗传性别鉴定方法和单性鱼生产方法。

背景技术

鱼类的性别决定、分化机制和性别控制技术育种在水产养殖研究和应用方面意义重大，许多鱼类具有性别二态性，半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、比目鱼(Hippoglossus hippoglossus L.)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)等雌性生长速度显著快于雄性，通过性别控制技术实现全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一(陈松林等,2013；Bye and Lincoln,1986；Shao et al.,2014)。相反，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)等鱼类雄性在生长上显著优于雌性，生产上期望实现全雄化养殖以增加产量和效益(孙运侣,2013；丹成,2014；Simco et al.,1989)。

南方鲇(Silurus meridionalis Chen)隶属于鲇形目、鲇科、鲇属，是我国特有的重要经济鱼类，广布于长江流域。具有个体大、肉质好、生长快、抗病力强、经济价值高等特点。南方鲇雌鱼比雄鱼生长快，全雌化养殖可以明显提高南方鲇的养殖效率(谢小军等，1994)。同时，超雄鱼和全雄鱼的获得则有助于基础研究。因此，开展南方鲶遗传性别鉴定和性别控制技术研究既有重要的科学意义，又有广阔的应用前景。

南方鲇染色体2n＝58，为XY型性染色体。由于鱼类性别的可塑性，一方面可以通过雄性类固醇激素、抗雌药物和芳香化酶(雌激素合成关键酶)抑制剂等处理，诱导遗传性别为XX的个体发育为伪雄鱼(遗传上仍为XX)，将XX伪雄鱼与正常XX雌鱼交配繁殖，最终获得全雌后代，实现南方鲇全雌单性苗种培育。另一方面，通过雌激素处理或者投喂水蚯蚓Limnodilus spp(Dong et al.,2014)，诱导遗传性别为XY的个体发育为伪雌鱼(遗传上仍为XY)，将XY伪雌鱼与正常XY雄鱼交配繁殖，可获得YY超雄鱼，将YY超雄鱼雌性化处理，获得的YY伪雌鱼与正常XY雄鱼交配繁殖，可获得全雄鱼。传统的鱼类性别控制育种需要通过测交，来判断亲本的基因型，耗时耗力，而基于性别连锁的分子标记，可以简单快速地实现遗传性别的鉴定，大大节省人力物力，但是在南方鲇中尚未发现相关遗传性别的特异分子标记。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于找到一种南方鲇性染色体特异分子标记，可以适用于实验室及不同流域的野生南方鲇；目的之二在于提供一种基于上述分子标记进行南方鲇遗传性别鉴定的方法，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼XX♀、正常雄鱼XY♂、转化雌鱼XY♀和YY♀、转化雄鱼XX♂和超雄鱼YY♂；目的之三在于提供一种基于上述分子标记快速高效生产全雌鱼的方法，以实现全雌鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益；目的之四在于提供一种基于上述分子标记快速高效生产全雄和超雄鱼的方法，以获得单性鱼苗应用于基础研究。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、南方鲇性染色体特异分子标记，包括南方鲇X和Y染色体特异分子标记，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2、南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：

A.PCR扩增：取待测南方鲇的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.1所示的上游引物(5’-ACCAGACCTGGTCTTGGTCAGAAG-3’)和SEQ ID NO.2所示的下游引物(5’-TGTGTTCATCAGCCATAAGGGTGTT-3’)，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与上述南方鲇性染色体特异分子标记进行对比；

B.结果判断：从待测南方鲇的基因组DNA中仅扩增出X染色体特异分子标记，判断该待测南方鲇为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX；从待测南方鲇的基因组DNA中仅扩增出Y染色体特异分子标记，判断该待测南方鲇为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为YY；从待测南方鲇的基因组DNA中同时扩增出X染色体特异分子标记和Y染色体特异分子标记，判断该待测南方鲇为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY。

3、一种全雌南方鲇的生产方法，包括以下步骤：

A.将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY交配后代进行雄性化处理，采用上述分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XX的转化雄鱼；

B.将XX转化雄鱼与正常南方鲇XX雌鱼交配，获得XX全雌鱼，进而可大量生产全雌商品鱼。

4、一种超雄和全雄南方鲇的生产方法，包括以下步骤：

A.将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY的交配后代进行雌性化处理，采用上述分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY的转化雌鱼；

