CN105525027A - Snp标记及其应用、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及SNP标记及其应用、检测方法。本发明采用全基因组测序对中国西域黑蜂大量个体进行全基因组测序，获得了中国西域黑蜂中21个特有的SNP信息，成为鉴定中国西域黑蜂的标志SNP位点。本发明提供的中国西域黑蜂蜜蜂特有的SNP位点在中国西方蜜蜂与其它地区西方蜜蜂的分化及中国西方蜜蜂对本地环境的适应性进化具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及SNP标记及其应用、检测方法。
背景技术
我国蜜蜂饲养历史悠久，蜜蜂种质资源丰富，但是长久以来，我国境内仅发现存在东方蜜蜂，并无西方蜜蜂。东方蜜蜂采集能力稍次于西方蜜蜂，伴随着西方蜜蜂的引进，我国养蜂者越来越多的开始饲养西方蜜蜂，我国原生蜂种质资源受到威胁。如果能够在我国境内找到原生的西方蜜蜂对我国蜜蜂种质资源有着重要意义。中国蜜蜂种质资源委员会主任石巍老师与新疆自治区蜂业管理站工作人员一直从事加强对新疆原有伊犁黑蜂保护的工作，经过多年的努力，首次在中国新疆伊犁境内发现欧洲黑蜂自然种群，并且与目前国际上已知的西方蜜蜂亚种至少存在9万年的分化，证明中国也是西方蜜蜂的原产地，结束了我国没有西方蜜蜂自然种群分布的历史，这在畜禽资源研究方面具有很大的突破性意义。中国西域黑蜂个体较大、越冬性能好、抗逆性强、抗螨能力十分突出，而且蜂王产卵力强，能维持强群和蜂群极大的采集能力，既可作为推广普及的新品种，也可以作为育种素材，作进一步的深入育种研究，具有很好的发展前景。
中国发现西方蜜蜂，在国内外产生了较大的影响，为了更加深入的保护中国西域黑蜂，有效的利用中国西域黑蜂为我国蜜蜂育种工作服务，在“蜂产业技术体系”“物种资源保护”等课题的资助下，我们对中国西域黑蜂的研究工作取得突破性进展，利用全基因组重测序技术鉴定了中国西域黑蜂特有的21个SNP位点。
全基因组测序，即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息，准确性高。每个个体从受精卵开始就继承了父母的DNA遗传信息，并且携带一生，不易改变。全基因组测序就是通过运用新一代高通量DNA测序仪，进行10-20倍覆盖率的个体全基因组测序，然后与该物种基因组精确图谱比较，得到完整的个体全基因组序列，破译个体全部的遗传信息的过程。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到特定物种(品种)特有的大量的单核苷酸多态性(SNP)位点。
目前，研究人员通常采用线粒体DNA的SNP位点信息来鉴定蜂种信息。线粒体DNA的SNP位点检测方法是首先提取个体基因组DNA，然后进行线粒体DNA的PCR扩增，进而测序，获得线粒体DNA序列SNP信息。
目前存在的技术问题：
(1)SNP位点信息少；
(2)蜂种鉴别准确性低；
(3)具有片面性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了SNP标记及其应用、检测方法。本发明采用全基因组测序对中国西域黑蜂大量个体进行全基因组测序，获得了中国西域黑蜂中21个特有的SNP信息，成为鉴定中国西域黑蜂的标志SNP位点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种SNP标记，其特征在于如下所示：
本发明还提供了所述SNP标记在物种鉴定中的应用；所述物种为中国西域黑蜂。
本发明还提供了所述SNP标记在中国西域黑蜂分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了所述SNP标记在物种资源遗传多样性中的应用。
本发明还提供了所述SNP标记在物种适应性进化中的应用。
本发明还提供了用于检测所述SNP标记的引物对。
本发明还提供了用于检测所述SNP标记的试剂盒，含有所述的引物对。
本发明还提供了所述SNP标记鉴定中国西域黑蜂的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得待测物种的DNA，用如权利要求6所述的引物对扩增，获得扩增产物；
步骤2：对步骤1获得扩增产物进行单核苷酸多态性检测，检测标准如下所示：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述SNP标记鉴定中国西域黑蜂的方法中，如果所述待测物种满足所述检测标准的95％以上，则所述待测物种为中国西域黑蜂；如果所述待测物种不满足至少两项所述检测标准，则所述待测物种不为中国西域黑蜂。
本发明采用全基因组测序对中国西域黑蜂大量个体进行全基因组测序，获得了中国西域黑蜂中21个特有的SNP信息，成为鉴定中国西域黑蜂的标志SNP位点。本发明提供的中国西域黑蜂蜜蜂特有的SNP位点在中国西方蜜蜂与其它地区西方蜜蜂的分化及中国西方蜜蜂对本地环境的适应性进化具有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示利用形态鉴定数据对中国西域黑蜂和其他主要蜂种进行的主成份分析图；从图中可以看出，中国西域黑蜂和欧洲黑蜂聚到了一起，不能区分；
图2示利用线粒体DNA测序数据数据对中国西域黑蜂和其他主要蜂种构建的进化树；从图中可以看出，中国西域黑蜂和欧洲黑蜂聚到了一起，不能区分。
