CN107385095B - 一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物及其应用。首先通过分子生物学和生物信息学方法分析弓背青鳉常染色体基因和Y染色体基因的序列信息，找到了两条在弓背青鳉常染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，其常染色体上DNA片段序列如SEQ ID NO：1所示，命名为SEQchrA；其Y染色体上DNA片段长度序列如SEQ ID NO：2所示，命名为SEQchrY；同时，针对上述DNA片段设计特异性引物进行弓背青鳉遗传性别鉴定，可以快速、准确的区分弓背青鳉遗传性别，所述方法可用于不同发育时期弓背青鳉的遗传性别鉴定，对研究弓背青鳉性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义，具有较大的应用前景。

Description

一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物及其应用。

背景技术

弓背青鳉（Oryzias curvinotus），又称为海南青鳉，属于鹤鱵目、异鳉科、青鳉属，主要分布在东亚及东南亚一代，在我国南方海域分布广泛，并且在不同盐度水域均可生长繁殖，具有广盐性。弓背青鳉和日本青鳉亲缘关系最近，且体型小、盐度适应性强、易饲养、性成熟周期短可以广泛在实验室养殖，是进行环境监测的理想本地鱼种。在已知的20多种青鳉属物种中，弓背青鳉和日本青鳉一样，其性别决定系统为XX/XY，雌性为XX染色体类型，雄性为XY染色体类型，是研究鱼类性别决定和分化理想材料，具有极好的理论和应用开发潜力。

鱼类的性别决定、分化机制和性别控制技术育种在水产养殖研究和应用方面意义重大，许多鱼类具有性别二态性，半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）雌性生长速度显著快于雄性，通过性别控制技术实现全雌化养殖是提高其养殖产业的关键技术之一（陈松林等,2013；Shao et al., 2014）；罗非鱼（Oreochromisniloticus）和黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）等鱼类雄性在生长上显著优于雌性，生产上期望实现全雄化养殖以增加产量和效益（孙运侣, 2013; 丹成, 2014）。阐明鱼类的性别决定和分化机制是实现其性别控制的必要条件，这就需要在胚胎或者幼鱼性别分化之前确定鱼类的遗传性别，然而绝大多数鱼类在胚胎和幼鱼时期无法通过表型区分性别，这为鱼类的性别决定和分化机制研究增加了困难。开发鱼类性别特异的分子标记，建立快速鉴定鱼类遗传性别的方法，是阐明鱼类性别决定和分化机制进而实现鱼类性别控制的有效途径。弓背青鳉性成熟之前很难通过表型确定其遗传性别，因此，筛选弓背青鳉遗传标记，开发快速鉴定其遗传性别的方法，对实现弓背青鳉的开发应用及推广具有重要意义。

在青鳉性别特异分子标记的开发和遗传性别鉴定方面，日本学者在日本青鳉上筛选了一对遗传性别鉴定的引物，其在常染色体上扩增出1906bp的DNA片段，在Y染色体上扩增出933bp的DNA产物，可以用来快速、准确鉴定日本青鳉的遗传性别（Patil, 2008）。但由于物种不同及基因组序列的差异，日本青鳉的引物在弓背青鳉中并不完全适用（Matsudaet al., 2003）。因此，需要筛选针对弓背青鳉遗传性别的特异分子标记，开发适用于弓背青鳉胚胎和幼鱼时期遗传性别快速准确鉴定的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术弓背青鳉遗传性别鉴定方面存在的缺陷和不足，提供一种弓背青鳉遗传性别的特异分子标记，通过针对该特异分子标记设计用于鉴定弓背青鳉遗传性别的引物同时建立了一套弓背青鳉遗传性别的鉴定方法，可以快速、准确的区分弓背青鳉遗传性别。所述方法可用于对弓背青鳉成鱼、幼鱼及胚胎的性别鉴定和筛选，对研究弓背青鳉性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

本发明的目的是提供一种弓背青鳉遗传性别的特异分子标记。

本发明的另一目的是提供一种鉴定弓背青鳉遗传性别的引物。

本发明的再一目的是提供一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种弓背青鳉遗传性别的特异分子标记，所述分子标记为两条在弓背青鳉常染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，所述常染色体上DNA片段序列如SEQ ID NO：1所示，Y染色体上DNA片段序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明通过分子生物学和生物信息学方法分析弓背青鳉常染色体基因和Y染色体基因的序列信息，找到了两条在弓背青鳉常染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，常染色体上DNA片段为959bp，序列如SEQ ID NO：1所示，命名为SEQchrA；Y染色体上DNA片段为656bp，序列如SEQ ID NO：2所示，命名为SEQchrY。

