CN112795663A - 用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物、试剂盒及方法，属于分子鉴定技术领域。引物对组合物包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.1和2、NO.3和4、NO.5和6、NO.7和8、NO.9和10、NO.11和12、NO.13和14、NO.15和16、NO.17和18、NO.19和20以及NO.21和22。试剂盒包括上述引物对组合物，以及核苷酸序列为SEQ ID NO.23和24的阳性对照引物。采用该引物对组合物或该试剂盒对鲤鱼样本的基因组DNA进行PCR扩增，然后根据扩增情况判断鲤属，能够准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属，而且，区分方法简单便捷且成本低。
Description
技术领域
本申请涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物、试剂盒及方法。
背景技术
黄河鲤以其体型梭长、金鳞赤尾且肉质鲜美而驰名中外；而且，黄河鲤生长速度快、抗逆性强且营养价值高，因此备受养殖户和消费者的青睐，具有广阔的市场前景。黄河鲤市场价格远高于普通鲤鱼，受到经济利益的驱使，不良商家销售冒牌黄河鲤的情况时有发生。在一方面，侵害了消费者的合法权益；另一方面，损害了黄河鲤的名声，给黄河鲤相关产业的正常运作造成了干扰。
因此，亟需建立一种行之有效的方法对市场上的鲤鱼进行鉴别，以准确区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属。
发明内容
本申请的目的在于提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物，能够准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属，而且，区分方法简单便捷且成本低。
本申请的实施例是这样实现的：
第一方面，本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物，包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQID NO.16；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22。
第二方面，本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的试剂盒，包括阳性对照引物对以及如第一方面提供的引物对组合物，阳性对照引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
第三方面，本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的方法，包括：采用如第一方面提供的引物对组合物或者如第二方面提供的试剂盒对鲤鱼样本的基因组DNA进行PCR扩增。
将引物对组合物分为第一标记组、第二标记组、第三标记组、第四标记组和第五标记组。
若有5个标记组出现扩增产物则判断鲤鱼样本为黄河鲤鱼鲤属，否则判断鲤鱼样本为非黄河鲤鱼鲤属。
第一标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；以及SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18。
第二标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
第三标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
第四标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
第五标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
本申请提供的用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物，有益效果包括：
本申请中，基于等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)的SNP(单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphisms)分型，筛选特异性的SNP标记并设计对应的AS-PCR引物以进行PCR扩增，然后根据扩增情况判断鲤属。该方法结合了AS-PCR和特异性扩增的优点，能够准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属，而且，该区分方法操作简单便捷且成本低，适合大量样本的分析鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例中一个黄河鲤鱼属种样本的基因组DNA在PCR扩增后的毛细管电泳图谱；
图2为本申请实施例中一个非黄河鲤鱼属种样本的基因组DNA在PCR扩增后的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，本申请中的“和/或”，如“特征1和/或特征2”，均是指可以单独地为“特征1”、单独地为“特征2”、“特征1”加“特征2”，该三种情况。
另外，在本申请的描述中，除非另有说明，“一种或多种”中的“多种”的含义是指两种及两种以上；“数值a～数值b”的范围包括两端值“a”和“b”，“数值a～数值b+计量单位”中的“计量单位”代表“数值a”和“数值b”二者的“计量单位”。
下面对本申请实施例的用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物、试剂盒及方法进行具体说明。
第一方面，本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物，包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQID NO.16；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22。
可以理解的是，在本申请的引物对表述中，任意的SEQ ID NO.X1和SEQ ID NO.X2，即表示一个引物对。例如，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，即代表一个标记引物对。
