CN105483261B - 一种蓝腹库蠓的特异基因及其分子鉴定方法 - Google Patents
一种蓝腹库蠓的特异基因及其分子鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种蓝腹库蠓的特异基因及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学方法获取该库蠓的COⅠ基因序列，通过基因序列相似性的比对，对该库蠓进行种类鉴定。本发明提供的蓝腹库蠓分子鉴定方法，有利于实现蓝腹库蠓准确、快速的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及蓝腹库蠓的特异基因序列及其分子鉴定方法。
背景技术
库蠓是我国三大吸血蠓之一，可传播蓝舌病、住球虫病等多种人兽共患病，是一种重要的病媒生物。因此，对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是疾病预防控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。
DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，有利于帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。
作为DNA 条形码的标准目的基因，一方面必须足够保守，便于利用通用引物进行大范围的扩增；另一方面要有足够的变异来区分不同物种。因此，鉴定不同的物种类群需要选择有效的目的基因。目前，在系统发育研究中广泛应用的标志基因是核糖体12S和16S基因，但因其存在大量的插入和缺失现象，不宜用做条形编码基因。线粒体基因组中存在的13个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（Cytochrome Oxidase Subunit Ⅰ, COⅠ）、线粒体细胞色素b（Cytb）、ND4、ND5 这4 个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900 bp左右这两个条件，但ND4 和ND5 进化太快，难以设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA 鉴定系统的目标基因。故人们最终选定COⅠ基因中的一个片段作为DNA 条形编码基因。迄今为止，已有诸多研究证明COⅠ基因在鸟类、鱼类、鳞翅目昆虫、蚊类、蚁类和弹尾目等类群的分类鉴定中行之有效。因此，可采用基于COⅠ基因的DNA 条形码技术对吸血蠓进行分子鉴定。该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等问题，而且可实现吸血蠓的快速鉴定。目前，通过该方法已获得多种吸血蠓的COⅠ基因序列并上传Genbank中，但至今尚无蓝腹库蠓的相关基因序列。本发明提供的蓝腹库蠓特异基因序列有利于实现蓝腹库蠓的快速鉴定，缩短鉴定时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蓝腹库蠓的特异基因序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学方法获取蓝腹库蠓（Culicoides cyancus）特异基因—COⅠ基因序列，通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地鉴定蓝腹库蠓。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
采用小型昆虫微量DNA 模板制备方法，通过改进的PCR 反应条件，由合成的引物扩增蓝腹库蠓的COⅠ基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI 中进行Blast 相似性搜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的蓝腹库蠓特异基因为COⅠ基因，所述库蠓的CO Ⅰ基因序列如SEQ ID No.1 所示（不含引物）：
所述的蓝腹库蠓COⅠ基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：
正向引物 5’AATCATAAAGATATTGGAAC 3’
反向引物 5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3’。
本发明所述的蓝腹库蠓的分子鉴定方法，包括：
1）从待测的昆虫组织中分离提取DNA；
2）以该DNA为模板，采用的引物为：正向引物 5’AATCATAAAGATATTGGAAC 3’，反向引物5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3’，通过聚合酶链式反应扩增出该昆虫的COⅠ基因；
3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的COⅠ基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果。若能相应地特异性扩增出大小约为643 bp的条带，送生物公司测序；
4）根据测序结果，若目标基因序列与SEQ ID No.1的相似性均在98%以上，即可判断所述的待测组织即为蓝腹库蠓。
蓝腹库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结果的可靠性。
所述引物根据文献合成，正向引物 5’AATCATAAAGATATTGGAAC 3’，反向引物5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3’。
本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。
本发明的优点为：
1）本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述库蠓进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。
2）与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的蓝腹库蠓分子鉴定方法可有效缩短蓝腹库蠓的鉴定时间。
附图说明
图1为蓝腹库蠓COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阴性对照，泳道2为蓝腹库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为643 bp的条带。M为DL 2000的DNAmarker。
图2为未知库蠓雌虫COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阴性对照，泳道2为未知库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为643 bp的条带。M为DL 2000的DNAmarker。
具体实施方式
实施例1 蓝腹库蠓（Culicoides cyancus）COⅠ基因序列的获取
1、蓝腹库蠓标本的获取
蓝腹库蠓为野外采集获得的标本，经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。标本制成玻片后经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。标本制作前，挑取蓝腹库蠓胸部末端和腹部前几节置于95%酒精中，供DNA提取。
2、DNA模板制备
采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取蓝腹库蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010. pp278-286），提取的DNA样品保存于-20℃备用。
3、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物 5’AATCATAAAGATATTGGAAC 3’
反向引物 5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3’。
4、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表1所示。
表1 蓝腹库蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
| 成分 | 体积（uL） |
| 模板 | 2 |
| 引物1 | 1 |
| 引物2 | 1 |
| 10×缓冲液 | 5 |
| dNTPs | 1 |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 37.5 |
本实施例的反应程序如表2所示。
表2蓝腹库蠓COⅠ基因PCR反应程序
| 步骤 | 反应温度（℃） | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94 | 3 min | — |
| 变性 | 94 | 45 s | 35 |
| 退火 | 48 | 45 s | 35 |
| 延伸 | 72 | 60 s | 35 |
| 延伸 | 72 | 7 min | — |
PCR产物于4℃保存备用。
5、PCR扩增产物检测
取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图1。
6、基因序列测定
选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为蓝腹库蠓的CO基因序列—SEQ IDNo.1。
实施例2 未知库蠓的鉴定
1、标本的采集与保存
采用挥网法或灯诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
2、DNA模板制备
在解剖镜或体视显微镜下，从采集到的蠓类标本中随机挑出一只雌性库蠓，采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取库蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010. pp278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用，每份标本一个编号。
3、目的基因序列的获取
3.1 引物合成
以获得的未知库蠓DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：
正向引物 5’AATCATAAAGATATTGGAAC 3’
反向引物 5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3’。
3.2 PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表3所示。
表3 未知库蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
| 成分 | 体积（uL） |
| 模板 | 2 |
| 引物1 | 1 |
| 引物2 | 1 |
| 10×缓冲液 | 5 |
| dNTPs | 1 |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 37.5 |
本实施例的反应程序如表4所示。
表4未知库蠓COⅠ基因PCR反应程序
| 步骤 | 反应温度（℃） | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94 | 3 min | — |
| 变性 | 94 | 45 s | 35 |
| 退火 | 48 | 45 s | 35 |
| 延伸 | 72 | 60 s | 35 |
| 延伸 | 72 | 7 min | — |
PCR产物于4℃保存备用。
3.3 PCR扩增产物检测与基因序列测定
取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。由附图2看出实施例2的未知库蠓也能特异性扩增出大小约为643 bp 的产物，将大小约为643 bp 的产物送生物公司测序，结果显示与基因序列SEQ ID NO. 1的相似性为99.9%，因而可判定该未知库蠓为蓝腹库蠓。
Claims (1)
1.一种蓝腹库蠓特异基因，其特征在于，所述基因为COⅠ基因，为如下所述的基因序列SEQ ID No.1：
。
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