B.将XY转化雌鱼与南方鲇XY雄鱼交配，采用上述分子标记方法，从后代中筛选出性染色体基因型为YY的超雄鱼；另取XY转化雌鱼与南方鲇XY雄鱼交配后代进行雌性化处理，采用上述分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY和YY的转化雌鱼；

C.将YY超雄鱼与XY或者YY的转化雌鱼交配，可获得YY超雄鱼；

D.将YY超雄鱼与XX正常雌鱼交配，可获得XY全雄鱼。

本发明的有益效果在于：

本发明首次筛选到南方鲇X和Y染色体特异分子标记，建立了南方鲇遗传性别PCR鉴定方法，并将本方法应用到全雌南方鲇培育过程中的遗传性别鉴定。本发明具有高效，准确和稳定的特点，在南方鲇性别控制和全雌南方鲇苗种的持续规模化生产中具有重要的应用价值。

本发明的南方鲇X和Y染色体特异分子标记，可适用于实验室及不同流域的野生南方鲇；基于该分子标记构建的南方鲇遗传性别鉴定方法，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼XX♀、正常雄鱼XY♂、转化雌鱼XY♀和YY♀、转化雄鱼XX♂和超雄鱼YY♂；基于上述遗传性别鉴定方法可以通过XX转化雄鱼♂与正常雌鱼XX♀交配实现全雌鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益；通过正常雌鱼XX♀与超雄鱼YY♂交配产生XY全雄鱼，转化雌鱼YY♀和超雄鱼YY♂交配产生YY超雄鱼，可获得大量单性鱼苗，从而应用于基础研究。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明所述X和Y染色体特异分子标记的序列比对图，引物位置用箭头标出，黑色背景为X染色体和Y染色体DNA片段的一致序列，“-”表示缺失序列。

图2为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记对5尾南方鲇雌鱼XX、5尾南方鲇雄鱼XY和5尾南方鲇超雄鱼YY进行遗传性别鉴定的结果，M表示DNA分子量标准DL2000。

图3为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记对来自不同流域的野生南方鲇(总计96尾)进行遗传性别鉴定的结果，M表示DNA分子量标准DL2000。

图4为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记辅助选育生产遗传全雌鱼(A)、全雄鱼和超雄鱼(B)的技术路线，FAD,Fadrozole，芳香化酶抑制剂，Limnodilus spp,水蚯蚓。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、南方鲇性别特异分子标记的获得

1、基因组DNA的提取

剪取南方鲇鳍条10mg，置裂解液[10mM Tris-HCl(pH8.0)+100mM EDTA(pH8.0)+100mM NaCl+5mg/ml SDS]600μl中匀浆，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的核糖核酸酶A(RnaseA)，55℃水浴消化至澄清，再加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比为25:24:1)混合液600μl，充分混匀后于12000rpm离心10分钟，吸取上清液，再次加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比为25:24:1)混合液抽提DNA，离心，吸取上清液，加入冰乙醇1000μl沉淀DNA，离心，弃上清液，DNA沉淀经体积分数为70％的乙醇洗涤、自然干燥后，用TE缓冲液溶解制成浓度为20ng/μl的溶液(OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.76～1.80)，-20℃保存备用。

2、性别特异分子标记的筛选

基于实验室前期对南方鲇进行了全基因组测序和雌雄混合池的重测序，发明人将测序获得的XY雄鱼142,759,127条clean reads通过Bowtie2比对到XX雌鱼参考基因组上，用SAMtools软件将没有比对到参考基因组的21,024,303条reads提取出来，并通过De novo组装软件Iterative De Bruijn Graph Assembler(IDBA)对提取结果进行从头组装，得到8954个contig，然后将雌鱼混合池的172,602,041条clean reads比对到这些contig上，从比对结果中过滤掉被雌鱼混合池中的reads比对上的contig，最终得到38条Y染色体特异的片段，将这些片段比回到雄鱼基因组上，确定出它们的位置，然后用雌鱼的reads进行比对，结果文件用可视化软件Integrative Genomics Viewer(IGV)打开进行查看，在差异之处的左右两侧的一致序列(consensus sequences)处设计引物，分别对XX，XY和YY南方鲇基因组池进行PCR扩增，筛选性别特异分子标记。结果发现，其中1对引物(上游引物F序列(5’-ACCAGACCTGGTCTTGGTCAGAAG-3)如SEQ ID NO.1所示，下游引物R序列(5’-TGTGTTCATCAGCCATAAGGGTGTT-3’)如SEQ ID NO.2所示)具有明显的性别特异性，能在XX和XY个体中扩增出一条长534bp的X染色体特异条带，同时在XY和YY个体中扩增出一条长613bp的Y染色体特异条带。

