CN108034730A - 鉴别青斑的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别青斑的分子特异性标记引物及方法，该用于鉴别青斑的分子特异性引物的上游引物QBF：5’‑GCACCCTCCAACATTTCC‑3’(SEQ ID NO:3)；下游引物QBR5’‑ATAAAGAAGAAGGAGGCG‑3’(SEQ ID NO:4)。本发明利用分子特异性标记引物QBF/QBR，通过常规PCR方法对青斑进行快速的分子鉴定，方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成，是形态特征辨别青斑的有效辅助。

Description

鉴别青斑的分子特异性标记引物及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别涉及一种鉴别青斑的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异引物对青斑标本快速鉴别的方法。

背景技术

青斑(学名：Epinephelus awoara)，隶属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)，主要分布在热带、亚热带海区，具有生长速度快、适应性强、耐高密度养殖的优点，更是一种低脂肪、高蛋白的上等食用鱼。研究表明，除偶然进行群体产卵外，大部分石斑鱼是单对产卵，石斑鱼通常长期栖息在某个固定的地方，这种固定栖息地的特异性和相对慢的生长速度使用石斑鱼资源特别容易受到过度捕捞的影响，由于石斑鱼又是典型的雌雄同体，雌性先成熟，在人工繁育中往往存在雌雄不同步的现象，严重制约石斑鱼的人工育种工作的开展。近代，石斑鱼的资源量明显下降，同时种质退化、病害、抗逆等问题严重。选育生长快、抗逆性强的石斑鱼品系是其养殖产业健康持续发展的重要保证。青斑具有抗逆性好的优点，选择他作为亲本进行杂种育种，子代能表现出显著的杂种优势。但是石斑鱼的种类较多，根据《Groupers of the World》统计，石斑鱼类包括16个属，163个种，中国大陆沿海记录66种，台湾海峡记录58种。目前，对青斑的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于石斑鱼种子资源明显下降；加之石斑鱼种类较多。因此，对青斑亲本等进行正确鉴定以及物种保护已经刻不容缓。

DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中一种常见的分子标记是线粒体细胞色素b基因(Cytb)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对青斑进行快速、有效的鉴定。

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些经济物种，分类鉴定工作就显得尤其重要。该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决鉴定中标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有青斑的相关基因序列。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别青斑的分子特异性标记引物及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴别青斑的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

用于鉴别青斑的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：

上游引物QBF：5’-GCACCCTCCAACATTTCC-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物QBR：5’-ATAAAGAAGAAGGAGGCG-3’(SEQ ID NO:2)。

该对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对青斑标本的核糖体ITS区序列的克隆序列，然后通过NCBI的序列比对，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行PCR扩增，可以获得200bp左右的特异性片段。

本发明还涉及上述的分子特异性标记引物(QBF/QBR)在鉴别青斑标本中的应用。

本发明还涉及上述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别青斑标本的试剂盒中的应用。

一种用于鉴别青斑的试剂盒，该试剂盒中包含上述的分子特异性标记引物。该试剂盒中还包含PCR常用试剂。

一种快速鉴别青斑的方法，以待测样本的基因组DNA为模板，以上述的分子特异性标记引物(QBF/QBR)作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为青斑。在本发明优选的实施方式中，上述的DNA目的条带为约200±10bp的DNA目的条带。

在本发明优选的实施方式中，上述PCR扩增的反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。

上述方法中扩增的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。

需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于青斑的形态学特征初步的判断之后，再将判断为青斑的标本运用本发明方法鉴别。

在本发明优选的实施方式中，本发明所述鉴别青斑方法的具体步骤如下：

(1)从待鉴定组织样本中分离提取基因组DNA；

(2)生物公司试剂盒方法提取样品中的基因组DNA，于-20℃保存备用。

(3)以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(QBF/QBR)作为扩增引物，进行PCR扩增；

PCR反应体系(总体积为50μL)组成为：

PCR反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。

取2μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示，检出大小约为200±10bp的条带，可初步判定待测样本可能是青斑。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明的分子特异性标记引物(QBF/QBR)可对青斑进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别青斑的有效辅助手段。

附图说明

图1是采用本发明的分子特异性标记引物对青斑进行PCR扩增的电泳图。其中，M：DNA标准分子量标；1,2为目标的片段；3,4为空白；5,6为阴性对照。

图2是采用本发明的分子特异性标记引物对实施例3中的样本进行PCR扩增的电泳图，其中，M：DNA标准分子量标；1,2为目标的片段；3,4为老虎斑的片段；5,6为龙趸的片段；7，8为空白对照。

具体实施方式

本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别青斑。下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：

(1)对能特异性扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出200±10bp的条带，则将其进行测序分析；

