CN109810982A - 短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及昆虫鉴定领域，具体涉及短须库蠓特异基因及其分子鉴定方法。所述特异性基因为CO Ⅰ基因、Cyt b基因中的一种或两种的组合，所述CO Ⅰ基因的序列为SEQ ID NO.1，所述Cyt b基因序列为SEQ ID NO.2，可用于短须库蠓物种的准确鉴定。本发明提供一种准确率高、鉴定时间短的，将CO Ⅰ基因和Cyt b基因结合的短须库蠓分子鉴定方法。将待测的昆虫DNA分别与短须库蠓的CO Ⅰ基因和Cyt b基因同源性比对，当同源性均达到98％以上，则判断为待测的昆虫为短须库蠓。

Description

短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法

技术领域

本发明涉及昆虫鉴定领域，具体涉及短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法。

背景技术

库蠓在动物分类上属节肢动物门(Arthropoda)昆虫纲(Insecta)双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)库蠓属(Culicoides)，是蠓科中最大的一个属，也是吸血蠓属中分布最广，种类最多，与人畜关系最密切的一个属，是多种重要动物虫媒病的传播媒介。近年来，随着全球气候变暖，在一定程度上使库蠓传播虫媒病病毒的能力提高，也使库蠓的分布范围向地球两极和高海拔地区扩大，库蠓种群传播虫媒病毒给动物的能力增强，一些传统的“非媒介”库蠓种类具备了传播疫病的能力。由库蠓传播的虫媒病如蓝舌病、水泡性口炎等，在全球一些国家或地区的传播流行，造成了巨大的经济损失，对畜牧业发展构成了严重威胁。短须库蠓(Culicolides brevipalpis)属库蠓属的二囊亚属，在我国分布于福建、海南、广东、云南、台湾等地。

对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是疾病预防与控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以DNA序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用手段，极大地弥补了传统分类鉴定的不足。线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)具有结构简单，序列和组成一般比较保守，易于操作，母系遗传，单拷贝，进化速率较核DNA快等特点，已被作为分子标记广泛用于昆虫分类学研究中。线粒体基因组中存在的13个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome Oxidase SubunitⅠ，COⅠ)、线粒体细胞色素b(Cyt b)、ND4、ND5这4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900bp左右这两个条件，但ND4和ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA鉴定系统的目标基因。由于COⅠ基因在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，而且目前研究表明，其DNA序列本身很少存在插入和缺失(即使有少数也主要分布于该基因的3端，对结果的分析不会造成很大的影响)。同时，它还拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异，故人们选定COⅠ基因中的一个片段作为DNA条形编码基因。但COⅠ基因作为物种鉴定的唯一目的基因尚存在不足，比如可能会存在杂交或者基因渗透，因此需要尝试多个分子标记的结合使用。

目前，有文献报道尝试将COⅠ和ITS2两个基因作为分子标记对吸血蠓进行鉴定，但ITS变异速度快，种内基因变异大，而且ITS基因序列无法直接测序，只能通过克隆获得，采用其进行组合鉴定在很大程度上影响了鉴定的时效。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供短须库蠓的特异基因，能够用于短须库蠓物种的准确鉴定。

相应地，本发明提供一种准确率高、鉴定时间短的，将COⅠ基因和Cyt b基因结合的短须库蠓分子鉴定方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

本发明提供一种短须库蠓特异性基因，所述特异性基因为COⅠ基因、Cyt b基因中的一种或两种的组合，所述COⅠ基因的序列为SEQ ID NO.1，所述Cyt b基因序列为SEQ IDNO.2。

