CN108192963A

CN108192963A - 一种准确鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记及其引物

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Publication number: CN108192963A
Application number: CN201810210532.6A
Authority: CN
Inventors: 江东能; 李广丽; 奥马尔·法鲁克·穆斯塔法; 朱春华; 陈华谱; 邓思平; 吴天利; 梁志华; 向玲; 杨尉; 古皓天
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: CN108192963B

Abstract

本发明公开了一种金钱鱼遗传性别的特异分子标记，所述分子标记为两条在金钱鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，X染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Y染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明首次从金钱鱼基因组信息中筛选到两条在金钱鱼X染色体和Y染色体上部分同源DNA片段，并设计特异性引物进行金钱鱼遗传性别鉴定，可以快速、准确的区分金钱鱼遗传性别。本发明的方法适用于实验室或水产养殖企业准确鉴定金钱鱼遗传性别。本发明检测金钱鱼遗传性别的方法可用于对不同生长阶段和不同群体的金钱鱼性别鉴定和筛选，对研究金钱鱼性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

Description

一种准确鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记及其引物

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种准确鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记及其引物。

背景技术

鱼类的性别决定、分化机制和性别控制技术育种在水产养殖研究和应用方面意义重大，许多鱼类具有性别二态性，半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、比目鱼（Hippoglossus hippoglossus L.）和鲤鱼（Cyprinus carpio）等雌性生长速度显著快于雄性，通过性别控制技术实现全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一（陈松林等,2013；Shao et al., 2014）；尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）等鱼类雄性在生长上显著优于雌性，生产上期望实现全雄化养殖以增加产量和效益（孙运侣, 2013; 丹成, 2014）。

金钱鱼（Scatophagus argus）是目前我国有记录的金钱鱼科鱼类中唯一物种，是我国东南沿海重要的养殖经济鱼类。金钱鱼雌鱼比雄鱼生长快30%以上，全雌化养殖可以明显提高金钱鱼的养殖效率（蔡泽平等，2010）。开展这种鱼遗传性别鉴定和性别控制技术研究既有重要的科学意义，又有广阔的应用前景。金钱鱼染色体2n=48，目前还不清楚其性染色体类型。如果其雄鱼具有XY 异型性染色体，由于鱼类性别的可塑性，理论上可以通过雄性类固醇激素、抗雌药物和芳香化酶（雌激素合成关键酶）抑制剂处理，诱导遗传性别为XX的个体发育为伪雄鱼（遗传上仍为XX），将XX伪雄鱼与正常XX雌鱼交配繁殖，最终获得全雌后代，实现金钱鱼全雌单性苗种培育。传统的鱼类性别控制育种需要通过测交，来判断亲本基因型是否为XX伪雄鱼，耗时耗力。

而基于性别连锁的分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力，但是在金钱鱼中尚未发现相关遗传性别的特异分子标记。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于性别连锁的特异分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力（图1）。

本发明的第一个目的是提供一种金钱鱼遗传性别的特异分子标记。

本发明的第二个目的是提供所述特异分子标记在制备鉴定金钱鱼性别引物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一对能够PCR扩增所述特异分子标记或其部分片段的引物。

本发明的第四个目的是提供所述特异分子标记或所述引物在鉴定金钱鱼遗传性别中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述特异分子标记或所述引物在制备鉴定金钱鱼性别试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种鉴定金钱鱼遗传性别的方法。

本发明的第七个目的是提供一种鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明通过分子生物学和生物信息学方法分析金钱鱼性别决定与分化相关基因的序列信息，找到了一条特异在雄鱼存在的序列和它的同源序列，推测他们分别来自金钱鱼的Y染色体和X染色体，即确立金钱鱼具有雄性异型的XY性别决定系统。X染色体上DNA片段为546bp，序列如SEQ ID NO：1所示，命名为SEQchrX；Y染色体上DNA片段为543bp，序列如SEQID NO：2所示，命名为SEQchrY。

因此本发明要求保护一种金钱鱼遗传性别的特异分子标记，所述分子标记为两条在金钱鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，X染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQID NO：1所示，Y染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的特异性分子标记在金钱鱼X染色体和Y染色体中存在差异，可将此差异用于鉴别金钱鱼的遗传性别。因此，所述特异分子标记在制备鉴定金钱鱼性别引物中的应用，也属于本发明的保护范围。

一对能够PCR扩增权利要求1所述特异分子标记或其部分片段的引物，所述部分片段包含特异分子标记的第151位点和/或第166位点记。

本发明基于上述特异性分子标记的两条DNA片段序列设计了一对性别鉴定的引物，以扩增金钱鱼X染色体和Y染色体同源差异DNA片段，再通过DNA测序峰图可以清晰分辩XX个体和XY个体特异DNA序列，准确鉴定金钱鱼的遗传性别。

