CN105483227B - 一种华鲮dna条形码标准检测基因及其应用 - Google Patents

一种华鲮dna条形码标准检测基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种华鲮DNA条形码标准检测基因及其应用，该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。本发明的华鲮DNA条形码物种鉴定方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了华鲮。与传统的形态学鉴定方法相比，该方法获得的标准基因序列有利于实现华鲮的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。

Description

一种华鲮DNA条形码标准检测基因及其应用
技术领域
本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种华鲮DNA条形码标准检测基因及其应用。
背景技术
华鲮，学名：(Sinilabeo rendahli)为辐鳍鱼纲鲤形目，鲤科，野鲮亚科，华鲮属。俗称：青龙棒，桃花棒，野鲮鱼，青衣子，是中国的特有物种。体长，略呈棒状，尾柄高而宽厚。吻钝圆而突出，口下位，横裂。上唇前部光滑，为游离的吻皮所遮盖，两侧则有细小的乳突；下唇游离部分的内缘有许多小乳状突，下唇与下颌分离，其间有一深沟相隔，上颌为上唇所包。有1对短颌须，吻须常退化。侧线鳞45-47个。体背及体侧青黑色，鳞片紫绿色夹有红色，并具金属光泽；腹部微黄，鳍灰黑色。华鲮分布于长江上游干流及各大支流中，栖息于水流较急的河流及山涧溪流中，尤以川东盆地水流湍急、水质清澈的山涧溪流为多，为底栖性鱼类，喜集群生活。常出没于岩石间隙中，在石砾底的基质上觅食，利用下颌锐利的角质边缘刮取着生藻类，也食高等植物的枝叶、碎屑等。入冬以后，华鲮则数十尾甚至上百尾集群在深水洞穴越冬，很少外出活动。2龄即可性成熟。亲鱼于4-6月集群进入支流产卵，产卵场为石砾底质的急流浅滩滩尾。华鲮生长较缓慢，一般个体为1-2公斤，最大个体可达5公斤，在产地产量较高，是四川省常见食用鱼类。其肉质坚实脆嫩、十分鲜美、富含油脂，与青鱼相似，被视为珍贵食品。华鲮及其相近种，除去内脏和鳞的肌肉称之为“竹鱼”。其鲜鱼肉入药，具有益气和中、除湿的功效，主治久病体虚、腰腿疼痛等症。
DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase I,COI)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对华鲮进行快速、有效的鉴定。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。自从2003年，加拿大科学家Hebert提出以COI基因做为DNA条形码以来，越来越多的研究表明DNA条形码在物种分类上具有高效可行性。大量的研究结果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。
该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决形态学鉴定中因标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且鉴定时间也极大缩短。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有华鲮的相关基因序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定华鲮的DNA条形码标准检测基因。
本发明的另一目的在于提供上述用于鉴定华鲮的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种华鲮DNA条形码物种鉴定方法，该方法有利于实现华鲮的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于鉴定华鲮的DNA条形码标准检测基因，该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，该核苷酸序列的全长为652bp。华鲮标准序列SEQ IDNO.1为：
TTATCTCGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGAGCTGAGCTAAGCCAACCCGGATCGCTCCTAGGCGACGACCAAATTTACAATGTTATTGTTACCGCTCACGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTCATCGGAGGGTTTGGAAACTGACTAGTACCCCTAATAATTGGGGCCCCAGACATGGCATTCCCACGAATAAACAATATAAGCTTCTGACTCCTACCCCCCTCATTTCTATTACTACTTGCCTCTTCTGGTGTTGAAGCCGGAGCCGGGACAGGATGAACAGTATATCCACCTCTCGCAGGCAATTTAGCCCATGCAGGAGCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCATTACATCTGGCAGGTGTCTCATCAATTTTAGGGGCTATCAACTTCATTACTACAACCATTAATATGAAACCCCCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTGTTCGTCTGATCTGTACTTGTAACTGCCGTACTACTTCTTCTATCATTACCCGTTTTAGCCGCTGGAATTACAATACTTCTAACAGATCGAAACCTAAACACCACATTCTTTGATCCGGCAGGAGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAACATCTGTTC。
上述的用于鉴定华鲮的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。
一种华鲮DNA条形码物种鉴定方法，包括以下步骤：
1)从待测组织中分离提取总DNA；
2)以步骤1)分离提取的DNA为模板用两对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)的扩增产物进行电泳分析，如果能特异性扩增出目的条带，则进行测序；
4)如果目的条带的测序结果与SEQ ID NO.1的基因序列同源性在98％以上时，即可判定该待测组织为华鲮。
步骤2)中所述的两对引物的序列为：
FishF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQ IDNO.2)
VF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)
FishR2_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQ IDNO.4)
FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQ IDNO.5)
所述的目的条带为长度为700±15bp的条带。
本发明公开了华鲮的DNA条形码分子鉴定方法和COI序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出华鲮COI基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至测序公司进行测序。与所述DNA条形码标准基因序列SEQIDNO.1的同源性在98％以上，即可判定所述的待测组织即为华鲮。该方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了华鲮。
上述华鲮DNA条形码物种鉴定方法的详细步骤为：1)从待测组织中分离提取总DNA；2)以该DNA为模板用两对通用引物，通过聚合酶链式反应扩增出目的基因；3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的目的基因用琼脂糖电泳进行分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出700±15bp的条带，则送生物公司测序；4)根据测序结果，如果与如SEQ ID NO.1所示的基因序列的同源性在98％以上，即可判定该待测组织为华鲮。