SEQ ID NO.1序列信息如下：

SEQ ID NO.2序列信息如下：

为使短须库蠓COⅠ基因实现PCR扩增，本发明提供一种短须库蠓特异基因扩增引物，所述COⅠ基因的引物序列为：

正向引物：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3’，

反向引物：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3’。

经实验表明，采用本方案中的引物，通过PCR和测序，可成功获得SEQ ID NO.1的序列。

为使短须库蠓Cyt b基因实现PCR扩增，本发明提供一种短须库蠓特异基因扩增引物，所述Cyt b基因的引物序列为：

正向引物为：5’GGACAAATATCATTTTGAGGAGCWACAG 3’，

反向引物为：5’ATTACTCCTCCTAATTTATTAGGAATTG 3’。

经实验表明，采用本方案中的引物，通过PCR和测序，可成功获得如SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明还提供一种短须库蠓的分子鉴定方法，其包括以下步骤：将待测的昆虫DNA序列，分别与短须库蠓COⅠ基因和Cyt b基因序列同源性比对，当同源性均达到98％以上，则判断为待测的昆虫为短须库蠓。

COⅠ基因作为物种鉴定的唯一目的基因尚存在不足，比如可能会存在杂交或者基因渗透，而Cyt b基因是mtDNA中目前结构和功能研究得最为清楚的基因之一。该基因大小和结构较为保守，进化速度适中，能在同一物种内表现出稳定的遗传性，却在不同物种间具有明显的遗传差异；本发明将COⅠ基因和Cyt b基因组合作为蠓类鉴定分子标记，可明显提高蠓类物种鉴定的准确性和稳定性。目前，未见将COⅠ基因和Cyt b基因组合作为蠓类鉴定分子标记的报道。

本发明短须库蠓的分子鉴定方法优选的方案中，所述昆虫DNA分别采用COⅠ基因扩增引物和Cyt b基因扩增引物，进行扩增，分别得到COⅠ目的产物和Cyt b目的产物，进行测序后，再与短须库蠓COⅠ基因和Cyt b基因同源性比对。

本发明还提供一种短须库蠓的分子鉴定方法，其包括以下步骤：

S1:从待测的昆虫组织中分离提取DNA；

S2:将所提取得到的DNA为模板，采用COⅠ基因引物通过聚合酶链式反应扩增得COⅠ产物；

S3:将所提取得到的DNA为模板，采用Cyt b基因引物通过聚合酶链式反应扩增得Cyt b产物；

S4:将所得到的COⅠ产物和Cyt b产物分别经电泳分离检测，若COⅠ产物分离得到大小500～750bp的条带，则保存为第一目的条带；若Cyt b产物分离得到大小400～500bp的条带，则保存为第二目的条带；

S5:将所得到的第一目的条带和第二目的条带分别测序得到第一序列和第二序列；若第一序列与SEQ ID NO.1所述的基因序列，且第二序列与SEQ ID NO.2所述的基因序列同源性均达到98％以上，则可判断为待测的昆虫为短须库蠓。

本方案中，能够有效的通过短须库蠓COⅠ基因引物(正向引物：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3’，反向引物：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3’)，短须库蠓Cyt b基因引物(其序列为，正向引物为：5’GGACAAATATCATTTTGAGGAGCWACAG3’，反向引物为：5’ATTACTCCTCCTAATTTATTAGGAATTG3’)，以最终是否分别成功扩增出SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所述的基因序列同源性均达到98％以上的相应的序列，以成功判断待测的昆虫是否为短须库蠓，其检测方法效率高、稳定性高。另，在步骤S4中，当其中一条产物未检出相应大小的目的条带，则不能判断为待测的昆虫为短须库蠓，即，当待测昆虫不是短须库蠓时，检测只要到步骤S4就能快速准确判定。此外，COⅠ产物和Cyt b产物的PCR、电泳检测、测序和同源性比对，可同时进行，且PCR、电泳检测、测序和同源性比对检测过程的步骤工艺参数等皆一致，可相互校验，从而在提高准确率，有效缩短检测时间的同时，减少检测过程的误差，提高检测结果的稳定性。

因此，本发明短须库蠓的分子鉴定方法与单一分子标记测定相比，在检测时间相同的情况下，其准确率更高。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

1.本发明填补了短须库蠓的COⅠ基因序列和Cyt b基因序列的空白，并使其成功的应用于短须库蠓的分子鉴定。

2.本发明首次采用COⅠ基因和Cyt b基因的两种基因片段相结合对短须库蠓进行分子鉴定，可实现短须库蠓的准确鉴定，与传统的形态学鉴定方法相比，能有效缩短短须库蠓的鉴定时间。

