CN105331724B - 一种半滑舌鳎性染色体连锁的dna片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段及其应用，其中Z染色体上DNA片段的序列为SEQ ID NO:1；W染色体上DNA片段的序列为SEQ ID NO:2。上述的DNA片段用于设计鉴定半滑舌鳎遗传性别的分子标记。本发明从半滑舌鳎全基因组信息中筛选到两条Z、W染色体同源差异DNA片段，设计引物进行半滑舌鳎遗传性别鉴定，可以快速、准确、有效的区分半滑舌鳎遗传性别。本发明的方法在雌、雄个体中都可扩增出特异目的条带并可以用琼脂糖电泳分辨，缩短了准确鉴定半滑舌鳎遗传性别的时间，适用于养殖场简易环境内半滑舌鳎遗传性别的鉴定，节约了检测时间和成本。

Description

一种半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段及其应用

技术领域

本发明属于水产生物技术中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段及其在快速鉴定半滑舌鳎遗传性别中的应用。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)俗称“鳎米”、“鳎目”，属于鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是一种近海温水大型底栖鱼类，在我国从渤海到南海都有分布，其中以渤海最多，黄海次之(柳学周等2005；孟庆闻等1995)。半滑舌鳎肉质细嫩鲜美、营养价值高，日渐为人们所喜；且营养级低、食性温和，活动范围小、便于工厂化养殖和管理，具有广阔的养殖前景，近年来已成为我国北方沿海地区一种优良的增养殖对象(柳学周等2005)。

半滑舌鳎具有20对常染色体和一对性染色体(Z和W染色体)，其性别决定机制为ZW型，遗传雌鱼为异型染色体ZW，遗传雄鱼为同型染色体ZZ(周丽青等，2005)。在自然条件下，雄性半滑舌鳎产生Z型精子，雌性半滑舌鳎产生Z、W型两种卵子，受精后得到正常的ZZ雄性和ZW雌性后代。在养殖过程中，半滑舌鳎雌性个体生长速度明显大于雄性，研究发现在21月龄时雌性个体重量可以达到雄性个体的3.29倍(陈松林等2013)。在自然养殖条件下有些遗传雌性半滑舌鳎表现为生理雄性，称为伪雄鱼，研究表明伪雄鱼的后代中伪雄鱼个体比例更高(Shao et al.,2014；季相山等2010)。养殖群体中高比例的生理雄性(正常雄鱼和伪雄鱼)会降低半滑舌鳎产量，因此，在半滑舌鳎亲鱼的选育过程中需要剔除伪雄鱼。开发半滑舌鳎性别特异分子标记，建立快速鉴定遗传性别的方法，是进行半滑舌鳎性别控制和提高养殖群体中雌性比例的有效途径，对实现半滑舌鳎养殖业的可持续发展有重要意义。

在半滑舌鳎性别特异分子标记的开发和遗传性别鉴定方面，黄海水产研究所已经先后筛选到半滑舌鳎雌性特异的AFLP标记(Chen et al.，2007)和性别特异的微卫星标记(Chen et al.,2012)。但是在实际应用中，这两种标记都有自身的不足。AFLP标记由于其显性的遗传特性，在实际鉴定中有可能会出现假阴性，从而对ZZ雄性和ZW雌性产生误判。共显性的微卫星性别特异标记虽然可以准确鉴定ZZ雄性和ZW雌性个体，但由于其两条DNA片段条带之间仅有12bp的差异，无法用琼脂糖凝胶电泳分辨，只能通过分辨力更高的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳的方法进行鉴别，而PAGE胶电泳的操作难度大、操作时间长、对实验设备和试剂等要求高，增加了遗传性别鉴定的时间、提高了成本，难以在半滑舌鳎养殖场进行现场检测。因此，半滑舌鳎性别控制研究和高雌性苗种生产还需要一种能采用琼脂糖凝胶电泳方法准确分辨、且可以在养殖场现场应用的遗传性别快速鉴定的分子技术。

发明内容

本发明提供了一种半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段及其应用，即一种半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段并应用到半滑舌鳎遗传性别鉴定以及伪雄鱼筛选中。

本发明首先通过生物信息学方法分析半滑舌鳎全基因组序列，提供了两条半滑舌鳎Z、W染色体同源差异DNA片段，其中Z染色体上DNA片段长366bp，命名为SEQchrZ，其序列为：

