CN105483228A - 一种拟鲶高原鳅dna条形码标准检测基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拟鲶高原鳅DNA条形码标准检测基因及其应用，该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1。本发明的拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了拟鲶高原鳅。与传统的形态学鉴定方法相比，该方法获得的标准基因序列有利于实现拟鲶高原鳅的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。
Description
技术领域
本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种拟鲶高原鳅DNA条形码标准检测基因及其应用。
背景技术
拟鲶高原鳅(学名：Triplophysasiluroides)为辐鳍鱼纲鲤形目鳅科高原鳅属的鱼类，是中国的特有物种。是高原河流鱼类，分布于黄河上游的干支流和附属湖泊等，多见于干支流和附属湖泊上游的河口地区。常喜潜伏于砾石底质，也栖息于冲积淤泥、多水草的缓流和静水水体，营底栖生活。该物种的模式产地在黄河上游。鱼体粗壮，前端宽阔，稍平扁，后端近圆形，尾柄细圆。头大，平扁，背面观呈三角形。口大，下位，弧形。唇无乳突，下颌匙状。眼小。体无鳞，体表皮肤散布有短条状和乳突状的皮质突起。体背侧黄褐色，腹部浅黄，体背及体侧具黑褐色的圈纹和云斑，各鳍均具斑点。为鳅科鱼类中较大的种，常见个体体长150-480毫米左右，最大个体体长482毫米，重1.5公斤。目前仅在人眼较稀少的高原地区，仍保持一定数量。属于极度濒危鱼种！因此，对拟鲶高原鳅地方特有种进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。
DNA条形码技术(DNAbarcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochromecoxidaseI,COI)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对拟鲶高原鳅进行快速、有效的鉴定。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。自从2003年，加拿大科学家Hebert提出以COI基因做为DNA条形码以来，越来越多的研究表明DNA条形码在物种分类上具有高效可行性。大量的研究结果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。
该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决形态学鉴定中因标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且鉴定时间也极大缩短。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有拟鲶高原鳅的相关基因序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定拟鲶高原鳅的DNA条形码标准检测基因。
本发明的另一目的在于提供上述用于鉴定拟鲶高原鳅的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法，该方法有利于实现拟鲶高原鳅的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于鉴定拟鲶高原鳅的DNA条形码标准检测基因，该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1，该核苷酸序列的全长为652bp。拟鲶高原鳅标准序列SEQIDNO.1为：
ATTTGGTGCCTGAGCCGGGATAGTTGGAACTGCCCTAAGCCTATTAATCCGAGCTGAATTAAGTCAGCCAGGGTCCCTCCTTGGCGATGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACCGCACACGCCTTTGTTATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATTCTTATTGGAGGCTTTGGTAACTGACTTGTTCCACTAATGATCGGGGCCCCAGATATGGCATTCCCCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTACCACCTTCCTTTCTCCTACTCCTAGCCTCGTCGGGTGTAGAGGCTGGAGCCGGTACAGGATGAACAGTATATCCTCCCCTTTCAGGTAACCTAGCCCATGCAGGTGCATCCGTAGACCTAACTATCTTCTCTTTACATCTGGCAGGTGCATCATCTATCTTAGGGGCAATTAACTTTATTACAACAACAATTAATATGAAGCCCCCAGCCATTTCCCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGAGCTGTTTTAGTAACAGCTGTACTACTCCTGCTATCTCTACCAGTTCTGGCTGCTGGGATTACAATACTTCTAACAGACCGAAATCTAAATACTACATTTTTTGATCCCGCAGGAGGGGGAGATCCTATTCTTTATCAGCACTTATTCTGATTCTTC。
上述的用于鉴定拟鲶高原鳅的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。
一种拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法，包括以下步骤：
1)从待测组织中分离提取总DNA；
2)以步骤1)分离提取的DNA为模板用两对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)的扩增产物进行电泳分析，如果能特异性扩增出目的条带，则进行测序；
4)如果目的条带的测序结果与SEQIDNO.1的基因序列同源性在98％以上时，即可判定该待测组织为拟鲶高原鳅。
步骤2)中所述的两对引物的序列为：
FishF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQIDNO.2)
VF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQIDNO.3)
FishR2_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQIDNO.4)
FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQIDNO.5)
所述的目的条带为长度为700±15bp的条带。
本发明公开了拟鲶高原鳅的DNA条形码分子鉴定方法和COI序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出拟鲶高原鳅COI基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至测序公司进行测序。与所述DNA条形码标准基因序列SEQIDNO.1的同源性在98％以上，即可判定所述的待测组织即为拟鲶高原鳅。该方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了拟鲶高原鳅。
上述拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法的详细步骤为：1)从待测组织中分离提取总DNA；2)以该DNA为模板用两对通用引物，通过聚合酶链式反应扩增出目的基因；3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的目的基因用琼脂糖电泳进行分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出700±15bp的条带，则送生物公司测序；4)根据测序结果，如果与如SEQIDNO.1所示的基因序列的同源性在98％以上，即可判定该待测组织为拟鲶高原鳅。