优选地，其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

正向引物F：5′- ACGAGAGCCTGGAGAGCCTCAT -3′（SEQ ID NO：3）

反向引物R：5′- TGCGGCACCACTGTGTAACTGA -3′（SEQ ID NO：4）

同时，以下应用均属于本发明的保护范围：

所述特异分子标记或所述引物在鉴定金钱鱼遗传性别中的应用。

所述特异分子标记或所述引物在制备鉴定金钱鱼性别试剂盒中的应用。

本专利可以判定金钱鱼的性别决定系统为XX/XY，雌性为XX染色体类型，雄性为XY染色体类型；本发明的引物在雌性个体XX染色体和雄性个体的XY染色体都能扩增出单一的电泳条带，他们分子量大小相近，胶回收可以同时将它们回收，通过PCR产物测序，可以准确判断金钱鱼的遗传性别。

因此，本发明要求保护一种鉴定金钱鱼遗传性别的方法，包括如下步骤：

S1. 提取待测样本基因组DNA；

S2. 设计引物并以S1的基因组DNA为模板，PCR扩增权利要求1所述特异分子标记或其部分片段；

S3. 将S2的PCR扩增产进行测序；

S4. 分析测序结果，根据测序结果判断金钱鱼遗传性别，判断标准为：

如果特异分子标记的第151位点的核苷酸为G的单峰，和/或第166位点的核苷酸为G的单峰，则待测样本为雌鱼；

如果特异分子标记的第151位点的核苷酸为G和C的双峰，和/或第166位点的核苷酸为G和A的双峰，则待测样本为雄鱼。

优选地，所述PCR扩增的体系为2× PCR mix Buffer 5μL，10 μmol/L正反向引物各1μL，基因组DNA 2μL，ddH₂O 21μL，共50μL。

优选地，PCR扩增的程序：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，37个循环；72℃ 10min延伸。

优选地，使用SEQ ID NO：3～4所示引物进行扩增。

更优选地，使用SEQ ID NO：3所示引物作为测序引物。

一种鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求3所述引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次从金钱鱼基因组信息中筛选到两条在金钱鱼X染色体和Y染色体上部分同源DNA片段，并设计特异性引物进行金钱鱼遗传性别鉴定，可以快速、准确的区分金钱鱼遗传性别。本发明的方法在雌、雄个体中都可扩增出特异DNA片段并可用测序法区分，适用于实验室或水产养殖企业准确鉴定金钱鱼遗传性别。本发明检测金钱鱼遗传性别的方法可用于对不同生长阶段和不同群体的金钱鱼性别鉴定和筛选，对研究金钱鱼性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

附图说明

图1为分子标记辅助选育生产遗传全雌鱼的技术路线；（A）在XY系统构建全雌鱼生产的技术路线图；（B）在ZW系统构建全雌鱼的生产技术路线图。FAD，fadrozole，芳香化酶抑制剂。

图2为为本发明金钱鱼X染色体、Y染色体同源DNA片段序列比对图，引物位置用箭头标出；方框：本专利鉴定遗传性别的X染色体、Y染色体DNA片段差异SNP序列；黑色背景X染色体和Y染色体DNA片段一致序列；-：缺失序列。

图3为本发明雌、雄金钱鱼PCR产物采用SEQ ID NO：3测序的部分峰图，XX femalefish为遗传雌鱼且表型也为雌鱼；XY male fish为遗传雄鱼且表型也为雄鱼；箭头指示SNP所在碱基。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 金钱鱼性别特异标记的获得

1、性腺RNA的提取

取雌性金钱鱼各3尾，分别取雌雄性腺，先液氮速冻，然后转移至–80℃ 冰箱保存，用于提取总RNA。利用RNAiso提取样品总RNA，然后进行 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，28S 和 18S两条带清晰可见，用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪（Thermo Scientific，美国）检测 RNA 样品的OD值和浓度，OD260/280 值均在1.95～2.00 之间。总RNA样品用干冰寄送到生物测序公司进行转录组建库和测序分析。

2、性腺转录组测序组装及注释

获得原始数据后，然后对Raw reads 经过滤后，通过 De novo 组装软件 Trinity进行组装，将组装得到的序列通过软件TGICL去冗余和拼接，得到尽可能长的非冗余的Unigene集，并对Unigene集做进一步的统计和质控。本次测序共获得了136561个转录本，平均测序长度为1389.72bp。De novo 组装聚类得到的Unigene集，通过Blast比对数据库进行功能注释，注释数据库包括：NT、NR、COG、KEGG、SwissProt等，并基于NR注释结果对Unigene集通过Blast2GO进行 GO 功能注释。再通过近源物种的性别决定与分化相关的基因为参考，分析金钱鱼的这些基因的转录本。