具体实施方式
本发明公开了SNP标记及其应用、检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
1.样品采集。采集活体蜜蜂样品，并尽快放入75％酒精中保存；此外，样品保存，除了75％酒精保存，也可以用纯度更高的酒精(90％)，或者液氮、干冰等低温保存方式。
2.提取样品高质量DNA；
3.将DNA样品进行Illumina高通量测序，获得DNA序列原始数据；DNA高通量测序可采用任何高通量测序平台，除上述Illumina平台外，还可以选用SOLiD平台，454测序等。
4.过滤掉低质量序列。过滤规则包括：1)末端“N”的个数应小于等于序列长度的10％；2)测序质量低于5的碱基数应不超过序列长度的50％；
5.以西方蜜蜂(Apismellifera)在NCBI公共数据库上的基因组为参考基因组(apiMel4.5)，利用BWA软件进行序列比对，比对参数为“-t-k32-M-R”；参考基因组最新版本为apiMel4.5，更新版的参考基因组发布后，可采用新版参考基因组。
6.利用SAMtools’mpileup程序获得群体的SNP基因型，将获得的基因型进行过滤，获得最后的结果。过滤的规则有：1)质量值应不小于20；2)在序列间隔处5个碱基以内的SNP应过滤掉；3)测序深度应当大于等于4，小于等于1000；4)去掉有三个或更多基因型的SNP位点；获得SNP基因型的程序可以是各种变异检测的程序，包括上述的SAMtools，和GATK、CLC等程序。
7.检测各个待测样本基于21个SNP位点的基因型，如果所有待测样本均满足如下(1)-(21)的95％以上标准，则待蜜蜂群体为候选的中国西域黑蜂群体，即满足1-21个SNP中的任意20个或21个，即为中国西域黑蜂。
(1)NW_003378074.1，位置935827，SNP信息T；
(2)NW_003378158.1，位置846767，SNP信息A；
(3)NW_003378051.1，位置292887，SNP信息C；
(4)NW_003378051.1，位置512953，SNP信息C；
(5)NW_003378077.1，位置1503304，SNP信息T；
(6)NW_003378131.1，位置693133，SNP信息T；
(7)NW_003378131.1，位置860330，SNP信息T；
(8)NW_003378091.1，位置420520，SNP信息A；
(9)NW_003378085.1，位置1765707，SNP信息A；
(10)NW_003378085.1，位置1775747，SNP信息T；
(11)NW_003378085.1，位置2595617，SNP信息T；
(12)NW_003378054.1，位置1502972，SNP信息T；
(13)NW_003378088.1，位置3767987，SNP信息A；
(14)NW_003378088.1，位置3816341，SNP信息C；
(15)NW_003378088.1，位置3914549，SNP信息A；
(16)NW_003378088.1，位置4363281，SNP信息A；
(17)NW_003377992.1，位置391791，SNP信息T；
(18)NW_003378010.1，位置550054，SNP信息A；
(19)NW_003378027.1，位置356859，SNP信息A；
(20)NW_003378033.1，位置211517，SNP信息T；
(21)NW_003377995.1，位置360953，SNP信息G。
如果待测样本中存在至少两个不满足(1)至(21)的所有标准，待测蜜蜂群体为候选的非中国西域黑蜂群体。
本发明公开了一种应用21个SNP鉴定中国西域黑蜂蜂种的方法。本发明提供的辅助鉴定蜜蜂是否为中国西域黑蜂的方法包括如下步骤：检测待测蜜蜂基于21个SNP位点的基因型；如果满足(1)-(21)的95％以上的标准，待测蜜蜂为候选的中国西域黑蜂蜂种；如果不满足上述(1)-(21)的95％以上的标准则待测蜜蜂为候选的非中国西域黑蜂。本发明对中国西域黑蜂的蜂种种质资源鉴定具有重大价值。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明应用全基因组测序技术，测序深度覆盖蜜蜂全基因组基因序列，能够全面、准确的检测到中国西域黑蜂的特有SNP信息；因此，本专利所列的鉴定中国西域黑蜂的21个SNP具有全面、准确的特点；
(2)本专利所列的鉴定中国西域黑蜂的特有的SNP位点在中国西方蜜蜂与其它地区西方蜜蜂的分化及中国西方蜜蜂对本地环境的适应性进化具有重要作用。
本发明提供的SNP标记及其应用、检测方法中所用原料与试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)采集蜜蜂样本，提取DNA，DNAOD值在1.8-2.0，含量大于1.5微克的样品认为是合格的；
(2)合格的DNA样品构建文库：检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段。采用TruSeqLibraryConstructionKit进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illuminaHiSeq进行测序。