优选的，上述拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法中的PCR反应体系(25ul)为：10×PCRBuffer2.5μl、dNTPMixture(2.5mMeach)2.0μl、TaKaRaTaq(5U/μl)0.3μl、FishF2_t1引物(10μM)0.5μl、FishR2_t1引物(10μM)0.5μl、VF2_t1引物(10μM)0.5μl、FR1d_t1引物(10μM)0.5μl、DNA模板(约10ng/μl)1μl、ddH2O17.2μl。
PCR反应程序为：95℃*2min,94℃*30s,55℃*30s,72℃*1min,35个循环,72℃*10min。
本发明的有益效果：
本发明的方法采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了拟鲶高原鳅。与传统的形态学鉴定方法相比，该方法获得的标准基因序列有利于实现拟鲶高原鳅的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。
附图说明
图1为拟鲶高原鳅DNA条形码分子鉴定技术路线图
图2为扩增产物电泳图谱
具体实施方式
实施例1拟鲶高原鳅标准序列的获得
1.拟鲶高原鳅形态学鉴定及样本采集保存
根据拟鲶高原鳅鱼体粗壮，前端宽阔，稍平扁，后端近圆形，尾柄细圆。头大，平扁，背面观呈三角形。口大，下位，弧形。唇无乳突，下颌匙状。眼小。体无鳞，体表皮肤散布有短条状和乳突状的皮质突起。体背侧黄褐色，腹部浅黄，体背及体侧具黑褐色的圈纹和云斑，各鳍均具斑点等形态学特征以及相关鱼类分类专家的共同鉴定，选出拟鲶高原鳅样本。剪取肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
2.DNA提取
酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于-20℃保存备用。
3.PCR引物合成
本方法选取2对引物的序列如下：
FishF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQIDNO.2)
VF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQIDNO.3)
FishR2_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQIDNO.4)
FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQIDNO.5)
4.PCR反应体系(25ul)
5.PCR反应程序
反应结束后，打开PCR仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存。
6.标准序列的获得
取2μlPCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，选取效果较好的PCR产物送至生物公司纯化后测序，测序结果经过去除两端的冗余序列即为拟鲶高原鳅的标准序列(SEQIDNO.1)。
实施例2
1.待测样本的采集保存与处理
从浸泡标本中剪取待测样本的部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
2.DNA提取
酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于-20℃保存备用。
3.PCR引物合成
本方法选取2对引物的序列如下：
FishF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’(SEQIDNO.2)
VF2_t1:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’(SEQIDNO.3)
FishR2_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’(SEQIDNO.4)
FR1d_t1:5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’(SEQIDNO.5)
4.PCR反应体系(25ul)
5.PCR反应程序
反应结束后，打开PCR仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存
6.PCR产物检测
取2μlPCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如下，检出大小约为700±15bp的目的条带，可初步判定待测样本可能是拟鲶高原鳅。
7.基因序列测定
选取效果较好的PCR产物送至生物公司纯化后测序，测序结果显示与如SEQIDNO.1所示的基因序列的同源性为99％，可判定该待测样本即为拟鲶高原鳅，并结合拟鲶高原鳅体型、体表、头型、背部花纹、眼和鳍等形态学特征进行复核鉴定提供该样本组织的物种确为拟鲶高原鳅。
送样序列(SEQIDNO.6)：
CAAGAATTGGACCTTTTTCCTAGTATTTGGTGCCTGAGCCGGGATAGTTGGAACTGCCCTAAGCCTATTAATCCGAGCTGAATTAAGTCAGCCAGGGTCCCTCCTTGGCGATGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACCGCACACGCCTTTGTTATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATTCTTATTGGAGGCTTTGGTAACTGACTTGTTCCACTAATGATCGGGGCCCCAGATATGGCATTCCCCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTACCACCTTCCTTTCTCCTACTCCTAGCCTCGTCGGGTGTAGAGGCTGGAGCCGGTACAGGATGAACAGTATATCCTCCCCTTTCAGGTAACCTAGCCCATGCAGGTGCATCCGTAGACCTAACTATCTTCTCTTTACATCTGGCAGGTGCATCATCTATCTTAGGGGCAATTAACTTTATTACAACAACAATTAATATGAAGCCCCCAGCCATTTCCCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGAGCTGTTTTAGTAACAGCTGTACTACTCCTGCTATCTCTACCAGTTCTGGCTGCTGGGATTACAATACTTCTAACAGACCGAAATCTAAATACTACATTTTTTGATCCCGCAGGAGGGGGAGATCCTATTCTTTATCAGCACTTATTCTGATTCTTCGGACACCCTGAAGTGTCATAGCTTGTTTTCCTGGA
Claims (5)
1.一种用于鉴定拟鲶高原鳅的DNA条形码标准检测基因，其特征在于：该DNA条形码标准检测基因为COI基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1。
2.权利要求1所述的用于鉴定拟鲶高原鳅的DNA条形码标准检测基因在鉴定待测标本中的应用。
3.一种拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从待测组织中分离提取总DNA；
2)以步骤1)分离提取的DNA为模板用两对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)的扩增产物进行电泳分析，如果能特异性扩增出目的条带，则进行测序；
4)如果目的条带的测序结果与SEQIDNO.1的基因序列同源性在98％以上时，即可判定该待测组织为拟鲶高原鳅。
4.根据权利要求3所述的拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法，其特征在于：步骤2)中所述的两对引物的序列为SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。
5.根据权利要求3所述的拟鲶高原鳅DNA条形码物种鉴定方法，其特征在于：所述的目的条带为长度为700±15bp的条带。
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