CN109295239A - 边鸡分子标记的筛选方法及其应用 - Google Patents

边鸡分子标记的筛选方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109295239A
CN109295239A CN201811299022.7A CN201811299022A CN109295239A CN 109295239 A CN109295239 A CN 109295239A CN 201811299022 A CN201811299022 A CN 201811299022A CN 109295239 A CN109295239 A CN 109295239A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chicken
screening technique
molecular labeling
genetic
snp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811299022.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109295239B (zh
Inventor
张会永
朱静
韩威
李国辉
朱云芬
殷建玫
苏军
苏一军
盛中伟
沈海玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Institute Poultry Sciences
Original Assignee
Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Institute Poultry Sciences filed Critical Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority to CN201811299022.7A priority Critical patent/CN109295239B/zh
Publication of CN109295239A publication Critical patent/CN109295239A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109295239B publication Critical patent/CN109295239B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种边鸡分子标记的筛选方法及其应用，涉及遗传学领域。该边鸡分子标记的筛选方法，包括通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较边鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出边鸡的分子标记，缓解了目前边鸡保种效果的评价过程中缺少高效的分子生物学方法导致的边鸡遗传分化研究成本高、精确度低的技术问题，达到了高效快速筛选出用于评价边鸡保种效果的分子标记技术效果。本发明还提供了边鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记的应用，缓解了边鸡研究中缺少高效的分子生物学标记和筛选方法的技术问题。

Description

边鸡分子标记的筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及遗传学领域，尤其是涉及一种边鸡分子标记的筛选方法及其应用。
背景技术
我国家禽品种是几千年来自然生态环境和不同的民族文化所赋予的宝贵资源，在上千年的饲养驯化过程中，逐渐形成许多优良特性。边鸡是我国一个特殊的地方品种，具有体型大、蛋重大、肉质好、适应性强、耐粗抗寒的优良特性。原产于内蒙古自治区与山西省北部相毗连的长城内外一带，因当地人民视长城为“边墙”，所以称边鸡。近年来，随着引进品种的冲击及山区人们的外迁，边鸡品种已濒临灭绝。国家级地方鸡种基因库于2006年引入进行异地保护。为更好的了解和保护这一宝贵的品种资源，有必要利用现代先进的分子生物学方法重新认识这一品种，利用品种特异性的分子标记来评价这一品种的保护状况，而不受常规的形态学标记手段及环境因素的影响，也便于对边鸡这一宝贵的品种资源进行开发利用。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指基因组DNA序列中由单个核苷酸的突变引起的多态性。染色体DNA同一位置的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最常见的多态形式，具有很高的遗传稳定性。传统的SNP检测方法采用PCR-单链构象多态性、毛细管电泳及变性高效液相色谱等，由于传统方法均通过凝胶电泳进行分析因此通过量受到限制，因此测序方法在SNP的检测中拥有广阔的应用前景。
目前使用测序方法检测SNP的主要手段为SNPs芯片技术，然而SNPs芯片技术存在操作复杂、假阳性、检测成本高的缺点，并且SNPs芯片探针设计需要有目标物种高质量的参考基因组信息，不适于非模式生物及珍惜生物等没有基因组信息的物种。
