CN105441576B

CN105441576B - 一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重pcr方法

Info

Publication number: CN105441576B
Application number: CN201610018599.0A
Authority: CN
Inventors: 李琪; 刘婷; 于红
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2036-01-12
Also published as: CN105441576A

Abstract

本发明公开了一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，该方法包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；使用18个微卫星位点及带荧光标记的M13（‑21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。经验证，使用本发明2组多重PCR组合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100%的鉴定成功率。本发明为长牡蛎提供了一套经济有效、准确度高的基于DNA标记的亲子鉴定技术。通过微卫星标记鉴定获得的系谱关系记录，可以将长牡蛎个体追溯到其产出地，从而建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，为解决当今社会人们日益关注的食品安全问题提供有力的技术支持。

Description

一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法

技术领域

本发明涉及一种水产动物亲子鉴定的方法，具体涉及了一种采用微卫星多重PCR方法进行长牡蛎亲子鉴定的方法。

背景技术

微卫星标记方法具有多态性丰富、高度杂合、稳定性好、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR扩增等特点，是当今最流行的分子标记之一。在亲子鉴定中，相比于SNP标记，使用微卫星标记所需位点数少，但相对鉴定力可达5倍以上；微卫星标记方法不需特殊仪器，具有操作便捷、易于检测、省时高效以及准确度高的特点。

利用微卫星标记进行亲子鉴定，传统的分析方法是将PCR扩增产物在变性或者非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分型，利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得所需要的目的条带。这种方法存在许多不足之处，如判读误差较大、分辨率不高、操作无法自动化及存在有害物质、处理通量低等问题，不适合于大量样本的分析，也满足不了亲子鉴定对基因型分型的精度要求。

微卫星多重PCR方法是指在同一反应体系里加入多对引物，同时进行多个扩增反应，得到多个产物，因而具有提高反应效率，避免样品浪费，节约实验成本等优点。微卫星多重PCR在大黄鱼(Pseudosciaena crocea)，大菱鲆(Scophthalmus maximus)，斑节对虾(Penaeus monodon)，以及虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、皱纹盘鲍(Haliotisdiscus hannai)等的亲权分析及系谱认证中均有应用。

长牡蛎(Crassostrea gigas)是世界上养殖范围最广、产量最大的经济贝类，素有“海中牛奶”之美誉，深受消费者青睐。为了确保食品安全和增强消费者对养殖牡蛎产品的信赖，建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，以实现从苗种到餐桌的全程质量控制至关重要。长期以来，养殖水产品大都采用物理方法进行标记，但是物理标记容易丢失和改变，可靠性较低。使用DNA标记进行跟踪具有标记稳定、可靠，且易于检测的优势。

因此，开发精确的适用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR技术体系对于开展养殖牡蛎产品的DNA鉴定具有重要意义。此外，牡蛎亲子鉴定技术在牡蛎种质资源保护、优良品种选育等方面也具有重要的应用前景。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、鉴定准确率高的长牡蛎亲子鉴定的多重PCR方法，该方法采用加尾引物，能够快速、准确的对未知亲缘关系的长牡蛎亲本与子代间进行亲子鉴定，以弥补现有技术的不足。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA，其中长牡蛎子代选取的是D形幼虫，这是由于在海洋贝类中，经常会出现偏分离的微卫星等位基因，因此利用幼虫进行家系分析可以减少或排除偏分离位点的影响；

(2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选：根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；

(3)对步骤(1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增：对步骤(2)中筛选得到的引物首先两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位点的多重PCR体系的构建；然后优化退火温度、引物浓度和反应体系，最终将18个微卫星位点组成了6组最佳多重PCR体系，这使微卫星标记基因分型的工作量降低了2/3，节省了大量的时间、人力和物力；

(4)获得长牡蛎亲本和子代的基因型数据：对步骤(3)得到的多重PCR扩增产物进行荧光信号检测，从而获得亲本和子代的基因型数据；

(5)通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，从而对长牡蛎亲本和子代进行亲缘关系鉴定。

上述步骤(2)中筛选得到的引物序列如下：

该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列。

所述正向引物的5’端添加M13(-21)通用引物序列，荧光标记添加在单独合成的M13(-21)通用引物序列的5’端，所述荧光标记为FAM、VIC、NED其中的一种；本发明使用了加尾引物，相比于直接在正向引物5’端添加荧光标记，本发明不仅大大降低了在每个位点添加荧光标记的昂贵费用，同时也避免了只进行了10～30个反应的带荧光标记的正向引物的浪费。