本发明的特异性分子标记在弓背青鳉常染色体和Y染色体中存在差异，可将此差异用于鉴别弓背青鳉的遗传性别。因此，上述特异性分子标记在鉴定弓背青鳉遗传性别中的应用；在制备鉴定弓背青鳉遗传性别的引物和/或试剂盒中的应用均在本发明保护范围内。

本发明基于上述特异性分子标记的两条DNA片段序列设计了一对性别鉴定的引物，以扩增弓背青鳉常染色体和Y染色体同源差异DNA片段，再通过普通电泳清晰分辩常染色体、Y染色体特异DNA片段，准确鉴定弓背青鳉的遗传性别。

一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物，其正向引物F的序列如SEQ ID NO：3所示，反应引物R序列如SEQ ID NO：4所示；

上游引物F：5′-ATGGTAACGCAGCCTTTCC-3′（SEQ ID NO：3）

下游引物R：5′-GCCACATTCTTCTCAGGCA-3′（SEQ ID NO：4）

同时，所述引物在制备鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以上述引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳，若电泳检测结果为单一条带，则待测样本为雌性；若电泳检测结果为两条带，则待测样本为雄性。

具体地，若扩增出959bp的单一条带，则该样本为雌性个体；若扩增出959bp和656bp两个条带，则该样本为雄性个体。

由于弓背青鳉的性别决定系统为XX/XY，雌性为XX染色体类型，雄性为XY染色体类型；因此本发明的引物在雌性个体中针对常染色体仅能扩增出单一的条带，在雄性个体中针对常染色体和Y染色体可以扩增出两个条带。

优选地，所述PCR扩增体系为2×PCR mix Buffer 25μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，ddH₂O 20μL，共50μL。

优选地，所述PCR扩增程序：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min。

另外，上述方法在制备鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，本发明提供一种用于鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含有上述用于鉴定弓背青鳉遗传性别的引物。

优选地，所述试剂盒中还包含有PCR扩增反应所需的试剂。

作为一种优选地可实施方式，本发明所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以上述引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳，若扩增出959bp的单一条带，则该样本为雌性个体；若扩增出959bp和656bp两个条带，则该样本为雄性个体。

所述PCR扩增体系为2× PCR mix Buffer 25μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，ddH₂O 20μL，共50μL。

所述PCR扩增程序：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，35个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从弓背青鳉基因组信息中筛选到两条在弓背青鳉常染色体和Y染色体上部分同源DNA片段，并设计特异性引物进行弓背青鳉遗传性别鉴定，可以快速、准确的区分弓背青鳉遗传性别。本发明的方法在雌、雄个体中都可扩增出特异DNA片段并可用琼脂糖电泳分辨，缩短了准确鉴定弓背青鳉遗传性别的时间，适用于实验室快速鉴定弓背青鳉遗传性别，节约了检测的时间和成本。本发明检测弓背青鳉遗传性别的方法可用于对弓背青鳉成鱼、幼鱼及胚胎的性别鉴定和筛选，对研究弓背青鳉性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

附图说明

图1为本发明弓背青鳉常染色体、Y染色体同源DNA片段序列比对图，引物位置用方框标出；空格：常染色体、Y染色体DNA片段差异序列；*：常染色体、Y染色体DNA片段一致序列；-：缺失序列；W：兼并碱基A/T。

图2为本发明雌、雄弓背青鳉PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳结果图，♀：遗传雌鱼；♂：遗传雄鱼；M：DL 2000 DNA Maker；0：空白对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 弓背青鳉性别鉴定引物序列的筛选

1、本实施例所用弓背青鳉来源于广东海洋大学生物技术实验室所采集南海海域弓背青鳉，通过分子生物学和生物信息学方法分析弓背青鳉常染色体、Y染色体基因的序列信息，找到了两条在弓背青鳉常染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，所述常染色体上DNA片段为959bp，序列如SEQ ID NO：1所示，命名为SEQchrA；Y染色体上DNA片段为656bp，序列如SEQ ID NO：2所示，命名为SEQchrY。

2、引物筛选

（1）针对上述同源DNA片段，设计了多对用于扩增所述同源片段的引物，所述引物序列如下所示：

Ocsex-F1：5’-ACAGTACACAACACAAGGACTCC-3’

Ocsex-F2：5’-ATGGTAACGCAGCCTTTCC-3’

Ocsex-F3：5’-TGGAAAAGAACAGAAATA-3’

Ocsex-R：5’-GCCACATTCTTCTCAGGCA-3’

（2）选择已知遗传性别的雌、雄弓背青鳉DNA为模板，通过以下引物组合来扩增同源片段：Ocsex-F1&R（1）；Ocsex-F2&R（2）；Ocsex-F3&R（3）；

