CN109055401A - 一种寡鳞飘鱼dna条形码序列及其应用 - Google Patents

一种寡鳞飘鱼dna条形码序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寡鳞飘鱼DNA条形码序列及其应用，属于物种鉴定技术领域。所述寡鳞飘鱼DNA条形码序列为SEQ ID NO:1。所述寡鳞飘鱼DNA条形码序列为寡鳞飘鱼COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。该DNA条形码序列可以作为寡鳞飘鱼DNA的标准检测序列，有效的对寡鳞飘鱼物种进行鉴定。

Description

一种寡鳞飘鱼DNA条形码序列及其应用
技术领域
本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种寡鳞飘鱼DNA条形码序 列及其应用。
背景技术
寡鳞飘鱼(Pseudolaubuca engraulis)，隶属鲤科(Cyprinidae) 鲌亚科(Culterinae)飘鱼属(Pseudolaubuca)，分布广泛，在长江中 上游、赤水河及西江等地均有分布。寡鳞飘鱼为杂食性鱼类，食物主要是 水生昆虫、枝角类、桡足类、藻类以及植物种子和嫩叶等。个体小，怀卵 量较大，是许多肉食性鱼类重要的饵料来源。鲌亚科鱼类往往由于形态学 特征的相似，不同种属的鱼类常常会产生混淆，难以区分，因此，有必要 对物种进行有效的鉴定。
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、有足够变异的、标准的、 易扩增并且相对较短的DNA片段，可以快速、准确的进行物种鉴定。线 粒体DNA的COI基因具有长度适中、进化速率适中和富含系统进行发育信 息等特点。在研究中，能够较好地对物种的COI基因片段进行有效扩增。 因此，在动物物种分类和鉴定中，COI基因作为条形码应用有很大的潜力。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的 基础步骤。因此，准确的对物种鉴定和分类就显得尤其重要。目前，各国 研究者已经开展了从湖泊到海洋不同地理区域的鱼类DNA条形码研究计 划，研究表明DNA条形码在物种鉴定方面具有高效可行性。大量的研究结 果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴 定，可以选用COI基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。
在实际操作中，往往会遇到标本量较少以及样本保存不完整等问题， 这样给传统的物种分类和鉴定研究带来了很大的困难。在现有的技术中 心，均没有寡鳞飘鱼DNA条形码序列以及寡鳞飘鱼COI基因作为寡鳞飘鱼 DNA条形码标准检测序列的记载和报道。
采用DNA条形码结合传统的分类学方法，对物种高效准确的鉴定和分 类起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以作为寡鳞飘鱼DNA的标准检测序列，能 够有效的对寡鳞飘鱼物种进行鉴定。
本发明所采用的技术方案是：
一种寡鳞飘鱼DNA条形码序列，所述序列为SEQ ID NO:1。
优选地，所述寡鳞飘鱼DNA条形码序列为寡鳞飘鱼COI(cytochrome c oxidasesubunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。
一种寡鳞飘鱼DNA条形码标准检测序列的应用，该DNA条形码序列可 以作为寡鳞飘鱼DNA的标准检测序列，有效的对寡鳞飘鱼物种进行鉴定。
本发明具有以下优点：
本发明所得到的寡鳞飘鱼DNA条形码序列可以作为寡鳞飘鱼DNA的标 准检测序列，对寡鳞飘鱼物种高效和准确的进行鉴定和分类。在实际工作 中，有时要进行鱼卵和鱼苗的物种鉴定，鱼卵很难通过传统的形态学方法 进行鉴定，另外处于生长发育期的鱼苗形态特征也还不是很显著，无法通 过传统的形态学进行鉴定的时候，这时借助于物种的DNA标准条形码，就 很容易对该物种的鱼卵和鱼苗进行鉴定。有时在物种鉴定的时候，会遇到样本不完整或残缺不全，也给传统的物种分类和鉴定带来困难，这时借助 于物种的DNA标准条形码，可以很快的进行准确的鉴定。有时同一属內甚 至亚科内的不同物种形态相似，有时会出现同一物种，会错误的把它界定 为不同的物种，或者不同的物种，错误的把它界定为同一物种，分类关系 混乱，利用该物种的标准条形码可以方便快捷的对其物种进行准确的鉴 定。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明做进一步说明:
取金沙江水系向家坝库区的5个寡鳞飘鱼样本进行验证。
1.DNA的提取
剪取5mg左右的鱼类肌肉组织，尽可能剪碎，置于1.5ml的离心管中， 室温下放置，待乙醇完全挥发干净后采用GENEray公司的细胞/组织基因 组试剂盒进行基因组DNA的抽提。
2.PCR扩增
PCR引物采用COI基因在鲤科鱼类中的通用引物，上、下游引物序列 分别为：FCOI：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC，RCOI： TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR反应体系总体积为50μl，采用PCR 试剂盒进行PCR扩增，具体成分见表1，PCR反应程序见表2。
表1 PCR反应体系
反应成分 体积(μl)
灭菌双蒸水 22
P1 1
P2 1
基因组DNA模板 1
2ⅹPCR mix 25
表2 PCR反应程序
3.琼脂糖凝胶电泳检测
以恒压5V/cm的标准进行对PCR产物进行电泳，当溴酚蓝移到距琼脂 糖凝胶前沿约5cm时，停止电泳。取出凝胶，置于EB染色液中浸泡15min， 然后用紫外透射仪进行观察。
4.序列测定
经琼脂糖电泳检测目的条带清晰的PCR产物，用离心柱式PCR产物纯 化试剂盒进行目的片段的回收纯化后，送至武汉天一辉远生物科技有限公 司进行双向测序。
5个金沙江水系向家坝库区寡鳞飘鱼样本验证的结果：