另外，在本申请中，“鲤属”是指鲤科鲤亚科下的一个属Cyprinus。
本申请中，通过数据库位点群体验证以及性状基因位点搜索两种SNP挑选方法，挑选在黄河鲤鱼鲤属样本中具有多态性但在非黄河鲤鱼鲤属中不具多态性的SNP位点(即，在黄河鲤鱼鲤属样本中既存在杂合子也存在纯合子，而在非黄河鲤鱼鲤属中仅存在纯合子的位点)，筛选出了11个特定的SNP位点。
发明人根据筛选出的11个特定的SNP位点，设计11个特定的标记引物对，使得标记引物对只针对杂合子扩增，故只有黄河鲤鱼鲤属样本能出现扩增出产物而非黄河鲤鱼鲤属样本不会出现扩增出产物。
发明人研究发现，本申请提供的引物对组合物中，根据11个特定的SNP位点设计的11个特定的标记引物对，在对样本进行PCR扩增时，能够较为准确地反映黄河鲤鱼鲤属样本和非黄河鲤鱼鲤属样本之间的扩增差异，从而能够准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属。
第二方面，本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的试剂盒，包括阳性对照引物对以及如第一方面提供的引物对组合物，阳性对照引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
本申请提供的试剂盒中，该引物对组合物能够准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属。其中，特定核苷酸序列的阳性对照引物，在对黄河鲤鱼鲤属样本和非黄河鲤鱼鲤属样本进行扩增时都能扩增出相应条带。在扩增不出条带时，表明提取的DNA模板质量太低，此时需要重新提取DNA，有利于更准确地反应使用标记引物对的实验中的扩增情况。
发明人进一步研究发现，由于鲤鱼鲤属之间的差异较小，通过单独地统计每一个标记引物对的扩增情况进行判断时，无法准确地将黄河鲤鱼鲤属样本和非黄河鲤鱼鲤属样本进行有效地鉴别区分。而基于常见的、应用较广的非黄河鲤鱼鲤属的基因位点进行分析筛选及归类，将本申请引物对组合物中的多个标记引物对按照特定组合进行分组，使得黄河鲤鱼鲤属样本在每个标记组中均能够扩增而非黄河鲤鱼鲤属样本基本上都能满足至少在一个标记组中不会扩增，从而能够有效地根据标记组的扩增情况准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属。
在一些可选的实施方案中，根据上述的归类分组，在试剂盒中将引物对组合物按照特定的分组方式进行分组设置，该引物对组合物分为第一标记组、第二标记组、第三标记组、第四标记组和第五标记组。
第一标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；以及SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18。
第二标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
第三标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
第四标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
第五标记组包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
在本申请的试剂盒中，将引物对组合物按照特定的分组方式进行分组设置，便于分组进行PCR扩增实验，使得实验操作和结果统计更方便。
可以理解的是，在本申请的其他实施方式中，也可以将该每个标记引物对分别设置，在进行PCR扩增实验时按照每个标记引物对单独进行，然后通过结果整理将每个标记引物的结果按照特定组别进行分组统计并进行分析即可。
需要说明的是，在本申请的实施例中，试剂盒也可以根据需要，按照本领域的公知的方式设置其他试剂。
作为一种示例，试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPS(脱氧核糖核苷三磷酸)、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。
可以理解的是，DNA聚合酶可以根据需要，基于生物活性、操作要求和原料成本等方面的考虑进行选择。
可选地，DNA聚合酶选自以下一种或多种：Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、T11、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho和ES4 DNA聚合酶，以及Klenow片段。
进一步地，该DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
第三方面，本申请提供一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的方法，包括：采用如第一方面提供的引物对组合物或者如第二方面提供的试剂盒对鲤鱼样本的基因组DNA进行PCR扩增。
将引物对组合物分为上述的第一标记组、第二标记组、第三标记组、第四标记组和第五标记组。
若有5个标记组出现扩增产物则判断鲤鱼样本为黄河鲤鱼鲤属，否则判断鲤鱼样本为非黄河鲤鱼鲤属。
可以理解的是，在本申请的方法中，在采用引物对组合物或者试剂盒对鲤鱼样本的基因组DNA进行PCR扩增之前，可以先采用阳性对照引物对鲤鱼样本的基因组DNA进行PCR扩增。如果采用阳性对照引物扩增时不出条带，表明提取的DNA模板质量太低，需要重新提取，直至提取的DNA模板扩增时出现条带。
本申请的方法，结合了AS-PCR和特异性扩增的优点。其中：基于等位基因特异性PCR的SNP分型，采用AS-PCR的方式以扩增情况进行黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的区分，操作简单便捷且成本低，而且以直观的扩增状态表现鉴定结果使得判断方便，适合大量样本的分析鉴定。筛选特异性的SNP位点并设计对应的SNP分子标记进行PCR扩增，将多个标记引物对按照特定组合进行分组，使得黄河鲤鱼鲤属样本在每个标记组中均能够扩增而非黄河鲤鱼鲤属样本基本上都能满足至少在一个标记组中不会扩增，能够有效地根据标记组的扩增情况准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属。