所述PCR反应体系包括为2× PCR mix Buffer 25μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，ddH₂O 20μL，共50μL，混匀后离心。

PCR扩增程序为95℃10min；95℃ 30s、退火温度（50～62℃）30s、72℃ 60s，35个循环；72℃10 min，4℃保存。

（3）结果

当使用引物组合1扩增时，无论选择何种退火温度，都仅可以在雄性弓背青鳉中扩增出单条带，而在雌性个体中无法扩增出条带，存在假阴性风险，因此引物组合1无法用于弓背青鳉遗传性别鉴定。

当使用引物组合2扩增时，在温度梯度PCR（50℃、52.4℃、54.7℃、57.6℃、60.0℃、62.0℃）检测显示在退火温度为52.4～60℃时其PCR扩增结果均较好，当退火温度为50℃会有非特异扩增；考虑到引物的特异性扩增，最终确定选择60℃作为退火温度，尽管60℃时产物条带弱，但不影响最终的结果判定。

当使用引物组合3扩增时，在温度梯度PCR（50℃、52.4℃、54.7℃、57.6℃、60.0℃、62.0℃）检测显示仅在退火温度为50℃时PCR扩增结果较好。但是在实际检测过程中发现，当选择50℃作为退火温度时，发现引物组合3在弓背青鳉中有非特异扩增产物存在，导致无法判断扩增结果。因此，确定了引物组合2为扩增引物。

（4）通过以上筛选，最终确定引物组合为Ocsex-F2&R（2），其序列如下所示：

上游引物F：5′-ATGGTAACGCAGCCTTTCC-3′（SEQ ID NO：3）

下游引物R：5′-GCCACATTCTTCTCAGGCA-3′（SEQ ID NO：4）

将引物组合2扩增得到的PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。将雌、雄差异片段回收连接pMD 18-T载体，转化至感受态细胞DH5α，阳性克隆送至苏州金维智公司测序。

结果确认了弓背青鳉常染色体、Y染色体上部分同源DNA片段序列，常染色体DNA片段的扩增长度为959bp，Y染色体DNA片段的扩增长度为656bp，两条PCR产物大小相差303bp。电泳结果显示：雌性个体均扩增出长度为959bp的单一条带，雄性个体均扩增出长度为959bp和656bp两条带，如图1所示；所述引物可用于实际弓背青鳉遗传性别鉴定。

实施例2弓背青鳉遗传性别鉴定引物序列的应用

1、快速准确鉴定弓背青鳉遗传性别，包括如下步骤：

（1）待检测成鱼亲鱼鳍条、胚胎及幼鱼的采集

提前准备好编号的离心管和培养皿，且编号一一对应。在养殖系统中逐条现场采集弓背青鳉尾鳍，待检测成鱼的鳍条于编号离心管中；将对应成鱼放入编号培养皿中，置于26℃光照培养箱中暂时保存；胚胎和幼鱼直接单个放入离心管中。

（2）弓背青鳉基因组DNA提取

采用基因组DNA提取试剂盒，按步骤提取弓背青鳉基因组DNA。

（3）待测样本DNA的PCR检测

采用实施例1的弓背青鳉性别鉴定引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4对所提取的基因组DNA进行PCR扩增；

PCR反应体系：2×PCR mix Buffer10μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，模板DNA1.5μL，ddH₂O 7.7μL，混匀后离心。

PCR扩增程序：95℃10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

PCR产物用1.2%琼脂糖电泳，150V，20分钟，用凝胶成像仪观察待测样本遗传性别。记录个体编号对应PCR产物，电泳检测为一条DNA条带且条带大小为959bp的个体为遗传雌鱼（XX），电泳检测为两条DNA条带且条带大小为959bp和656bp的个体为遗传雄鱼（XY），与前期通过其他手段性别鉴别技术得出来的结果一致。所述检测引物和方法可用于实验室弓背青鳉性别决定和性别控制研究。

整个过程耗时约4小时，可保证被检测的成年弓背青鳉存活，并且不影响其正常繁殖。

实施例3 一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒

一种用于鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含有用于鉴定弓背青鳉遗传性别的引物；所述引物序列如下所示：

上游引物F：5′-ATGGTAACGCAGCCTTTCC-3′（SEQ ID NO：3）

下游引物R：5′-GCCACATTCTTCTCAGGCA-3′（SEQ ID NO：4）

同时，所述试剂盒中还包含有PCR扩增反应所需的试剂：2×PCR mix Buffer和ddH₂O。

所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以上述引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳，若扩增出959bp的单一条带，则该样本为雌性个体；若扩增出959bp和656bp两个条，则该样本为雄性个体。

所述PCR扩增体系为2× PCR mix Buffer 25μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，ddH₂O 20μL，共50μL。