(3)库检：文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM)，以保证文库质量。
(4)上机测序：库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行illuminaHiSeq测序。
(5)质控：测序得到的原始测序序列(SequencedReads)或者rawreads，里面含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，必须对rawreads过滤，得到cleanreads，后续分析都基于cleanreads。数据处理的步骤如下：
a.去除带接头(adapter)的paired-endreads；
b.当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired-endreads；
c.当单端测序read中含有的低质量(Q<＝5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired-endreads。
(6)序列比对：
使用BWA软件进行序列(cleanreads)比对，除“-t-k32-M-R”外，其它参数选择默认值。以Amel4.5(来源NCBI)为参考基因组，比对获得的bam文件利用SAMtools软件进行排序，并移除重复的序列。
(7)SNP检测：得到bam文件后，我们进行SNP的检测。SNP(单核苷酸多态性)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。我们采用SAMTOOLS(mpileup-m2-F0.002-d1000)进行个体SNP的检测。为了降低SNP检测的错误率，选用如下标准进行过滤：
a.SNP的reads支持数不低于4；
b.SNP的质量值(MQ)不低于20；
(8)SNP注释：ANNOVA是一种高效的软件工具，它能利用最新的信息，对由多个基因组检测出的基因变异进行功能注释。只要给出变异所在的染色体、起始位点、终止位点、参考核苷酸和变异核苷酸，ANNOVAR就能进行Gene-basedannotation、Region-basedannotations、Filter-basedannotation和Otherfunctionalities。鉴于ANNOVAR强大的注释功能和国际的认可性，我们利用它对SNP检测结果进行注释。
(9)筛选比对，得到中国西域黑蜂特有的SNP：我们将本研究获得的SNP与主要蜂种A.m.mellifera，A.m.carnica,A.m.ligustica，A.m.anatoliaca，A.m.scutellata，A.cerana的基因组SNP信息进行比对，筛选出位于基因编码区的、且为非同义突变、仅在中国西域黑蜂中出现的SNP，就是中国西域黑蜂特有SNP。
通过筛选比对，我们得到了中国西域黑蜂特有的SNP具体如下所列：
(1)NW_003378074.1，位置935827，SNP信息T；
(2)NW_003378158.1，位置846767，SNP信息A；
(3)NW_003378051.1，位置292887，SNP信息C；
(4)NW_003378051.1，位置512953，SNP信息C；
(5)NW_003378077.1，位置1503304，SNP信息T；
(6)NW_003378131.1，位置693133，SNP信息T；
(7)NW_003378131.1，位置860330，SNP信息T；
(8)NW_003378091.1，位置420520，SNP信息A；
(9)NW_003378085.1，位置1765707，SNP信息A；
(10)NW_003378085.1，位置1775747，SNP信息T；
(11)NW_003378085.1，位置2595617，SNP信息T；
(12)NW_003378054.1，位置1502972，SNP信息T；
(13)NW_003378088.1，位置3767987，SNP信息A；
(14)NW_003378088.1，位置3816341，SNP信息C；
(15)NW_003378088.1，位置3914549，SNP信息A；
(16)NW_003378088.1，位置4363281，SNP信息A；
(17)NW_003377992.1，位置391791，SNP信息T；
(18)NW_003378010.1，位置550054，SNP信息A；
(19)NW_003378027.1，位置356859，SNP信息A；
(20)NW_003378033.1，位置211517，SNP信息T；
(21)NW_003377995.1，位置360953，SNP信息G；
以上SNP为中国西域黑蜂所特有，凡是样品基因组所含SNP信息符合以上列表95％以上的SNP信息的则为中国西域黑蜂，否则不是中国西域黑蜂。
实施例2
通过实施例1所述SNP位点鉴定中国西域黑蜂与其他蜂种的试验方法参照实施例1的方法。试验结果如表1所示：
表1SNP基因型鉴定结果
备注：K代表GT杂合子，S代表CG杂合子，R代表AG杂合子，Y代表CT杂合子；单一一个A或C或G或T代表纯合子。