考虑到采用AS-PCR结合电泳可以降低分型难度并减少分型成本，更有助于企业的成规模的溯源实践。其中，电泳检测中，毛细管电泳还具有高通量等优点。
在一些示例性的实施方案中，在PCR扩增步骤之后，还包括：电泳分离检测。可选地，电泳检测为毛细管电泳。
适应性地，在包括电泳分离检测的方法中，按照如下标准进行鲤鱼鲤属的判断：若有5个标记组出峰则判断鲤鱼样本为黄河鲤鱼鲤属，否则判断鲤鱼样本为非黄河鲤鱼鲤属。
在本申请包括电泳分离检测的方法中，通过电泳检测可以降低分型难度并减少分型成本；其以出峰的可视化数据表现鉴定结果，使得数据分析简单更简单，结果判断更方便。将AS-PCR结合高通量的毛细管电泳方式，使得检测还具备高通量、高效和灵敏度高等优点。
考虑到在PCR扩增步骤中，不同的标记引物对适应的退火温度不同，针对每个标记引物对控制不同的退火温度，能够保证每个标记引物对都能够在合适的退火温度下进行PCR扩增，使得扩增结果更准确可靠。
在一些可选的实施方案中，在PCR扩增步骤中，核苷酸序列依次如下的标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17和SEQID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。其退火温度依次为62～63.7℃、60.1～60.7℃、48.5～51.4℃、56.1～56.2℃、57.8～60℃、50.3～55.8℃、52～52.6℃、58.6～62.2℃、55.4～55.9℃、53.5～54.8℃以及54.6～54.7℃。
示例性地，核苷酸序列依次如上述的标记引物对，其退火温度依次为63℃、60.4℃、50℃、56.2℃、58℃、53℃、52.3℃、60.2℃、55.7℃、54.3℃以及54.6℃。
考虑到本申请中，引物对组合物中的多个标记引物对是基于常见的、应用较广的非黄河鲤鱼鲤属的基因位点进行分析筛选及归类，然后按照特定组合进行分组，以使得黄河鲤鱼鲤属样本在每个标记组中均能够扩增而非黄河鲤鱼鲤属样本基本上都能满足至少在一个标记组中不会扩增。因此，一些特定的非黄河鲤鱼鲤属能够较好地匹配本申请中标记组特定的分组方式，在区分方法中，能够较好地鉴别分黄河鲤鱼鲤属和该类特定的非黄河鲤鱼鲤属。
作为一些示例，非黄河鲤鱼鲤属包括尖鳍鲤Cyprinus acutidorsalis、洱海鲤Cyprinus barbatus、西鲤Cyprinus carpio carpio Linnaeus、鲤鱼Cyprinus carpio、中心鲤Cyprinus centralus、杞麓鲤Cyprinus chilia、大理鲤Cyprinus daliensis、抚仙小鲤Cyprinus fuxianensis、翘嘴鲤Cyprinus ilishaestomus、因莱湖鲤Cyprinus inthaAnnandale、春鲤Cyprinus longipectoralis、大眼鲤Cyprinus megalophthalmus、小鲤Cyprinus micristius、三角鲤Cyprinus multitaeniata、大头鲤Cyprinus pellegrini、邛海鲤Cyprinus qionghaiensis、华南鲤Cyprinus rubrofuscus、异龙鲤Cyprinusyilongensis、以及云南鲤Cyprinus yunnanensis。
可选地，非黄河鲤鱼鲤属为鲤鱼Cyprinus carpio。示例性地，鲤鱼Cyprinuscarpio包括荷包红鲤、福瑞鲤、松浦镜鲤、建鲤以及丰产鲤。
上述特定鲤属的非黄河鲤鱼鲤属能够较好地匹配本申请中标记组特定的分组方式，能够较好地满足至少在一个标记组中不会扩增，有利于更准确地鉴别分黄河鲤鱼和非黄河鲤鱼鲤属。
可以理解的是，在本申请的实施例中，黄河鲤鱼鲤属和/或非黄河鲤鱼鲤属样本的DNA来源，可以根据本领域公知的选择方式确定。
可选地，DNA来源为鲤鱼鲤属的细胞、组织、血液、鱼鳍、鱼鳞或者鱼骨。示例性地，DNA来源为背部肌肉组织。
另外，在本申请的实施例中，从DNA来源提取基因组DNA的方法，可以参照本领域公知的DNA提取方法进行。
作为一种示例，样本中的基因组DNA通过磁珠提取法、树脂提取法或者苯酚-氯仿提取法提取得到。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的方法，包括：
一、采集样本并提取基因组DNA
采集来自黄河鲤主产区河南段的黄河鲤鱼鲤属样本，共计70个；采集来自山东、辽宁及黑龙江该鲤鱼主产区的非黄河鲤鱼鲤属样本，包括荷包红鲤、福瑞鲤、松浦镜鲤、建鲤以及丰产鲤，共计230个。
采用组织DNA提取试剂盒(GeneJET，美国Thermo Scientific公司)，按照说明书方法提取基因组DNA，取部位为鲤鱼背部肌肉组织。提取后得到的基因组DNA，首先使用分光光度计测定样本的浓度和纯度，之后经凝胶琼脂糖电泳分离(电泳电压为110V，时间45～50min)、凝胶成像系统观察样本完整性，然后将符合标准的样本在-20℃的温度条件下储存备用。
二、筛选SNP标记
通过数据库位点群体验证以及性状基因位点搜索两种SNP挑选方法，挑选在黄河鲤鱼鲤属样本中具有多态性但在普通鲤鱼群体中不具多态性的SNP标记位点，共计11个，具体如表1所示。
三、设计AS-PCR引物
针对挑选的11个SNP位点，设计AS-PCR引物，得到本申请的引物对组合物中的11对标记引物对，其核苷酸序列具体如表1所示。
同时，设计一对针对SH2D基因的阳性照引物，其核苷酸序列具体如表1所示。
四、AS-PCR扩增
采用引物对组合物中的各标记引物对分别对基因组DNA进行AS-PCR扩增，其AS-PCR扩增参数如表1所示，其中，Tm表示退火温度。
另外，AS-PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件见如表3所示。
表1.用于鉴定黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的SNP标记位点、AS-PCR引物序列及AS-PCR扩增参数
注：
(1)AS-PCR引物的设计与粗体序列相匹配。
(2)核苷酸序列中，小写字母表示SNP扩增序列。
(3)SNP序号中，右上角小写字母a、b、c、d、e表示SNP标记分为五组，其依次对应本申请中的第五标记组、第三标记组、第二标记组、第一标记组和第四标记组，用于黄河鲤与荷包红鲤、黄河鲤与福瑞鲤、黄河鲤与松浦镜鲤、黄河鲤与建鲤、黄河鲤与丰产鲤的鉴别。
表2.AS-PCR扩增体系
表3.AS-PCR扩增条件
五、毛细管电泳分离