全基因组关联分析(genome-wide association analysis，GWAS)是当前用于功能基因发掘的最常用手段，然而，其仅针对单个性状，且需要建立分离群体，并不适于品种特性的全面评价。自然选择和人工选择作用会在动物基因组上留下选择信号(selectionsignal)，对这些选择信号进行分析是发掘品种特性功能基因的最有效技术手段，通过多种不同类型品种基因组的比较，可在全基因组水平上对单个品种资源的特性有充分、全面的认识。
品种资源的保护目标是尽可能地保持品种的特征、特性不丢失，因此开展品种资源保护的前提是充分认识品种的特征特性。目前，对边鸡的认识仍局限于常规的外貌特征、屠宰性能、繁殖性能、肉蛋品质等，对其种质特性内涵及相关功能基因仍知之甚少，而这些特性正是保种效果评价及开发利用的核心内容。现阶段，边鸡保种效果的评价主要依赖于常规表型性状记录、系谱记录和低密度DNA分子标记信息，通量低，精确度差，不能客观的评价边鸡保种效果如何；也限制了边鸡品种资源的开发利用。因此，快速高效成本低并且适于非模式物种的分子生物学标记方法是评价边鸡保种效果及开发利用所需要的技术手段。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种边鸡分子标记的筛选方法，缓解了目前对边鸡研究中缺少高效的分子生物学方法导致的成本高、精确度低的技术问题。
本发明的目的还在于提供了一种边鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记的应用，缓解了边鸡保种效果评价过程及开发利用中缺少分子生物学标记的技术问题。
为实现上述目的，特采用以下技术方案：
一种边鸡分子标记的筛选方法，所述方法包括通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较边鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出边鸡的分子标记。
优选地，所述的高通量测序为RAD-seq。
优选地，采用ddRAD建库方式构建pair-end文库；
优选地，所述的文库长度范围在300～500bp。
优选地，SNP质控条件包括Q20>95％、SNP depth>60％、所有样品检出率SNP Callrate>70％、单个样品检出率SNP Call rate>90％和MAF>0.05。
优选地，所述计算遗传统计量包括计算群体分化指数Fst值、群体θπ值、连锁不平衡LD和群体遗传聚类分析。
优选地，所述筛选方法包括选择清除分析和基因功能富集分析。
优选地，所述选择清除分析基于群体分化Fst值和群体θπ值计算。
优选地，所述基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法。
优选地，筛选出的所述边鸡的分子标记与边鸡抗耐寒、抗应激、抗病性和高繁殖力相关。
本发明还提供了一种上述边鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记在如下(x1)-(x5)中的应用：(x1)个体识别；(x2)家系管理；(x3)种质资源鉴定；(x4)新品系选育；(x5)遗传多态性位点分析。
本发明提供的边鸡分子标记的筛选方法采用了高通量测序技术检测边鸡中的SNP位点，包含多重分析，可对边鸡鸡种进行全面有效的种质分析，筛选得到边鸡的受选择基因作为边鸡种质特性的分子标记，用来评价边鸡保种效果，成本低，数据量丰富，检测精度高，为后续的边鸡的种质鉴定和保种效果的监测提供了技术保障。本发明提供的边鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记的应用，可应用于评价边鸡的保种效果、品种特性评价、边鸡新品系的选育、遗传分化分析等领域，应用广泛。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的边鸡SNP在染色体上的分布图；
图2为本发明实施例1提供的边鸡和其它品种LD随距离增长的衰减图；
图3为本发明实施例1提供的边鸡及其他鸡种聚类图；
图4为本发明实施例1提供的边鸡群体受到选择的基因信号分布(边鸡VS白耳鸡)图；
图5为本发明实施例1提供的边鸡受选择的基因GO注释分类统计图；
图6为本发明实施例1提供的边鸡受选择基因的KEGG通路注释统计图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的。
本发明提供了一种边鸡分子标记的筛选方法，通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较边鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出边鸡的分子标记。
传统的SNP检测方法采用PCR-单链构象多态性、毛细管电泳及变性高效液相色谱等，由于传统方法均通过凝胶电泳进行分析因此通过量受到限制，因此，本实施方式中选用高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，全面的分析了边鸡与其他鸡种的SNP，通过生物信息学方法对大数据量的SNP位点进行统计分析，从而分析边鸡进化的方式。
在一个优选的实施方式中，上述的其他鸡种群体包括白耳黄鸡、藏鸡、茶花鸡、仙居鸡、固始鸡、大骨鸡、北京油鸡、东乡绿壳蛋鸡、惠阳胡须鸡、金湖乌凤鸡、狼山鸡、萧山鸡、安义瓦灰鸡、大围山微型鸡、文昌鸡、瓢鸡、斗鸡、鹿苑鸡、隐性白羽肉鸡和安卡红鸡。这些鸡种囊括蛋用型、肉用型、兼用型、观赏、药用型地方品种和国外标准鸡种，广泛分布于我国青藏高原区、蒙新高原区、黄土高原区、西南山地区、东北区、黄淮海区、东南区等地理生态区域，充分代表了差异化品种类型，能准确地鉴定出边鸡品种的特异性分子标记。