根据步骤(2)中得到的引物序列，步骤(3)中所述的6个多重PCR组合如下：

上述步骤(3)中的多重PCR扩增的反应程序分为两步：前35个循环使用50℃～60℃，的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度；优选的，前35个循环6组中退火温度为58℃、50℃、54℃。

上述步骤(4)中荧光信号检测采用毛细管荧光电泳方法，毛细管电泳采用荧光标记的方式对位点进行区分，不同的荧光染料在被激光激发后，会释放出不同波长的荧光信号，利用虚拟滤镜技术，可使得不同荧光获得区分，在同一根毛细管中可以同时混合多个位点，大大增加了处理通量。

所述的基因序列分析软件为Genemapper v4.0和Cervus 3.0。

本发明具有的优点和有益效果如下：

本发明利用多重PCR的方法，使用荧光标记通用引物，结合毛细管电泳技术，可以提高分析精度和实验效率。经过已知遗传背景的家系实际验证，使用本发明2组多重PCR组合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100％的鉴定成功率。

为保证养殖牡蛎产品的食品安全，进行牡蛎产品溯源具有重要意义。传统的物理标记容易改变或者丢失，缺乏足够高的可信度和准确度。本发明的方法是基于DNA微卫星标记的长牡蛎亲子鉴定技术，采用亲本重建法对养殖个体进行家系分析，可以将长牡蛎个体成功追溯到其产出地，为确保其食品安全、建立消费者的信赖提供强有力的技术支持。

附图说明

图1在95％置信水平下，长牡蛎家系模拟和实际的累积鉴定成功率结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。

实施例：

(1)选取性腺成熟好的1龄长牡蛎亲贝进行人工催产，建立12个全同胞单对交配家系；收集各个家系的全部亲本个体(共24个)和部分子代个体(每个家系40个D形幼虫)；

(2)使用苯酚氯仿法提取每个亲本的DNA，使用螯合树脂法提取每个幼虫的DNA；

(3)根据前述筛选的18种引物序列以及通用引物序列合成引物；

(4)使用前述的6种引物组合方式进行多重PCR扩增，多重PCR的反应体系如表1所示；

多重PCR的反应程序为：94℃3min；94℃变性30s，退火温度退火60s，72℃延伸75s，35个循环；94℃变性30s，53℃退火60s，72℃延伸75s，8个循环；72℃延伸10min，12℃保存。

表1 用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星标记多重PCR反应体系

其中，反应体系中3对上下游引物的浓度和组分见前述6种多重PCR组合表所示；

(5)PCR扩增产物经适当稀释后，与分子量内标混合，在ABI 3130测序仪上进行毛细管电泳分析；

(6)使用Genemapper v4.0软件分析电泳结果，得到每个个体微卫星标记的基因型数据；混合12个全同胞家系的480个子代个体的基因型数据，以检验微卫星多重PCR在亲子鉴定中的效率；使用Cervus 3.0软件对亲本和子代个体进行亲缘关系分析，计算每个子代最可能的父母本个体；根据分析结果，将置信度最高的雄性和雌性个体确认为子代个体亲本。

结果显示，在全部的504个个体(24个亲本和480个子代)中，在95％置信水平下，运用两组多态性最高的多重PCR(6个位点)即可达到100％的亲子鉴定成功率，如图1所示。

家系鉴定的成功率不仅与微卫星的多态性和标记数量有关，而且也与所选择群体可能配对的亲本数有关。Bentsen and Olesen(2002)建议在群体选择育种中使用50对亲本可以有效的避免近交并获得长期的选择反应。根据Cervus 3.0软件模拟结果，当亲本数达到400对时，使用本发明3组多态性最高的多重PCR组合仍可达到100％鉴定成功率。因此，在实际生产中进行大批量材料分析时，本发明6组多重PCR仍是可靠的分析工具。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

<110> 中国海洋大学

<120> 一种用于太平洋牡蛎家系鉴定的多重PCR方法

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-117正向引物序列

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtcc aagcttgcac tcactcaa 38

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-117反向引物序列

<400> 2

gagtgttctg gtgtgccaaa t 21

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-120正向引物序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtgg gtgagattta gggggaga 38