通过分析，发现其中一个性别决定分化相关基因的转录本在表达水平具有明显的性别二态性，仅仅在精巢表达。针对该转录本序列设计一对引物（SEQ ID NO：3：5′-ACGAGAGCCTGGAGAGCCTCAT -3′和SEQ ID NO：4：5′- TGCGGCACCACTGTGTAACTGA -3′），对10尾金钱鱼雌鱼和10尾金钱鱼雄鱼基因组DNA进行PCR扩增和测序分析。

结果发现，该引物组合扩增的序列具遗传性别的特异分子标记，因此，该特异片段即为筛选出的X和Y染色体特异分子标记。这是找到了两条在金钱鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，其X染色体上DNA片段序列命名为SEQchrX；其Y染色体上DNA片段长度命名为SEQchrY；

3、性染色体特异标记的克隆和序列分析

将该引物扩增的雌雄金钱鱼各4尾的基因组，扩增产物即含有上述X和Y染色体特异SNP标记，用刀片切下琼脂糖凝胶，回收目的片段，将其克隆入Peasy-T3载体，再转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，挑取白斑单菌落，用PCR法鉴定阳性克隆，并用ABI3730测序仪进行测序。

将来自每尾鱼的6个阳性克隆的核苷酸序列用DNAMAN 4.0软件进行多重比对，结果发现，来自雌性个体的SEQchrX序列同源性高达99.45%-99.87%。来自雄性个体SEQchrX和SEQchrY的序列同源性仅仅为95.52%-95.80%，它们与来自雌性个体的SEQchrX序列同源性平均分别为99.52%和95.50%。以上结果表明SEQchrX在雌雄个体都存在，SEQchrY仅仅在雄性个体存在，即SEQchrX和SEQchrY分别来自X和Y染色体的同源序列。

最终确定SEQchrX，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；SEQchrY，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；两条序列比对的分析图见图2。

对大量金钱鱼雌雄个体采用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行基因组扩增，对PCR产物采用SEQ ID NO：3测序，发现如果为雌鱼，则在扩增产物151和166核苷酸处分别为G和G；如果为雄鱼，则在扩增产物151核苷酸处为G和C的，且在166核苷酸处为G和A的双峰（图3）。通过182尾样品的测序分析，我们发现第151位和166位的SNP最为稳定，且最容易区分，所以本专利测序峰图以这两个SNP进行雌雄性别区分。

实施例2金钱鱼遗传性别鉴定引物序列的应用

1、快速准确鉴定金钱鱼遗传性别，包括如下步骤：

（1）不同地理来源金钱鱼的采集和表型性别鉴定

为了验证专利对遗传性别鉴定的准确性，我们采集了自湛江市、吴川市、珠海市三个地方的182尾金钱鱼（116尾表型雌鱼和66尾表型雄鱼），金钱鱼的表型性别通过性腺外观确定，雌鱼卵巢拟三角形，雄鱼精巢长囊状（崔丹等，2013）。

（2）金钱鱼基因组DNA提取

剪取待测的金钱鱼的尾鳍，采用基因组DNA提取试剂盒，按步骤提取金钱鱼基因组DNA。

（3）待测样本DNA的测序检测

采用实施例1的金钱鱼性别鉴定引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4对所提取的基因组DNA进行PCR扩增；

PCR反应体系：2×PCR mix Buffer 25μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA2μL，ddH₂O 21μL，混匀后离心。

PCR扩增程序：95℃10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

PCR产物用1.5%琼脂糖电泳，150V，20分钟，切胶，送测序公司测序分析。

结果显示为116尾雌鱼和66尾雄鱼。与表型鉴定结果进行匹配分析，发现基因型性别和表型性别鉴定结果完全吻合，遗传性别与表型性别的吻合率为100%（表1）。由上述结果可知，本实验开发的性别特异分子标记适用于多个不同地理来源的金钱鱼，具有普适性。

表1 3个不同地理来源的金钱鱼的遗传性别鉴定结果：

表型性别	湛江	吴川	珠海
				雌鱼	(93♀:0♂)	(13♀:0♂)	(10♀:0♂)
雄鱼	(0♀:35♂)	(0♀:15♂)	(0♀:16♂)
				雌鱼准确率	100%	100%	100%
雄鱼准确率	100%	100%	100%
				平均准确率	100%	100%	100%