3、性别特异分子标记的克隆与序列分析

分别取含有上述X染色体特异条带、Y染色体特异条带的琼脂糖凝胶，回收目的片段，将其克隆入pMD-19T载体，再转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，挑取白斑单菌落，用PCR法鉴定阳性克隆，再进行测序。

对测序获得的X染色体特异分子标记(序列如SEQ ID NO.3所示，命名为SmX)和Y染色体特异分子标记(序列如SEQ ID NO.4所示，命名为SmY)进行序列比对分析。结果如图1所示，X和Y染色体特异分子标记的序列差异主要有3处：与X染色体特异分子标记相比，Y染色体特异分子标记①在72bp处插入了10bp序列；②在135bp处缺失了4bp序列；③在422bp处插入了74bp序列。

二、南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法

南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：

A.PCR扩增：剪取待测南方鲇的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.1所示的上游引物F和SEQ ID NO.2所示的下游引物R进行PCR扩增；PCR扩增参数为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸40秒，共38个循环，最后72℃延伸10分钟；所得PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；

B.结果判断：当从待测南方鲇的基因组DNA中仅扩增出长534bp的X染色体特异条带(即本发明所述X染色体特异分子标记SmX)，则判断该待测南方鲇为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX；当从待测南方鲇的基因组DNA中仅扩增出长613bp的Y染色体特异条带(即本发明所述Y染色体特异分子标记SmY)，则判断该待测南方鲇为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为YY；当从待测南方鲇的基因组DNA中同时扩增出长534bp的X染色体特异条带和长613bp的Y染色体特异条带，则判断该待测南方鲇为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY。

应用上述方法对5尾南方鲇雌鱼XX、5尾南方鲇雄鱼XY和5尾南方鲇超雄鱼YY进行遗传性别鉴定，结果见图2，在所有XX个体中都仅扩增出了长534bp的X染色体特异条带，在所有YY个体中都仅扩增出了长613bp的Y染色体特异条带，而在XY个体中同时扩增出了长534bp的X染色体特异条带和长613bp的Y染色体特异条带，与理论结果一致。

三、基于性别特异分子标记对不同流域的野生南方鲇进行遗传性别鉴定

应用上述方法对来自实验室养殖、嘉陵江北碚段和嘉陵江合川段三个地方的96尾南方鲇(48尾表型雄鱼和48尾表型雌鱼)进行遗传性别鉴定，结果见图3，在所有待测雌性南方鲇个体中都仅扩增出了长534bp的X染色体特异条带，而在所有待测雄性南方鲇个体中都同时扩增出了长534bp的X染色体特异条带和长613bp的Y染色体特异条带，说明这96尾待测南方鲇表型与基因型完全吻合(表1)。由上述结果可知，本实验开发的性别特异分子标记适用于实验室养殖的南方鲇和另外2个群体的南方鲇，具有普适性。

表1 3个不同群体的南方鲇的遗传性别鉴定结果

四、基于性别特异分子标记生产全雌南方鲇的方法

基于本发明的性别特异分子标记SmX/SmY进行南方鲇遗传性别鉴定，生产全雌南方鲇的方法包括以下步骤(图4中A)：

A.将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY交配后代于孵化后5天进行法倔唑Fadrozole浸浴，采用本发明所述南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XX的转化雄鱼；

此外，利用本发明的性别特异分子标记还建立了生产超雄和全雄南方鲇的方法，包括以下步骤(图4中B)：

A.将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY的交配后代进行雌性化处理(水蚯蚓Limnodilus spp代替正常饵料进行投喂)，采用本发明所述南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY的转化雌鱼；

B.将XY转化雌鱼与南方鲇XY雄鱼交配，采用本发明所述南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，从后代中筛选出性染色体基因型为YY的超雄鱼；另取XY转化雌鱼与南方鲇XY雄鱼交配后代进行雌性化处理，采用本发明所述南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY和YY的转化雌鱼；

C.将YY超雄鱼与XY或者YY的转化雌鱼交配，可获得YY超雄鱼；

D.将YY超雄鱼与XX正常雌鱼交配，可获得XY全雄鱼。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 南方鲇性染色体特异分子标记与基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和单性鱼生产方法