所述PCR扩增程序：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s，35个循环；72℃10min。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物及其应用

<130> 1712936ZBSH042

<141> 2017-09-08

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 959

<212> DNA

<213> 弓背青鳉(Oryzias curvinotus)

<400> 1

atggtaacgc agcctttcct gtaaagctgc acgagtgaag gcttcttcta aaagctgctg 60

caggttgaaa agcgacctga aagctgctgg ggaacgccga ctgtaatgct ccatcgtgtg 120

aagaaaacca aggtttgttc agaaggaaca atgagaaatg aggaggaatc aaaatgtcat 180

ctgagctact tttccaagat ttcaacaaca tatttgacct gcttggaatg ggaatgaatt 240

agtttaaagc actggagaca aaaagaagac agacaaaagg agtaaacatt gatgtgtcca 300

actgaagtca tgatttgact ggaaaagaac agaaatagat gagatacatg cagatgatga 360

taagtactct tgatgacgtg tacttataca tacaatacaa ttgaattgct tgactgtgag 420

gaagtgagct tctctaatct ctctctcatt atgcattatg ttattgattt gacttggctt 480

ctgtttgagg aaatgtttcg tttttctttg gatttctgta aagttctgaa gcgtttctgc 540

tttaatcggt cccacacgcg accattcagt cctttccagc tgcctttgtt cagagagcgg 600

gaggctcttc atttccgccg agtctgacac actgagatgg tggagaagtc ggatgatgtc 660

ctgagccgct ctctctggag gaggctgcgg acagacgctg ctgataaggt gttccttctg 720

catgagagcc cgtggtggag cgagcgtcta gcaaaggtca aggccgccct cgtcccgctc 780

cgactcgtgt aaaaagtgtg aactctgggg gtttttgctc ggctgcagac tggagtctga 840

tactgatgac aggccttatc tgtagataca gcaaaggaca tcatctgtgg ctgcgcttgt 900

gcacagtctc ttcattatgt gaagccaaga gatcggtgtc tgcctgagaa gaatgtggc 959

<210> 2

<211> 656

<212> DNA

<213> 弓背青鳉(Oryzias curvinotus)

<400> 2

atggtaacgc agcctttcct gttaagctgc acgaatgaac gcttcttcta aaagcgggaa 60

agctgctgca ggttggaaac cgacatgaaa gctgctggag aaccactgac tttaatgctt 120

cattatgtga agaaaaccaa agtttgttca gaagaaatga tgaggaataa aaatgtaatc 180

tatactactt ttccaagatg cttggagtgg gaataaatta gttttaagca ctacagacaa 240

aagacaaaag gggtaaacat tgatgtgtca aacttaagtc atgatttgat tggaaaagaa 300

cagaaataaa tgagatacat gcagatatgt ccacatgcat aaaatgatgc catgagaagt 360

agtcttgatg ataaatagat atatgtgtac ttatacatac agtacacaac acaaggactc 420

cagtaaatgg gaactttgtc aaaaagagtt gaattgcttg aatgtgagga agtaaactct 480

atctaaactt ctagaatctc ccgccgtcgt gccgctctga ctggtgtaaa ggtgtgaact 540

catctgcaga tacagcaaag gatatatgtg tatatatata tatgtggcgg cgcttgtgca 600

caatgtcttc attatgtgaa acaaagaaat cggtgtttgc ctgagaagaa tgtggc 656

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 弓背青鳉(Oryzias curvinotus)

<400> 3

atggtaacgc agcctttcc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 弓背青鳉(Oryzias curvinotus)

<400> 4

gccacattct tctcaggca 19

Claims (9)

1.一种弓背青鳉遗传性别鉴定的特异分子标记，其特征在于，所述分子标记为两条在弓背青鳉常染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，所述常染色体上DNA片段序列如SEQID NO：1所示，Y染色体上DNA片段序列如SEQ ID NO：2所示。

2.检测权利要求1所述特异性分子标记的引物在鉴定弓背青鳉遗传性别中的应用。

3.检测权利要求1所述特异性分子标记的引物在制备鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒中的应用。

4.一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的引物，其特征在于，上游引物的序列如SEQ IDNO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示。

5.权利要求4所述引物在制备鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒中的应用。

6.一种快速鉴定弓背青鳉遗传性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以权利要求4所述引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳，若电泳检测结果为单一条带，则待测样本为雌性；若电泳检测结果为两条带，则待测样本为雄性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为2× PCR mixBuffer 25μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，ddH₂O20μL，共50μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序：95℃ 10min；95℃ 30s、60℃30s、72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min。

9.一种鉴定弓背青鳉遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求4所述引物。

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