实施例3 一种快速鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒

一种用于鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含有用于鉴定金钱鱼遗传性别的引物；所述引物序列如下所示：

上游引物F：5′- ACGAGAGCCTGGAGAGCCTCAT -3′（SEQ ID NO：3）

下游引物R：5′- TGCGGCACCACTGTGTAACTGA -3′（SEQ ID NO：4）

同时，所述试剂盒中还包含有PCR扩增反应所需的试剂：2× PCR mix Buffer和ddH₂O。

所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以上述引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳，可获得一条单一的电泳条带，将其切下，纯化；

S4. 将S3的PCR纯化产物进行测序，测序引物为上游引物F：5′-ACGAGAGCCTGGAGAGCCTCAT -3′（SEQ ID NO：3），分析测序峰图，如果在扩增产物151和166核苷酸处分别为G和G，则为雌鱼；如果在扩增产物151核苷酸处为G和C的，且在166核苷酸处为G和A的双峰，则为雄鱼。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种准确鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记及其引物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 546

<212> DNA

<213> 金钱鱼(Scatophagus argus)

<400> 1

acgagagcct ggagagcctc atcccggagt cactcagagt actgcccggc atcggcatct 60

ccggagccgg cgaggggaac cagggagccc cgccgaggac ggaggaggtg gagctgaggt 120

ggagcagcac ggagccggtg caggccggag cacaaacatg cacaggtagg agagtgatga 180

agggtgacgg ttgactttaa agctttaaag ttctgatttt tatttgttta tttttaccta 240

tttgcttatt tatttacttt taaaaactac aaacaatttt aaaccactgc cactagcttt 300

ttcccaataa ataataaagg agaacgtgat gatgttctac cctaataaaa aatgtgaaag 360

gtcagtgcgt tcttaaaaac aatcaaatgc aacgaagaga cggagatttg gatgtttgta 420

atcttgatgt gacgcctgta caaacagctt tttgtttggt attttcacac aaattattcc 480

cagttaactt aagatgctgt catttctaca ttttgagtca ggtctcagtt acacagtggt 540

gccgca 546

<210> 2

<211> 543

<212> DNA

<213> 金钱鱼(Scatophagus argus)

<400> 2

acgagagcct ggagagcctc atcccggagt cactcagagt actgcccgtc atcggcatct 60

ccggagccgg cgaggggaac catggagccc cgccgaggac ggaggaggtg gagctgaggt 120

ggagcagcac ggagccggta catgccggag gacaaacatg cacagatagg agagtgatga 180

agggtgacgt ttgactttaa agctttacag ttctgatttt tatttattta tttttaccta 240

tttgcttatt tatttacttg tttttttatt aatttttgaa tgcaaacaat tttaaaccac 300

tgccactagc tttttcccaa taaataataa aggagaacgt gatgatgata taccctaata 360

aaaaatgtga aaggtcagtg cattcttaaa aacaatcaaa tgcaacgaag agacggagat 420

ttggatgttt ctaatcttga tgtgacgcct atttgttatt ttcacacaaa ttattccctg 480

ttaacttaag atgctgtcat ctctatattt taagtcaggt ttcagttaca cagtggtgcc 540

gca 543

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 金钱鱼(Scatophagus argus)

<400> 3

acgagagcct ggagagcctc at 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 金钱鱼(Scatophagus argus)

<400> 4

tgcggcacca ctgtgtaact ga 22

Claims

1.一种金钱鱼遗传性别的特异分子标记，其特征在于，所述分子标记为两条在金钱鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，X染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Y染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述特异分子标记在制备鉴定金钱鱼性别引物中的应用。

3.一对能够PCR扩增权利要求1所述特异分子标记或其部分片段的引物，其特征在于，所述部分片段包含特异分子标记的第151位点和/或第166位点记。

4. 根据权利要求3所述引物，其特征在于，其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.权利要求1所述特异分子标记或权利要求3所述引物在鉴定金钱鱼遗传性别中的应用。

6.权利要求1所述特异分子标记或权利要求3所述引物在制备鉴定金钱鱼性别试剂盒中的应用。

7.一种鉴定金钱鱼遗传性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 提取待测样本基因组DNA；

S3. 将S2的PCR扩增产进行测序；

8. 根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为2× PCR mix Buffer5μL，10 μmol/L正反向引物各1μL，基因组DNA 2μL，ddH₂O 21μL，共50μL。

9. 根据权利要求7所述方法，其特征在于，PCR扩增的程序：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，37个循环；72℃ 10min延伸。

10.一种鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求3所述引物。