(2)根据测序结果，如果与SEQ ID NO:3(该物种条形码标准序列)所示的核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判断该待鉴定组织为青斑。SEQ ID NO:3序列如下：

GCACCCTCCAACATTTCCATTTGATGAAATTTCGGCTCGCTACTCGGACTCTGCCTTATTGCTCAAATTCTCACAGGCCTATTTCTAGCCATACATTACACATCAGACATCGCCACAGCCTTCTCATCCGTTGCCCATATTTGCCGAGACGTAAACTACGGCTGACTCATCCGCAACATACATGCCAACGGCGCCTCCTTCTTCTTTAT

(3)测序结果显示其序列如SEQ ID NO:4所示，SEQ ID NO:4序列如下：

CCGAAAGGGACGGATGAGAGGCTGTGGCGATGTCTGATGTGTAATGTATGGCTAGAAATAGGCCTGTGAGAATTTGAGCAATAAGGCAGAGTCCGAGTAGCGAGCCGAAATTTCATCAAATGGAAATGTTGGAGGGTGCTGGGAGGTCAACTAGTA

(5)经同源性比对发现，SEQ ID NO:4所示核苷酸序列与如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的同源性为99％，因而可判定该待测样本即为青斑的组织样本，证明本方法的有效性和可靠性(如若测序后的序列经同源性比对发现同源性小于98％，可判定该待测样本不是青斑的组织样本)。

实施例2：

(1)待测青斑基因组DNA的提取

取青斑组织样品，剪碎后使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，利用1.5％琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。

(2)设计合成特异性PCR扩增引物

设计合成基于青斑的特异性引物，上游引物QBF：5’-

GCACCCTCCAACATTTCC-3’(SEQ ID NO:3)；和下游引物5’-ATAAAGAAGAAGGAGGCG-3’(SEQ ID NO:4)。由技术人员设计，并由引物设计公司合成。

(3)分子特异性标记引物(QBF/QBR)的PCR扩增PCR反应体系50μL：ReactionBuffer 10μL，dNTPS 4μL，Q5

0.5μL，QBF引物(10μM)1μL，QBR引物(10μM)1μL，DNA模板(约10ng/μL)0.5μL，ddH2O33μLPCR。

反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。

(4)电泳检测：

取2μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。

M：DNA标准分子量标；1,2为目的的片段；3,4为空白；5,6为阴性对照。由图1可见，扩增出分子量约为200bp左右的特异性DNA条带。

实施例3：

用实施例1的方法进行青斑、老虎斑、龙趸三种冰冻鱼块检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，结果表明仅仅有一种鱼块可扩增出分子量约为200bp左右的特异性DNA条带，另两种鱼块样本不能扩增出，检测结果与取样人记录信息完全一致。因此可表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别青斑。

实施例4：

从鱼类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的鱼类，其中一组为青斑(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，PCR产物测序结果显示其中一组的5个样品能够扩增出200bp左右的特异性DNA条带为青斑的组织样本，另一组的5个样品为非青斑的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。

上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南华大海洋科技有限公司

<120> 鉴别青斑的分子特异性标记引物及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaccctcca acatttcc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataaagaaga aggaggcg 18

<210> 3

<211> 209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaccctcca acatttccat ttgatgaaat ttcggctcgc tactcggact ctgccttatt 60

gctcaaattc tcacaggcct atttctagcc atacattaca catcagacat cgccacagcc 120

ttctcatccg ttgcccatat ttgccgagac gtaaactacg gctgactcat ccgcaacata 180

catgccaacg gcgcctcctt cttctttat 209

<210> 4

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgaaaggga cggatgagag gctgtggcga tgtctgatgt gtaatgtatg gctagaaata 60

ggcctgtgag aatttgagca ataaggcaga gtccgagtag cgagccgaaa tttcatcaaa 120

tggaaatgtt ggagggtgct gggaggtcaa ctagta 156

Claims (9)

1.用于鉴别青斑的分子特异性标记引物，其特征在于：该引物的核苷酸序列如下：

如SEQ ID NO:3所示的上游引物QBF：5’-GCACCCTCCAACATTTCC-3’；

如SEQ ID NO:4所示的下游引物QBR：5’-ATAAAGAAGAAGGAGGCG-3’。

2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别青斑中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为青斑。

4.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别青斑的试剂盒中的应用。

5.一种用于鉴别青斑的试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含权利要求1所述的分子特异性标记引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中还包含PCR常用试剂。

7.一种快速鉴别青斑的方法，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为青斑。

8.根据权利要求7所述的鉴别青斑的方法，其特征在于：所述的DNA目的条带为200±10bp的DNA目的条带。

9.根据权利要求7所述的鉴别青斑的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃变性3min；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，35个循环；72℃延伸5min。