在一个可选的实施方式中，上述高通量测序为RAD-seq。
限制性酶切位点关联DNA测序技术(restriction-site-associated DNAsequencing，RAD-seq)是在二代测序技术基础上发展起来的一种简化基因组技术。简化基因组测序(reduced-representation sequencing)是在新一代测序基础上发展起来的一种新型测序方法，该方法利用限制性内切酶对基因组进行酶切，只选取基因组特定区域进行测序，从而降低了基因组的复杂程度。RAD测序文库构件对基因组DNA片段进行酶切和随机打断，选取一端带有酶切位点，另一端为随机打断点的片段进行建库测序。RAD-seq能够降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP。
在一个可选的实施方式中，采用ddRAD建库方式构建pair-end文库。
在一个优选的实施方式中，所述的文库长度范围在300～500bp。
采用ddRAD双酶切建库方式能够在改善测序效率的同时减少试验成本，单酶切RAD建库，利用单一的限制性内切酶和随机打断对基因组进行切割，由于缺少方向性，酶切位点两边相邻的100bp序列都可能被测出，序列分散度高，准确性低，而采用双酶切系统对基因组进行切割并且辅以对酶切后产物大小的选择，这样可以把序列固定在两端为不同酶切位点并且长度为500bp左右。采用ddRAD双酶切建库的方式，得到的文库长度大小适中，测序效率高，既不容易测出过多的接头序列导致数据质量低，也不容易由于文库片段过长导致文库中间部分测序不充分，数据流失。
在一个可选的实施方式中，SNP质控条件包括Q20>95％、SNP depth>60％、所有样品检出率SNP Call rate>70％、单个样品检出率SNP Call rate>90％和MAF>0.05。
SNP depth为SNP的测序深度，SNP Call rate为SNP位点检出率；MAF为最小等位基因频率，通过上述质控能准确鉴定出SNP标记。
在一个可选的实施方式中，上述计算遗传统计量包括计算群体分化指数Fst值和群体θπ值、连锁不平衡LD和群体遗传聚类分析。
在一个优选的实施方式中，利用Haploview软件对所有品种进行连锁不平衡(LD)分析。
连锁不平衡(linkage disequilibrium)是指在某一群体中，不同座位上某两个基因同时遗传的频率明显高于预期的随机频率的现象。一般来说，在连锁不平衡分析中，野生种的LD值较低，而驯化种由于受到了正选择的作用，LD值就会偏大。
在一个优选的实施方式中，利用admixture软件进行群体遗传聚类分析。
在一个可选的实施方式中，上述筛选方法包括选择清除分析和基因功能富集分析。
在一个可选的实施方式中，上述选择清除分析基于群体分化Fst值和群体θπ值计算。
选择清除分析是指基因组某区域由于受到了正向选择而消除多态性在物种基因组上留下选择印记。栽培或驯化的物种发生选择清除的区域遗传多样性显著降低。
在一个优选的实施方式中，利用PLINK软件检测选择信号，进行选择清除分析，选择信号检测条件为以100kb为窗口，10kb为step进行滑动的θπ值和Fst分布计算。
群体遗传分化是指物种群体间存在明显的等位基因频率差异，通常遗传漂变和选择过程均可造成群体间的遗传分化。群体遗传分化指数Fst是检测群体间遗传分化的重要指标之一，而对全基因组范围内的单个位点估算Fst值，就能对每个位点分析其分化程度，最终实现选择信号检测，0≤Fst≤1，Fst越接近1表示亚种群间的种群分化越明显。
群体θπ值反映了群体基因组碱基多样性。θπ分析，通过以一定大小的窗口在基因组上滑动，并对滑动窗口中群体遗传信息的差异进行分析。
在一个可选的实施方式中，基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法；优选地，利用在线软件DAVID进行基因富集分析。
在研究中多个基因直接注释的结果是得到大量的功能节点，这些功能具有概念上的交叠现象，导致分析结果冗余，不利于进一步的精细分析，因此需要对得到的功能节点加以过滤和筛选，因此，在本发明的一个优选的实施方式中，采用了基于GO或KEGG数据库的富集方法。
基因本体数据库(gene ontology，GO)涵盖了基因生物学过程、分子功能和细胞组分三个方面，GO数据库通过控制注释词汇的层次结构从不同层面查询和使用基因注释信息，从整体上看，GO注释系统是一个有向无环图结构，包含基因生物学过程、分子功能和细胞组分三个节点，注释系统中每一个节点都是对基因或蛋白质的描述，因此，一个基因可以从三个方面得到注释。京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG)是系统分析基因功能和基因组信息的数据库，整合了基因组学、生物化学以及功能组学的信息，KEGG提供了整合代谢途径查询，包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等代谢及有机生物的降解。
在一个可选的实施方式中，筛选出的边鸡分子标记与抗耐寒、抗应激、抗病性和高繁殖力相关。
