CN104789650B - 芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法 - Google Patents
芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法，用其线粒体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR扩增，将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质；本发明能快速、有效地鉴别芸薹属栽培种细胞质，为品种选育和材料创新提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法。
背景技术
芸薹属栽培种包括白菜(B. rapa；AA, 2n = 20)、甘蓝(B. oleracea；CC, 2n =18)和黑芥(B. nigra；BB, 2n = 16) 3个二倍体基本种以及甘蓝型油菜(B. napus；AACC,2n = 38)、芥菜型油菜(B. juncea；AABB, 2n = 36)和埃塞俄比亚芥(B. carinata；BBCC,2n = 34) 3个四倍体复合种。
远缘杂交是同种间属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交，可以把不同种、属的特征、特性结合起来，从而突破种属界限，扩大遗传变异，从而创造新的变异类型或新物种。
甘蓝型油菜是芸薹属中的重要作物之一，在世界范围内均有较大的种植面积。甘蓝型油菜为异源双二倍体。由基本种白菜型油菜和甘蓝在自然界通过种间杂交后双二倍化进化而来。随着育种工作的不断深入，甘蓝型油菜种内可利用的基因资源日趋贫乏。可以有意识地利用属间甚至亲缘关系更远的物种进行杂交，能有效拓展甘蓝型油菜的遗传变异，充分利用远缘物种的高度抗病性和对环境胁迫的抵抗能力，来改良栽培品种。
植物细胞质有自己的遗传系统，它的DNA分布于线粒体和叶绿体中，细胞质DNA能通过自己的转录翻译系统来指导部分细胞质生物大分子的合成，如卡尔文循环中的关键酶——核酮糖羧化酶（加氧酶）的大亚基、线粒体中细胞色素氧化酶蛋白。植物细胞质具有高度异质性，由细胞质遗传系统决定，不受细胞核基因及环境因素的影响。
目前，针对芸薹属不同栽培种之间细胞质的鉴别方法研究较少，而针对甘蓝型油菜中几种常见的细胞质类型：Nap细胞质类型(Nap)、玻里玛系统细胞质(Pol)、陕2A细胞质(2A)、Cam细胞质类型、萝卜质细胞质类型 (Ogu)等的鉴别较多。通常采用普通遗传学方法、线粒体基因组DNA的限制性片段长度多态性（mtDNA-RFLP）（杨光圣等，中国农业科学，2009,31(1):27-31）、PCR技术（程计华等，作物学报，2008,34(11):1946-1952；张瑞杰等，西北农业学报, 2012,21(10):59-64）。普通遗传学鉴定费时费力，需要2～3年，mtDNA-RFLP方法实验周期缩短到几天时间，但线粒体DNA的限制性酶切和酶切片段的分离检测操作难度大且成本高，应用PCR技术检测是现今最为简洁方便的方法。
目前，芸薹属栽培种的线粒体和叶绿体全基因组已被测序，可以根据这些特异基因组序列开发分子标记，利用PCR技术快速鉴别不同栽培种的细胞质类型，由此将极大地提高工作效率。
发明内容
本发明的目的是解决目前缺乏芸薹属栽培种细胞质分子鉴定方法的问题，提供芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法。
本发明采用的是PCR技术，是针对芸薹属栽培种细胞质目标基因特定位点设计特异引物，进行PCR扩增，检测得到的DNA多态性，以此做为分子标记的技术。
本发明提供的芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法，具体步骤如下：用线粒体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR反应，以芸薹属几个栽培种：包括白菜、甘蓝、黑芥、甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥的线粒体和叶绿体DNA为模板，用以下13对特异引物对ccmp2、trnL-F、rpl16、trnE-trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、PsbB- PsbT、BnTR1、BnTR4进行扩增，其中：
第一对引物序列为：
正向引物 5’ -GATCCCGGACGTAATCCTG-3’
反向引物 5’ -ATCGTACCGAGGGTTCGAAT-3’
第二对引物序列为：
正向引物 5’ -TCAATTGCACATTCTAGAATTCTAAG-3’
反向引物 5’ -CAATTCAATATGGTTATATATTAGAG-3’
第三对引物序列为：
正向引物 5’ -GGTTCCGTCGTTCCCATCGC-3’
反向引物 5’ -CATAATAATTAGATAAATCTGTTCC-3’
第四对引物序列为：
正向引物 5’ -AATGGTATGACTAGCTTATAAGG-3’
反向引物 5’ -CTTAACAATGAGATGAGGCAATC-3’
第五对引物序列为：
正向引物 5’ -GAAAAATGCAAGCACGGTTT-3’
反向引物 5’ -TACGATCCGTAGTGGGTTGC-3’
第六对引物序列为：
正向引物 5’ -TACCCGTATTAGGCACTA-3’
反向引物 5’ -TTTGTAAGACCACGACTG-3’
第七对引物序列为：
正向引物 5’ -ATTGGCTTACTTCTTGCG-3’
反向引物 5’ -GGTTTCCGGGATGTTATT-3’
第八对引物序列为：
正向引物 5’ -GGTTCGTTAGCAGGTTTA-3’
反向引物 5’ -GTTCCCTAGCAACACTTT-3’
第九对引物序列为：
正向引物 5’ -TGTACTTATGGGAAAGCG-3’
反向引物 5’ -CTGGGTTCTTCTACTTCATT-3’
第十对引物序列为：
正向引物 5’ -GGCCATAGGCTGGAAAGTCT-3’
反向引物 5’ -GTTTATGCATGGCGAAAAGG-3’
第十一对引物序列为：
正向引物 5’ -CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC-3’
反向引物 5’ -TTCCATAGATTCGATCGTGGTTTA-3’
第十二对引物序列为：
正向引物 5’ -CCGTTAGGGGTATTTAGTAACTCG-3’
反向引物 5’ -ACATAATGGCAATGTATCGGACTG-3’
第十三对引物序列为：
正向引物 5’ -GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACC-3’
反向引物 5’ -AGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCAT-3’
其中，所述PCR的反应体系如下:
PCR反应体系为10µL，包含20ng 模板，正向引物和反向引物引物各0.25μmol/L，1xTaq buffer，MgCl2 1.5 mmol/L, 每种dNTP 0.2 mmol/L，0.5 U的Taq DNA聚合酶, 然后用ddH20 补足 10ul。采用Touch down 扩增程序： 94℃ 预变性3min；94℃ 变性30s，60℃ 退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性1min，57℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，28个循环；72℃ 延伸10min；通过PCR扩增，分别获得100-400bp 的片段。
将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质。
本发明得到的有益效果：本发明采用PCR分子标记技术对芸薹属栽培种细胞质进行分子水平的多态性检测，本发明的方法非常适用于对含芸薹属栽培种细胞质的材料进行鉴定，具有以下优点：
（1）本发明鉴定引物和鉴定方法具有快速准确、稳定可靠的特点。
（2）可进行高通量筛选，提高了鉴定效率。
附图说明
图1为本发明中显示第十一对引物对部分油菜材料PCR电泳图谱；
图2为本发明中显示第十三对引物对部分油菜材料PCR电泳图谱；
图3为用NTSYS-PC2.10e软件包的SHAN程序和UPGMA方法进行聚类分析后得到的聚类分析图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：芸薹属几个栽培种细胞质细胞质的分子鉴定方法
本实施例的试验材料GRB094为白菜细胞质，GRB4107为黑芥细胞质， GRA113和11HB32为甘蓝细胞质，GRB4106为埃塞俄比亚芥细胞质，GRA093、GRA094、GRA096、C30707、C30854、C30947、C31085和C31190为芥菜型油菜细胞质，Zhongshuang11、GRB999、xiangyou17、Chuanyou36、Y335、Y336、D3361A、D3361、AB450、Liraglu、31048、Nabo、HJa82470、Koolzaand-2、Huayou-2H、Canada-2H、TRIVMPH、P11、Halleyuche、Dong-Hae23、Qinseng、SV.Juno、BF10(A)、P4、Expander和Superlati-velot 601为甘蓝型油菜细胞质。
1、利用CTAB法提取并纯化叶片总DNA，具体步骤如下：
①取0.1g新鲜幼嫩叶片于研钵中，加700微升提取液研磨，随即装入2毫升EP管中置于65°C恒水浴保温60min，其间摇动2－3次。
②取出EP管，稍冷却后，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1，体积比)，轻轻颠倒混匀，4°C, 12000r/min 离心 I0min，使其分层。
③取上清到另一EP管，加入等体积的氯仿/异戍醇(体积比为24:1，体积比)，颠倒混匀，4°C, 12000r/min离心I0min。
④重复步骤③，直至两相界面不出现白色沉淀为止。
⑤取上清，加入1毫升－20°C预冷的无水乙醇，轻轻混匀，－20°C静置不超过30min；4°C，12000r/min 离心 10min。
⑥弃上清，用体积百分比75%乙醇洗涤沉淀2－3次，室温干燥后，加入TE(10mMTris, pH 8.0; 1mM EDTA, pH8.0)溶解DNA；紫外风光光度计测定质量浓度，样品最终稀释到25mg/L冻保存备用。
2、基于ccmp2、trnL-F、rpl16、trnE-trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、PsbB-PsbT、BnTR1、BnTR4基因的分子标记。
2.1 引物
表1：基于特定基因的鉴定引物
2.2 PCR反应
分子标记PCR检测的10ul反应体系中包含20ng 模板，正向引物和反向引物引物各0.25μmol/L，1x Taq buffer，MgCl2 1.5 mmol/L, 每种dNTP 0.2 mmol/L，0.5 U的Taq DNA聚合酶, 然后用 ddH20 补足 10ul。采用Touch down 扩增程序： 94℃ 预变性3min；94℃变性30s，60℃ 退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性1min，57℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，28个循环；72℃ 延伸10min。
2.3 PCR反应产物用的凝胶电泳检测
扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr : Bis=19 : 1）上180V恒压电泳分离。参照《分子克隆实验指南，第三版》，方法进行银染，在凝胶自动成像仪上观察。
2.4 数据分析
点用图谱上有带计为：“1”，无带计为：“0”，用NTSYS-PC2.10e软件包计算遗传相似系数，获得相似系数矩阵，用该软件包的SHAN程序和UPGMA方法进行聚类分析（附图3）。在相似系数0.75处可区分不同栽培种类型。
表2：国内外39份不同类型的油菜品种（系）
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州禾睦福种子有限公司；贵州省油菜研究所
<120> 一种芸薹属栽培种细胞质的鉴定引物及鉴定方法
<130>
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 1
gatcccggac gtaatcctg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 2
atcgtaccga gggttcgaat 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 3
tccattgcac attctagaat tctaag 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 4
caattcaata tggttatata ttagag 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 5
ggttccgtcg ttcccatcgc 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 6
cataataatt agataaatct gttcc 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 7
aatggtatga ctagcttata agg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 8
cttaacaatg agatgaggca atc 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 9
gaaaaatgca agcacggttt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 10
tacgatccgt agtgggttgc 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 11
tacccgtatt aggcacta 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 12
tttgtaagac cacgactg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 13
attggcttac ttcttgcg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 14
ggtttccggg atgttatt 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 15
ggttcgttag caggttta 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 16
gttccctagc aacacttt 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 17
tgtactatg ggaaagcg 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 18
ctgggttctt ctacttcatt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 19
ggccataggc tggaaagtct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 20
gtttatgcat ggcgaaaagg 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 21
ccaaaaactt ggagatccaa ctac 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 22
ttccatagat tcgatcgtgg ttta 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 23
ccgtt agggg tatttagtaa ctcg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 24
acataatggc aatgtatcgg actg 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 25
gaagtccgag gacctttagt acc 23
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 26
agtaagttgt aggtaggggc ttcat 25
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州禾睦福种子有限公司；贵州省油菜研究所
<120> 一种芸薹属栽培种细胞质的鉴定引物及鉴定方法
<130>
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 1
gatcccggac gtaatcctg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<400> 2
atcgtaccga gggttcgaat 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
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<400> 3
tccattgcac attctagaat tctaag 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
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<400> 4
caattcaata tggttatata ttagag 26
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<400> 5
ggttccgtcg ttcccatcgc 20
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<212> DNA
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cataataatt agataaatct gttcc 25
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<400> 7
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<400> 8
cttaacaatg agatgaggca atc 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 9
gaaaaatgca agcacggttt 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 10
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<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
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<210> 14
<211> 18
<212> DNA
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<400> 14
