WO2023001210A1 - 绵羊种质资源鉴定和系谱重构的基因芯片、试剂盒及应用 - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to the field of biotechnology, in particular to the field of biodetection technology, and more specifically to a gene chip, a kit and an application for identification of sheep germplasm resources and pedigree reconstruction.
- breeding is a technical term used to define homogeneous, subspecies groups of domestic animals having definable and identifiable external characteristics that allow them to be distinguished by visual assessment from other similarly defined groups of the same species.
- the term defines a group of animals to which humans have applied selective pressure to acquire the same external characteristics that are heritable and distinguishable from other members of the species.
- Molecular genetic markers refer to genetic markers based on nucleotide sequence differences in genetic material between individuals, and are a direct reflection of genetic variation at the DNA level. There are a large number of markers throughout the entire genome, with high polymorphism and stable inheritance. It is not limited by the environment and gene expression or not, and tissues, organs and even cells at different developmental stages can be used for detection of the marker. Therefore, compared with morphological, cytological and biochemical markers, molecular markers are now a more commonly used marker for livestock breed identification.
- the present invention provides a locus combination consisting of only 4213 loci, and a molecular probe combination made based on the above-mentioned loci combination points , gene chips, kits, site combinations and molecular probe combinations, gene chips, and kits provided by the present invention can not only identify sheep germplasm resources and reconstruct pedigrees, but also realize screening, identification, and traceability of sheep breeds, and The improvement and protection of germplasm resources can also be applied to the source of sheep products and the variety identification of sheep products, such as the identification of the source of sheep meat.
- the method is simple, fast, low-cost, and has broad application prospects.
- the physical location information of the site combinations in Table 1 is determined based on the sequence alignment of the sheep v4.0 genome.
- the sixth aspect of the present invention provides a kit for sheep pedigree reconstruction, which has the molecular probe combination described in the fourth aspect or the gene chip described in the fifth aspect
- sheep breeds can be identified by combining 4213 SNP sites, which can be used for sheep pedigree reconstruction and breed or source identification of individual sheep or their products, which is helpful It can shorten the breeding process, ensure the quality of sheep products, and provide technical support for the protection and improvement of germplasm resources.
- the present invention has collected 41 local sheep breeds in China, including Xinjiang, Cambodia, Ningxia, Henan, Inner Mongolia, Shanxi, Qinghai, Shandong, Yunnan, Guizhou and Jiangsu and 6 breeds (comprising Charolais, Dorper, etc.) Sheep, Australian Merino sheep, Hornless Dorset sheep, Suffolk sheep and Texel sheep), a total of 47 breeds, 2012 sheep individuals, the breed information is shown in Table 2.
- Use plink1.9 software to perform quality control on the data according to: 1) delete SNP sites with high SNP deletion rate, geno>0.05; 2) delete SNPs with low minor allele frequency, MAF>0.01; 3) delete SNPs that do not conform to Hardy-Weinberg balance, hwe>0.00001; 4) Delete the points of linkage disequilibrium (LD), indep-pairwise 100 25 0.05, when r2>0.05, this function calculates a pair of LD estimation r2 in A 100-SNPs window, moving at a rate of 25 SNPs, excludes one of a pair of SNPs. Estimates of variability based on BeadChipSNPs may have certainty bias in SNP discovery.
- Delete individuals that cannot be gathered together continue to map, repeat for many times, and finally get 1524 sheep individuals and 4213 loci after 7 times of deletion. Finally, the chip contains 4213 SNP loci and 1524 sheep individuals. The loci obtained are shown in Table 1, and the number of individual sheep is shown in Figure 1.