边鸡群体与其它地方鸡种群体相比较，通过Fst和θπ检验鉴定出受到强烈选择的基因8个，将这8个基因进行GO和KEGG功能注释分析，这些差异基因主要富集在代谢、神经受体—配体的相互作用、MAPK、血管内皮生长因子等信号通路，SLC30A7、NOS2、HP1BP3用于评价边鸡抗寒耐缺氧、抗应激的特性；DNAJA1、PTGS2、VLDLR、HSD17B4、BNC2基因用于评价边鸡高繁殖性能；PLA2G4A、TNFAIP8基因用于评价边鸡的抗病性。
本发明还提供了边鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记在如下(x1)-(x4)中的应用：(x1)个体识别；(x2)家系管理；(x3)种质资源鉴定；(x4)新品系选育；(x5)遗传多态性位点分析。
为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明实施例中建库测序部分由南京集思慧远生物科技有限公司完成；本发明实施例中所用试剂全部为市售常规试剂；边鸡保种群体与其他品种保种群体来自于江苏省家禽科学研究所的国家级地方鸡种基因库。
实施例1边鸡分子标记的筛选
(a)血液样品采集：边鸡保种群体与其他品种保种群体来自于江苏省家禽科学研究所的国家级地方鸡种基因库，每个群体按照家系选择20个个体(10公、10母)，个体间无亲缘关系。翅静脉采血1mL～1.5mL，柠檬酸钠(ACD)抗凝，-20℃保存备用。
(b)DNA样品获取：常规酚-氯仿法提取所有品种基因组DNA。将获得的DNA进行质检，包括nanodrop初步检测DNA样品浓度；电泳检测DNA的完整性，包括DNA有无降解，是否存在蛋白质和RNA等其他杂质污染；Qubit 2.0对DNA样品进行准确定量，选取质量≥1ug的样品。将合格样品置于-80℃保存，以备建库测序使用。
(c)建库测序：质检合格的样品采用ddRAD建库的方式构建长度范围在300～500bp的pair-end文库，然后进行RAD-seq简化基因组测序。将得到的raw reads数据进行过滤得到clean reads，过滤标准为：①去除接头污染的reads；②去除质量值小于5的碱基占整条reads比例超过50％的reads；③去掉测为N的碱基占整条reads比例超过10％的reads。
(e)SNP的检测主要使用GATK和samtools软件工具包实现。质控条件包括Q20>95％、SNP Depth>60％、所有品种SNP Call Rate>70％、单个品种SNP Call Rate>90％和MAF>0.05。通过数据质控，在边鸡群体中鉴定出SNP 319723个，SNP分布数量与染色体长度总体上呈正相关，结果如图1所示。
(f)利用Haploview软件对所有品种进行连锁不平衡(LD)分析发现在总体范围内，边鸡群体和其它地方鸡种群体各等位基因不存在强烈的连锁不平衡现象，结果如图2所示。
(g)PopGen软件计算群体分化指数(Fst)，得到边鸡群体平均Fst为0.154，和其它群体比较未发生显著分化。
(h)admixture软件进行群体遗传聚类分析，结果表明，边鸡群体与大骨鸡、安义瓦灰鸡狼山鸡聚为一类，亲缘关系较近，结果如图3所示。
(i)选择信号检测采用PLINK软件，以100kb为窗口，10kb为step进行滑动的θπ值和Fst分布计算，得到边鸡群体受到选择基因分布图。结果如图4所示，以边鸡和白耳鸡的比较结果为例。
(j)利用DAVID在线软件(https://david.ncifcrf.gov/)对受选择的基因进行GO注释和KEGG分析，确定受选择的基因与边鸡群生物学特性的关系，结果如图5和图6所示，在其他地方鸡种群体中未检测到上述8个基因受到强烈选择的现象，筛选得到的受选择基因有：SLC30A7、NOS2、HP1BP3、PTGS2、VLDLR、DNAJA1、HSD17B4、BNC2、PLA2G4A和TNFAIP8。
边鸡群体与其它地方鸡种群体相比较，通过Fst和θπ检验鉴定出受到强烈选择的基因8个，将这8个基因进行GO和KEGG功能注释分析，这些差异基因主要富集在代谢、神经受体—配体的相互作用、MAPK、血管内皮生长因子等信号通路，SLC30A7、NOS2、HP1BP3用于评价边鸡抗寒耐缺氧、抗应激的特性；DNAJA1、PTGS2、VLDLR、HSD17B4、BNC2基因用于评价边鸡高繁殖性能；PLA2G4A、TNFAIP8基因用于评价边鸡的抗病性。
附图中缩写表示：BE-白耳黄鸡；ZZ-藏鸡；CH-茶花鸡；XJ-仙居鸡；GS-固始鸡；DG-大骨鸡；BY-北京油鸡；DX-东乡绿壳蛋鸡；HX-惠阳胡须鸡；JH-金湖乌凤鸡；LS-狼山鸡；XS-萧山鸡；WH-瓦灰鸡；WX-大围山微型鸡；WC-文昌鸡；PJ-瓢鸡；DJ-斗鸡；LY-鹿苑鸡；和RW-隐性白羽肉鸡；AK-安卡鸡。
实施例2边鸡分子标记的应用
(a)边鸡保种群个体血液采集：使用医用一次性注射器采集保种群随机选留公、母鸡翅静脉全血0.5～1.0ml(公鸡不少于10只，母鸡不少于20只)，采集后迅速注入含有2μL0.5mol/LNa2EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用。
(b)DNA提取和质量检测：常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2～0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；将合格样品置于-80℃保存，以备SNP检测使用。
(c)边鸡品种特异性基因的SNP标记检测