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378054.1的1502972位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为K，为GT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378051.1的292887位置的SNP信息包括C，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括A，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为S，为CG杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378077.1的1503304位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为R，为GT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378091.1的420520位置的SNP信息包括A，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括A，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为R，为GT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378088.1的3914549位置的SNP信息包括A，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括A，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为R，为AG杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378010.1的550054位置的SNP信息包括A，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括A，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为R，为AG杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378027.1的356859位置的SNP信息包括A，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括A，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为R，为AG杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003377995.1的360953位置的SNP信息包括G，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括G，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为R，为GT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378074.1的935827位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378051.1的512953位置的SNP信息包括C，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括C，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378131.1的693133位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378131.1的860330位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378085.1的2595617位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003377992.1的391791位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
根据本发明提供的SNP信息及鉴定方法可知：如果NW_003378033.1的211517位置的SNP信息包括T，则待测物种为西域黑蜂；如果不包括T，则非西域黑蜂；由表1结果可知，待测物种的SNP信息为Y，为CT杂合子，因此为中国西域黑蜂，且可以与其他物种区分开来，因此，本发明提供的检测方法具有可行性和准确性；
同样的，根据表1的实验结果可以很好地证明，本发明提供的SNP信息及鉴定方法的可行性和准确性。
对比例1
现有技术主要有两种，一是形态鉴定，二是线粒体DNA多态性分析。
(1)蜜蜂形态鉴定：
形态测定指标与方法：
a.喙长、上居和唇基的色度：
将蜜蜂头部取下，观察其上唇和唇基的色度。取下喙，包括后颤、前颌和中唇舌三部分，展开在涂有凡士林的载玻片上.鹿用测量系统测定喙的长度。
b.盾片色度：