采用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分离，具体操作如下：
(1)取PCR扩增产物2μL，并使用TE缓冲液定容至24μL。
(2)使用dsDNA 905分离胶(AATI，USA)进行分离。当同一次实验需要跑多次样时，第一次毛细管电泳分离电压5kv，分离时间55min；之后，可采用省胶模式，分离电压调至7kv，分离时间45min。
六、数据分析
采用PROSize 3.0软件对分离图谱进行分析。并统计11个SNP标记位点在黄河鲤鱼鲤属样本及非黄河鲤鱼鲤属样本中的出峰情况。
图1为本申请实施例中一个黄河鲤鱼属种样本的基因组DNA在PCR扩增后的毛细管电泳图谱；其中，出峰出标记的数值与表1中SNP序号对应。
根据表1可知，该检测的黄河鲤鱼属种的样本中，在PCR扩增后，在a、b、c、d和e该5个标记组中均有对应的出峰。
图2为本申请实施例中一个非黄河鲤鱼属种样本的基因组DNA在PCR扩增后的毛细管电泳图谱。
根据图1和图2可见，该检测的非黄河鲤鱼属种的样本中，在PCR扩增后，在a、b、c、d和e该5个标记组中均无对应的出峰。
七、结果分析
对300个样本(70个黄河鲤鱼鲤属样本，230个非黄河鲤鱼鲤属样本)的11个SNP标记位点在进行PCR扩增、毛细管电泳分离后的出峰数量和出峰百分比进行统计，其结果如表4及表5所示。
表4.黄河鲤鱼鲤属样本与非黄河鲤鱼鲤属样本AS-PCR扩增组数的数量统计
表5.黄河鲤鱼鲤属样本与非黄河鲤鱼鲤属样本AS-PCR扩增组数的百分比统计
注：
(1)表4和表5中，No.of groups with peaks中的数字1、2、3、4和5，依次是指其出峰的引物组的个数。
(2)表5中，扩增组数百分比，是以表4中的统计数量/对应样本总数得到的。在不能除尽的情况下，按照四舍五入并保留两位小数的方式表示。
根据表4和表5可知，黄河鲤鱼鲤属样本中，有5个标记分组均出峰的概率接近1；所有的非黄河鲤鱼鲤属样本中，不存在5个标记分组均出峰的情况。
可见，本申请中，基于AS-PCR和特异性扩增的结合，在作简单便捷且成本低的同时，通过扩增情况能够直观且准确地鉴别区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物、试剂盒及方法
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 23
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<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
catcctgtaa aataaaaa 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
tgtaagtaag taagtaagta 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
cgtaatacta ctcttaaaca ac 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
actgaagact ggacaata 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
tatggtgact gatgttgtt 19
<210>10
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
tactgagaaa gcttgcca 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 11
tgcagtgact tatagagt 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
ttcтgatgta atgtggtt 18
<210>13
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 13
cacctacaga caaatg 16
<210>14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 14
cactatggat attagaggaa 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 15
gtcactctgt gctttcgg 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 16
actcatccct cttcaттcт 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 17
gaatatgaga cctgtaacc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 18
ctagttcact ggaaacac 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 19
agttattaaa tgctgtaaga 20
<210> 20
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<212> DNA
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aagtagttgt aggtgttc 18
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<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 21
ataaagataa aattaaagat aaatcg 26
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<212> DNA
<213>人工序列
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ctagttcgtc caagtac 17
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<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 23
ggataacatg ttagaatgca aaga 24