引物设计：对筛选得到8个边鸡品种特性基因的SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位点的一段序列。利用鸡基因组DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增。
PCR扩增和检测：PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为100ng/μL，2μL10×PCRBuffer，1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，ddH2O13.3μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用；把PCR产物送入上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。
(d)边鸡保种效果的评价，结果如表1所示：
表1边鸡保种效果评价
本发明采用计算机模拟方法研究了一对基因在群体内的实际频率和假设不同基因频率和不同群体规模闭锁群体内单个双等位基因座位的遗传漂变，发现不同初始基因频率下4种群体规模100次重复模拟中等位基因A发生丢失的概率。可以看出：无论在何种初始频率下，等位基因A固定的次数均随着群体规模的降低而升高，且A发生固定的概率受其初始频率的影响较为明显。当初始频率为0.1时，规模为100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为4.4％和1.49％，当初始频率为0.5时，100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为2.4％和0.8％。即使到了20世代，规模为400只的群体发生A的丢失或固定仅为1.2％。当初始频率为0.9时，100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为0.4％和0.1％。这表明，初始频率过低将会加速基因在群体中的丢失(见表2)。
表2不同基因频率和群体规模下1对等位基因固定概率的数学模型理论预测结果
将边鸡品种特性记基因的等位基因频率75％作为临界点，大于75％的基因频率代表保种效果较好，由边鸡保种效果的评价表表1可知在保种过程中未发生较强的遗传漂变。
实施例3边鸡分子标记在新品系选育中的应用
在筛选出边鸡品种的特性的基因基础上，我们进一步的分析上述每个基因的SNP。
(a)边鸡保种群个体血液采集：使用医用一次性注射器采集保种群随机选留公、母鸡翅静脉全血0.5～1.0ml(公鸡不少于10只，母鸡不少于20只)，采集后迅速注入含有2μL0.5mol/L Na2EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用。
(b)DNA提取和质量检测：常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2～0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；将合格样品置于-80℃保存，以备SNP检测使用。
(c)边鸡品种特异性基因的SNP标记检测
引物设计：对筛选得到8个边鸡品种特性基因的SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位点的一段序列。利用鸡基因组DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增。
PCR扩增和检测：PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为100ng/μL，2μL10×PCRBuffer，1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，ddH2O13.3μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用；把PCR产物送入上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。
(4)边鸡新品系的培育
根据PCR扩增和测序结果，分析个体基因型，选择优势基因型个体留种，30个个体SNP位点基因型如表3所示：
表3 30个个体SNP位点基因型
统计结果如下：AA型6个、GG型6个、AG型18个，优势基因型为AA型，根据统计结果选留6个AA型个体。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种边鸡分子标记的筛选方法，其特征在于，所述方法包括通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较边鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出边鸡的分子标记。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的高通量测序为RAD-seq。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，采用ddRAD建库方式构建pair-end文库；
