CN105349691B - 一种鉴定中国明对虾遗传性别的dna序列标签及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中国明对虾性别差异的DNA序列标签及其应用。通过高通量测序手段，分别对雌性个体和雄性个体DNA的混池进行高通量测序，测序结果经过生物信息学分析筛选出在雌雄混池中有显著差异的DNA序列片段，获得的差异片段在不同来源的雌雄个体中进行验证，最终获得一条可以用于鉴定中国明对虾雌雄性别的DNA序列标签，利用该DNA序列标签可以实现该种对虾遗传性别的准确鉴定。本发明方法具有高效、准确、可靠的特点，在对虾性别鉴定、性别决定和分化机制及性别控制研究中具有广阔的应用前景。

Description

一种鉴定中国明对虾遗传性别的DNA序列标签及其应用
技术领域
本发明涉及水产生物技术中的对虾性别鉴定和性别控制技术，具体地说，一种鉴定中国明对虾遗传性别的DNA序列标签及其应用。
背景技术
中国明对虾是我国重要的养殖虾类，由于其个体较大，营养价值高，具有重要的经济价值。中国明对虾与其他对虾种类一样，雌雄个体的大小存在明显差异，雌性个体在生长的中后期生长速度远高于雄性个体，因此实现中国明对虾的单性控制，培育单性群体，对于提高对虾养殖产量、增加经济效益具有重要意义。
要培育中国明对虾的单性群体，首先需要实现对虾遗传性别的鉴定。虽然在对虾生长到一定阶段时可以通过表型的外部性征实现雌雄虾的性别鉴定，但是在科学研究和实际生产中，如果能够在发育早期实现性别的鉴定，可以有针对性地对某一性别的个体开展实验和养殖，加快科学研究和实际生产的效率。
在对虾性别标记的研究中，已经有较多进行性别标记筛选的报道，Staelens etal.(2008)构建了斑节对虾的高密度遗传连锁图谱，并从遗传图谱上发现了两个性别差异的标记，该标记在其他遗传来源的斑节对虾群体中也证实了其可以作为一种进行性别鉴定的标记，并且该团队也申请了相关专利一项(虾和对虾的性别特异性标记，中国发明专利，申请号：200780015173.9)；Zhang et al.(2006)通过QTL定位方法筛选到了一个凡纳滨对虾性别特异性的微卫星位点，后来证实该微卫星位点是家系特异性的，在其他来源的个体中并不适用；同样，Alcivar-Warren et al.(2007)的研究也发现了凡纳滨对虾性别特异性的微卫星标记，但是也是仅限于所研究的群体。然而，由于对虾不同物种的差异性，其它物种的分子标记并不能用于中国明对虾的性别鉴定。在中国明对虾的研究中，虽然构建了较多的连锁图谱，但是未筛选到相应的性别鉴定标记(Li et al.2006；Sun et al.2008；Liuet al.2010)。Li et al.(2013)通过基因差异表达分析的方法筛选到了一个中国明对虾雌雄差异表达的基因，并将该标记开发成了一种可以用作雌雄幼体性别鉴定的标记(中国发明专利，公开号：101709332A)，然而此标记是在转录组水平上发展的标记，受虾的生长发育时期的影响较大，不能用于对虾在幼虾阶段之前的性别区分。目前用于中国明对虾性别鉴定的DNA标记还没有报道。
参考文献
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本发明的目的是提供一种用于中国明对虾遗传性别鉴定的DNA序列标签及应用方法，该方法不受对虾发育时期、个体大小等因素的限制，即使在幼体时期甚至胚胎时期，只要能提取到一定量的DNA，就可实现性别的准确鉴定。
发明内容
本发明的目的提供一种用于中国明对虾遗传性别鉴定的DNA序列及应用方法，为对虾性别控制、全雌苗种培育和性别决定和分化基因的筛选提供一种重要的技术手段。
为实现以上目的，本发明采用的方案为：
首先提取不同来源(包括野生、选育)的中国明对虾雌性个体20尾和雄性个体20尾的基因组DNA，将来源于雌性个体的等量DNA制作1个混池，来源于雄性个体的等量DNA制作1个混池，分别进行简化基因组建库和高通量测序，雌雄混池的DNA测序三次，雄性混池的DNA测序两次，测序量最大的混池样本进行数据拼接后获得200bp以上的拼接序列作为参考序列，雌雄样本DNA的测序数据(clean reads)分别通过BWA软件与拼接序列进行比对，采用GATK2软件的UnifiedGenotyper模块进行多个样本SNP检测和基因分型，对获得的部分含有差异SNP位点的DNA序列在其他来源的个体中进行验证、筛选，最终获得一条鉴别中国明对虾遗传性别的DNA序列标签。
所述的对虾基因组DNA提取方法采用天根植物基因组提取试剂盒中的说明书进行。