优选的，上述华鲮DNA条形码物种鉴定方法中的PCR反应体系(25ul)为：10×PCRBuffer 2.5μl、dNTP Mixture(2.5mM each)2.0μl、TaKaRa Taq(5U/μl)0.3μl、FishF2_t1引物(10μM)0.5μl、FishR2_t1引物(10μM)0.5μl、VF2_t1引物(10μM)0.5μl、FR1d_t1引物(10μM)0.5μl、DNA模板(约10ng/μl)1μl、ddH2O 17.2μl。
PCR反应程序为：95℃*2min,94℃*30s,55℃*30s,72℃*1min,35个循环,72℃*10min。
本发明的有益效果：
本发明的方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了华鲮。与传统的形态学鉴定方法相比，该方法获得的标准基因序列有利于实现华鲮的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。
附图说明
图1为华鲮DNA条形码分子鉴定技术路线图
图2为扩增产物电泳图谱
具体实施方式
实施例1华鲮标准序列的获得
1.华鲮形态学鉴定及样本采集保存
根据华鲮具有体长，略呈棒状，尾柄高而宽厚。吻钝圆而突出，口下位，横裂。上唇前部光滑，为游离的吻皮所遮盖，两侧则有细小的乳突；下唇游离部分的内缘有许多小乳状突，下唇与下颌分离，其间有一深沟相隔，上颌为上唇所包。有1对短颌须，吻须常退化。背鳍iv-10；胸鳍i-15-17；腹鳍i-8；臀鳍iii-5；背鳍前鳞18-24；围尾柄鳞22-24；侧线鳞45-47个。体背及体侧青黑色，鳞片紫绿色夹有红色，并具金属光泽；腹部微黄，鳍灰黑色等形态学特征以及相关鱼类分类专家的共同鉴定，选出华鲮样本。剪取肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
2.DNA提取
酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于-20℃保存备用。
3.PCR引物合成
本方法选取2对引物的序列如下：
FishF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQ IDNO.2)
VF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)
FishR2_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQ IDNO.4)
FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQ IDNO.5)
4.PCR反应体系(25ul)
5.PCR反应程序
95℃*2min,
72℃*10min
反应结束后，打开PCR仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存。
6.标准序列的获得
取2μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，选取效果较好的PCR产物送至生物公司纯化后测序，测序结果经过去除两端的冗余序列即为华鲮的标准序列(SEQ ID NO.1)。
实施例2
1.待测样本的采集保存与处理
从浸泡标本中剪取部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
2.DNA提取
酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于-20℃保存备用。
3.PCR引物合成
本方法选取2对引物的序列如下：
FishF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQ IDNO.2)
VF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)
FishR2_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQ IDNO.4)
FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQ IDNO.5)
4.PCR反应体系(25ul)
5.PCR反应程序
95℃*2min,
72℃*10min
反应结束后，打开PCR仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存。
6.PCR产物检测
取2μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如下，检出大小约为700±15bp的目的条带，可初步判定待测样本可能是华鲮。
7.基因序列测定
选取效果较好的PCR产物送至生物公司纯化后测序，测序结果显示与如SEQ IDNO.1所示的基因序列的同源性为99％，因而可判定该待测样本即为华鲮，结合华鲮体型、体表、头型和鳍等形态学特征进行复核鉴定提供该样本组织的物种确为华鲮。
送样序列(SEQ ID NO.6)：
CAAAGAATTGGGACCCTTTATCTCGTATTTGGTGCCTGAGCCGGATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTCCTCATTCGAGCTGAGCTAAGCCAACCCGGATCGCTCCTAGGCGACGACCAAATTTACAATGTTATTGTTACCGCTCACGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATCCTCATCGGAGGGTTTGGAAACTGACTAGTACCCTTAATAATTGGGGCCCCAGACATGGCATTCCCACGAATAAACAACATAAGCTTCTGACTCCTACCTCCCTCATTTCTATTACTACTTGCCTCTTCTGGTGTTGAAGCCGGAGCCGGGACAGGATGAACAGTATATCCACCTCTCGCAGGCAATTTAGCCCATGCAGGAGCATCAGTAGACCTAACAATTTTCTCATTACATCTGGCAGGTGTCTCATCAATTTTAGGGGCCATCAACTTCATTACTACAACCATTAATATGAAACCCCCAGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTGTTCGTCTGATCTGTACTTGTAACTGCCGTACTACTTCTTCTATCATTACCCGTTTTAGCCGCTGGAATTACAATACTTCTAACAGATCGAAACCTAAACACCACATTCTTTGATCCGGCAGGAGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAACATCTGTTCTGATTCTTCGGACACCCTGAAGTGTCATACTGGTTTTCCTGGAAA

Claims (4)

1.一种用于鉴定华鲮的DNA条形码标准检测基因，其特征在于：该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的用于鉴定华鲮的DNA条形码标准检测基因在鉴定华鲮中的应用。
3.一种华鲮DNA条形码物种鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从待测组织中分离提取总DNA；
2）以步骤1）分离提取的DNA为模板用两对引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述的两对引物的序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
3）将步骤2）的扩增产物进行电泳分析，如果能特异性扩增出目的条带，则进行测序；
4）如果目的条带的测序结果与SEQ ID NO.1的基因序列同源性在99%以上时，即可判定该待测组织为华鲮。
4.根据权利要求3所述的华鲮DNA条形码物种鉴定方法，其特征在于：所述的目的条带为长度为700±15bp的条带。
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