- Embodiment 2 sheep breed identification method
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Abstract
一种绵羊种质资源鉴定和系谱重构的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用，提供了4213个SNP位点及基于所述SNP位点制得的基因芯片、分子探针组合、试剂盒，SNP位点的物理位置如表1所示，不仅可以用于绵羊种质资源鉴定及绵羊系谱重构，还能对绵羊个体及其产品进行品种鉴定、品种溯源以及绵羊育种控制。
Description
本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物检测技术领域，更具体的涉及绵羊种质资源鉴定和系谱重构的基因芯片、试剂盒及应用。
数千年来，人类在动物饲养过程中应用选择压力来产生表现某些有利特征的家畜。选择这些特征以满足审美、技术、宗教仪式、社会和经济的需要。结果是产生大量不同的动物品种。术语“品种”是用于定义家畜的同型、亚种群体的专业术语，群体内家畜具有可定义和可鉴定的外部特征使其能够通过视觉评估与相同物种中其它相似定义群体区分开。因此，此术语定义一群动物，人类对它们应用选择压力而得到可遗传的并且可区分于该物种的其它成员的相同外部特征。随着品种的确立，其完整性通过品种群落、家畜血统书和系谱记录得以维持。传统的品种选择方法是基于对动物和/或其亲缘动物表型的直接测定。因此，完成育种策略需要保持广泛的表型记录。例如，美国和西欧的产奶家畜改进计划部分依赖于以月为基础进行的数百万头奶牛个体记录(奶产量和成分，种类性状、健康性状等)的收集。然而，一些重要特征不会立即在存活动物水平表现。例如，一些肉质参数是由细微的生理或生化特征决定的，这些特征不容易观察到，且因此不能用作有效人工选择的基础。传统的育种选择方法由于有些表型仅在一种性别中或特定发育时期表达而受到限制。此外，有些表型难以测定并且测试费用昂贵。
随着生物学理论和技术的不断进步，畜禽品种鉴定方法已经发展为根据动物群体的形态学、细胞学、生物化学和分子等标记特征来判断其来源、归属及它们之间亲缘关系等的方法。分子遗传标记是指以个体间遗传物质内核苷酸序列差异为基础的遗传标记，是在DNA水平上遗传变异的直接反映，该标记数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，而且检测该标记时可取用不同发育时期的组织器官甚至细胞。因此，与形态学、细胞学和生化标记相比，分子标记是现在用于畜禽品种鉴定较为常用的一种标记方式。分子标记检测技术发展历经三代，即以限制性片段长度多态性标记、随机扩增多态性DNA、扩增片段长度多态性为主的第一代、以微卫星标记为主的第二代以及单核苷酸多态性为主的第三代。DNA结构直接决定遗传物质，是物种特性的根本所在，不同品种或不同类别在遗传上的差异可不同程度地反映在其序列上。DNA分子遗传标记为克服这一难题提供了有效的解决途径。
发明内容
为满足我国当前绵羊品种研究、品种鉴定、系谱重构以及育种上的检测需求，本发明提供了仅由4213位点组成的位点组合，以及基于上述位点组合点制成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒，本发明提供的位点组合以及分子探针组合、基因芯片、试剂盒不仅能够对绵羊种质资源进行鉴定和系谱重构，实现绵羊品种的筛选、鉴定、溯源，以及种质资源的改良和保护，同时还能应用于绵羊产品的来源及绵羊产品的品种鉴定，例如绵羊肉的来源鉴定，方法简单、快速，成本低，应用前景广阔。
为实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种鉴定绵羊种质资源的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合：
表1 4213个位点信息
所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。
为实现本发明的目的，本发明第二方面提供鉴定绵羊种质资源的基因芯片，所述基因芯片负载有第一方面所述的分子探针组合。
为实现本发明的目的，本发明第三方面提供鉴定绵羊种质资源的试剂盒，其包括第一方面所述的分子探针组合或第二方面所述的基因芯片。