3.本发明采用的双分子标记结合的分子鉴定方法，可避免单一分子标记存在的杂交或者基因渗透，有效解决复合组的种类鉴定问题。

4.本发明与形态学鉴定方法相佐证，进一步确保了鉴定结果的准确性。

附图说明

图1：短须库蠓CO Ⅰ基因PCR产物电泳图；

图2：短须库蠓Cyt b基因PCR产物电泳图；

图3：待测库蠓CO Ⅰ基因PCR产物电泳图；

图4：待测库蠓Cyt b基因PCR产物电泳图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1短须库蠓CO Ⅰ和Cyt b基因序列的获取

本实施例短须库蠓CO Ⅰ和Cyt b基因序列的获取，其包括以下步骤：从短须库蠓中提取基因组DNA，并设计和合成短须库蠓COⅠ和Cyt b基因引物。以上述所提取的基因组DNA为模板，采用上述所合成的短须库蠓CO Ⅰ基因引物，经过PCR扩增，得到短须库蠓CO Ⅰ产物；以上述所提取的基因组DNA为模板，采用上述所合成的短须库蠓Cyt b基因引物，经过PCR扩增，得到短须库蠓Cyt b产物。将上述得到的短须库蠓CO Ⅰ产物和短须库蠓Cyt b产物，经过检测和测序得到短须库蠓CO Ⅰ和Cyt b基因序列。

具体的：

1、短须库蠓基因组DNA制备

取同一批采获并经形态学鉴定为短须库蠓的其他标本，采用改进的小型昆虫痕量DNA抽提法提取短须库蠓的基因组DNA(文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京：科学出版社，2010.278-286)。提取的DNA样品于-20℃保存备用。形态学鉴定经权威专家复核，确保鉴定结果的可靠性。

2、短须库蠓COⅠ和Cyt b基因引物合成

短须库蠓COⅠ基因引物和Cyt b基因引物序列设计如表1所示，并合成。

表1 CO Ⅰ基因引物和Cyt b基因引物序列

3、PCR扩增

以基因组DNA为模板，经过PCR扩增得到短须库蠓COⅠ产物和短须库蠓Cyt b产物的反应体系和反应条件分别均如表2和表3所示。

表2 PCR反应体系(以25μL为例)

成分	体积(μL)
		模板	1
正向引物(10μM)	0.5
		反向引物(10μM)	0.5
10×缓冲液	2.50
		Taq酶(2U/μL)	1.25
dNTPs(10mM)	0.5
		ddH<sub>2</sub>O	18.75

表3 PCR反应条件

步骤	反应温度(℃)	时间	循环数
				预变性	94	3min	—
变性	94	45s	35
				退火	48	45s	35
延伸	72	60s	35
				延伸	72	10min	—

将上述PCR分别得到的短须库蠓COⅠ产物和短须库蠓Cyt b产物于4℃保存备用。

4、PCR扩增产物检测

取5μL短须库蠓COⅠ产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(130V电压，电泳35min)，溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱分别如图1所示，其中，泳道1～3均为短须库蠓的COⅠ基因，检出大小约为643bp的条带，泳道4为空白对照。M为2000bp的DNA Ladder Marker；同理，取5μL短须库蠓Cyt b产物，与上述短须库蠓COⅠ产物相同的检测方法检测，得到的电泳图谱分别如图2所示，其中，泳道1～3均为短须库蠓的Cyt b基因，检出大小约为414bp的条带，泳道4为空白对照，M为2000bp的DNA Ladder Marker。

5、基因序列测定

分别选取3～5个电泳效果较好的短须库蠓COⅠ产物和短须库蠓Cyt b产物送专业生物公司进行双向测序。所得基因序列经校正拼接后即分别为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2。