ggtttccggg atgttatt 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
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<400> 15
ggttcgttag caggttta 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 16
gttccctagc aacacttt 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 17
tgtactatg ggaaagcg 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 18
ctgggttctt ctacttcatt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 19
ggccataggc tggaaagtct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 20
gtttatgcat ggcgaaaagg 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 21
ccaaaaactt ggagatccaa ctac 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 22
ttccatagat tcgatcgtgg ttta 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 23
ccgtt agggg tatttagtaa ctcg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 24
acataatggc aatgtatcgg actg 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 25
gaagtccgag gacctttagt acc 23
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 26
agtaagttgt aggtaggggc ttcat 25
Claims (3)
1.区分芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法，其特征在于：对芸薹属栽培种的线粒体和叶绿体DNA为模板，用以下13对特异引物对ccmp2、trnL-F、rpl16、trnE-trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、PsbB-PsbT、BnTR1、BnTR4进行扩增，所述芸薹属栽培种包括白菜、甘蓝、黑芥、甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥，其中：
第一对引物序列为：
正向引物5’-GATCCCGGACGTAATCCTG-3’
反向引物5’-ATCGTACCGAGGGTTCGAAT-3’
第二对引物序列为：
正向引物5’-TCAATTGCACATTCTAGAATTCTAAG-3’
反向引物5’-CAATTCAATATGGTTATATATTAGAG-3’
第三对引物序列为：
正向引物5’-GGTTCCGTCGTTCCCATCGC-3’
反向引物5’-CATAATAATTAGATAAATCTGTTCC-3’
第四对引物序列为：
正向引物5’-AATGGTATGACTAGCTTATAAGG-3’
反向引物5’-CTTAACAATGAGATGAGGCAATC-3’
第五对引物序列为：
正向引物5’-GAAAAATGCAAGCACGGTTT-3’
反向引物5’-TACGATCCGTAGTGGGTTGC-3’
第六对引物序列为：
正向引物5’-TACCCGTATTAGGCACTA-3’
反向引物5’-TTTGTAAGACCACGACTG-3’
第七对引物序列为：
正向引物5’-ATTGGCTTACTTCTTGCG-3’
反向引物5’-GGTTTCCGGGATGTTATT-3’
第八对引物序列为：
正向引物5’-GGTTCGTTAGCAGGTTTA-3’
反向引物5’-GTTCCCTAGCAACACTTT-3’
第九对引物序列为：
正向引物5’-TGTACTTATGGGAAAGCG-3’
反向引物5’-CTGGGTTCTTCTACTTCATT-3’
第十对引物序列为：
正向引物5’-GGCCATAGGCTGGAAAGTCT-3’
反向引物5’-GTTTATGCATGGCGAAAAGG-3’
第十一对引物序列为：
正向引物5’-CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC-3’
反向引物5’-TTCCATAGATTCGATCGTGGTTTA-3’
第十二对引物序列为：
正向引物5’-CCGTTAGGGGTATTTAGTAACTCG-3’
反向引物5’-ACATAATGGCAATGTATCGGACTG-3’
第十三对引物序列为：
正向引物5’-GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACC-3’
反向引物5’-AGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCAT-3’，
用其线粒体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR扩增，将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质。
2.根据权利要求1所述的区分芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法，其特征在于：所述PCR的反应体系如下：
PCR反应体系为10μL，包含20ng模板，正向引物和反向引物各0.25μmol/L，1x Taqbuffer，MgCl21.5mmol/L，每种dNTP 0.2mmol/L，0.5U的Taq DNA聚合酶，然后用ddH2O补足10ul；采用Touch down扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性1min，57℃退火30s，72℃延伸45s，28个循环；72℃延伸10min；通过PCR扩增，分别获得100-400bp的片段。
3.如权利要求1-2任一项所述的区分芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法在油菜杂交选育中的应用。
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