为实现本发明的目的，本发明第四方面提供绵羊系谱重构的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列 比对确定。
为实现本发明的目的，本发明第五方面提供绵羊系谱重构的基因芯片，所述基因芯片负载有明第四方面所述的分子探针组合。
为实现本发明的目的，本发明第六方面提供绵羊系谱重构的试剂盒，其具有第四方面所述的分子探针组合或第五方面所述的基因芯片
为实现本发明的目的，本发明第七方面提供鉴定绵羊种质资源的方法，应用第一方面所述的分子探针组合或第二方面所述的基因芯片或第三方面所述的试剂盒对绵羊样品进行检测。
为实现本发明的目的，本发明第八方面提供鉴定绵羊产品的方法，应用第一方面所述的分子探针组合或第二方面所述的基因芯片或第三方面所述的试剂盒对绵羊产品进行检测。
为实现本发明的目的，本发明第九方面提供测定绵羊产品的品种来源的方法，应用第一方面所述的分子探针组合或第二方面所述的基因芯片或第三方面所述的试剂盒对绵羊产品进行检测。
其中，所述绵羊产品包括但不限于市售的绵羊肉及其加工品、绵羊脂肪及其加工品、绵羊毛及其加工品等。
第一方面所述的分子探针组合或第二方面所述的基因芯片或第三方面所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：(1)在绵羊种质资源鉴定中的应用；(2)在绵羊系谱重构中的应用；(3)在绵羊品种筛选的应用；(4)在绵羊品种鉴定中的应用；(5)在绵羊品种溯源中的应用；(6)在绵羊育种中的应用；(7)在绵羊种质资源保护中的应用；(8)在绵羊种质资源改良中的应用；(9)在绵羊产品鉴定中的应用；(10)在测定绵羊产品的品种来源中的应用。
本发明基于对国内97％以上的绵羊品种的遗传资源研究，发现利用4213个SNP位点组合即可鉴定绵羊品种，用于绵羊系谱重构，绵羊个体或其产品进行品种或来源鉴定，有助于缩短育种进程，保障绵羊产品质量，同时还能为种质资源保护和种质资源的改良提供技术支持。
基于本发明提供的上述位点制成的探针组合、基因芯片、试剂盒与其他芯片相比，每个SNP位点距离分布更为均匀，提高了位点应用于关联分析和受选择信号定位等研究的效率；而且还具有通量小、成本低，分析更容易的特点，普适性广，市场前景广阔。
利用本发明提供的位点信息以及制成的探针组合、基因芯片、试剂盒还能够用于绵羊产品原材料的质量控制。
图1是本发明研究的47个绵羊品种鉴定的个体数，47种颜色代表47个品种，图中简称分别代表不同的绵羊品种，如表2所示：
表247个绵羊品种信息
下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。
在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合所形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。
实施例14213个SNP位点组合的获得
1样本采集
本发明采集了中国41个本土绵羊品种，包括来自新疆、西藏、宁夏、河南、内蒙古、山西、青海、山东、云南、贵州和江苏等地以及6个培育品种(包括夏洛莱羊、杜泊羊、澳洲美利奴羊、无角陶赛特羊、萨福克羊和特克赛尔羊)，共47个品种，2012个绵羊个体，品种信息如表2所示。
2、DNA的提取
收集绵羊样本的耳缘组织提取每个绵羊品种的DNA，具体方法为采集新疆、西藏、宁夏、河南、内蒙古、山西、青海、山东、云南、贵州和江苏等地绵羊的耳缘组织，将采集的耳缘组织用95％-100％乙醇保存于管中，并在-80度条件下保存，按照苯酚-氯仿提取程序从耳组织中提取基因组DNA，生成了一个全基因组数据集，共有2012个DNA样本，利用SAMtools和GATK两种方式与2015年发布的绵羊4.0参考基因组(从NCBI获得)进行对比，并将两种方式获得共同结果形成一个SNP集合，得到共计48201个SNP位点。
3、SNP BeadChip基因分型
2012份样本采用国际绵羊基因组学协会开发的(ISGC)Illumina Ovine SNP50进行基因分型，生成ped和map文件。
4、质量控制
使用plink1.9软件对数据进行质控，按照：1)删除SNP缺失率过高的SNP位点，geno>0.05；2)删除次等位基因频率过低的SNP，MAF>0.01；3)删除不符合Hardy-Weinberg平衡的SNP，hwe>0.00001；4)对连锁不平衡(LD)的点进行删减，indep-pairwise 100 25 0.05,当r2>0.05时，这个函数计算一对LD估计r2在100-SNPs窗口，以25个SNPs的速度移动，排除一对SNPs中的一个。基于BeadChipSNPs的可变性估计可能在SNP发现中存在确定偏差。在高水平LD中去除snp已被证明可以抵消确定偏差的影响，因此在质控程序中通过删减LD可以大大降低确定偏差。5)删除0号和27号染色体。通过以上操作，得到20748个SNP和2012个绵羊个体样本。
5、选择信号分析
Fst值显著偏高的SNPs(占SNPs总数的前0.1％)被认为是强人工选择下的预测信号。先用vcftools软件将原始数据文件转化为vcf格式，再使用shell脚本进行群体fst值计算，删去top前0.1％的位点，得到20727个SNP和2012个个体。
6、筛选位点制成芯片数据
根据染色体碱基距离均匀分布筛选，最后得到4213个SNP位点。
使用plink1.9软件--extract命令提取4213个位点的ped和map文件。
7、遗传关系和群体结构
使用plink1.9软件的--distance-matrix命令生成距离矩阵，接着用splitstree5构建所有个体的邻接树(neighbor-joining tree)，并通过Figtree1.4.4进行可视化，得到2012个绵羊个体的个体树。
删除不能聚在一起的个体，继续作图，多次重复，经过7次删减，最后得到1524个绵羊个体，4213个位点，最终，该芯片包含SNP位点4213个，绵羊个体1524个，得到的位点如表1所示，绵羊个体的个体数如图1所示。
基于本发明提供的位点信息，本领域技术人员可以根据本领域常规方法制成分子探针、基因芯片、试剂盒，但凡基于本领域常规方法以及本发明提供的位点信息制得的产品均属于本发明的保护范围。
实施例2绵羊品种鉴定方法
采集待测绵羊个体样品采外周血或组织提取DNA，经生物公司对DAN测序分析计算后得到ped与map文件，将其与本发明提供的位点信息数据合并在一起用splitetree5和figtree软件做个体树，根据待测样品聚在品种的支上来确定其所属的品种。
工业应用
利用本发明提供的位点信息，能够应用于绵羊种质资源鉴定、绵羊系谱重构、绵羊品种筛选、绵羊品种鉴 定、绵羊品种溯源、绵羊育种、绵羊种质资源保护、绵羊种质资源改良，还能用于绵羊的产品鉴定、以及测定绵羊产品的品种来源。
以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。
Claims (10)
- 鉴定绵羊种质资源的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。
- 鉴定绵羊种质资源的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片负载有权利要求1所述的分子探针组合。
- 鉴定绵羊种质资源的试剂盒，其特征在于，其具有权利要求1所述的分子探针组合或权利要求2所述的基因芯片。
- 绵羊系谱重构的分子探针组合，其特征在于，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。
- 绵羊系谱重构的基因芯片，所述基因芯片负载有权利要求4所述的分子探针组合。
- 绵羊系谱重构的试剂盒，其具有权利要求4所述的分子探针组合或权利要求5所述的基因芯片
- 鉴定绵羊种质资源的方法，应用权利要求1所述的分子探针组合或权利要求2所述的基因芯片或权利要求3所述的试剂盒对绵羊样品进行检测。
- 鉴定绵羊产品的方法，应用权利要求1所述的分子探针组合或权利要求2所述的基因芯片或权利要求3所述的试剂盒对绵羊产品进行检测。
- 测定绵羊产品的品种来源的方法，应用权利要求1所述的分子探针组合或权利要求2所述的基因芯片或权利要求3所述的试剂盒对绵羊产品进行检测
- 权利要求1所述的分子探针组合或权利要求2所述的基因芯片或权利要求3所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：(1)在绵羊种质资源鉴定中的应用；(2)在绵羊系谱重构中的应用(3)在绵羊品种筛选的应用；(4)在绵羊品种鉴定中的应用；(5)在绵羊品种溯源中的应用；(6)在绵羊育种中的应用；(7)在绵羊种质资源保护中的应用；(8)在绵羊种质资源改良中的应用；(9)在绵羊产品鉴定中的应用；(10)在测定绵羊产品的品种来源中的应用。
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