实施例2待测库蠓的鉴定

待测库蠓的鉴定，其包括以下步骤：

S1:从待测的库蠓组织中分离提取DNA；

(1)采用灯诱法采集待测库蠓，采获的待测库蠓经冷冻处死后成标本直接保存于95％酒精中。

(2)取出保存于95％酒精中的待测库蠓标本，在解剖镜下进行解剖，除胸部外其余部分制成玻片标本用于形态鉴定。将待测库蠓胸部单独编号后，并确保与玻片标本一一对应。若需较长时间保存，则应将装有待测库蠓胸部组织部位的PCR管置于-20℃冰箱冻存。

(3)采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，从待测库蠓胸部中提取待测库蠓基因组DNA(文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京：科学出版社，2010.278-286)，提取的DNA样品于-20℃保存备用。

S2:以S1中得到的DNA为模板，采用合成的COⅠ基因序列引物(正向引物：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3’，反向引物：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3’)通过聚合酶链式反应扩增得COⅠ产物，并于4℃保存备用。其中，PCR中加入的各物质的含量如表1所示，PCR反应条件如表2所示：

表1 PCR反应体系各物质成分的含量(以25μL为例)

成分	体积(μL)
		DNA模板	1
正向引物(10μM)	0.5
		反向引物(10μM)	0.5
10×缓冲液	2.50
		Taq酶(2U/μL)	1.25
dNTPs(10mM)	0.5
		ddH<sub>2</sub>O	18.75

表2 PCR反应条件

步骤	反应温度(℃)	时间	循环数
				预变性	94	3min	—
变性	94	45s	35
				退火	48	45s	35
延伸	72	60s	35
				延伸	72	10min	—

S3:以S1中得到的DNA为模板，采用Cyt b基因序列引物(正向引物为：5’GGACAAATATCATTTTGAGGAGCWACAG3’，反向引物为：5’ATTACTCCTCCTAATTTATTAGGAATTG3’)通过聚合酶链式反应扩增得Cyt b产物，并于4℃保存备用。PCR中加入的各物质的含量如表1所示，PCR反应条件如表2所示。

S4:将S2和S3分别得到的COⅠ产物和Cyt b产物分别经电泳分离条带。

电泳分离的方法为：取5μL COⅠ产物或Cyt b产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(130V电压，电泳35min)，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测。COⅠ产物和Cyt b产物电泳图谱如图3和图4所示，其中，图3中的泳道1为阳性对照，泳道2为待测库蠓的COⅠ基因，检出大小约为643bp的条带，泳道3为空白对照。M为2000bp的DNA Ladder Marker。图4中的泳道1为阳性对照，泳道2为待测库蠓的Cyt b基因，检出大小约为414bp的条带，泳道3为空白对照。M为2000bp的DNA Ladder Marker。

由图3看出本实施例的待测库蠓DNA可特异性扩增出大小约643bp的目的条带，将PCR产物送专业生物公司进行双向测序。经序列比对，所得序列与SEQ ID NO.1的同源性大于99％，可初步判定该待测组织为短须库蠓。同时，从图4看出本实施例的待测库蠓DNA也可特异性扩增出大小约414bp的目的条带，将PCR产物送专业生物公司进行双向测序。经序列比对，所得序列与SEQ ID NO.2的同源性也大于99％，即可确定该待测库蠓为短须库蠓。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 福建国际旅行卫生保健中心（福建出入境检验检疫局口岸门诊部）

<120> 短须库蠓特异基因及其分子鉴定方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 643

<212> DNA

<213> 短须库蠓(Culicoides brevis)

<400> 1

tttatacttt atttttggca cctgagcagg aatagtcgga acttccctaa gcatcttaat 60

tcgaactgaa ttaagccatc caggagcttt aattggcaac gaccaaattt ataatgtaat 120

tgtaactgcc catgcatttg taatgatttt ttttatagta ataccaatta taattggggg 180

gtttggtaat tgactagtcc ctttaatact cggggcccca gatatagctt ttccacgaat 240

aaataatata agcttttgaa tattgccccc atcaatttct ttacttttag ttagtagcct 300

agtagaaaat ggggctggaa ctggatgaac tgtttatccc cccctttctg ctaatatatc 360

ccatgccgga gcctctgtag atcttgctat tttttcactt cacttagcag gtatttcatc 420

aattttaggt gccgtaaatt tcatcactac aattattaat atacgatcca gaggaattac 480

ttttgatcga ataccgttat ttgtttgatc agtcttaatc acagctattt tattactttt 540

atcactaccc gtcttagctg gggccatcac aatacttctt acagaccgta atcttaatac 600

ttcttttttt gacccagcgg gaggaggaga ccccattctt tac 643

<210> 2

<211> 414

<212> DNA

<213> 短须库蠓(Culicoides brevis)