上述个体的DNA使用Nanodrop1000(美国)进行浓度测量，测量后每个个体的DNA稀释到100ng/μl。
所述的高通量测序方法使用Illumina Hiseq2000测序平台，文库构建和高通量测序方法按照标准流程进行。
运用生物信息学对测序的雌性和雄性个体DNA混池的测序数据进行差异SNP分析，获取在雌雄混池中含有差异SNP位点的DNA序列。
对获得的雌雄差异DNA序列进行测序深度分析，选取其中20条DNA序列，使用Primer 3Plus在线设计软件(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物进行DNA扩增。
选择不同来源的中国明对虾雌虾20尾，雄虾20尾，使用设计的PCR引物扩增上述20个序列，每个个体的扩增序列通过测序分析雌雄序列的差异，最终获得一条在雌雄个体中有显著差异的DNA序列,在雌性个体中序列为seqFcF，雄性个体中序列为seqFcM，两个序列的第209bp和第385bp的两个位置的碱基序列，雌性个体中分别为CT杂合和TA杂合，雄性个体中分别为T纯合和A纯合。(杂合位点的表示方法为：Y＝C/T；W＝T/A)
扩增该段序列的引物为
FcSDF：TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCAT
FcSDR：CCCTGCATCAGGCCCCATAAAGTC
使用上述引物在另外来源的中国明对虾雌雄各20尾进行验证，通过Sanger测序法对扩增的序列进行测序，证实了该序列的确为雌雄差异序列，其中在雌性个体中该序列为seqFcF：
(1)序列特征：
基因组序列：
TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCATGGCTGAATTTGGCTCAAAACCACGGCAGCTGAATGTGAGTTATGTGATGAGGATTTGATTGTCCAATTACCTTTTGATTAATATCTGAATTTCAAAGGCTCATGGTGTAAATTTAGGTAATTTTTAAAATAAAGGATTCCTGAAGAAAACTTTAAATAAAGAATTCTCTGAAAAACTTTCAACT[C/T]GTGATTAAACGCAAGATCACTTATGTAGAGGAGAATAATGTTAATTGATTAGGCCCTTGGGATATCAAAACTTACGATTTATTGATTTTTTAAATGTATTGTTAGCTTTACATTAGATTAACAAGTATGTTTTAAGAAAGTTAGTGTTGATATATTTTTTATTCATATGATCCAT[T/A]ACTTTTATTACATATTTTCTCAATATACCATCAAATGATAAAGGTATGTACTGCTGAAGAAGAGGACGAAGATTTTGGTGACTTTATGGGGCCTGATGCAGGG
碱基对：488bp；
类型：核苷酸；
链型：双链；
拓扑结构：线性
(2)分子类型：DNA
(3)假设：否
(4)反义：否
(5)最初来源：简化基因组测序
在雄性个体中该序列为seqFcM：
(1)序列特征：
基因组序列：
TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCATGGCTGAATTTGGCTCAAAACCACGGCAGCTGAATGTGAGTTATGTGATGAGGATTTGATTGTCCAATTACCTTTTGATTAATATCTGAATTTCAAAGGCTCATGGTGTAAATTTAGGTAATTTTTAAAATAAAGGATTCCTGAAGAAAACTTTAAATAAAGAATTCTCTGAAAAACTTTCAACTTGTGATTAAACGCAAGATCACTTATGTAGAGGAGAATAATGTTAATTGATTAGGCCCTTGGGATATCAAAACTTACGATTTATTGATTTTTTAAATGTATTGTTAGCTTTACATTAGATTAACAAGTATGTTTTAAGAAAGTTAGTGTTGATATATTTTTTATTCATATGATCCATAACTTTTATTACATATTTTCTCAATATACCATCAAATGATAAAGGTATGTACTGCTGAAGAAGAGGACGAAGATTTTGGTGACTTTATGGGGCCTGATGCAGGG
碱基对：488bp；
类型：核苷酸；
链型：双链；
拓扑结构：线性
(2)分子类型：DNA
(3)假设：否
(4)反义：否
(5)最初来源：简化基因组测序
根据测序获得序列信息可以鉴定对虾的遗传性别。
本发明方法具有高效、准确、可靠的特点，在对虾性别鉴定、性别决定和分化机制及性别控制研究中具有广阔的应用前景。
本发明的优点
1.本方法筛选获得了中国明对虾用于遗传性别鉴定的DNA序列，可以实现中国明对虾遗传性别的鉴定，该方法不受个体发育时期、环境的影响，是一种能准确进行遗传性别鉴定的方法。
2.通过运用测序方法进行对虾性别的鉴定，具有很高的准确性。
3.本方法仅需要很少的组织即可实现性别的分子鉴定，即使对于冷冻处理、酒精浸泡的组织也可以实现。
具体实施方式
实施例：一种中国明对虾遗传性别的分子鉴定方法
2014年10月，从青岛南山水产品市场随机挑选中国明对虾40尾，运至中国科学院海洋研究所水族楼暂养，之后取出肌肉组织-80度冰箱冻存。
1.使用天根生化科技(北京)有限公司(简称天根)的植物基因组DNA提取试剂盒分别提取上述样品的DNA并标记，操作方法参考设计和说明书。提取的DNA使用Nanodrop1000(Thermo，美国)测定DNA浓度。
2.采用如下扩增引物对提取的DNA进行PCR扩增，
FcSDF：TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCAT
FcSDR：CCCTGCATCAGGCCCCATAAAGTC
扩增体系如下：
PCR反应程序为：94℃预变性4min,(94℃30s,55℃30s,72℃30s)共计35个循环,72℃延伸10min。
3.上述PCR产物经琼脂糖电泳后使用天根的胶回收试剂盒进行产物回收，使用FcSDF引物在ABI PRISMTM 3700Genetic Analyzer测序仪上进行测序。
4.使用Bioedit软件读取测序结果的峰图文件，与雌雄对虾中已知seqFcF和seqFcM序列进行比对分析：
seqFcF：
TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCATGGCTGAATTTGGCTCAAAACCACGGCAGCTGAATGTGAGTTATGTGATGAGGATTTGATTGTCCAATTACCTTTTGATTAATATCTGAATTTCAAAGGCTCATGGTGTAAATTTAGGTAATTTTTAAAATAAAGGATTCCTGAAGAAAACTTTAAATAAAGAATTCTCTGAAAAACTTTCAACT[C/T]GTGATTAAACGCAAGATCACTTATGTAGAGGAGAATAATGTTAATTGATTAGGCCCTTGGGATATCAAAACTTACGATTTATTGATTTTTTAAATGTATTGTTAGCTTTACATTAGATTAACAAGTATGTTTTAAGAAAGTTAGTGTTGATATATTTTTTATTCATATGATCCAT[T/A]ACTTTTATTACATATTTTCTCAATATACCATCAAATGATAAAGGTATGTACTGCTGAAGAAGAGGACGAAGATTTTGGTGACTTTATGGGGCCTGATGCAGGG
seqFcM：
TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCATGGCTGAATTTGGCTCAAAACCACGGCAGCTGAATGTGAGTTATGTGATGAGGATTTGATTGTCCAATTACCTTTTGATTAATATCTGAATTTCAAAGGCTCATGGTGTAAATTTAGGTAATTTTTAAAATAAAGGATTCCTGAAGAAAACTTTAAATAAAGAATTCTCTGAAAAACTTTCAACTTGTGATTAAACGCAAGATCACTTATGTAGAGGAGAATAATGTTAATTGATTAGGCCCTTGGGATATCAAAACTTACGATTTATTGATTTTTTAAATGTATTGTTAGCTTTACATTAGATTAACAAGTATGTTTTAAGAAAGTTAGTGTTGATATATTTTTTATTCATATGATCCATAACTTTTATTACATATTTTCTCAATATACCATCAAATGATAAAGGTATGTACTGCTGAAGAAGAGGACGAAGATTTTGGTGACTTTATGGGGCCTGATGCAGGG
如果测序获得的序列在第209bp和385bp处分别为CT杂合和TA杂合，则判定对应的个体为雌性；如果该两处位置分别为T纯合和A纯合，则判定对应的个体为雄性。结果表明，其中20个为雌性个体，20个为雄性个体。