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-120反向引物序列

<400> 4

ctccatcaaa cctgccaaac 20

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-198正向引物序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtga aagacacgac cggagaga 38

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-198反向引物序列

<400> 6

ctgatgatgt cccacacctg 20

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-146正向引物序列

<400> 7

tgtaaaacga cggccagtcg ctctggtctt tgttccat 38

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-146反向引物序列

<400> 8

accccaacag atcacaatcc 20

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi3正向引物序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagtta ggatgaggct ggcaccttgg a 41

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi3反向引物序列

<400> 10

gcctgccttg cctttgagga ata 23

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> uscCgi-210正向引物序列

<400> 11

tgtaaaacga cggccagttt cacaatgaag atgacagtgc 40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> uscCgi-210反向引物序列

<400> 12

cctcctctgc ctccatatca 20

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-180正向引物序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagttc acacgcagcg aattttta 38

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-180反向引物序列

<400> 14

aataaccacg ccgacagc 18

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-156正向引物序列

<400> 15

tgtaaaacga cggccagtag cagaccttgg caaatacg 38

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-156反向引物序列

<400> 16

ccgtcatcag gtcctgtttt 20

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-199正向引物序列

<400> 17

tgtaaaacga cggccagtgg gaagagttga attctgcaa 39

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-199反向引物序列

<400> 18

aaaccgaggc tcaggaaaat 20

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_0007_B07正向引物序列

<400> 19

tgtaaaacga cggccagtta tcatcgcggc aattcgtg 38

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_0007_B07反向引物序列

<400> 20

gcaacttagc tggtcgttcc 20

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_0129_E11正向引物序列

<400> 21

tgtaaaacga cggccagttg actgttcttc gtacccatca 40

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_0129_E11反向引物序列

<400> 22

aggtggaacg agattgcctt t 21

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi4正向引物序列

<400> 23

tgtaaaacga cggccagtcc aaaacacgat aagatacact ttc 43

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi4反向引物序列

<400> 24

gatcagtccc tcacatcttt cctc 24

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-152正向引物序列

<400> 25

tgtaaaacga cggccagttg gttttggagc ttggctta 38

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-152反向引物序列

<400> 26

tcaagcaaag aaagtcacct ca 22

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi39正向引物序列

<400> 27

tgtaaaacga cggccagttt ccaagtccgt tttgtcatcg t 41

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi39反向引物序列

<400> 28

gtgcacaaac ccaccatcag ctc 23

<210> 29

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi45正向引物序列

<400> 29

tgtaaaacga cggccagtga gtcaccatga agagtatctg aa 42

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crgi45反向引物序列

<400> 30

atgattacat aactctgacc caat 24

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-200正向引物序列

<400> 31

tgtaaaacga cggccagtaa agttgctttg ctgtcgtc 38

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ucdCg-200反向引物序列

<400> 32

cgctaacgtg cttcattcaa 20

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_408293正向引物序列

<400> 33

tgtaaaacga cggccagtac cctggtttga tctgagaaat g 41

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_408293反向引物序列

<400> 34

tctaaggagt gttgagtgtt agtag 25

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_0139_G12正向引物序列

<400> 35

tgtaaaacga cggccagtgt gcttcagggt atctctttcc 40

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> otgfa0_0139_G12反向引物序列

<400> 36

agctactgca tggacacgat t 21

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13（-21）通用引物序列

<400> 37

tgtaaaacga cggccagt 18

Claims

1.一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA；

(2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选：根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；所述引物序列如下：

该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列；

(3)对步骤(1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增：对步骤(2)中筛选得到的引物进行组合，并通过优化PCR反应条件得到6组多重PCR组合；

所述的6组多重PCR组合如下：

(5)通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，以对长牡蛎亲本和子代进行亲缘关系鉴定。

2.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述正向引物的5’端添加M13(-21)通用引物序列，荧光标记添加在M13(-21)通用引物序列的5’端。

3.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的多重PCR扩增的反应程序分为两步：前35个循环使用50℃～60℃的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度。

4.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的引物组合和优化PCR条件具体操作为：首先将所述各引物两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位点的多重PCR体系的构建；通过优化退火温度、引物浓度、反应体系最终得出6组多重PCR组合。

5.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(4)中荧光信号检测采用毛细管荧光电泳方法。

6.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的基因序列分析软件为Genemapper v4.0和Cervus 3.0。

7.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的长牡蛎子代DNA提取选取的实验材料是D形幼虫。