<400> 2

ttattacaaa tttactatca gcaatcccat atttaggaca aacattagtc caatgattat 60

gggggggatt tgccgtagat aatgcaactc taacacgatt ttttaccttt cattttttaa 120

taccattcat aattatagga gccacaataa ttcatttact atttcttcat caaacaggat 180

ctaataaccc cctaggtatt tcatcaaata gaaataaaat ttcattccac ccatatttta 240

tttataaaga ccttgtggga ttttttttaa tactaataat attaatctct ttatgtttaa 300

tatccccata tcttttagga gacccagata attttgtgcc cgctaaccca ttagtaaccc 360

caattcatat ccaaccagaa tgatattttt tatttgcata tgcaatttta cggt 414

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggacaaatat cattttgagg agcwacag 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attactcctc ctaatttatt aggaattg 28

Claims (8)

1.短须库蠓的特异基因，其特征在于：所述特异性基因为COⅠ基因、Cyt b基因中的一种或两种的组合，COⅠ基因的序列为SEQ ID NO.1，所述Cyt b基因序列为SEQ ID NO.2。

2.如权利要求1所述的短须库蠓特异基因扩增引物，其特征在于：所述COⅠ基因的引物序列为：

正向引物：5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’，

反向引物：5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’。

3.如权利要求1所述的短须库蠓特异基因扩增引物，其特征在于：所述Cyt b基因的引物序列为：

正向引物为：5’GGACAAATATCATTTTGAGGAGCWACAG 3’，

反向引物为：5’ATTACTCCTCCTAATTTATTAGGAATTG 3’。

4.一种短须库蠓的分子鉴定方法，其特征在于，其包括以下步骤：将待测的昆虫DNA序列，分别与短须库蠓COⅠ基因和Cyt b基因序列同源性比对，当同源性均达到98％以上，则判断为待测的昆虫为短须库蠓。

5.如权利要求4所述短须库蠓的分子鉴定方法，其特征在于：所述昆虫DNA分别采用COⅠ基因扩增引物和Cyt b基因扩增引物，进行扩增，分别得到COⅠ目的产物和Cyt b目的产物，进行测序后，再与短须库蠓COⅠ基因和Cyt b基因同源性比对。

6.如权利要求4所述的短须库蠓的分子鉴定方法，其特征在于，其包括以下步骤：

S1:从待测的昆虫组织中分离提取DNA；

S2:将所提取得到的DNA为模板，采用COⅠ基因引物通过聚合酶链式反应扩增得COⅠ产物；

S3:将所提取得到的DNA为模板，采用Cyt b基因引物通过聚合酶链式反应扩增得Cyt b产物；

S4:将所得到的COⅠ产物和Cyt b产物分别经电泳分离检测，若COⅠ产物分离得到大小为500～750bp的条带，则保存为第一目的条带；若Cyt b产物分离得到大小为400～500bp的条带，则保存为第二目的条带；

S5:将所得到的第一目的条带和第二目的条带分别测序得到第一序列和第二序列；若第一序列与SEQ ID NO.1的基因序列，且第二序列与SEQ ID NO.2的基因序列同源性均达到98％以上，则可判断为待测的昆虫为短须库蠓。

7.如权利要求6所述的短须库蠓的分子鉴定方法，其特征在于:所述COⅠ基因的引物序列为：

正向引物：5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’，

反向引物：5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA3’。

8.如权利要求6所述的短须库蠓的分子鉴定方法，其特征在于：所述Cyt b基因的引物序列为：

正向引物为：5’GGACAAATATCATTTTGAGGAGCWACAG 3’，

反向引物为：5’ATTACTCCTCCTAATTTATTAGGAATTG 3’。