Claims (5)

1.一种鉴定中国明对虾遗传性别的DNA序列标签，其特征在于：中国明对虾雌性个体基因组DNA中的序列为特征性的seqFcF序列，序列为序列表SEQ ID NO：1中核苷酸序列；中国明对虾雄性个体基因组DNA中序列为特征性的seqFcM序列，序列为序列表SEQ ID NO：2中核苷酸序列。
2.按照权利要求1所述的DNA序列标签，其特征在于：所述的雌性个体DNA中的seqFcF序列为：
seqFcF：
TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCATGGCTGAATTTGGCTCAAAACCACGGCAGCTGAATGTGAGTTATGTGATGAGGATTTGATTGTCCAATTACCTTTTGATTAATATCTGAATTTCAAAGGCTCATGGTGTAAATTTAGGTAATTTTTAAAATAAAGGATTCCTGAAGAAAACTTTAAATAAAGAATTCTCTGAAAAACTTTCAACT[C/T]GTGATTAAACGCAAGATCACTTATGTAGAGGAGAATAATGTTAATTGATTAGGCCCTTGGGATATCAAAACTTACGATTTATTGATTTTTTAAATGTATTGTTAGCTTTACATTAGATTAACAAGTATGTTTTAAGAAAGTTAGTGTTGATATATTTTTTATTCATATGATCCAT[T/A]ACTTTTATTACATATTTTCTCAATATACCATCAAATGATAAAGGTATGTACTGCTGAAGAAGAGGACGAAGATTTTGGTGACTTTATGGGGCCTGATGCAGGG；
在雌性个体DNA中第209bp位点均为C与T杂合，在雌性个体DNA中第385bp位点为T与A杂合。
3.按照权利要求1所述的DNA序列标签，其特征在于：所述的雄性个体DNA中的seqFcM序列为：
seqFcM：
TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCATGGCTGAATTTGGCTCAAAACCACGGCAGCTGAATGTGAGTTATGTGATGAGGATTTGATTGTCCAATTACCTTTTGATTAATATCTGAATTTCAAAGGCTCATGGTGTAAATTTAGGTAATTTTTAAAATAAAGGATTCCTGAAGAAAACTTTAAATAAAGAATTCTCTGAAAAACTTTCAACTTGTGATTAAACGCAAGATCACTTATGTAGAGGAGAATAATGTTAATTGATTAGGCCCTTGGGATATCAAAACTTACGATTTATTGATTTTTTAAATGTATTGTTAGCTTTACATTAGATTAACAAGTATGTTTTAAGAAAGTTAGTGTTGATATATTTTTTATTCATATGATCCATAACTTTTATTACATATTTTCTCAATATACCATCAAATGATAAAGGTATGTACTGCTGAAGAAGAGGACGAAGATTTTGGTGACTTTATGGGGCCTGATGCAGGG。
4.一种权利要求1-3任一所述的DNA序列标签序列标签的应用，其特征在于：所述序列标签可用于中国明对虾遗传性别鉴定；
雌性个体的DNA序列seqFcF和雄性个体的DNA序列seqFcM的性别差异位点为第209bp和第385bp的两个碱基位点，在雌性个体DNA中第209bp位点均为CT杂合，在雄性个体DNA中第209bp位点为T纯合；在雌性个体DNA中第385bp位点为TA杂合，在雄性个体DNA中第385bp位点为A纯合。
5.按照权利要求4所述的DNA序列标签序列标签的应用，其特征在于：进行中国明对虾遗传性别鉴定的过程为，对虾个体提取DNA后，使用FcSDF：TTCTGCCTCCAGAGGGAAAGCCAT，FcSDR：CCCTGCATCAGGCCCCATAAAGTC扩增上述seqFcF或seqFcM序列，获得的序列进行Sanger测序，测序峰图文件使用Bioedit软件读取上述序列第209bp和第385bp的两个位置的碱基序列，如果第209bp和第385bp位置分别为CT杂合和TA杂合，则鉴定的个体为雌性，如果第209bp和第385bp位置分别为T纯合和A纯合，则鉴定个体为雄性。
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