GTCACAGTTCCAACCAGGACAAGAGACTTTTCTCTTTTTTCAAAAAGAACTGAGCGTTGTCGGACTGACACCAGACGGAGATGACAGAAGGAGACAGAGACAGTTGTGGAGGATCAGGCGGGAGAAACAACGTAGCACTTGGGGGATGCCCCATACAGCCAGCCAAAAACAGGGCAGTGACACAGTAAGGTTGAGGTTTGGCAGGGGGGTGTCATTTTGCACTTTATCTGTTCCATTGCTTTTCTTCTGACTCACTGCTGAGTTGTCGTCTGTACAGACACTGACAAATTTCCTCAGAGGCTTTGGCTCTACTCCCCTCCCCATCCCTATATAGACAGATACCAGACTTAGTAGAACAACAACAGG(SEQ IDNO:1)；

W染色体上DNA片段长度为253bp，命名为SEQchrW，其序列为：

GTCACAGTTCCAACCAGGACAAGAGGCTTTTCTCTTTTTTCAAAAAGAACTGAGCGTCGTTGGACTGACACCAGACAGAGGTGACAAGGAGACAGAAACAGGTGTGGAGGATCAGGCGGGAGAGACAACATTGCACAGTACAGTACTGTATTGCACCTGTACAGACACTGACAAATTCCCTCAGAGGCTTTGGCTCAACTCCCCTCCCCATCCCTCTATAGACAGATACCAGACTTAGTAGAACAACAACAGG(SEQ ID NO:2)；

上述的DNA片段用于设计鉴定半滑舌鳎遗传性别的分子标记；

本发明还基于这两条DNA片段序列设计了一对性染色体连锁的DNA片段引物，可以通过普通浓度(1.5％)的琼脂糖凝胶电泳清晰分Z、W染色体特异DNA片段，准确鉴定半滑舌鳎遗传性别，上、下游引物序列分别为:

SEQ ZW:1：5′-GTCACAGTTCCAACCAGGACAAGAG-3′(SEQ ID NO:3)；

SEQ ZW:2:5′-CCTGTTGTTGTTCTACTAAGTCTG-3′(SEQ ID NO:4)；

使用上述的引物来鉴定半滑舌鳎遗传性别，主要包括以下步骤：

半滑舌鳎基因组DNA的提取、Z、W同源差异DNA片段PCR扩增、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测步骤；其中在遗传雄性个体中扩增出366bp的单一DNA片段；在遗传雌性个体中扩增出366bp和253bp的两种DNA片段。

本发明从半滑舌鳎全基因组信息中筛选到两条Z、W染色体同源差异DNA片段，设计引物进行半滑舌鳎遗传性别鉴定，可以快速、准确、有效的区分半滑舌鳎遗传性别。该方法在雌、雄个体中都可扩增出特异目的条带并可以用琼脂糖电泳分辨，缩短了准确鉴定半滑舌鳎遗传性别的时间，适用于养殖场简易环境内半滑舌鳎遗传性别的鉴定，节约了检测时间和成本。本发明所示检测半滑舌鳎遗传性别的方法，可用于对伪雄鱼的鉴定和筛选，对提高养殖群体雌性比例，推动半滑舌鳎养殖业持续健康发展具有重要意义。

附图说明

图1：本发明Z、W染色体DNA片段序列比对图，引物位置用下划线表示；空格：Z、W染色体DNA片段差异序列；*：Z、W染色体DNA片段一致序列；-：缺失序列

图2：本发明遗传雌、雄半滑舌鳎PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图，♀：遗传雌鱼；♂：遗传雄鱼；M：DL 2000DNA Maker；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1半滑舌鳎性染色体连锁DNA片段的筛选

本发明所用的性染色体连锁的DNA片段序列来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所水产基因组与细胞工程研究室完成的半滑舌鳎全基因组测序结果，生物信息学分析半滑舌鳎基因组序列筛选出两条Z、W染色体同源差异DNA片段。设计多对引物，筛选出了结果稳定的一对引物(SEQ ZW:1、SEQ ZW:2)。

选择已知遗传性别的雌、雄半滑舌鳎DNA，使用引物SEQ ZW:1、SEQ ZW:2进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系包括35.5μL ddH2O；5.0μL10×Buffer；4.0μL dNTP(2.5mmol/L)；1.0μL SEQ ZW:1(10μmol/L)；1.0μL SEQ ZW:2(10μmol/L)；0.5μL rTaq酶(5U/μL)；3.0μL模板DNA(上清)，混匀后离心。PCR扩增程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳可看出雌、雄个体存在差异。将雌、雄差异片段回收连接pMD 18-T载体，转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至北京华大测序。测序结果验证了Z、W染色体上的同源差异DNA片段的序列，Z、W染色体上的两条DNA序列相差103bp，如图1所示。