测得的3个寡鳞飘鱼样本的COI基因片段与寡鳞飘鱼DNA条形码标准 检测序列相似性为99.9％。
CAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGAACCGCTTTAAGCCTTCTCATTCGAGCCGAACTAAGTCAACCGGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACTGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTCTTATCGGAGGGTTTGGAAACTGACTCGTGCCACTAATGATTGGGGCACCGGACATAGCCTTCCCCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTACCCCCCTCTTTCCTCCTGCTCCTAGCCTCCTCTGGCGTTGAGGCCGGAGCCGGTACAGGATGAACAGTCTACCCCCCACTCGCAGGCAATCTTGCCCATGCAGGAGCATCCGTAGACCTAACGATCTTCTCACTTCACTTAGCAGGTGTGTCCTCAATTTTAGGCGCAATTAATTTTATCACCACAACCATTAATATGAAACCACCAGCCATTTCTCAGTACCAAACACCTCTATTTGTTTGAGCCGTACTTGTAACAGCCGTACTTCTTCTCCTGTCCCTACCAGTCTTAGCGGCTGGAATTACAATGCTCCTTACAGACCGAAACCTAAATACTACCTTCTTTGATCCGGCAGGGGGAGGAGACCCAATCTTATACCAACACTTATTCTGATTCTT
测得的2个寡鳞飘鱼样本的COI基因片段与寡鳞飘鱼DNA条形码标准 检测序列相似性为99.7％。
CAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGAACCGCTTTAAGCCTTCTCATTCGAGCCGAACTAAGTCAACCGGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACTGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTCTTATCGGAGGGTTTGGAAACTGACTCGTGCCACTAATGATTGGGGCACCGGACATAGCCTTCCCCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTACCCCCCTCTTTCCTCCTGCTCCTAGCCTCCTCTGGCGTTGAGGCCGGAGCCGGTACAGGATGAACAGTCTACCCCCCACTCGCAGGCAATCTTGCCCATGCAGGAGCATCCGTAGACCTAACGATCTTCTCACTTCACTTAGCAGGTGTGTCCTCAATTTTAGGCGCAATTAATTTTATCACCACAACCATTAATATGAAACCACCAGCCATTTCTCAGTACCAAACACCTCTATTTGTTTGAGCCGTACTTGTAACAGCCGTACTTCTTCTCCTGTCCCTACCAGTCTTAGCGGCTGGAATTACAATGCTCCTTACAGACCGAAACCTAAATACTACCTTCTTTGACCCGGCAGGGGGAGGAGACCCAATCTTATACCAACACTTATTCTGATTCTT
根据测序结果，以上5个样本与寡鳞飘鱼DNA条形码标准检测序列的 核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判断这些物种为寡鳞飘鱼。
本发明所得到的寡鳞飘鱼DNA条形码序列可以作为寡鳞飘鱼DNA的标 准检测序列，对寡鳞飘鱼物种高效和准确的进行鉴定和分类。在实际工作 中，有时要进行鱼卵和鱼苗的物种鉴定，鱼卵很难通过传统的形态学方法 进行鉴定，另外处于生长发育期的鱼苗形态特征也还不是很显著，无法通 过传统的形态学进行鉴定的时候，这时借助于物种的DNA标准条形码，就 很容易对该物种的鱼卵和鱼苗进行鉴定。有时在物种鉴定的时候，会遇到样本不完整或残缺不全，也给传统的物种分类和鉴定带来困难，这时借助 于物种的DNA标准条形码，可以很快的进行准确的鉴定。有时同一属內甚 至亚科内的不同物种形态相似，有时会出现同一物种，会错误的把它界定 为不同的物种，或者不同的物种，错误的把它界定为同一物种，分类关系 混乱，利用该物种的标准条形码可以方便快捷的对其物种进行准确的鉴 定。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限 制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人 员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离 本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当 中。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种寡鳞飘鱼DNA条形码序列及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 寡鳞飘鱼DNA条形码序列(Pseudolaubuca engraulis)
<400> 1
caaagacatt ggcacccttt atcttgtatt tggtgcctga gccggaatag tgggaaccgc 60
tttaagcctt ctcattcgag ccgaactaag tcaaccggga tcacttctgg gcgacgatca 120
aatttataat gttattgtta ctgcccatgc cttcgtaata attttcttta tagtaatgcc 180