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 24
cagcgtgatc gacttgaa 18
Claims (10)
1.一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物，其特征在于，包括以下核苷酸序列的标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQID NO.22。
2.一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的试剂盒，其特征在于，包括阳性对照引物对以及如权利要求1所述的引物对组合物，所述阳性对照引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对组合物分为第一标记组、第二标记组、第三标记组、第四标记组和第五标记组；
所述第一标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；以及SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；
所述第二标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6；以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述第三标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10；以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；
所述第四标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12；
所述第五标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
4.一种用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的方法，其特征在于，包括：采用如权利要求1所述的引物对组合物或者如权利要求2所述的试剂盒对鲤鱼样本的基因组DNA进行PCR扩增；
将所述引物对组合物分为第一标记组、第二标记组、第三标记组、第四标记组和第五标记组；
若有5个标记组出现扩增产物则判断所述鲤鱼样本为黄河鲤鱼鲤属，否则判断所述鲤鱼样本为非黄河鲤鱼鲤属；
所述第一标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；以及SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；
所述第二标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6；以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述第三标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10；以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；
所述第四标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12；
所述第五标记组包括以下核苷酸序列的所述标记引物对：SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，在所述PCR扩增步骤之后，还包括：电泳分离检测；
若有5个标记组出峰则判断所述鲤鱼样本为黄河鲤鱼鲤属，否则判断所述鲤鱼样本为非黄河鲤鱼鲤属。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在所述PCR扩增步骤中，核苷酸序列依次如下的所述标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQID NO.22；
退火温度依次为62～63.7℃、60.1～60.7℃、48.5～51.4℃、56.1～56.2℃、57.8～60℃、50.3～55.8℃、52～52.6℃、58.6～62.2℃、55.4～55.9℃、53.5～54.8℃以及54.6～54.7℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增步骤中，核苷酸序列依次如下的所述标记引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22；
退火温度依次为63℃、60.4℃、50℃、56.2℃、58℃、53℃、52.3℃、60.2℃、55.7℃、54.3℃以及54.6℃。
8.根据权利要求4或5所述的方法、其特征在于，所述非黄河鲤鱼鲤属包括尖鳍鲤Cyprinus acutidorsalis、洱海鲤Cyprinus barbatus、西鲤Cyprinus carpio carpioLinnaeus、鲤鱼Cyprinus carpio、中心鲤Cyprinus centralus、杞麓鲤Cyprinus chilia、大理鲤Cyprinus daliensis、抚仙小鲤Cyprinus fuxianensis、翘嘴鲤Cyprinusilishaestomus、因莱湖鲤Cyprinus intha Annandale、春鲤Cyprinus longipectoralis、大眼鲤Cyprinus megalophthalmus、小鲤Cyprinus micristius、三角鲤Cyprinusmultitaeniata、大头鲤Cyprinus pellegrini、邛海鲤Cyprinus qionghaiensis、华南鲤Cyprinus rubrofuscus、异龙鲤Cyprinus yilongensis、以及云南鲤Cyprinusyunnanensis。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述非黄河鲤鱼鲤属为鲤鱼Cyprinuscarpio。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述鲤鱼Cyprinus carpio包括荷包红鲤、福瑞鲤、松浦镜鲤、建鲤以及丰产鲤。
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