实施例2：半滑舌鳎性染色体连锁DNA片段的应用

1.实验室条件下半滑舌鳎遗传性别鉴定

使用半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段引物SEQ ZW:1、SEQ ZW:2通过PCR方法检测半滑舌鳎遗传性别。PCR反应体系15μL，其中10×buffer 1.5μL、dNTP 0.8μL、上下游引物各0.3μL、模板DNA 1μL(50ng/μL)、ddH2O 11.0μL，rTaq酶0.1μL。PCR扩增程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s35个循环；72℃10min，4℃保存。加入10×Loading Buffer 2.0μL，1.5％琼脂糖凝胶电泳，150V，20分钟，凝胶成像可分辨遗传性别。ZW雌性含有366bp和253bp两种DNA条带，ZZ雄性仅有366bp的一种DNA条带，如图2所示。

2.养殖场条件下半滑舌鳎遗传性别鉴定和伪雄鱼筛选

为获得半滑舌鳎高雌性比例养殖群体，在亲鱼培育和苗种繁育过程中，剔除雄鱼中ZW型伪雄亲鱼、筛选出ZZ型优质雄性亲鱼，对于提高半滑舌鳎苗种中的生理雌鱼比例至关重要。而在伪雄鱼筛选过程中，要求快速、准确、一一对应，以保证在鉴定出优质雄鱼的同时，尽可能减少对亲鱼的损伤。这就要求亲鱼的遗传性别鉴定工作必须在半滑舌鳎养殖场现场进行。

2.1现场鉴定的准备

准备实验仪器PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽、水浴锅、稳压器、微波炉、凝胶成像仪以及实验所需各种试剂、工具、耗材。在养殖场布置好实验室。

2.2待检测亲鱼鳍条的采集

提前准备好编号的标签和离心管，且二者编号一一对应。在亲鱼养殖车间，逐条现场采集30-50mg待检测亲鱼的鳍条于编号离心管中；将对应亲鱼放入圆柱形塑料袋中，加入海水和和氧气，二者比例为1:2，密封后贴上与离心管对应的标签，置于避光阴凉处暂时保存。

2.3碱法煮沸快速提取基因组DNA

在每个装有鳍条的离心管中加入400μL 50mmol/L NaOH溶液煮沸10min；加入40μL1mol/L Tris-HCl混匀后12000rpm离心10min，以上清液作为模板进行PCR反应。

2.4待测亲鱼DNA的PCR扩增和检测

采用半滑舌鳎性染色体连锁的DNA片段引物SEQ ZW:1、SEQ ZW:2对提取的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系15μL，其中10×buffer 1.5μL、dNTP 0.8μL、上下游引物各0.3μL、模板DNA 2.0μL、ddH2O 10.0μL，rTaq酶0.1μL。PCR扩增程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃保存。加入10×Loading Buffer 2μL，1.5％琼脂糖电泳，150V，20分钟，在凝胶成像仪下观察亲鱼遗传性别。记录个体编号对应PCR产物，电泳结果为两条DNA条带的个体为ZW型伪雄鱼，应予淘汰；电泳结果为一条DNA条带的个体为ZZ型优质雄性亲鱼，可用于半滑舌鳎高雌比例育种。

根据所得鉴定结果，将车间里暂时保存的亲鱼分类，并放回相对应的养殖池中。整个过程耗时约4小时，可保证检测亲鱼的存活和正常繁殖。

Claims (5)

1.一种半滑舌鳎Z、W染色体同源差异DNA片段，特征在于，所述的差异DNA片段，其中Z染色体上DNA片段的序列为SEQ ID NO:1；W染色体上DNA片段的序列为SEQ ID NO:2。

2.一种用于检测半滑舌鳎遗传性别的引物，其特征在于，所述的引物的上、下游引物的序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。

3.权利要求2所述的引物在鉴定半滑舌鳎的遗传性别中的应用。

4.一种鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

半滑舌鳎基因组DNA的提取、PCR扩增Z、W同源差异DNA片段、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测步骤；其中PCR扩增是采用权利要求2所述的引物进行的。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增Z、W同源差异DNA片段，其中在遗传雄性个体中扩增出366bp的单一DNA片段；在遗传雌性个体中扩增出366bp和253bp的两个DNA片段。