aattcttatc ggagggtttg gaaactgact cgtgccacta atgattgggg caccggacat 240
agccttcccc cgaataaata atataagctt ctgactccta cccccctctt tcctcctgct 300
cctagcctcc tctggcgttg aggccggagc cggtacagga tgaacagtct accccccact 360
cgcaggcaat cttgcccatg caggagcatc cgtagaccta acgatcttct cacttcactt 420
agcaggtgtg tcctcaattt taggcgcaat taattttatc accacaacca ttaatatgaa 480
accaccagcc atttctcagt accaaacacc tctatttgtt tgagccgtac ttgtaacagc 540
cgtacttctt ctcctatccc taccagtctt agcggctgga attacaatgc tccttacaga 600
ccgaaaccta aatactacct tctttgatcc ggcaggggga ggagacccaa tcttatacca 660
acacttattc tgattctt 678
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 寡鳞飘鱼DNA序列(Pseudolaubuca engraulis)
<400> 2
caaagacatt ggcacccttt atcttgtatt tggtgcctga gccggaatag tgggaaccgc 60
tttaagcctt ctcattcgag ccgaactaag tcaaccggga tcacttctgg gcgacgatca 120
aatttataat gttattgtta ctgcccatgc cttcgtaata attttcttta tagtaatgcc 180
aattcttatc ggagggtttg gaaactgact cgtgccacta atgattgggg caccggacat 240
agccttcccc cgaataaata atataagctt ctgactccta cccccctctt tcctcctgct 300
cctagcctcc tctggcgttg aggccggagc cggtacagga tgaacagtct accccccact 360
cgcaggcaat cttgcccatg caggagcatc cgtagaccta acgatcttct cacttcactt 420
agcaggtgtg tcctcaattt taggcgcaat taattttatc accacaacca ttaatatgaa 480
accaccagcc atttctcagt accaaacacc tctatttgtt tgagccgtac ttgtaacagc 540
cgtacttctt ctcctgtccc taccagtctt agcggctgga attacaatgc tccttacaga 600
ccgaaaccta aatactacct tctttgatcc ggcaggggga ggagacccaa tcttatacca 660
acacttattc tgattctt 678
<210> 3
<211> 678
<212> DNA
<213> 寡鳞飘鱼DNA序列(Pseudolaubuca engraulis)
<400> 3
caaagacatt ggcacccttt atcttgtatt tggtgcctga gccggaatag tgggaaccgc 60
tttaagcctt ctcattcgag ccgaactaag tcaaccggga tcacttctgg gcgacgatca 120
aatttataat gttattgtta ctgcccatgc cttcgtaata attttcttta tagtaatgcc 180
aattcttatc ggagggtttg gaaactgact cgtgccacta atgattgggg caccggacat 240
agccttcccc cgaataaata atataagctt ctgactccta cccccctctt tcctcctgct 300
cctagcctcc tctggcgttg aggccggagc cggtacagga tgaacagtct accccccact 360
cgcaggcaat cttgcccatg caggagcatc cgtagaccta acgatcttct cacttcactt 420
agcaggtgtg tcctcaattt taggcgcaat taattttatc accacaacca ttaatatgaa 480
accaccagcc atttctcagt accaaacacc tctatttgtt tgagccgtac ttgtaacagc 540
cgtacttctt ctcctgtccc taccagtctt agcggctgga attacaatgc tccttacaga 600
ccgaaaccta aatactacct tctttgaccc ggcaggggga ggagacccaa tcttatacca 660
acacttattc tgattctt 678

Claims (3)

1.一种寡鳞飘鱼DNA条形码序列，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的寡鳞飘鱼DNA条形码序列，其特征在于，所述寡鳞飘鱼DNA条形码序列为寡鳞飘鱼COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。
3.一种寡鳞飘鱼DNA条形码标准检测序列的应用，其特征在于，该DNA条形码序列可以作为寡鳞飘鱼DNA的标准检测序列，有效的对寡鳞飘鱼物种进行鉴定。
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