优选地，所述的文库长度范围在300～500bp。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，SNP质控条件包括Q20>95％、SNPdepth>60％、所有样品检出率SNP Call rate>70％、单个样品检出率SNP Call rate>90％和MAF>0.05。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述计算遗传统计量包括计算群体分化指数Fst值、群体θπ值、连锁不平衡LD和群体遗传聚类分析。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括选择清除分析和基因功能富集分析。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述选择清除分析基于群体分化Fst值和群体θπ值计算。
8.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，筛选出的所述边鸡的分子标记与边鸡抗耐寒、抗应激、抗病性和高繁殖力相关。
10.如权利要求1-9任一项所述的边鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记在如下(x1)-(x5)中的应用：
(x1)个体识别；
(x2)家系管理；
(x3)种质资源鉴定；
(x4)新品系选育；
(x5)遗传多态性位点分析。
CN201811299022.7A 2018-11-01 2018-11-01 边鸡分子标记的筛选方法及其应用 Active CN109295239B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811299022.7A CN109295239B (zh) 2018-11-01 2018-11-01 边鸡分子标记的筛选方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811299022.7A CN109295239B (zh) 2018-11-01 2018-11-01 边鸡分子标记的筛选方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109295239A true CN109295239A (zh) 2019-02-01
CN109295239B CN109295239B (zh) 2022-05-10

Family

ID=65145421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811299022.7A Active CN109295239B (zh) 2018-11-01 2018-11-01 边鸡分子标记的筛选方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109295239B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564832A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 广东省农业科学院动物科学研究所 一种基于高通量测序平台的基因组育种值估计方法与应用
CN114921572A (zh) * 2022-06-17 2022-08-19 江西农业大学 一种用于鉴别泰和乌鸡品种的snp分子标记及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907867A (zh) * 2016-05-26 2016-08-31 江苏省家禽科学研究所 用于鉴定狼山鸡种特异性的snp标记及测定snp位点的方法
CN106086172A (zh) * 2016-06-13 2016-11-09 江苏省家禽科学研究所 一种鸡保种群个体选配优化的方法
CN106434867A (zh) * 2016-07-28 2017-02-22 江苏省家禽科学研究所 监测家禽保种效果的snp标记筛选方法及其在鸡保种上的应用、以及snp标记的鉴定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907867A (zh) * 2016-05-26 2016-08-31 江苏省家禽科学研究所 用于鉴定狼山鸡种特异性的snp标记及测定snp位点的方法
CN106086172A (zh) * 2016-06-13 2016-11-09 江苏省家禽科学研究所 一种鸡保种群个体选配优化的方法
CN106434867A (zh) * 2016-07-28 2017-02-22 江苏省家禽科学研究所 监测家禽保种效果的snp标记筛选方法及其在鸡保种上的应用、以及snp标记的鉴定方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHENGXIAO ZHAI ET AL.: "SNP discovery and genotyping using restriction-site-associated DNA sequencing in chickens", 《ANIM GENET》 *
宋国华 著: "《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》", 30 November 2011, 军事医学科学出版社 *