取蜜蜂胸部，固定在白色蜡盘内.在40倍体视显微镜下测定小盾片sc区、K区、B区色度。
c.右前翅长、宽，肘脉长度和翅脉角角度：
取下蜜蜂右前翅，展平将其放在涂有凡士林的载玻片上，应用测量系统测定右前翅的长和宽肘脉a、b以及翅脉角角度。
d.右后翅翅钩数：
取下蜜蜂右后翅，展平放在载玻片上，在读数体视显微镜下计数右后翅翅钩数并记录
e.第五背板覆毛长：
取蜜蜂腹部，将其体表酒精晾干，直接放大40倍读数体视显微镜下，读取第五背板覆毛的长度。
f.蜜蜂右后足股节长、胫节长、跗节长和跗节宽：
取下蜜蜂右后足，将其放置于涂有凡士林的载玻片上.应用测量系统测定各指标长度。
e.蜜蜂第三背板、第四背板长：
解剖蜜蜂腹部,取下其第三背扳、第四背扳.将其置于辣有凡士林的载玻片上.应用测量系统测定其长度。
f.蜜蜂第三腹扳长、第三脾板蜡镜长、第三腹板蜡镜斜长、第三腹板蜡镜间距：
取下蜜蜂第三腹板，刮净腹板上的肌肉组织和蜡鳞，注意不要损害蜡镜，展平后置于涂有凡士林的载玻片上.应用测量系统测定各项指标的长度。
g.蜜蜂第六腹扳长和宽：
取下蜜蜂第六腹板，刮净腹板上的肌肉组织和蜡鳞，展平后置于涂有凡士林的载玻片上，应用测量系统铡定第六腹板的长和宽。
h.第四背板绒毛带宽与绒毛带到底边的长度：
本指标可与第四背板长度同时测量完成，首先用吸水纸吸去第四背板上的体渡，应用测量系统测定第四背板绒毛带宽与绒毛带到底边的长度。
i.第二、第三、第四背扳色度：
取下第二、第三、第四背板.在读数体视显微镜下观察其色度。
形态鉴定存在的缺点：
a.步骤多，方法繁琐；
b.误差大；
c.不能区分所有亚种；
中国西域黑蜂和欧洲黑蜂在形态方面，利用现有测定指标，不能区分，但是利用基因组重测序数据进行分析可以验证中国西域黑蜂和欧洲黑蜂为两个不同的亚种。
表2为利用形态鉴定方法，对中国西域黑蜂(sinisxinyuan)、欧洲黑蜂(mellifera)、卡尼鄂拉蜂(carnica)、意大利蜂(ligustica)、高加索蜂(caucasica)、pomonella(发现于哈萨克斯坦的一种西方蜜蜂)形态鉴定的结果。
表2中国西域黑蜂与其他主要蜂种形态鉴定数据
从结果中可以看出，利用形态鉴定不能区分中国西域黑蜂和欧洲黑蜂。
对比例2
(2)蜜蜂线粒体DNA多态性分析：
蜜蜂不同亚种通常都是由于地理隔离和生态隔离形成的，隔离导致了亚种的变异，包括mtRNA的变异，这样的变异朝着不同方向积累，各亚种的mtRNA就出现了遗传多样性。其中最经典的是线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)与细胞色素c氧化酶II基因(COII)之间的区域在不同亚种之间长度不一。根据mRNA片段长度或SNP信息为某一亚种的特征，进而可以将其作为该亚种的遗传标记与其他亚种区分。例如根据mtDNA的限制图谱和序列分析资料，西方蜜蜂在进化过程中形成三大分支，此分支发生在大约1000000年前，第一分支(BranchM)，与西欧亚种A.m.mellifera相对应：第二分支(BranchC)，从中东延伸至意大利，包括伊朗蜂、高加索蜂、希腊蜂、卡尼鄂拉蜂和意大利蜂。第三分支(BranchA)包括非洲蜜蜂和美洲的非洲化蜜蜂，例如：突尼斯蜂、西非蜂、东非蜂、海角蜂和乞力马扎罗蜂。
但是有些亚种不能通过mtDNA进行分类，例如中国西域黑蜂和欧洲黑蜂，采用现有mtDNA序列分析方法不能区分，但是利用基因组重测序数据进行分析可以验证中国西域黑蜂和欧洲黑蜂为两个不同的亚种。
利用线粒体DNA测序数据数据对中国西域黑蜂和其他主要蜂种构建的进化树。
从图2中可以看出，中国西域黑蜂和欧洲黑蜂聚到了一起，不能区分。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种SNP标记，其特征在于，如下所示：
2.根据权利要求1所述的SNP标记在物种鉴定中的应用；所述物种为中国西域黑蜂。
3.根据权利要求1所述的SNP标记在中国西域黑蜂分子标记辅助育种中的应用。
4.根据权利要求1所述的SNP标记在物种资源遗传多样性中的应用。
5.根据权利要求1所述的SNP标记在物种适应性进化中的应用。
6.用于检测如权利要求1所述的SNP标记的引物对。
7.用于检测如权利要求1所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求6所述的引物对。
8.根据权利要求1所述的SNP标记鉴定中国西域黑蜂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得待测物种的DNA，用如权利要求6所述的引物对扩增，获得扩增产物；
步骤2：对步骤1获得扩增产物进行单核苷酸多态性检测，检测标准如下所示：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，如果所述待测物种满足所述检测标准的95％以上，则所述待测物种为中国西域黑蜂；如果所述待测物种不满足至少两项所述检测标准，则所述待测物种不为中国西域黑蜂。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，如果所述待测物种满足1-21个SNP中的任意20个或21个，即为中国西域黑蜂。
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