<130> 2019

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

accagacctg gtcttggtca gaag 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

tgtgttcatc agccataagg gtgtt 25

<210> 3

<211> 534

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

accagacctg gtcttggtca gaagcttagc agctgaattt taaacaacct gcaacttgtt 60

taatgtcgca ttacagcatt acagtaagta aaagttctta aaaaaatacg aaaatatttt 120

gcatttctga agtgctgaag agttcggtga actctgactt atgagtttgt atgatgcgat 180

aaaagattga cctcttcaga aaatcaagag gaagcaccag ctgtagcatt gtgttacatc 240

atcatgttat tctatacaaa acatcaaata aaaaaaaatg ttggcttgtt tacatatagt 300

aacatgtact tccatatttt tacatataat aacatgatct ttcctacaat tatgtgattc 360

ttctccaaac tgttaccaca aagctggaga tagacaattg tacaggacgt ctttggatgc 420

ggatccctac tgaacacctt gggatgaatg tgaacgctga cggcacccca gatctcctca 480

cttcacttgc atcagtacct gacttcacta acacccttat ggctgatgaa caca 534

<210> 4

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

accagacctg gtcttggtca gaagcttagc agctgaattt tgaacaacct gcaacttgtt 60

taaggtcgat tttgaaatcc caacagcatt acagtaagtc aaagttctta gaaaatacga 120

aaatattttg catctccgaa gtgcgagttc agtgaactct gaccgatgag tttgtatgat 180

gcgataaaag attgacctct tcagaaaatc aagaggaagc accagctgta gcattgtgtt 240

acaccattat cccattctat acaaaatata aaatcaaaag gaacgttgcc ttgtttacat 300

atagtaacat gtcatttcat atttttacat ataataacat gatctttcct acaattatgt 360

gattcttctc caaactgtta ccaaaaagct ggagatacac aattgtacag gacgtgtttg 420

gatgtggcgc aaagccagct ccatgaagat cttctataca tggttgggga ggaagatatt 480

ctgctctaga gctcttaact catccctact gaacaccttg ggataaatgt gaacgctgac 540

ggcaccccag atctcctcac ttcacttgac acagtacctg actttactaa cacccttatg 600

gctgatgaac aca 613

Claims

1.南方鲇性染色体特异分子标记，其特征在于，包括南方鲇X和Y染色体特异分子标记，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。

2.南方鲇遗传性别鉴定的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

A .PCR扩增：取待测南方鲇的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用SEQID NO .1所示的上游引物和SEQ ID NO .2所示的下游引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的南方鲇性染色体特异分子标记进行对比；

B .结果判断：从待测南方鲇的基因组DNA中仅扩增出X染色体特异分子标记，判断该待测南方鲇为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX；从待测南方鲇的基因组DNA中仅扩增出Y染色体特异分子标记，判断该待测南方鲇为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为YY；从待测南方鲇的基因组DNA中同时扩增出X染色体特异分子标记和Y染色体特异分子标记，判断该待测南方鲇为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY。

3.一种全雌南方鲇的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

A .将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY交配后代进行雄性化处理，采用权利要求2所述的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XX的转化雄鱼，所述雄性化处理具体为：将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY交配后代于孵育后5天进行法倔唑Fadrozole浸浴；

B .将XX转化雄鱼与正常南方鲇XX雌鱼交配，获得XX全雌鱼，进而可大量生产全雌商品鱼。

4.一种超雄和全雄南方鲇的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

A .将南方鲇雌鱼XX与雄鱼XY的交配后代进行雌性化处理，采用权利要求2所述的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY的转化雌鱼，所述雌性化处理具体为：向所述交配后代投喂水蚯蚓Limnodilus spp；

B .将XY转化雌鱼与南方鲇XY雄鱼交配，采用权利要求2所述的分子标记方法，从后代中筛选出性染色体基因型为YY的超雄鱼；另取XY转化雌鱼与南方鲇XY雄鱼交配后代进行雌性化处理，采用权利要求2所述的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY和YY的转化雌鱼；

C .将YY超雄鱼与XY或者YY的转化雌鱼交配，可获得YY超雄鱼；

D .将YY超雄鱼与XX正常雌鱼交配，可获得XY全雄鱼。