李国辉 等: "基于RAD-seq技术分析边鸡保种群体的遗传进化", 《农业生物技术学报》 *
李慧芳 等: "中国地方鸡种遗传多样性和品种贡献率分析", 《家畜生态学报》 *
王洋坤 等: "RAD-seq技术在基因组研究中的现状及展望", 《遗传》 *
王洪志 等: "基于RAD-seq简化基因组测序评价鹿苑鸡不同保种群保种现状", 《畜牧兽医学报》 *
翟正晓: "基于RAD简化基因组测序技术的13种中国地方优良鸡品种SNPs多态性图谱构建及群体遗传学分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
韩威 等: "基于RAD-seq简化基因组测序的19个地方鸡种遗传进化研究", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564832A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 广东省农业科学院动物科学研究所 一种基于高通量测序平台的基因组育种值估计方法与应用
CN110564832B (zh) * 2019-09-12 2023-06-23 广东省农业科学院动物科学研究所 一种基于高通量测序平台的基因组育种值估计方法与应用
CN114921572A (zh) * 2022-06-17 2022-08-19 江西农业大学 一种用于鉴别泰和乌鸡品种的snp分子标记及其应用
CN114921572B (zh) * 2022-06-17 2023-05-05 江西农业大学 一种用于鉴别泰和乌鸡品种的snp分子标记及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109295239B (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109295238A (zh) 东乡绿壳蛋鸡基因组snp分子标记的筛选方法及其应用
CN109207610A (zh) 河南斗鸡基因组snp分子标记的筛选方法及其应用
CN106086172B (zh) 一种鸡保种群个体选配优化的方法
CN107345248A (zh) 基于大数据的基因与位点风险评估方法及其系统
An et al. Introgression threatens the genetic diversity of Quercus austrocochinchinensis (Fagaceae), an endangered oak: a case inferred by molecular markers
CN112746110B (zh) 基于全基因组测序筛选的与广西麻鸡体尺相关的snp分子标记组合及应用
CN115838808A (zh) 一种鉴定汶上芦花鸡品种的分子标记及其应用
CN109321665B (zh) 金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法及其应用
CN109680078A (zh) 利用snp位点选择信号梯度变化指数评估经济性状候选基因的方法
CN109295239A (zh) 边鸡分子标记的筛选方法及其应用
CN116516029A (zh) 一种金鲳全基因组育种芯片及应用
CN109486961B (zh) 一种拟穴青蟹高密度遗传图谱的构建方法
Bernatchez et al. Mitochondrial DNA sequence heterogeneity among James-Hudson Bay anadromous coregonines
CN105525027A (zh) Snp标记及其应用、检测方法
Hernández-Alonso et al. Redefining the evolutionary history of the rock dove, Columba livia, using whole genome sequences
CN105209642A (zh) 基因组测序和表观遗传分析的方法
CN105907860B (zh) 一种利用|Δ(SNP-index)|进行性状定位的QTL-seq方法及其应用
CN116426647A (zh) 一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合及其应用
Gwee et al. The interplay of colour and bioacoustic traits in the differentiation of a Southeast Asian songbird complex
CN113186297B (zh) 用于长白山中华蜜蜂品种鉴定的snp标记及鉴定方法
CN109810982A (zh) 短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法
CN105504037A (zh) 基因及其应用
CN105543235B (zh) 基因及其应用
Coutinho et al. Association mapping for sugarcane quality traits at three harvest times
CN111613271B (zh) 一种预测畜禽数量性状显性遗传效应的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant