CN113186297B - 用于长白山中华蜜蜂品种鉴定的snp标记及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于长白山中华蜜蜂品种鉴定的SNP标记及鉴定方法，属于蜜蜂鉴定技术领域。本发明公开了22个长白山中华蜜蜂特异性SNP位点，以特异性SNP标记鉴定为主，几何形态测量学特征鉴定为补充，建立了一种应用22个SNP位点和5个翅形态学特征的鉴定长白山中华蜜蜂生态型蜂种的方法。本发明公开的SNP标记和鉴定方法可用于长白山中华蜜蜂种质资源遗传多样性分析、长白山中华蜜蜂分子标记辅助育种和蜂种纯度鉴定、与中国中华蜜蜂其他地理生态型的遗传分化、对本地环境的适应性进化以及濒危长白山中华蜜蜂种质资源的保护具有重要理论与应用价值，对更加深入的保护长白山中华蜜蜂种群具有重要意义。

Description

用于长白山中华蜜蜂品种鉴定的SNP标记及鉴定方法
技术领域
本发明涉及蜜蜂鉴定技术领域，特别是涉及用于长白山中华蜜蜂品种鉴定的SNP标记及鉴定方法。
背景技术
长白山中华蜜蜂是长白山地区特有的蜜蜂品种，长期以来在长白山区特定的气候、蜜源条件下形成了繁育快、维持强群、采集力强、抗逆性强、性情温顺、抗寒等优良性状，极具保护和开发价值。且长白山中华蜜蜂是长白山植物区系唯一的中华蜜蜂生态型，在维持和丰富陆地生态系统生物多样性以及提供授粉和其他有价值的生态系统服务等方面的作用十分巨大。然而，长白山中华蜜蜂的群体数量和分布密度呈现出恶性态势。受物种生态入侵、大面积野生动植物栖息地日趋丧失、生物资源过度开发、农业集约化发展、病原微生物感染与扩展、杀虫剂过度使用和滥用以及全球气候变暖和大气污染等生物和非生物因子的影响，种群健康受到胁迫，目前种群数量已不足1万群，处于濒危-维持状态，对蜂种种质资源的保护、鉴定、评价工作迫在眉睫。
目前，中华蜜蜂生态型的鉴定技术，在外部形态层面主要依据形态学差异及其地理分布鉴定，在分子层面主要依据线粒体或微卫星等二代分子标记技术鉴定。基于外部形态的中华蜜蜂蜂种鉴定常利用传统的形态鉴定方法进行鉴定，具体指标包括吻长、右前翅长、右前翅宽等二十余项指标，因而传统形态学鉴定存在操作形态指标较多、步骤繁琐、人为误差大的技术缺陷，且仅通过传统形态学方法无法准确进行中华蜜蜂种质资源的鉴定和纯度分析；基于二代分子标记技术的中华蜜蜂蜂种鉴定，通常采用mtDNA或微卫星标记，当研究目的是制定保种计划和策略或种质资源鉴定等这些对遗传信息准确性要求比较高的研究时，并不能非常准确的评估。
随着第三代分子标记技术SNP标记的发展和基因分型技术的提高，越来越多的濒危种质资源采用SNP标记用于种质鉴定和识别。三代SNP标记技术具有覆盖基因组范围广、SNP标记数目多、不受环境因素影响、变异丰富等优点，能直接反应样品基因水平的差异，基于高密度的SNP标记信息保证了蜂种鉴定的可靠性和准确性。但现有技术中尚缺少能够用于鉴别长白山中华蜜蜂的SNP标记及具体鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供用于长白山中华蜜蜂品种鉴定的SNP标记及鉴定方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过检测长白山中华蜜蜂特有的SNP标记并结合形态学鉴定，实现了长白山中华蜜蜂品种的快速准确鉴别。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
技术方案之一，提供了一组用于长白山中华蜜蜂品种鉴别的SNP标记，所述的SNP分子标记包括如下所示的22个SNP分子标记：
Figure BSA0000240132080000021
Figure BSA0000240132080000031
技术方案之二，提供了一种鉴定长白山中华蜜蜂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测蜜蜂品种的DNA，扩增；
2)对步骤1)获得的扩增产物进行单核苷酸多态性检测并与所述的22个SNP位点进行比较，若所述待测蜜蜂品种满足22个SNP位点中的至少21个，则所述待测蜜蜂样品为长白山中华蜜蜂；若所述待测蜜蜂样品满足SNP位点个数为18个或18个以下，则所述待测蜜蜂样品不是长白山中华蜜蜂；若所述待测蜜蜂样品满足SNP位点个数为19个或20个，则所述待测蜜蜂样品为待定组蜜蜂，进行形态学补充鉴定；
3)对步骤2)中所述的待定组蜜蜂进行形态学补充鉴定，对其翅图像进行分析，判断其是否具有下列特征：
A.在工蜂的前翅外横脉中段1/3处有一分叉突出；
B.前翅相对收缩部位发生在第二中室域的径中横脉与中脉的交叉点和中肘横脉与中脉的交叉点；
C.前翅相对舒张部位发生在第二肘室域的扇脉与肘脉、扇脉之间连接横脉的交叉点、中脉和肘脉的润和脉与肘脉和扇脉之间连接横脉的交叉点、中脉与肘脉的交叉点；
D.后翅相对收缩的部位发生在基室域的径中横脉与径分脉和中脉的两个交叉点；
E.后翅相对扩张的部位发生在肘脉与中脉的交叉点、径脉与径分脉的交叉点；
若待定组蜜蜂满足上述5个形态学特征中的至少4个，则待定组蜜蜂为长白山中华蜜蜂；若待定组蜜蜂满足形态学特征数量为3个或3个以下，则待定组蜜蜂不是长白山中华蜜蜂。
技术方案之三，提供了检测所述的一组用于长白山中华蜜蜂品种鉴别的SNP标记的试剂或所述的鉴定方法在鉴别长白山中华蜜蜂中的应用。
技术方案之四，提供了检测所述的一组用于长白山中华蜜蜂品种鉴别的SNP标记的试剂或所述的鉴定方法在长白山中华蜜蜂纯化选育、分子育种中的应用。
全基因组重测序技术是对已知基因组序列的物种进行个体的基因组测序，并在此基础上针对个体或群体进行差异性分析，通过将测序序列和已知的参考序列进行比对，可以获得目标物种(品种)特有的大量单核苷酸多态性位点、插入缺失位点以及结构变异位点等，该方法具有测序范围广、测序深度深和数据量大、仅需构建小片段文库和实验操作方便的优点。本发明利用全基因组重测序技术鉴定了长白山中华蜜蜂特有的22个SNP位点，可用于鉴定长白山中华蜜蜂。
昆虫翅具有其二维性以及可靠的遗传特性，翅型和翅脉蕴涵着丰富的生态和行为信息，是膜翅目昆虫分类的重要依据。几何形态测量学方法使用坐标点来代替距离和角度，所选坐标点通过缩放、平移和旋转来叠加坐标从而去除由于样本大小、方位和物理性因素的影响，使其能更精确的辨别样本间的微小差异，对比传统的蜜蜂形态指标鉴定具有方法学优势。基于蜂类翅的几何形态测量学分析被很好的应用在种、亚种甚至个体水平的鉴定上。本发明利用几何形态测量学方法，开展长白山中华蜜蜂种群前后翅的形态变异分析，获得种群特异性的长白山中华蜜蜂翅形态特征，可直接应用于该蜂种的鉴定。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了22个长白山中华蜜蜂特异性SNP位点，建立了一种应用22个SNP位点和5个翅形态学特征的鉴定长白山中华蜜蜂生态型蜂种的方法。以特异性SNP标记鉴定为主，几何形态测量学特征鉴定为补充，进行长白山中华蜜蜂蜂种的鉴定和识别。
本发明利用全基因组重测序技术，测序深度覆盖蜜蜂全基因组基因序列，能够全面、准确的检测到长白山中华蜜蜂的特异性SNP信息，具有特异性强、稳定性好的特点，共检测到22个SNP位点，为长白山中华蜜蜂种质资源的生态型鉴别提供了稳定、可靠的分子检测方法。
几何形态测量学作为一种结合统计学和图论的图形定量分析方法在对昆虫的翅结构进行数值量化并进行形态学分析的研究中对比传统的蜜蜂外部形态鉴定具有方法学优势。本发明增加了对候选的待测群体的划分以及进行几何形态测量学的补充鉴定两个步骤，通过外部形态的几何形态测量学的补充鉴定可以增加种群鉴定的准确率和精确度，大大减少对待测样品的误判程度。
本发明所述的SNP标记和翅形态特征，可用于长白山中华蜜蜂种质资源遗传多样性分析、长白山中华蜜蜂分子标记辅助育种和蜂种纯度鉴定、与中国中华蜜蜂其他地理生态型的遗传分化、对本地环境的适应性进化以及濒危长白山中华蜜蜂种质资源的保护具有重要理论与应用价值。
本发明建立了鉴别长白山中华蜜蜂种质资源的方法，弥补了本领域目前尚无鉴别中华蜜蜂生态型分类阶元的分子标记检测技术的不足，实现了对长白山中华蜜蜂种质资源的精准鉴别，对更加深入的保护长白山中华蜜蜂种群，有效利用其为我国蜜蜂育种工作服务，特别是耐寒蜂种的分子选育具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为蜜蜂几何形态测量的翅脉地标点；图中A为前翅，B为后翅；
图2为长白山中华蜜蜂与其他生态型中华蜜蜂相比前翅和后翅的几何形态测量学特征差异图；图中A为前翅，1-20代表地标点LM1-20(FW)，其中地标点1、2、3、9、10位置颜色最深，为主要的变异发生部位，其中相对舒张部位发生在地标点1、2、3部位，相对收缩部位发生在地标点9、10部位；图中B为后翅，1-10代表地标点LM1-10(HW)，其中地标点3、4、5、6位置颜色最深，为主要的变异发生部位，其中相对舒张部位发生在地标点3、4部位，相对收缩部位发生在地标点5、6部位。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。本发明仅描述了优选的方法和材料，但与本文所述相似或等同的任何方法和材料均能够实施本发明。
本发明所使用的材料如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。
实施例中使用的长白山中华蜜蜂采集自长白山区吉林省的吉林市、延边州、通化市、白山市、辽宁省的本溪市，以及黑龙江省的饶河县等6个地区的26个采样点，基本覆盖了中国东北三省长白山脉的整个中华蜜蜂自然分布区。所有样品均来自于种质资源保护区或原始饲养的蜂群，优先选取自然巢房(如树洞蜂巢)及半人工饲养的蜂巢内的样品，每个采样地取1-10个蜂群，每个蜂群随机取30-50只工蜂，无水乙醇浸泡运输，于-80℃超低温冰箱中保存备用。
实施例1
长白山中华蜜蜂特有SNP的筛选
(1)样品选择：随机选择采集的活体健康长白山中华蜜蜂样品。
(2)测序：进行基因组DNA的提取及精准定量，检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段，随后采用TruSeq Library Construction Kit进行高质量文库的构建，之后使用Agilent 2100对文库的插入片段大小(insert size)进行检测，符合预期后使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量，最后根据文库的有效浓度及数据产出需求在Illumina平台进行PE150上机测序。
(3)质控：将测序得到的原始图像数据经碱基识别(base calling)转化为序列数据，这些原始测序数据(sequenced reads)中包含的接头信息，低质量碱基以及未测出的碱基等，会对后续的信息分析造成很大的干扰。我们使用以下方法进行原始数据的过滤：1)过滤掉含有接头(adapter)序列的读段(reads)；2)当单端测序read中N的含量超过该条read长度比例的10％时，去除此对读段对(paired reads)；3)当单端测序read中含有的低质量(Q＜＝5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，去除此对读段对。经过对测序数据的严格过滤，得到高质量的有效数据(clean data)。
(4)比对参考基因组：有效的高质量测序数据通过BWA软件(设置参数为mem -t 4-k 32 -M)比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复(设置参数为rmdup)。使用的参考基因组版本为GCA_002290385.1_ApisCC1.0_genomic.fa，基因组大小为228，791，026bp。
(5)SNP检测与注释：采用SAMTOOLS软件进行群体SNP的检测，通过以下方法过滤和筛选得到高质量的SNPs：1)SNP的支持数(覆盖深度)在3以上；2)mis(缺失)比例小于10％；3)maf(最小次等位基因频率)大于1％。之后，利用ANNOVAR软件对SNP检测结果进行功能注释。
最终筛选得到的长白山中华蜜蜂SNP位点信息如表1所示。若待测蜜蜂满足至少21个SNP，则能够直接判定为长白山中华蜜蜂；若满足SNP位点数目在19-21之间，为待定组蜜蜂，需进行形态学补充鉴定；若满足SNP位点数目不足19，则待测蜜蜂并非长白山中华蜜蜂。
表1 22个长白山中华蜜蜂SNP位点
Figure BSA0000240132080000091
Figure BSA0000240132080000101
实施例2
长白山中华蜜蜂形态学补充鉴定
1、形态学补充鉴定
(1)翅图像的获取：用镊子摘取蜜蜂样品右侧的前、后翅，使用两个载玻片将翅压在中间固定，制得玻片标本。随后使用德国莱卡LEICA-M165FC体式荧光显微成像系统对标本进行微距拍照。在图像采集过程中，所有标本都在同一标准及比例尺下完成拍摄。
(2)数据的标准化处理：使用TPS Util 32和TPS Dig 232软件分别对样品的前后翅进行数字化标点，前翅标记20个点，编号为1-20(LM1-20(FW))，后翅标记10个点，编号为1-10(LM1-20(HW))，具体位置如图1所示，所有标点都选择翅脉稳定的交叉点。将获得前后翅数据信息分别输入到IMP系列软件中的Coordgen软件，依据标尺长度剔除拍照焦距引起的误差，前翅以第1和第7坐标点作为基准线，后翅以第2和第10坐标点为基准线。使用广式普氏分析法(Procrustes superimposition)，将地标点坐标值进行叠印处理，剔除非形态因素的影响，同时基于GLS法计算每个种群的平均轮廓信息。采用PAST软件，通过解析标志点差异，以可视化图例的方式来展示长白山中华蜜蜂种群与其他地理种群在翅脉形态上的差异，结果如图2所示。
(3)统计分析，发现长白山中华蜜蜂形态学特征如下：
1)在工蜂的径中横脉中段1/3处有一分叉突出，如图1A圈中所示；
2)长白山中华蜜蜂种群前翅相对收缩部位发生在LM9-10(FW)部位，第二中室域的径中横脉与中脉的交叉点和中肘横脉与中脉的交叉点，如图2A所示；
3)前翅相对舒张部位发生在LM1-3(FW)部位，第二肘室域的扇脉与肘脉、扇脉之间连接横脉的交叉点、中脉和肘脉的润和脉与肘脉和扇脉之间连接横脉的交叉点、中脉与肘脉的交叉点，如图2A所示；
4)后翅相对收缩的部位发生在LM5-6(HW)，即基室域的径中横脉与径分脉和中脉的两个交叉点，如图2B所示；
5)后翅相对扩张的部位发生在LM3-4(HW)，肘脉与中脉的交叉点、径脉与径分脉的交叉点，如图2B所示。
实施例1中待定组蜜蜂样品的补充鉴定基于上述的1个翅脉变异特征和4个翅脉几何形态测量学特征，如可以满足翅形态标准的(1)-(5)中的至少4条标准，则判定为长白山中华蜜蜂生态型蜂种。
实施例3
长白山中华蜜蜂的品种鉴别
随机选择长白山中华蜜蜂群体中的30只蜜蜂和其他生态型中华蜜蜂蜜蜂30只进行检测。
(1)对待测蜜蜂按照实施例1所述方法进行SNP鉴别，结果显示，30只长白山中华蜜蜂中有22只满足全部22个SNP位点；4只满足21个SNP位点；3只满足20个SNP位点；1只满足19个SNP位点。其他蜜蜂中，2只蜜蜂满足19个SNP位点，其余蜜蜂满足SNP位点数均在18以下。
(2)对(1)中满足19-20个SNP位点的6只蜜蜂进行形态学补充鉴定，结果显示，4只长白山中华蜜蜂中3只满足全部形态学特征，1只满足4条形态学特征；2只其他蜜蜂分别满足2条、1条形态学特征。
由此可见，本发明建立的基于SNP位点鉴定和形态学补充鉴定的鉴定方法在区分长白山中华蜜蜂与其他生态型中华蜜蜂时能够达到较好的鉴定效果。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一组SNP分子标记在鉴定长白山中华蜜蜂中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记包括如下所示的22个SNP分子标记：
序号 染色体编号 位置 SNP信息 1 KZ288422.1 8614 T 2 KZ288186.1 193678 A 3 KZ288186.1 2126637 T 4 KZ288186.1 2859670 T 5 KZ288214.1 414419 T 6 KZ288298.1 120466 A 7 KZ288298.1 120553 A 8 KZ288219.1 165564 G 9 KZ288219.1 3770354 A 10 KZ288214.1 51987 A 11 KZ288456.1 813637 T 12 KZ288379.1 307819 A 13 KZ288223.1 584654 T 14 KZ288312.1 584699 T 15 KZ288312.1 8614 T 16 KZ288233.1 60918 A 17 KZ288233.1 62435 A 18 KZ288233.1 83548 A 19 KZ288242.1 96480 A 20 KZ288324.1 499874 A 21 KZ288325.1 930734 A 22 KZ288257.1 226585 T；
所述染色体的基因组版本号为：GCA_002290385.1_ApisCC1.0_genomic.fa。
2.一种长白山中华蜜蜂的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测蜜蜂品种的DNA，扩增；
2)对步骤1)获得的扩增产物进行单核苷酸多态性检测并与权利要求1中所述22个SNP分子标记进行比较，若所述待测蜜蜂品种满足22个SNP分子标记中的至少21个，则所述待测蜜蜂品种为长白山中华蜜蜂；若所述待测蜜蜂品种满足SNP分子标记个数为18个或18个以下，则所述待测蜜蜂品种不是长白山中华蜜蜂；若所述待测蜜蜂品种满足SNP分子标记个数为19个或20个，则所述待测蜜蜂品种为待定组蜜蜂，进行形态学补充鉴定；
3)对步骤2)中所述的待定组蜜蜂进行形态学补充鉴定，对其翅图像进行分析，判断其是否具有下列特征：
A.在工蜂的前翅外横脉中段1/3处有一分叉突出；
B.前翅相对收缩部位发生在第二中室域的径中横脉与中脉的交叉点和中肘横脉与中脉的交叉点；
C.前翅相对舒张部位发生在第二肘室域的扇脉与肘脉、扇脉之间连接横脉的交叉点、中脉和肘脉的润和脉与肘脉和扇脉之间连接横脉的交叉点、中脉与肘脉的交叉点；
D.后翅相对收缩的部位发生在基室域的径中横脉与径分脉和中脉的两个交叉点；
E.后翅相对扩张的部位发生在肘脉与中脉的交叉点、径脉与径分脉的交叉点；
若待定组蜜蜂满足上述5个形态学特征中的至少4个，则待定组蜜蜂为长白山中华蜜蜂；若待定组蜜蜂满足形态学特征数量为3个或3个以下，则待定组蜜蜂不是长白山中华蜜蜂。
3.检测权利要求1中所述SNP分子标记的试剂或权利要求2所述的鉴定方法在鉴定长白山中华蜜蜂中的应用。
4.检测权利要求1中所述SNP分子标记的试剂或权利要求2所述的鉴定方法在长白山中华蜜蜂纯化选育、分子育种中的应用。
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